Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29

p
BỘ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
CHỬ VÃN MẾN
NGHIÊN CỨU SINH TổNG HỢP k h á n g
SINH TỪ STREPTOMYCES 35.29
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dẫn
Noi thực hiện
Thời gian thực hiện
PGS.TS. CAO VĂN THU
B ộ MÔN VI SINH - SINH HỌC
2-5/2006
HÀ NỘI, 5/2006
LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân
thành tới Giảng viên, Phó giáo sư, TS. Cao Văn Thu, người đã trực tiếp hướng dẫn,
tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới các thầy cô ban giám hiệu nhà
trường, các thầy cô, cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Vi sinh-Sinh học, bộ môn
Công nghiệp dược, bộ môn Hoá dược, Phòng thí nghiệm trung tâm, cùng các phòng
ban đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tối trong quá trình thực nghiệm.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã giúp đỡ và dộng viên tôi
trong thời gian qua.
Do trình độ bản thân và Ihời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những
khiếm khuyết. Rất mong được sự chỉ bảo của các thầy cô và sự đóng góp ý kiến của
bạn bè.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày ỉ 9 tháng 5 nãm 2006.
Sính viên
Chủ Văn Mến

MỤC LỤC
Đặt vấn để 1
Phầnl: Tổng quan 2
1.1. Kháng sinh 2
1.1.1. Lịch sử 2
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
2
1.1.3. Phân loại kháng sinh 2
1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 3
1.2. Đại cưcmg về Strepiomyces
3
1.2.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces
3
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptoiĩiyces

4
1.2.3. Phân loại Streptomyces 5
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 6
1.3. Cải tạo giống vi sinh vật 6
1.3.1. Mục đích 6
1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống
7
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
8
1.4.1, Lên men bề mặt 8
1.4.2. Lên men chìm 8
1.5. Chiết tách - Tinh chế 10
1.5.1, Chiết xuất u
1.5.2. Tách sản phẩm 11
1.6. Một số thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh

12
1.6.1. Komodoquinon A, một anthracyclin móíi từ Streptomyces sp.KS^

12
1.6.2. Các Pyrrolomycin mới tù môi trường nuôi cấy Streptomyces íumanus

12
1.6.3. Các Anthrabenzoxocinon-Chất gắn thụ thể X ở gan-Chất kháng khuẩn

13
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 15
2.1. Nguyên liệu và phưcmg pháp thực nghiệm
15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Phưcmg pháp nghiên cứu
18
2.2. Kếi quả thực nghiệm và nhận xét 26
2.2.1. Kết quả phân loại theo ISP 26
2.2.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 35.29 trên môi
trường phân lập(MT2) 27
2.2.3. Kết quả lựa chọn mồi trường nuôi cấy thích liợp
27
2.2.4. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 29
2.2.5. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1 30
2.2.6. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 2 31
2.2.7. Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của kháng sinh
33
2.2.8. Đánh giá ảnh hưởng của pH dến dộ bền vững của kháng sinh trong dịch lên
men 34
2.2.9. Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi khác nhau 34

2.2.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng 35
2.2.1 ỉ. Kết quả sắc ký cột 36
2.2.12, Kết quả đo phổ hồng ngoại 37
Phẩn 3: Kết luận và đề xuất 38
3.1. Kết luận 38
3.2. Đề xuất 39
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
ADN
AIDS
ATCC
B
B. cereus
B. pumilus
B. subtilis
CWI
D
dmhc
E. coli
Gn
Gy
Ha
HIV
HPLC
IR
ISP
L. DAP
MT
MTdd
N
nm

P. aeruginosa
P. mirabilis
RA
R
RF
S
s
S. aureus
S. flexneri
S. lutea
Acid deoxyribonucleic
Acquired Immunodeficiency Syndrome
American Type Culture Collection
Blue (Xanh da trời)
Bacillus cereus ATCC 9964
Bacillus pumilus ATCC 1024]
Bacillus subtilis
Cell wall I
Đưòng kính vòng vô khuẩn trung bình
Dung mối hữu cơ
Escherichia coli ATCC 25922
Green (Xanh lá cây)
Grey (Xám )
Hair (Tóc)
Human Immunodeficiency Virus
High performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
Infrared (Hồng ngoại)
International Streptomyces Project
L. Diaminopimelic

Mồi trường
Môi trường dung dịch
Pha nước
nanomet
Pseudomonas aeruginosa Vm 201
Proteus mirabilis BV 108
Retinaculiaperti (Móc câu, xoắn đofn)
Red (Đỏ)
Rectiflexibiles (Thẳng, uốn cong)
Spỉrales ( Xoắn)
Sai số chuẩn có hiệu chỉnh
Staphylococcus aureus ATCC 1228
Shigella flexneri DT 112
Sarcina lutea
Sm
Smooth( Nhãn)
sp
Spiny( Gai)
STT
SỐ thứ tự
S. typhi Salmonella typhi DT 220
V Violet (Tim)
V Volumn(Thể tích)
v sv Vi sinh vật
Wa
Warty (Sần sùi)
w White (Trắng)
Y
Yellow (Vàng)
ĐẶT VẤN ĐỂ

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều chất kháng sinh được
tạo thành bằng con đường tổng hợp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất
kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn luôn được thế giới quan tâm. Hàng
năm, vẫn có nhiều kháng sinh mới được phát hiện.
Trong tổng số hơn 10.000 chất kháng sinh đã được phát hiện và còng bố, có
tới 66% là do xạ khuẩn sinh ra. Các còng trình nghiên cứu đã chứng minh
Streptomyces là chi xạ khuẩn lớn, gổm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn, một số loài trong chi này
còn có khả năng sinh tổng hợp các chất chữa ung thư, điều trị HIV/AIDS.
Bộ môn Vi sinh-Sinh học trong thời gian qua đã tiến hành phân lập và nghiên
cứu một số chủng Streptomyces có trong đất, bùn ở Việt Nam. Những nghiên cứu
ban đầu cho thấy Streptomyces 35.29 là chủng xạ khuẩn có đặc tính di truyền ổn
định, khả nãng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, có nhiều tiềm năng để tiến hành
các nghiên cứu tiếp theo.
Do đó chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ
Streptomỵces 35.29" với các mục tiêu:
- Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 35.29
bằng đột biến cải tạo giống kếl hợp với sàng lọc ngẫu nhiên.
- Bước đầu lựa chọn mói trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy.
- Nghiên cứu sơ bộ về tách chiết và tinh chế.
- Nghiên cứu các đạc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác định tên
khoa học của chủng Streptomyces 35.29 theo khoá phân loại ISP.
PHẤN 1
TỔNG QUAN
l.L Kháng sinh(2), (3), (6), (7), (9).
1.1.1. Lịch sử.
Tác dụng kháng sinh đầu tiên của penicilin do Alexander Fleming: nhà khoa
học người Anh phát hiộn T'd năm 1928. Năm 1941, penicilin được lên men trên quy
mô công nghiệp để phục vụ điều trị thương binh. Năm 1944, Streptomycin được phát
minh, tiếp đó, nhiều kháng sinh khác lần lượt được phát minh và nhanh chóng đưa

vào sử dụng điều tộ trong y học.
Kháng sinh không chỉ được sử dụng trong y học, nó còn được sử dụng trong
nông nghiệp, trong chăn nuôi và trong công nghiệp thực phẩm.
Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã dẫn tới hiện tượng kháng thuốc.
Những kháng sinh được coi là “thần dược” của những nãm 70 của thế kỷ XX đã
không còn hiệu quả điều trị như trước nữa. Chính vì vậy, đi kèm với việc sử dụng
hợp lý kháng sinh thi việc tìm ra kháng sinh mới để bổ xung phổ tác dụng là việc
cần thiết.
1.1.2. Định nghĩa(2).
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các
nguổn tự nhiên khác, có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt
một cách chọn lọc nên một nhóm vi sinh vật xác định ( vi khuẩn, vi nấm, nguyên
sinh động vật ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp,
1.1.3. Phân loại kháng sinh(2), (3), (10).
Kháng sinh được phân loại theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng, theo cấu
trúc hoá học. Trong đó, phân loại theo cấu trúc hoá học được xem là phân loại khoa
học nhất.
Theo cấu trúc hoá học, kháng sinh được phân loại thành các nhóm:
* Nhóm ß-lactam: penicilin, cephalosporin
* Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin
Nhóm amphenicol: choramphenicol, thiamphenicol
* Nhóm tetracyclin: tetracyclin, Oxytetracyclin
* Nhóm macrolid: erythromycin, spiramycin
* Nhóm rifamicin: rifampicin
* Nhóm quinolon: ciprofloxacin, oflofloxacin.,.
Trong đó nhóm p-lactam là nhóm kháng sinh quan trọng nhất.
1.1.4. Sơ đồ lên men sản xuất kháng sinh.
Giống truyền ủ trong PTN
1
r

Nhân giống cấp 1,11, III
Lên men tạo kháng sinh
Dịch lé:n men
Sinh khối
Bã
Giải phóng
vật chất
Lọc
lọc
Dịch lọc
Chiết bằng dung mỏi
Chiết bằng trao đổi ion
Chiết bằng kết tủa
Dịch chiết
Chiết bằng dung mòi
Chiết bằng trao đổi ion
Qiiết bằng kết tủa
Dịch chiết
Tinh chế
Sản phẩm kết tinh
Kiểm nghiệm,đóng gói
Sản phẩm
Hình 1: Giới thiệu sư đổ tổng quát sản xuất kháng sinh
(PTN: Phòng thí nghiệm)
1.2. Đại cưưng về Streptomyces(S), (10), (11).
1.2.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces.
Streptomyces là một chi thuộc lớp phụ Actinomycetales, phân bố rộng rãi
■ '
.

^
trong tự nhiên như: đất, bùn ao, nước và các chất thải hữu cơ. Phần lớn xạ khuẩn là
các tế bào Gram(+), hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phán nhánh (khuẩn ty).
Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên một triệu xạ khuẩn, số lượng xạ khuẩn
trong một gam đất ở các mẫu đất khác nhau là khác nhau, phụ thuộc vào độ ẩm,
nhiệt độ, pH, dinh dưỡng
Một số đặc điểm của xạ khuẩn:
- Đường kính khuẩn ty xấp xỉ khoảng từ 0,2-1,0 đến 2-3 |am.
- Mầu sắc khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, đỏ, lục, tím, nâu đen
- Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10,0 nm, không có cellulose, kitin.
- Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính.
- Nhuộm màu Gram (+).
Phân loại: ĩởp xạ khuẩn Actinomycetes bao gồm bộ Actinomycetales và các
vi sinh vật giống thế. Bộ Actinomycetales gồm các họ Actinoplanaceae,
Actinomycetaceae, Streptomycetaceae, Nocardiaceae, Micromonosporaceae
1.2.2. Đặc diêm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptomyces.
- Khuán lac:
+ Bề mặt: thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình
phóng xạ, vì vậy mới có tên xạ khuẩn.
+ Khuẩn lạc có chân vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
- Khuẩn ty cơ chất:
+ Mọc sâu trong môi trưcmg nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình
phát triển.
+ Bề mặt nhẵn hoặc sần sùi.
+ Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hoà tan
trong nước, có sắc tố chỉ hoà tan trong dung môi hữu cơ.
- Khuẩn ty khí sinh:
+ Khuẩn ty cơ chất phát triển một thòi gian thì dài ra trong không khí thành
những khuẩn ty khí sinh.

+ Có đường kính từ 1-1,4 micromet.
- Chuỗi bào tử:
+ Được hình thành từ khuẩn tỵ khí sinh, có nhiều hình dạng khác nhau:
thẳng, uốn cong hoặc xoắn lò xo.
- Bào tử:
^ + Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn là bào tử trần. f
+ Được hình thành trên các nhánh phân hoá của khuẩn ty khí sinh, tạo thành
chuỗi bào tử.
+ Trên mỗi nhánh có từ 10-100 bào tử, bào tử có thể là hình cầu, elíp, hoặc
hình trụ hai đầu tròn, đường kính của bào tử thưòíng tưcíng ứng với đường kính của
khuẩn ty, nếu bào tử hình cầu kích thước từ 0,3-0,8 micromet, còn bào tử htnh trụ
kích thước là 0,7; 0,8; 1 micromet.
+ Bề mặt của bào tử có thể có các kiểu trcm, nhẵn hoặc xù xì hoặc có gai hoặc
có tóc.
- Streptomyces là vi sinh vật có thành tế bào kiểu CWI, có chứa L.DAP và glycin. Ạ ' ,
- Streptomyces có thể phát triển ở nhiệt độ 20-40°c, nhưng nhiệt độ thích hợp là
30°c và pH thích hợp là 6,8-7,5.
- Khả năng tao sác tỏ' của Streptomyces:
+ Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chìa thành bốn loại: sắc tố hoà tan,
sắc tố khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố khuẩn lạc. Ị Ị ^
1.2.3. Phân loại Streptomyces.
Có nhiều khoá phân loại Streptomỵces khác nhau: khoá phân loại của
Krasillnikov, Waksman, Gauze, Shirling và Gottlieb. Hội nghị “Vi sinh vật thế giới
lần X” (được tổ chức tại Mêhicô vào năm 1970) chọn khoá phân loại của
E.B.Shirling và D.Gottlieb làm khoá phân loại chính để phân loại chi Streptomyces
và đặt tên là International Streptomyces Project, (ISP).
* Khoá phân loại này dựa vào các đặc điểm:
+ Đặc điểm hình thái học củíi xạ khuẩn:
- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh,
- Hình đạng chuỗi bào tử.

- Bề mặt bào tử.
+ Đặc điểm sinh lý:
- Khả năng tạo sắc tố hoà tan.
- Khả năng tạo sắc tố melanoid.
- Khả nàng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn.
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyce(3),(7), (9), (10).
Một số lượng lớn các kháng sinh do một số loài Streptomyces sinh tổng hợp
được nghiên cứu và sử dụng thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác nhau:
aminoglycosid, macrolid, tetracyclin, phenicol
Nhóm kháng sinh
Kháng sinh
Chủng Streptomyces
sinh tổng hợp
l.Nhóm aminoglycosid
Streptomycin
kanamycin
tobramycin
neomycin
spectomycin
S. griseus.
S. kanainyceticus.
S. tenebrius.
S. fradiae.
S. spectabilis.
2. Nhóm tetracyclin
tetracyclin
Oxytetracyclin
clotetracycỉin
S. aureofaciens.
S. rimosus.

S. aureofaciens.
3. Nhóm phenicol cloramphenicol
S. venezuelae.
4. Nhóm macrolid
erythromycin
oleandomycin
spiramycin
S. erythreus.
S. antibìoticus.
S. ambiofaciens.
5. Nhóm lincosamid
lincomycin
S. lincolnensis.
6. Kháng sinh chống nấm
nystatin
amphotercin B
candicidin
pyramycin
S. noursei.
S. nodosus.
S. griseus.
S. natalensis.
7. Kháng sinh khác
paromomycin S. rimosus.
1.3. Cải tạo gỉống vi sinh vật(l), (2),(6),(10).
1.3.1. Mục đích(2). ^
Vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có ‘
hoạt tính thấp. Vì vậy, để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất, đòi
hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các biện pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện
nuôi cấy thích hợp.

1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống.
1. Tuyển chọn ngẫu nhién(2),(6),(10).
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 1,1 - 1,2 lần những cá thể
khác. Cần phải chọn lấy những cá thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp.
2. Đột biến nhân tạo(l),(2),(6),(10).
+ Cho tác dụng của các tác nhân gây đột biến mạnh như tia uv, X, hay những
hoá chất: N-mustard, elhylenimin, dimetylsulphat, HNO2, hay tác nhân sinh học
Các tác nhân trên với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết các vi sinh vật.
Những cá thể sống sót sẽ có sự biến đổi ờ nhiễm sắc thể, làm thay đổi các tính trạng,
dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm tính), hoặc là làm tăng
hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên (đột biến dưcíng tính).
+ Ánh sáng ư v có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế báo vi sinh vật
có kích thước nhỏ (0,3-3 micromet) thi nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy được
dùng phổ biến trong cải tạo giống.
+ Cơ chế gây đột biến của ánh sáng u V: ánh sáng u V có tác dụng ữên ADN và
mạnh nhất ở bước sóng 254 nm, kết quả là gây dime hoá thymin (do làm đứt các
liên kết hydro trong mạch kép ADN của tế bào vi sinh vật), ở đây thymin gần nhau
được liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C4 và C5. Hậu quả là sao chép bị sai
lầm vì ADN polymerase dễ lắp một nucleotid không chính xác vào vị trí trên. Do tác
dụng của ánh sáng u v , trên sợi ADN cũng xuất hiện một dime pyrimỉdin khác gọi
là quang sản phẩm 6-4. ở đây C6 của pyrimidin 5’ (thymin hoặc cytozin) được liên
kết với C4 của pyrỉmidin 3’ (thường là cytozin) các sản phẩm này là nguyên nhân
chủ yếu của đột biến gây nên bcfi ánh sáng uv.
+ Các yếu tố ảnh hưởng ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và tần số phát sinh
đột biến:
- Liéu lương chiếu: được đặc trưng bởi 3 yếu tố: thời gian chiếu, khoảng cách
chiếu, độ pha loãng bào tử. Liều lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lóm
và cuối cùng đạt đến một giới hạn nhất định.
- Ảnh sáng: sau khi chiếu ánh sáng ụ v lên tế bào, nếu để ở ngoài ánh sáng

thường thì xảy ra hiện tượng quang phục hoạt làm quá trình đột biến không có ý
7
nghĩa. Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, thành phần môi trường nuôi cấy, trạng thái
sinh lý của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng u v ,
- Hiẽu Quả dốt biến: hiệu quả đột biến là tỷ số giữa số tế bào đột biến chia
cho tổng số tế bào sống sót sau đột biến. Người ta thường áp dụng đột biến gây chết
từ 75-90%, tuy nhiên trong cồng nghiệp người ta có thể đột biến gây chết tới 99%.
1A Lên men sinh tổng hợp kháng sinh (2),(6),(7),(9).
Có hai kiểu lên men chính hay sử dụng là: lên men bề mặt và lên men chìm.
1.4.1. Lên men bề mặt.
+ Vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn (cám, bột ngô )t hay
lỏng (dung dịch đường phối hợp với một số nguyên tố vi lượng), vi sinh vật hấp thu
các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt
môi trường. Vì vậy, yêu cầu lên men bề mặt là: bề mặt môi trường phải đủ rộng và
lớp môi trường không quá sâu (5-10 cm).
+ ưu điểm: đcm giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp.
+ Nhược điểm: cần có mặt bằng lớn, hiệu suất trường thấp, khó tự động và cơ
giới hoá, chi phí nhân công cho một đcfn vị sản phẩm cao.
Do đó, ngày nay, phương pháp này không còn ứng dụng trong công nghiệp sản
xuất kháng sinh, mà chỉ áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí
nghiệm.
1.4.2. Lên men chìm.
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trưcmg lỏng và phát triển trong toàn bộ
môi trường.
Sơ đổ tổng quát quá trình lên men:
+ Giống vi sinh vật dùng trong lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở
giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đổng hoá vật chất cao nhất. Vì vậy, trước
khi lên men phải có giai đoạn nhân giống (giống cấp I, II, III):
- Giống cấp I: nuôi cấy trong bình nón 500 ml trên máy lắc.
- Giống cấp II: nuối cấy trong bình 50 1.

- Giống cấp III: nuôi cấy trong bình từ 1-5 m^.
- Tỉ lệ giống trong môi trường lên men từ 1-10%. Quy mô giống phụ thuộc
vào quy mô của bình lên men.
+ Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi
trường: thay đổi pH, nồng độ của các thành phần trong môi trường, các sản phẩm
trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. E>ể đảm bảo những điều kiện tối ưu
cho sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men, người ta đã đưa vào một sô'
biện pháp: dùng hệ đệm để ổn định pH, thêm chất phá bọt, bổ xung dinh dưỡng
+ ưu điểm: hiệu suất sinh kháng sinh cao, môi trường dinh dưỡng được sử
dụng triệt để, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hoá, tự động hoá, chi phí cho
một đcfn vị sản phẩm thấp, có thể khai thác trên quy mô lớn. Do đó, phưong pháp
này được lựa chọn cho công nghiệp sản xuất kháng sinh.
+ Nhược điểm: yêu cầu phải có thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực,
điều kiện vô trùng tuyệt đối ), do đó, chi phí đầu tư lớn.
Phân loại:
- Lên men gián đoan: quá trình lên men gián đoạn được xem như là một hệ
thống kín. Trong suốt thời gian lên men, không có tác động hay bổ xung gì vào môi
trường lên men, ngoại trừ việc cung cấp oxy, chất phá bọt, hệ đệm ổn định pH.
- Trong lên men gián đoạn, vi sinh vật phát triển qua bốn pha: pha tiềm phát,
pha luỹ thừa, pha dừng và pha suy tàn.
Hìnhl: Đường cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của
vi sinh vật trong môi trường lỏng.
V ới: x: sinh khối khó vi sinh vật trong dịch lên men,
t: thời gian lên men.
+ Trong còng nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh
tổng hợp hoạt chất dừng ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật, hoặc khi
việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại
hiệu quả kinh tế.
- Lên men có bổ xung: nồng độ cao của một số chất (glucose, các hợp chất
nitơ, ) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trong quá trình trao đổi

chất. Vì vậy, trong phương pháp lên men có bổ xung, khi bắt đầu lên men, các thành
phần đó được đưa vào với nồng độ thấp và được bổ xung vào hệ thống trong quá
trình lên men.
1.5. Chiết tách-Tinh chế(2),(4),(6),(7),(9).
+ Kháng sinh tà sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, kết thúc quá trình lên men,
kháng sinh có thể nằm trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin ), hoặc trong
dịch lọc (ví dụ: penicilin, streptomycin, ) tuỳ theo đặc điểm của loài. Vì vậy, khi
chiết tách để lấy kháng sinh phải lựa chọn phưcíng pháp thích hợp. Việc lựa chọn
phương pháp phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh.
+ Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ,
- Phương pháp kết tủa,
- Dùng nhựa trao đổi ion.
Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được một
sản phẩm kliáng sinh với độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh
thường áp dụng một số phương pháp tách chiết và tinh chế như: lọc, chiết, hấp phụ
và sắc khí.
1.5.1. Chiết xuất.
+ Đinh nghĩa: chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hơp), không
đồng tan với hỗn hợp cán chiết, để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp
cần nghiên cứu.
+ Neu yên tác: dựa trên sự phân bố của chất tan vào hai pha không đồng tan với
nhau. Đó là pha dung môi chiết và dịch lọc dịch lên men hay sinh khối để tách riêng
chất kháng sinh (có thể là một chất hay một nhóm chất).
+ Phân loai:
- Chiết đơn,
- Chiết lặp,
- Chiết ngược dòng.
1.5.2. Tách sản phẩm.
+ Đinh nghĩa: là một nhóm các phưoíng pháp hoá học, vật lý và hoá lý nhằm đi từ

một hỗn hợp phức tạp đến một hỗn hợp đofn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng
từng chất.
+ Các phương pháp tách hỗn hơp đồng nhất hay đươc dùng:
- Phưcíng pháp chia cắt pha: là phưcíng pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất (một
pha), tách thành hỗn họfp không đồng nhất (hai pha).
- Phương pháp chuyển pha: trong nhóm này có các phương pháp: chiết, thẩm
thấu, các phương pháp sắc ký.
+ Sác kv:
- Sắc ký là phưcíng pháp tách và phân tích dựa vào sự phân bố của hoạt chất
giữa hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: pha động và pha tĩnh.
- Theo bản chất có thể chiíi sắc ký thành bốn loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký
phân bố, sắc ký trao đổi ion và sắc ký trên gel.
- Khi chiết tách và tinh chế sản phẩm ngưM ta dùng kết hợp cả hai phưcíng
pháp: phưcíng pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha.
1.6, Một sô thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh (13), (14), (15).
1.6.1. Komodoquinon A, một anthracyclin mới từ Streptomyces sp.KSa-
Một anthracyclin mới-komodoquinon A và phần aglycon komodoquinon B,
được phân lập từ môi trường lên men chủng Streptơmỵces sp.KS^. Komodoquinon A
là một anthracyclin duy nhất mà một đường amin được gắn với vòng D của khung
anthracyclin, được thấy có tác dụng cảm ứng biệt hoá tế bào thần kinh Neuro 2A.
Chủng Sĩreptomyces SP.KS3 được nuôi cấy tĩnh trong binh nón 500ml ở 30”C, trong
2 tuần, sử dụng môi trường tạo sản phẩm ( 25g bột gạo, 50ml nước biển nhân tạo có
chứa glucose 0,5% và cao nấm men 2%).
Dịch nuôi cấy dược chiết với aceton(31) và hỗn hợp dung môiíCHCl^-MeOH-
aceton 1:2:4 31). Dung môi hữu cơ được bay hơi dưới áp suất giảm, thu được cắn,
tiếp tục phân tách trong hỗn hợp ethylacetat-nước. Lớp nước được xử lý với DIAION
HP 20 và khuấy nhẹ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi lọc, nhựa thu hổi được
rửa với nước và phản hấp phụ bằng MeOH. Dịch rửa MeOH được bay hơi dưới áp
suất giảm được dịch chiết methanol, lớp ethylacetat bốc hơi duới áp suất giảm được
dịch chiết ethylacetat.

Dịch chiết MeOH được phân tách bằng sắc ký cột SiOsC CHClrMeOH-nước)
được 3 phần (A-C). Phần B có hoạt tính được phân tách với HPLC pha đảo (
Cosmosil 5Ph, 10x250 mm, Me0 H-H20-CHCl3, 7:3:0,5), thu được komodoquinon
A(20mg) là chất có hoạt tính, màu đỏ.
Dịch chiết ethylacetat được phân tách bằng sắc ký cột Si02( n-hexan-
ethylacetat) để được 3 phần (EA-EC). Phần EB( 320 mg) được rửa với MeOH được
hoạt chất màu đỏ không tan: komodoquinon B( 110 mg).
1.6.2.Các pyrrolomycin mói từ dịch nuôi cấy Streptomyces fumanus.
Cùng với dioxapỵrrolomycin, 4 kháng sinh pyưolomycin mới có tên là:
pyiTolomycin G, pyưolomycin H, pyưolomycin I và pyrrolomycin J được sản xuất
từ môi trường nuôi cấy Streptomyces fumamis.
Nhân giống cấp 1: chủng được cấy vào môi trường ( 7 ml) có chứa glucose
1%, tinh bột 2%, cao nấm men 0,5%, N-Z amin typ A 0,5%, và CaC03 0,l%. Sau
khi nuôi cấy 3 ngày ở 28"C, 200 vòng/phút, giống cấp 1 được sử dụng để cấy vào
50ml cùng môi trường, ủ trong 24h ở 28"C, tốc độ quay 200 vòng/phút. Giống cấp 2
được cấy vào bình lên men chứa 50ml môi trường tạo sản phẩm gồm glucose 3%,
NaNOj 0,1%, K2HPO4 0,01%, MgS04.7 H2O 0,01%, CaCOs 0,2%, KCl 0,1%,
prolin 0,1%, KF 0,08%, và 1,5% hạt nylon, ủ ở 28"C, 200 vòng/phút trong 5 ngày.
Dịch lên men thu được được ly tâm 4000 vòng/phút trong 20 phút, nhựa
polyamid cùng vói sinh khối được chiết 2 lần với aceton ( 300ml/lần). Dịch chiết
aceton được cô trong chân không, hỗn dịch nước thu được được chiết 3 lần với
ethylacetat(100ml/lần).
Cắn của dịch chiết ethylacetat được tinh chế bằng HPLC pha đảo ( cột YMC
ODS-A, 20x250 mm, 5 ụm), sử dụng gradient 40-90% acetonitril/nước có chứa
0,05% TFA trong 40 phút, tốc độ chảy 7ml/phút để được pyrrolomycin G( 20mg),
rửa rải ở phút thứ 39. Phân đoạn ở phút ứiứ 42 được tinh chế bằng HPLC trong 23
phút để được pyrrolomycin H( 14 mg) ở phút thứ 14,8- Pyrrolomycin I và J được
phân lập từ pellet đã li tâm đạt được từ 150 ml dịch lên men, sử dụng chất dinh
dưỡng methyl-L-methionin, sau khi đã chiết xuất vói aceton(2x60 ml) và
ethylacetat(3x20 ml) như đã mô tả ở trên. Bước tinh chế cuối cùng của cắn ứiô ( 87

mg) đạt được bằng HPLC pha đảo, sử dụng gradient 40-90% acetonitril/nước với
0,02% TFA quá 23 phút để đạt được pyrrolomycin I tinh khiết (7,5 mg, 19,6 phút),
và pyưolomycin J ( 0,5 mg, 22,2 phút).
1.6,3. Các Anthrabenzoxocinon- Các chất gán thụ thể X ở gan - Các chất
kháng khuẩn.
Phân tích các thành phần có hoạt tính từ Streptomỵces sp.( MA 6657) đã dẫn
tới việc phát hiện ra 2 ceton thơm vòng 6 cạnh mới: (-) anthrabenzoxocinon [(-)-
ABX (1)] và (-) - bischloroanthrabenzoxocinon[ (-) - BABX(2)]. Tất cả các chất
này cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn Gram (+) tốt.
Lên men Streptomyces sp ( MA 6657): Streptomyces sp. (MA 6657) được cấy
vào ống nghiệm 50 ml có chứa 10 ml mói trường nhân giống gồm glucose (lOg/1),
sucrose (lOg/1), glycerol (lOg/1), bacto-pepton (5g/l), cao nấm men (lOg/1), prolin
(lOg/1), bột yến mạch (5g/l) và CaCO;, (lg/1), trong nước cất ở pH 7,0. Sau ĩ ngày ở
27”C, giống dược cấy sang bình nón 250ml có chứa 50ml môi trường tạo sản phẩm
bao gồm tinh bột(20g/l), glycerol(10g/l), glucose(lOg/l), bột đậu tưcfng(10g/l),
bact0'pept0n(5g/l), cao nấm men(5g/l), CaC03(5g/l) trong nước cất ở pH 7,0, tỷ lệ
Vgiống/Vmôi trường=5%. Lên men trên máy lắc ở 27“C, trong 12 ngày, 220
vòng/phút trước khi chiết xuất với methyl ethyl ceton (MEK).
Phân lập anthrabenzoxocinon từ 1 và 2: ba lít của địch lên men MA 6657
được chiết với 2 lít của MEK, lắc trong 2h. Lc^ hữu cơ được tách ra và cô đặc dưới
áp suất giảm được 2,7g cắn. cắn được hoà tan trong lOOml MeOH và sắc ký trên cột
2L Sephadex LH 20.
Cột được rửa rải với MeOH, tốc độ chảy lOml/phút, phân đoạn 240 ml rửa rải
trong 0,85-1 thể tích cột mà đã được làm giàu với chất 1 và 2. Phần này được chạy
sắc ký 3 lần riêng biệt trên cột HPLC pha đảo (Zorbax RX C8-21x250 mm), rửa rải
với gradient CH;,CN:nước 55-90% có chứa 0,1% TPA trong 45 phút, tốc độ chảy 8
ml/phút. Đông khô phân đoạn rửa rải ở phút 20 và phút 36-43 được chất bột vô định
hình, tưcíng ứng là chất l(3mg, lmg/1), và 2 (78 mg, 26 mg/1).
PHẨN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẲ:
2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm.

2.1.1. Nguyên vật liệu.
+ Chủng xa khuán:
* Chủng xạ khuẩn Streptomyces 35.29 do phòng thí nghiêm vi sinh, bộ môn
Vi sinh-Sinh học, Trường đại học Dược Hà Nội cung cấp.
*Giống vi sinh vật kiểm định: giống vinh sinh vật kiểm định do bộ môn Vi
sinh-Sình học cung cấp:
+ Vi khuẩn Gram(-):
Escherichia coli ATCC 25922
Proteus mirabilis BV 108
Shigella flexneri DT 112
Salmonella typhi DT 220
Pseudomonas aeruginosa VM 201
+ Vi khuắn Gram(+):
Staphylococcus aureus ATCC 1128
Bacillus pumilus ATCC 10241
Bacillus subtilis ATCC 6633
Bacillus cereus ATCC 9946
Sarcina lutea ATCC 9341
+ Vi nấm:
(E. coỉi)
(P. mirabilis)
(S. flexneri)
(S. typhi)
(P. aeruginosa)
(S. aureus)
(B. pumilus)
(B. subtiỉis)
(B. cereus)
(S.lutea)
Aspergillus niger (A. niger)

Candida albicans (C albicans)
- Các môi trường sử dụng được ghi ở bảng 1:
- Thành phần của muối vi lượng trong các môi trường:
KH2PO4 l,Og; NaCl l,Og; MgS04.7H20 l,Og; nước cất vừa đủ 200 ml.
- Môi trường canh thang:
NaCl 0,5%; pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; nước vđ 100 ml.
- Môi trường thạch thường:
NaCl 0,5%; pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; thạch 1,6%; nước vđ 100 ml.
- Mỏi trường Sabouraud lỏng:
Glucose 2,0%; pepton 1,0%; nước vđ 100 ml; pH 6.0-6.5.
Bảng 1: Thành phần cá c môi trường sử dụng
Thành phần MTl
MTldd MT2
MT2dd MT3 MT3dd MT4 MT4dd MT5 MT5dd MT6 MT6dd
MT7
MT7dd
Tinh bôt 2 2 2 2
2,4
2,4
Lactose 3 3
Glucose 2 2 1 1
Cao ngô
0,5
0,5
0,5 0,5
Saccarose 3 3
2 2
Bột đậu tương 1 1
Pepton
0,3 0,3 0,3 0,3

Cao thit 03
0,3 0,5 0,5
KN03
0,1 0,1
KCl
0,05 0,05
NaN03 0,2 0,2
NH4N03 0,2 0,2 0,2 0,2
CaC03
0,3
0,3 0,4
0,4 0,2 0,2 0,4 0,4
(NH4)2S04 0,2 0,2
FeS04.7H20 0,001 0,001
KH2P04 0,05 0,05
0,1
0,1
0,1
0,1 0,05 0,05
M gS04.7H20 0,05 0,05 0,05 0,05 0,25 0,25 0,15 0,15
NaCl
0,05 0,05
0,1
0,1 0,5 0,5
Cao nấm men 0,5 0,5
Thach 1,8 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0
1,8
0
Nước 100 100 100
100

100 100 100 100
100 100
100 100
100 100
pH .
7,0-7,2 6,8-7,2 7,0-7,2 7,0-7,2 7,0-7,2 7,0-7,2
7 /
^-7,6
- Mói trường Sabouraud đặc;
Glucose 2,0%; pepton 1,0%; thạch 1,8%; nước vđ 100 ml; pH từ 6,0 - 6,5.
- Môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP 1 đến ISP 9)
+ Muối vi lượng: MnC12.4H20 0,1 g; FeS04.7H20 0,1 g; ZnS04.7H20 0,1 g;
nước cất vừa đủ 100 ml; pH 1,0-1,2.
+ ISP I: trypton 5,0 g; cao nấm men 3,0 g; nước cất 1000 ml; pH: 7,0-7,2.
+ ISP 2: cao nấm men 4,0 g; dịch chiết Malt 10,0 g; glucose 4,0 g; thạch 20,0
g; nước cất vđ 1000 ml; pH 7,3
+ ISP 3: yến mạch 20,0 g; dung dịch muối vi lượng 1.0 ml; thạch 18,0 g;
nước cất vđ 1000 ml; pH 7,2.
+ ISP 4: tinh bột 10,0 g; K2HPO4 1,0 g; MgS04.7H20 1,0 g; NaCl 1,0 g;
(NH4)2S04 2,0 g; CaCOi 2,0 g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; thạch 10,0 g; nước
cất vđ 1000 ml; pH 7.0-7A
+ ISP 5: L-asparagin 1,0 g; glycerin 10,0 g; K2ĨỈPO4 1,0 g; dung dịch muối vi
lượng 1,0 ml; thạch 20,0 g; nước cất vđ 1000 ml; pH 7,0-7,4.
+ ISP 6:
Dung dịch A; pepton 30,0 g; acid citric 0,384 g; FeS04.7ĩỈ20 0,556 g;
NH4OH 25% 0,264 g; NaiS^O^ 0,1 N 10 ml; K3HPO41,0 g; nước cất iOOO ml.
ISP6: dung dịch A 36,0 g; cao nấm men 1,0 g; thạch 15,0 g; nước cất 1000
ml; pH 7,0-7,2.
+ ISP7: glycerin 15,0 g; L-tyrosin 0,5 g; L-asparagin 1,0 g; K2HPO4 0,5 g;
MgS04.7H20 0,5 g; NaCl 0,5 g; FeS04.7H20 0,01 g; dung dịch muối vi lượng 1,0

ml; thạch 20,0 g; nước cất vđ 1000 ml; pH 7,2-7,4.
+ ISP9:
• A. Các nguồn đường khử trùng được sử dụng:
1. D-Glucose 4. I-inositol 7. RaffÌnose
2. L-arabÌnose 5. D-mannitol 8. Saccarose
3. D- Xylose 6. Rhamnose 9. D-fructose
• B. Dung dịch muối Pridham và Gottlieb:
CUSO4.5H2O 0,64 g; FeS04.7H20 0,11 g; MnCl2.4H20 079 g; ZnS04.7H2Ơ
0,15 g; nước cất 100 ml.
• c. Môi trường thạch muối khoáng:
(NH4)2S04 2,64 g; KH2PO4 2,38 g; KHPO4.3H2O 5,65 g; MgS04.7H20 1,0 g;
dung dịch muối B 1,0 ml; thạch 15 g; nước cất vđ 1000 ml; pH 6,8-7,0.
• Khử trùng môi trường c, để nguội tới 60°c, cho lần lượt các nguồn đường đã
tiệt trùng (dùng phường pháp Tyndal) vào sao cho nồng độ đường trong môi
trường là 1 %.
* Các dung môi đã sử dụng:
Dung môi
Methanol
Ethylacetat
Ethanol
Dimethylformamid
Diclomethan
Cloroform
Butylacetat
n-Butanol
Aceton
Triethyl amin
Khối lượng riêng
0,791-0,793
0,902

0,789-0,791
0,95
132
1,470-1,480
0,880-0,885
0,81
0,79
0,726-0,728
Nhiệt độ sôi
64.5"C
IT C
78,3"C
153“C
40"C
60-62"C
56“C
90"C
*Vật liệu đùng trong sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký: silicagel 60 F254, Merck.
- Dung môi chạy sắc ký: gồm các dung môi trên.
- Bình chạy sắc ký.
- Cột sắc ký: đường kính Icm, dài 50 cm.
- Hạt silicagel 60 Merck(0,lmm).
*Tác nhân gây đột biến:
Ánh sáng u v ( X-15A nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V.
*Máy móc thiết bị khác:
+ Máy lắc Taitec Bio-Shaker BR 300 Lf,
+ Tủ ấm Trung Quốc 30"C, 37’C,
+ Tủ lạnh,
+ Kính hiển vi điện tử (viện vệ sinh dịch tễ TW), / ^ỈAUỊO^

+ Cân kỹ thuật SCALTEC, PRECISA,
+ Tủ cấy AURA VF 48, BASSAIRE, SANYO CLEANBENCH,
+ Tủ sấy SHALLAB MODEL 1350 FX,
+ Máy cất quay,
+ Máy đo quang phổ hổng ngoại,
+ Patuyn, pipet các loại, ống đong, cốc có mỏ, ống nghiệm, nút bống, gạc, bình nón
các loại, đèn cồn, đũa thuỷ tinh
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu.
A. Phucfne pháp eâv giữ giống trong ổng thach nghiêng:
Chuẩn bị mối trường phân lập (MT2): cân, pha, chỉnh pH, đun sôi ưong 3
phút, phân đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5-6 ml, tiệt trùng ở latm/20 phút rồi
đặt thạch nghiêng. Khi mỏi trường đã nguội, đùng que cấy vô trùng cấy zigzac các
tế bào Streptomyces 35.29 thuần khiết lên bề mặt thạch nghiêng. Để cho phát triển ở
30"C, sau 6 ngày, xạ khuẩn tạo bào tử màu vàng, đem cất giữ trong tủ lạnh 2-4”C
trong vòng 3-6 tháng, dùng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
B. Đánh giá hoat tính khăng sinh bằng phưctng pháp khuếch tăn, l X
*Nguvên tác:
Mâu thử được đạt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểm định, kháng
sinh từ mẫu thử khuyếch tán vào mòi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của v s v
kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
*Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường cấy v sv kiểm định:
v s v kiểm định được cấy vào môi trường canh thang (đối với vi khuẩn); môi
trường Sabouraud lỏng (đối với nấm men) và dung dịch tween 80 0,1 %( đối với nấm
mốc). Chuẩn bị hỗn dịch v s v kiểm định có nồng độ từ 10^-10** tế bào/ml, đưa hổn
dịch này vào môi trường thạch thường (dối với vi khuẩn), vào môi trường Sabouraud
đặc (đối với vi nấm) ở nhiệt độ 45-50"C sau khi đã hấp tiệt trùng ở latm/20 phút, với
tỉ ỉệ V giốngẠ^ thạch thường = 5/200, lắc để v s v kiểm định phân tán đều trong môi
trường, đổ vào hộp petri với thể tích 20ml/hộp.
- Đưa mẫu thử vào hộp petri có chứa môi trường v sv kiểm định; có ba cách đưa

mẫu thử vào môi trường v sv kiểm định.
+ Khối thạch; đặt khối thạch chứa v s v sinh kháng sinh lên bề mặt môi
trưcmg v s v kiểm định.