Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng rutin trong hòe hoa

Bộ Y TÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
KIÈU MAI DUNG
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT Độ
ĐẾN HÀM LƯỢNG RUTIN
TRONG HÒE HOA
(KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHÓA 2<
Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Đức Toàn
Nơi thực hiện: Khoa Kiểm nghiệm Đông dược, dược liệu -
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Bộ môn Dược học cổ truyền -
Trường Đại học Dược Hà Nội.
Thời gian thực hiện: Tháng 10/2006 - 5/ 2007.
Hà Nội - 5/2007
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết on sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ
Phùng Hòa Bình, Thạc sỹ Nguyễn Đức Toàn, người đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Kiểm nghiệm Đông dược,
dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, các thầy cô giáo bộ môn Dược
học cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận.
Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo đã giảng dạy và
giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội tháng 5 năm 2007
Sinh viên: Kiều Mai Dung
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Vị thuốc Hòe hoa 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
2
1.1.2. Thành phần hóa học 2
1.1.3. Tác dụng theo YHCT 3
1.2. Rutin 3
1.2.1. Công thức hóa học 3
1.2.2. Tính chất vật lý 4
1.2.3. Định tính, định lượng 4
1.2.4. Tác dụng dược lý 8
1.2.5. Một số chế phẩm có chứa Rutin 9
1.2.6. Chiết suất Rutin 10
1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học của vị thuốc

11
Phần 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu

15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu 15
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
16
2.2.1. Phương pháp định tính Rutin 16
2.2.2. Khảo sát phương pháp chiết rutin từ Hòe hoa 16
2.2.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 19
2.2.4. Định lượng Rutin trong các MNC 19
2.2.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 20
2.3. KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

2.3.1. XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP 22
2.3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 24
2.3.3. ĐỊNH LƯỢNG RUTIN TRONG CÁC MNC 27
BÀN LUẬN 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
CÁC CHỮ VIÉT TẮT
BuOH: Butanol
DĐ: Dược điển
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid
Chromatography)
MNC: Mầu nghiên cứu
MeOH: Methanol
SKĐ: Sắc ký đồ
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
TPHH: Thành phần hóa học
TW: Trung ương
YHCT: Y học cổ truyền
ĐẶT VẮN ĐỀ
Hòe hoa Flos Sophorae là nụ của cây hòe Sophora japonica L., họ Đậu
(Fabaceae).
Hòe hoa là vị thuốc quý được Đông y sử dụng để chữa các bệnh như chảy
máu cam, băng huyết, cao huyết áp, trĩ
Thành phần hóa học chủ yếu của Hòe hoa là Rutin. Rutin là hoạt chất có tác
dụng làm giảm tính thấm của mao mạch, tăng sức bền của thành mạch, được ứng
dụng trong Tây y để chữa các bệnh có liên quan đến tổn thương thành mạch như
trĩ, chảy máu đáy mắt và các chứng bệnh có liên quan đến tai biến mạch máu
như xơ vữa động mạch, rối loạn tuần hoàn Ngoài ra Rutin còn được ứng dụng
nhiều trong các lĩnh vực bao màu, công nghệ thực phẩm Do vậy nhu cầu sử
dụng Rutin ngày càng tăng.

Rutin là một Flavonoid dễ bị thủy phân. Khi thủy phân Rutin cho Quercetin,
Glucose và Rhamnose. Nhiệt độ, độ ẩm và enzym (trong Hòe hoa) làm tăng quá
trình thủy phân Rutin. Vì vậy, trong quá trình bảo quản, chế biến hàm lượng
Rutin trong Hòe hoa thường có sự thay đổi.
Một số công trình nghiên cứu gần đây đã thông báo ảnh hưởng của nhiệt độ
đến thành phần hóa học, hàm lượng hoạt chất chính và thành phần hóa học của
một số vị thuốc thay đổi.
Đe góp phần tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Rutin trong vị
thuốc Hòe hoa chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
đến hàm lượng Rutin trong Hòe hoa” với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp định lượng Rutin trong Hòe hoa bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. ứng dụng phương pháp đã xây dựng để khảo sát hàm lượng Rutin trong
Hòe hoa đã được xử lý bằng nhiệt độ.
Phần 1: TỎNG QUAN
1.1. Vị thuốc Hòe hoa
Là nụ hoa đã phơi hay sấy khô của cây Hòe (Stypnoỉobium japonicum (L.)
Schott; Syn. Sophora japonica L.), họ Đậu (Fabaceae).
Nụ hoa hình trứng có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 0,3 - 0,6 cm,
rộng 0,2 - 0,4 cm. Đài hoa hình chuông, màu vàng xám, dài bằng 1/2 - 2/3 chiều
dài nụ hoa, phía trên xẻ thành 5 răng nông. Cánh hoa chưa nở màu vàng. Mùi
thom, vị đắng [4], [9], [17], [29].
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây gỗ, to cao có thể đến 15 m, thân thẳng có chỏm lá tròn, cành cong queo.
Lá kép lông chim lẻ, có 9 - 13 lá chét hình trứng, đỉnh nhọn, nguyên, dài 3 cm,
rộng 1,5 - 2,5 cm. Cụm hoa hình chùy ở đầu cành. Tràng hoa hình bướm màu
trắng ngà. Quả loại đậu không mở, dày và thắt nhỏ lại ở giữa các hạt.
Ở nước ta hòe được trồng ở một số tỉnh Nam Hà, Nam Định, Thanh Hóa,
Nghệ An và nhiều nhất là ở Thái Bình. Các nước như Trung Quốc, Triều Tiên,
Nhật Bản cũng trồng. Ở Châu Âu hòe được trồng làm cảnh [4].

1.1.2. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chủ yếu là Rutin (ít nhất là 20%) [9], phần Aglycol của
Rutin là Quercetin (Quercetol - thuộc nhóm flavonol), phần đường là
Rutinose(6 - o- a L Rhamnopyranosyl- ị3- D- glycopyranose). Ngoài ra trong Hòe
hoa còn có Betulin là dẫn chất của triterpenoid nhóm Lupan, Sophoradiol là dẫn
chất của nhóm Olean, Sophorin A, B, c [4], [17].
Lá có 6 , 6 % flavonoid toàn phần, trong đó có 4,7% Rutin.
Vỏ quả: 10,5% flavonoid toàn phần, trong đó có 4,3% là Rutin,
Sophoricosid, Sophorabiosid và một số Flavonoid khác [4 ].
1.1.3. Tác dụng theo YHCT
- Tính vị: Vị đắng, tính hơi hàn [6 ], [17].
- Quy kinh: Vào 2 kinh Can và Đại tràng [6 ], [17].
- Công năng, chủ trị: [6 ]
> Lương huyết, chỉ huyết: Dùng trong trường hợp xuất huyết như: chảy
máu cam, trĩ chảy máu, phụ nữ băng huyết, đại tiểu tiện ra máu.
> Thanh nhiệt, bình can: Dùng trong trường họfp can hỏa thượng viêm:
Đau mắt đỏ, đau đầu.
> Bình can, hạ áp: Hòe hoa sao vàng dùng trong trường hợp huyết áp cao,
ngoài ra có thể dùng trong trường họp đau thắt động mạch vành.
> Thanh phế chống viêm: Dùng trong trường hợp viêm thanh đới, nói
không ra tiếng.
1.2. Rutin
1.2.1. Công thức hóa học
• Công thức cẩu tạo:[4], [31 ]
-3-
• Công thức hóa học: C27H30O16
Rutin còn có tên gọi khác như Rutosid, quercetin-3-rutinoside và sophorin,
hoặc (3, 3', 4', 5, 7 pentahydroxy flavone - 3- Rutinosid).
Rutin là glycosid bao gồm flavonol Quercetin và disaccharide Rutinose. Khi
thủy phân Rutin cho Quercetin, Glucose và Rhamnose [4],

1.2.2. Tính chất vật lý
Bột kết tinh màu vàng hay vàng lục, không mùi, bay hơi có mùi đặc trưng,
để ngoài ánh sáng màu hơi sậm lại.
Dễ tan trong pyridin, tan trong methanol và các dung dịch kiềm loãng, hơi
tan trong glycerin, khó tan trong ethanol và isopropanol (1/650) nhưng tan trong
ethanol sôi (1/60), ít tan trong nước lạnh (1/8000), tan ít trong nước sôi (1 /2 0 0 ),
không tan trong ether dầu hỏa, benzen, cacbon sulfid [4], [17].
Rutin có độ hấp thụ cực đại tử ngoại bước sóng 258,5nm và
362,5nm/ethanol, 359nm/methanol.
Nhiệt độ nóng chảy: Khoảng 210°c, kèm phân hủy [17].
1.2.3. Định tính, định lượng
1.2.3.1. Định tính [4], [5]
a. Định tính bằng phương pháp ổng nghiệm:
- Phản ứng Cyanidin: Dịch chiết + (Mg + dd HC1) => Dịch chuyển sang
màu đỏ.
- Phản ứng hơi Amoniac: Hơ tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết lên lọ Amoniac
đặc: màu vàng đậm lên.
- Phản ứng dd NaOH 0,1N: Dịch chiết + dd NaOH 0,1N: Màu vàng đậm lên
- Phản ứng với dd FeCỈ3 5%: cho màu xanh lục.
b. Sắc ký
Thường dùng 2 loại sắc ký: SKLM và SKG [4], [5], [9], [11].
> Sắc ký lớp mỏng:
+ Bản mỏng: Chất hấp phụ Silicagel G
+ Dung môi thường dùng:
• Benzen - AtOAc (3:1)
• CHCỈ3 - MeOH (5:1)
• Benzen - Aceton (9:1)
• Toluen - Aceton (19:1)
• CHCI3 - CH3COOH (9:1)
> Sắc ký giấy:

+ Giấy sắc ký: Whatman số 1, số 3.
+ Dung môi thường dùng:
• TBA - nBuOH - CH3COOH - H20 (3:1:1).
• BAW - nBuOH - CH3COOH - H20 (4:1:5).
• Forestal - CH3 COOH - HC1 - H20 (30:3:10).
• Benzen - CH3 COOH - H20 (125:72:3).
• CHCI3 - CH3 COOH - H20 (13:6:1)
• nBuOH - CH3 COOH - H20 (5:1:4)
• nBuOH - CH3 COOH - H20 (4:1:1)
Hiện màu bằng đèn tử ngoại (UV) ở bước sóng 365nm hoặc bằng hơi
ammoniac rồi soi đèn tử ngoại ở X = 254nm.
1.2.3.2. Định lượng:
Để xác định hàm lượng Rutin trong chế phẩm hoặc trong dược liệu người ta
có thể dùng các phương pháp sau:
-5-
• Phương pháp cân [8 ]
Nguyên tắc: Rutin được chiết bằng cồn, dịch chiết được thủy phân bằng
acid H2SO4 thu được Quercetin ít tan, lọc lấy tủa, sấy khô, cân rồi tính ra Rutin.
• Phương pháp đo màu [4]
Nguyên tắc: Dựa vào màu khi cho Rutin chuẩn và mẫu thử cùng tác dụng
với AICI3 hoặc tiến hành phản ứng Cyanidin rồi đo màu. So sánh gam màu của
mẫu thử và Rutin chuẩn đã biết nồng độ, từ đó suy ra nồng độ của Rutin trong
mẫu thử.
• Phương pháp quang phổ [4], [9]
Nguyên tắc: Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến còn được
gọi là phương pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ. Trên cơ sở định
luật Lambert - Beer cho phép xác định nồng độ các chất bằng cách đo độ hấp
thụ:
Trong đdt: k là hệ số hấp thụ.
1 DTcĩĩỉèucIay của lóp dung dịch (cm)

A là độ hấp thụ của dung dịch đo ở bước sóng cực đại.
E\ là độ hấp thụ của dung dịch 1% (kl/tt), chiều dày của dung dịch là 1
cm khi đo ở bước sóng cực đại.
Phổ u v của Rutin ở \ max = 362,5nm thì có E1%icm = 325 (Ethanol).
Trên cơ sở đó xây dựng đường tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp
thụ vào nồng độ Rutin. Đo độ hấp thụ của mẫu thử, đối chiếu với đường chuẩn
tính được hàm lượng Rutin trong mẫu thử.
• Phương pháp HPLC [7], [12], [20], [25], [30].
Nguyên tẳc: Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hay
diện tích píc của nó. Khi định lượng một chất bằng HPLC, các phương pháp sau
thường được áp dụng: [7], [20].
s Phương pháp chuẩn ngoại (External Standard Method)
Đây là phương pháp thông dụng nhất khi định lượng bằng HPLC: cả 2 mẫu
chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó, so
sánh diện tích (hoặc chiều cao) píc của chất phân tích thu được từ mẫu thử và
mẫu chuẩn đã biết nồng độ. Từ đó tính được nồng độ chất phân tích trong mẫu
thử.
s Phương pháp chuẩn nội (Internal Standard Method)
Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ 2 (có
thời gian lưu và đáp ứng gần giống với mẫu thử) vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử
rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ 2 gọi là chất chuẩn nội. Tiến hành sắc ký
trong điều kiện đã khảo sát. So sánh tỷ lệ diện tích của chất thử và chuẩn nội
trong mẫu thử với tỷ số diện tích pic chất chuẩn và chuẩn nội ừong mẫu chuẩn,
từ đó sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu thử.
s Phương pháp thêm chuẩn
Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn ngoại và chuẩn nội. Thêm vào
mẫu thử những lượng đã biết các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có
trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ
chưa biết của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ AC (lượng chất

chuẩn thêm vào) và sự tăng diện tích pic AS theo công thức:
c x =sxx ——
&s
s Phương pháp chuẩn hỏa diện tích
Hàm lượng phần trăm của một chất ữong hỗn hợp nhiều thành phần được
tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích píc của nó so với tổng diện tích của tất cả các
píc thành phần trên sắc ký đồ. Phương pháp này yếu cầu tất cả các thành phần
đều được rửa giải và phát hiện. Kỹ thuật này được dùng để xác định tạp chất
trong mẫu thử.
1.2.4. Tác dụng dược lý
Rutin là chất có hoạt tính chống oxy hóa (antioxidant), chống viêm, chống
nghẽn mạch, bảo vệ tế bào và thành tế bào, chống ung thư [4], [17], [23], [24],
[31].
- Hoạt tính chống oxy hóa: Một vài nghiên cứu gần đây cho rằng Rutin có
hoạt tính chống oxy hóa do có khả năng tạo phức chelat với ion kim loại - là tác
nhân gây ra quá trình oxy hóa, làm tổn thương các tế bào. Rutin là một chất
chống oxy hóa phenolic, có khả năng thu dọn các gốc tự do superoxid.
In vivo, hoạt tính oxy hóa của Rutin là do phần aglycol-Quercetin là sản
phẩm chuyển hóa tiếp theo của Rutin ừong quá trình tiêu hóa.
- Chống viêm: Một vài thí nghiệm tiến hành trên động vật cho thấy Rutin có
khả năng chống viêm. Rutin có khả năng phòng và chữa bệnh viêm ruột kết. Tác
dụng này có thể giải thích là do Rutin làm tăng nồng độ Glutathione liên kết, làm
giảm các chuỗi oxy hóa gây viêm. Rutin được dùng làm thuốc chữa trĩ, chữa dị
ứng và chống thấp khớp, ngoài ra còn dùng trong các trường hợp da bị tổn
thương, Rutin có tác dụng làm chóng liền sẹo [17], [23], [24], [31].
- Chổng ung thư: Một số thí nghiệm trên súc vật cho thấy Rutin có thể hạn
chế một vài bệnh ung thư và các yếu tố gây ung thư [11], [23], [24].
- Tác dụng làm bền thành mạch, chống nghẽn mạch, bảo vệ tế bào và
thành tế bào: Rutin là Bioflavonol, có hoạt tính của vitamin p làm tăng sức bền
và tính đàn hồi của thành mạch [4], [9], [17].

Rutin được dùng chủ yếu để phòng các biến cố của bệnh xơ vữa động mạch,
điều trị các trường hợp suy yếu tĩnh mạch, các trường hợp xuất huyết như chảy
máu cam, ho ra máu, xuất huyết tử cung, xuất huyết tiêu hóa. Rutin rất ít độc, tuy
nhiên không được dùng trong các trường hợp nghẽn mạch hay có máu đông cao.
Dược động học Rutin: Dược động học của Rutin hiện nay vẫn đang được
nghiên cứu. Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng chỉ có 17% lượng rutin được hấp thu
qua đường tiêu hóa [31]. Sau khi được hấp thu, nhờ enzym của vi khuẩn chuyển
hóa rutin thành Quercetin. Quercetin và dạng liên hợp của nó đựợc chuyển qua
gan và thực hiện vòng chuyển hóa đầu tiên. Sản phẩm chuyển hóa có thể bao
gồm cả isorhamnetin, kaempferol và tamarixetin. Quercetin từ gan có thể phân
bố khắp các mô trong cơ thể, Quercetin được vận chuyển bởi albumin trong
huyết tương [31].
1.2.5. Một số chế phẩm có chứa Rutỉn
Rutin đã được bào chế thành các dạng thuốc sử dụng theo Y học hiện đại.
Có thể được sử dụng đon hoặc là phối hợp các hoạt chất khác:
• Dạng đơn: viên MEVON (Mekopharma), viên Rutin 500 mg, Rutin
Powder
• Dạng phối họp:
- Phối hợp vitamin C: Biệt dược Rutin c (XNDPTW 120), RUTASCOBIN
(Hungari). Được chỉ định trong điều trị bệnh trĩ, các trường hợp có tổn thương
mao mạch, rối loạn tính thấm mao mạch nhất là xuất huyết dưới da, võng mạc,
xuất huyết có liên quan đến xơ vữa động mạch và tăng huyết áp.
- Phối hợp với Cyclendelat: Biệt dược VASCUNORMYL với tác dụng giãn
mạch, chống co thắt các sợi cơ trơn của tiểu động mạch và tăng cường sức bền
thành mạch.
- Phối hợp với Barbital và theophylin: Điều trị tăng huyết áp, xơ cứng động
mạch, bệnh về mạch máu ngoại vi và não.
- Phối hợp vitamin Ki, lyzozyme có biệt dược SIDUOL với tác dụng cải
thiện lưu thông và lưu lượng máu đến các tĩnh mạch ở quanh vùng hậu môn.
Được chỉ định trong các bệnh trĩ nội, trĩ ngoại, nứt hậu môn và các triệu chứng

kết hợp.
- Phối hợp với Vicamine: Biệt dược VICARUTIN, RUTOVICINE có tác
dụng trên sự chuyển hóa của tế bào thần kinh do làm tăng sức tiêu thụ oxy và
giảm tỉ lệ lactaưpyruvat. Bên cạnh đó, nó còn làm tăng lưu lượng máu về các nơi
thiếu máu cục bộ. Được chỉ định trong các bệnh lý của người già như giảm khả
năng trí nhớ và chú ý.
- Ngoài ra Rutin còn có thể phối họp với các hoạt chất khác như: papaverin,
niticonamid [4].
1.2.6. Chiết xuất Rutin [11], [13]
Các phương pháp chiết xuất Rutin đều dựa trên khả năng hòa tan khác
nhau trong các dung môi của Rutin. Có nhiều phương pháp chiết Rutin nhưng về
cơ bản có thể xếp thành
2 cách chính như sau
+ Phương pháp chiết bằng nước.
+ Phương pháp chiết bằng cồn.
1.2.6.1. Phương pháp chiết bằng nước
a. Chiết bằng nước sôi
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào độ tan khác nhau của Rutin trong
nước sôi và nước lạnh, có thể chiết bằng áp suất thường hoặc áp suất cao. Dùng
nước sôi để chiết Rutin trong Hòe hoa, dịch chiết thu được để nguội sẽ có tủa
Rutin, lọc lấy tủa thu được Rutin.
-10-
Vì nước là dung môi có khả năng hòa tan rộng nên dịch chiết lẫn nhiều tạp, do
đó trước khi chiết thưởng dùng acid loãng để khử bớt tạp.
b. Chiết bằng dung dịch kiềm loãng
Nguyên tắc: Dựa vào cấu trúc Rutin có nhóm chức -OH phenol tự do ở vị
trí 3', 4' tạo muối dễ tan trong môi trường kiềm. Dùng nước kiềm để rửa dịch
chiết Rutin, acid hóa dịch chiết để Rutin tủa, lọc lấy tủa thu được Rutin.
Có thể chiết bằng kiềm nóng hay kiềm nguội với các loại kiềm khác nhau và
nồng độ khác nhau.

1.2.6.2. Phương pháp chiết bằng cồn
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào độ tan khác nhau của Rutin trong
cồn sôi và cồn lạnh. Người ta dùng cồn sôi để chiết Rutin, dịch chiết đem cô đặc
sau đó để nguội Rutin sẽ kết tủa, lọc lấy tủa thu được Rutin.
1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học của vị thuốc
Nhiệt độ có thể làm thay đổi thành phần hóa học của vị thuốc, có thể làm
tăng lên hay giảm xuống, có thể tạo điều kiện để biến đổi chất này thành chất
khác
❖ Sự biến đỗi về hàm lượng
- Ở mức nhiệt độ < 100°C: 1 số thành phần hóa học không có tính chất
thăng hoa, bay hơi thì ít bị biến đổi cả về lượng và chất. Những kết quả nghiên
cứu gần đây [10], [16], [23] chứng minh rõ hàm lượng các chất trong vị thuốc
thay đổi rất ít so với mẫu sống và được biểu thị trong bảng 1.1.
- 11 -
Bảng 1.1: Hàm lượng hoạt chất chính trong các MNC ở nhiệt độ
từ 80°C-100°C
Dược
liệu
Hoạt chât
chính
Hàm lượng chất trong MNC (%)
Sống
80°c
100°c
1 0 ' 2 0 ’
30'
1 0 ' 2 0 ' 30'
Hòe
hoa
Rutin

27,73 28,12
29,43
Quercetin 0 , 8 6
0,81 0,83
Hoàng
bá
Berberin
2,95
2,77
2,97 3,16
Palmatin
2,51
2,54
2,53 2,82
- Ở mức nhiệt độ 120°c - 160°C: Hàm lượng các chất thay đổi đáng kể so
với mẫu sống [2 ], [2 1 ], [28].
-12-
Bảng 1.2: Hàm lượng các chất trong các MNC ở nhiệt độ
từ 120 <€ -160 °c
Dược
liệu
Hoạt chât
chính
Hàm lượng các chất trong MNC (%)
Sống
120°c
140°c
160°c
1 0 ' 2 0 '
30' 1 0 ' 2 0 '

30' 1 0 ' 2 0 ' 30'
Hoàng
bá
Berberin
2,95 3,12
3,29 3,52 3,99 4,02 4,04
Palmatin
2,51 2 , 8
2 , 8 8 3,01
3,33
3,38
3,47
Đại
hoàng
Anthranoid
2,25
1,71
Thảo
quyết
minh
Anthranoid 0,20
0,19 0,17
- Ở mức nhiệt độ 170°c - 240°C: Hàm lượng các chất trong vị thuốc có sự
biến đổi lớn, một số chất bị phân hủy và đồng thời có một số chất mới được tạo
ra:
+ Hàm lượng Berberin, Palmatin trong Hoàng bá giảm khoảng 67 - 70%
so với mẫu sống [1 0 ].
+ Hàm lượng tanin trong Ngũ bội tử giảm 30 - 50% so với mẫu sống [14].
♦> Sự biến đổi về thành phần hóa học:
- Ở mức < 160°C: TPHH hầu như không thay đổi.

+ Trên SKĐ SKLM tannin ừong Ngũ bội tử cho thấy: Mầu sống và mẫu sấy
ở nhiệt độ 80°c đều cho vết có Rf tương đương [14].
-13-
+ Trên SKĐ SKLM Anthranoid toàn phần trong Thảo quyết minh: Mầu sấy
ở 150°c (20', 30'), 160°c (10', 20') cho 4 vết có màu sắc và Rf tương đương mẫu
sống [15].
- Ở mức nhiệt độ 180°C: TPHH của vị thuốc đã có sự thay đổi đáng kể.
Điều này đã được chứng minh trong các công trình nghiên cứu gần đây:
+ Trên SKĐ SKLM Alcaloid trong Hoàng liên khi sấy trên 180°c thấy có
vết cũ mất đi, xuất hiện thêm vết mới [18], [19].
+ Trên SKĐ SKLM Anthranoid trong Thảo quyết minh khi sấy ở nhiệt độ
220°C/20', 30' xuất hiện thêm 2 vết mới và 1 vết bị mất đi so với mẫu sống [15].
- 14-
Phần 2: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Hòe hoa được mua từ công ty Dược liệu TW1.
Xác định độ ẩm Hòe hoa đạt tiêu chuẩn DĐ Việt Nam III (Hàm ẩm Hoè hoa
< 12%) [9].
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1. Dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Merck-Hitachi, detecter UY, được nối
với máy tính IBM, máy in Laser.
- Máy siêu âm ELMASONIC SI00.
- Máy ly tâm HETTICH-UNIVERSAL 32.
- Tủ sấy MEMMERT UL 40.
- Cân phân tích METTLER TOLEDO AB204.
- Bình hút chân không.
- Máy lọc hút chân không.
- Bộ chày cối sứ.

- Các dụng cụ cần thiết: Bình định mức chính xác 10ml, 20ml, 100ml;
ống đong, pipet chính xác
2.1.2.2. Hỏa chất
- Methanol tiêu chuẩn phân tích, methanol dùng cho sắc ký lỏng (HPLC).
- Rutin chuẩn 90,83% do Viện Kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp.
- Acetonitril, tetrahydrofuran dùng cho sắc ký lỏng của hãng Merck
- Các hóa chất tiêu chuẩn phân tích: HC1 đặc, H3PO4 đặc, NaH2P0 4 , bột
Mg
- 15-
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp định tính Rutin
Dựa vào phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng lml dịch chiết rutin thêm ít bột
Mg và vài giọt dung dịch HC1 đặc -> lắc đều, sau vài phút xuất hiện màu hồng
tím đỏ [4].
2.2.2. Khảo sát phương pháp chiết rutin từ Hòe hoa
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu của L. Paniwnyk, E. Beaufoy, J. p. Lorimer,
T. J. Mason về phương pháp chiết xuất Rutin từ Hòe hoa, chúng tôi tiến hành
khảo sát 2 phương pháp:
- Phương pháp chiết bằng dụng cụ Soxhlet [1], [5], [9]
Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào khả năng tan tốt trong methanol của
Rutin và chiết liên tục bằng dung môi mới.
Cân chính xác khoảng 0,5g bột dược liệu đã được nghiền mịn và rây qua rây
0,4 mm, cho vào bình Soxhlet. Cho chloroform (CHC13) vào bộ chiết Soxhlet.
Đun cách thủy đến khi hết màu vàng. Để cho túi dược liệu bay hơi hết CHCI3.
Cho methanol vào bộ chiết Soxhlet, chiết đến khi dịch chiết hết màu vàng và có
phản ứng Cyanidin âm tính (-). Chuyển dịch chiết vào bình định mức 100ml,
tráng bình cầu bằng methanol, gộp vào bình định mức trên và bổ sung methanol
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc, thu được dung dịch A là dịch chiết
Rutin trong methanol.
Sơ đồ quy trình chiết xuất ghi ở hình 2.1,

- 16 -
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất Flavonoid trong Hòe hoa
bằng dụng cụ Soxhlet.
- Phương pháp chiết bằng lắc siêu âm:
Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào tác động của sóng siêu âm đến quá trình
chiết. Sóng siêu âm làm phá vỡ các mô liên kết và cấu trúc thực vật giúp cho
dung môi thấm sâu vào các tế bào, làm tăng diện tích tiếp xúc giữa chất tan và
dung môi. Dưới tác dụng của sóng siêu âm, 1 lượng lớn các bọt khí được tạo
thành và chuyển động mạnh làm tăng khả năng khuếch tán chất tan trong dung
môi. Quá trình chuyển động đó còn làm tăng nhiệt độ của hỗn hợp, do đó tăng
hiệu suất chiết [3], [2 2 ], [25], [26], [30].
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,5g MNC đã được nghiền mịn và rây
qua rây 0,4 mm, cho vào lọ thủy tinh có nắp kín. Thêm khoảng
-17-
lắc siêu âm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc bằng tay. Hỗn hợp
dịch chiết và bột dược liệu đem ly tâm trong 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút.
Hút lấy lớp dịch chiết phía trên. Tiếp tục chiết như trên thêm 4 lần nữa. Gộp các
dịch chiết vào bình định mức 100ml. Bổ sung methanol vừa đủ đến vạch, lắc
đều.
Qui trình chiết được thể hiện ở hình 2.2
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình chiết xuất Rutin từ Hòe hoa
bằng lắc siêu âm
- 18-
2.2.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký
> Khảo sát hệ dung môi.
> Lựa chọn cột sắc ký.
> Thẩm định phương pháp sắc ký: đánh giá dựa vào các chỉ tiêu sau:
+ Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ Rutin.
+ Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
+ Khảo sát độ đúng của phương pháp

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn chương trình sắc ký với các điều kiện
sau để định lượng Rutin trong các MNC:
❖ Cột Inertsil-ODS-3 (5ịim; 250x4,6 mm).
❖ Detector
uv, bước sóng phát hiện 254 nm
❖ Pha động: MeOH - Tetrahydrofuran - NaH2PC>4 0,05M (pH=3)
(10:20:70)
❖ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
❖ Thể tích tiêm: 20|il
❖ Nhiệt độ cột: 40°c
2.2.4. Định lượng Rutin trong các MNC.
2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 50mg Rutin chuẩn vào bình định mức 100ml, hòa tan
trong methanol và bổ sung vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 3,0ml vào
bình định mức 20ml, bổ sung vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc
0,45 |im được dung dịch tiêm sắc ký.
2.2.42. Chuẩn bị MNC:
- 19-
Chuẩn bị mẫu dược liệu Hòe hoa và mẫu Hòe hoa sấy ở các mức nhiệt độ
khác nhau (từ 100°c đến 140°C) ừong khoảng thời gian 10', 15', 20' và 30'.
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
Cân chính xác khoảng 0,5g bột dược liệu. Chiết suất theo qui ừình như sơ
đồ ở hình 2.2. Dịch chiết thu được pha loãng 20 lần với methanol, lọc qua màng
lọc 0,45|0 .m được dung dịch tiêm sắc ký.
Tiến hành: Tiêm lần lượt 20}J,1 các dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn vào
máy sắc ký lỏng theo các điều kiện sắc ký nêu trên. Ghi sắc đồ và tính diện tích
píc của Rutin. Từ đó tính được hàm lượng Rutin trong các MNC.
2.2.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
2.2.5.1. Đánh giá hiệu suất chiết:
Để đánh giá hiệu quả chiết chúng tôi dựa vào phản ứng Cyanidin.

2.2.5.2. Đánh giá kết quả thực nghiệm:
Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất phân tích tỷ lệ với diện tích píc của
nó trên sắc đồ. So sánh diện tích pic của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu
chuẩn từ đó tính ra hàm lượng của nó trong mẫu cần định lượng.
Hàm lượng % (kl/kl) Rutin trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
At và As
mT và ms
p
w
là diện tích píc của Rutin trong mẫu thử và mẫu chuẩn
là lượng cân của mẫu thử và Rutin chuẩn (g)
là hàm lượng % (kl/kl) Rutin trong mẫu chuẩn
là độ ẩm của mẫu thử (%)
-20-
— 1 n
- Giá trị trung bình: X = — X
n i=1
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng thống kê với các đặc trưng sau
- Độ lệch chuẩn:
s =
í
ị ( x , - * ĩ
i=l
__________
n - 1
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): Sx
- Sai số chuẩn:
- = =xlOO
X
s

Vn