Nghiên cứu thành phần hóa học các bộ phận mặt đất của cây ô đầu sapa (aconitum carmichaelii debx)

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HẢ NỘI
BÙI LAN PHƯƠNG
NGHIÊN cứ u THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÁC BỘ PHẬN
• • •
TRÊN MẶT ĐẤT CỦA CÂY Ô ĐẦU SA PA
(Aconitum carmỉchaelii Debx.)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2 0 0 2 -^ 7 )
Ngưòi hướng dẫn khoa học ^ f Q Ị ịW J
1. TS Phạm Văn Thanh
2. ThS Bùi Hồng Cường
Nơi thực hiện :
1. Viện dược liệu
2. Công ty TRAPHACO
Thời gian thực hiện : Tháng 3-5/2007
Hà N ộ i-2007
\
' ¥
M ồ i e ả n t đ i L
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận, tôi đã nhận được
rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô giáo, bạn bè và gia đình.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- TS Phạm Văn Thanh, trưởng khoa Hoá thực vật, Viện Dược liệu.
- Ths Bùi Hồng Cường, công ty Traphaco.
Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đê tài này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Hoà Bình, giảng
viên Bộ môn Dược học cổ truyền đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xỉn gửi lời cảm ơn chân thành tới:
- Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và các cô, chú, anh, chị công tác tại

khoa Hoá thực vật, Viện Dược liệu.
- Các thầy cô giáo trong Bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học
Dược Hà Nội.
- Các cô, chú, anh, chị trong phòng Kiểm tra chất lượng, công tỵ
Traphaco.
Là những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ten cha mẹ, bạn bè, người
thân đã luôn ủng hộ, động viên để tôi có được ngày hôm nay.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!
Hà Nội tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Bùi Lan Phương
MỤC LỤC
1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền
1.4.1. Phụ tử sống
1.4.2. Phụ tử chế
1.4.3. Phần trên mặt đất
Phần 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
Trang
1
NHỮNG CHỬ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỂ
Phần 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L. 2
1.1.1. Vị trí phân loại 2
1.1.2. Phân loại chi Aconitum L. 2

1.1.3. Phân bố ^
1.1.4. Nguồn gốc cây Ô đầu trồng ở Sa Pa (Lào Cai) hiện nay ^
1.1.5. Bộ phận dùng ^
1.2. Thành phần hoá học ^
1.2.1. Thành phần hoá học của rễ củ (Ô đầu, Phụ tử) ^
1.2.2. Thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu ^
1.2.3. Phương pháp kiểm định Alcaloid
1.3. Tác dụng sinh học
1.3.1. Tác dụng sinh học của Phụ tử
1.3.2. Tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu ^
9
9
10
10
11
11
11
11
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 13
2.2. Thực nghiệm và kết quả 13
2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ 13
2.2.2. Nghiên cứu Alcaloid 21
2.3. Bàn luận 32
2.3.1. Định tính 32
2.3.2. Định lượng 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Aco
Alc
Alctp

Cs
Dieste alc
HPLC
MeOH
MT
Nxb
PTS
SKLM
TB
uv
Aconitin
Alcaloid
Alcaloid toàn phần
Cộng sự
Diester alcaloid
High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu
năng cao)
Methanol
Mẫu thử
Nhà xuất bản
Phụ tử sống
Sắc ký lớp mỏng
Trung bình
Ultraviolet (tử ngoại)
ĐẬT VẤN ĐỂ
Cây Ô đầu là một cây thuốc quý, các bộ phận dưới mặt đất của nó như
củ cái (Ô đầu) và củ nhánh (Phụ tử) là những vị thuốc quý, có tác dụng cải tử
hoàn sinh đã được sử dụng khá phổ biến trong y - dược học cổ truyền phưoỉng
Đông [1], [3], [6], [12], [13], [14], [29].
Gần đây đã có một số tài liệu nước ngoài công bố nghiên cứu về các bộ

phận trên mặt đất của một số loài thuộc chi Aconitum L. cho thấy chúng cũng
có chứa một số thành phần hoá học giống với Phụ tử như các alcaloid,
flavonoid. Nhưng những công trình nghiên cứu về vấn đề này còn rất ít [17],
[18], [19], [21], [22],
Cây Ô đầu đã được trồng ở Việt Nam từ những năm 70 của thế kỷ
trước. Sau chiến tranh biên giới (1979), cây Ô đầu bị triệt phá và mất giống
hoàn toàn. Từ năm 1990, chúng đã được nhân dân Sa Pa phục hồi lại.Trong
điều kiện sinh thái của vùng Sa Pa thì thành phần hoá học của cây Ô đầu có
thể sẽ khác đi. Gần đây, một số nhà khoa học của Việt Nam đã nghiên cứu về
một loài Ô đầu ở Sa Pa có tên khoa học là Aconitum carmichaelii Debx. Họ
Ranunculaceae [8]. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu này chủ yếu là phần
rễ củ, chưa có nghiên cứu nào về các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa
Pa này.
Với mục tiêu nghiên cứu về các thành phần hóa học có trong một số bộ
phận trên mặt đất (gồm thân, lá, hoa, hạt) của cây Ô đầu Sa Pa chúng tôi thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học các bộ phận trên mặt đất của
cây Ô đầu Sa Pa ( Aconitum carmichaelii Debx.) ” vói các nội dung sau:
Định tính các nhóm chất hữu cơ trong các bộ phận trên mặt đất
của cây Ô đầu Sa Pa.
Định lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid, aconitin trong
các bộ phận đó.
Phần 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L.
1.1.1. Vị trí phân loại [5]
Chi Ô đầu {Aconitum L.) thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ
Hoàng Liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae), lófp Mộc
Lan (Magnoliopsida), ngành Mộc Lan (Magnoliophyta).
1.1.2. Phân loại chi Aconitum L.[16], [25]:
Được sắp xếp thành 3 phân chi:
- Phân chi Aconitum: cỏ, sống hai năm, giả một năm, có rễ củ.

- Phân chi Lycoctonum: cỏ, sống lâu năm, có thân rễ.
- Phân chi Gymnaconitum: cỏ, sống một năm.
1.1.3. Phân bố:
Chi Aconitum L. có khoảng 400 loài phân bố chủ yếu ở các vùng ôn
đói ấm Bắc Bán cầu, có nhiều nhất ở Trung Quốc (trên 200 loài) [25].
ở Việt Nam , cây Ô đầu có ở Sa Pa (Lào Cai) và một số noi ở tỉnh Hà
Giang, Lai Châu [1], [14].
1.1.4. Nguồn gốc cây Ô đầu trồng ở Sa Pa ( Lào Cai) hiện nay:
Tên khoa học của cây Ô đầu ở Sa Pa hiện nay đã được xác định là
Aconitum carmỉchaelii Debx. Họ Ranunculaceae [8].
Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam hiện nay có xuất xứ nhập nội từ hai
nguồn: Nguồn thứ nhất do ngành y tế chính thức nhập giống từ Trung Quốc,
được trồng đầu tiên ở Sa Pa từ những năm 70 của thế kỷ trước, còn được trồng
ở Bắc Hà ( Lào C ai), Sìn Hồ ( Lai Châu ). Nguồn thứ hai do cộng đồng người
Hoa ở huyện Quản Bạ và Đồng Văn (tỉnh Hà Giang) tự động nhập giống Ô
đầu từ bên kia biên giới về trồng [1].
1.1.5. Bộ phận dùng:
Rễ củ: Củ cái gọi là Ô đầu, chỉ được dùng ngoài. Củ nhánh gọi là Phụ
tử được chế biến thành Phụ tử chế để dùng trong.
1.2. Thành phần hóa học:
Đến nay đã có tới hàng trăm công trình nghiên cứu về thành phần hoá
học của chi Aconitum L., trong đó có ít nhất 96 loài đã được nghiên cứu.
Trong số đó thì chủ yếu các công trình nghiên cứu về phần rễ củ (Ô đầu, Phụ
tử), chỉ có ít công trình nghiên cứu về bộ phận trên mặt đất của một số loài
Aconitum spp. ĩử in Aconitum vulparia [23], Aconitum napellus [18], [19],
Aconitum leaveỴll].
Thành phần hoá học chính trong chi Aconitum L. là alcaloid, flavonoid,
ngoài ra cũng có một số chất thuộc nhóm polysaccharid, glycosid
1.2.1. Thành phần hoá học của rễ củ ( Ô đầu, Phụ tử ):
12.1.1. Alcaloid.

Các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được thành phần có hoạt
tính sinh học mạnh nhưng độc tính cao thuộc nhóm alcaloid, trong đó được
quan tâm nhiều nhất là các alcaloid diterpenoid. Một số tác giả đã phân lập
được một số alcaloid thuộc các nhóm khác, đặc biệt là l-benzyl-
tetrahydroisoquinolin và aporphin là những alcaloid có hoạt tính sinh học
mạnh [16].
a. Alcaloid diterpenoid.
Là nhóm alcaloid đặc trưng của chi Aconitum L. và cũng là nhóm tạo
ra độc tính cao. Căn cứ vào cấu trúc của khung diterpenoid, các tác giả đã chia
các alcaloid này thành 2 nhóm: Cig-Norditerpenoid alcaloid và C20”
Diterpenoid alcaloid [16].
Gần đây, một số tác giả bổ sung thêm 2 khung ít gặp hơn: Cjg-
Diterpenoid alcaloid [26] và khung Bisditerpenoid alcaloid [20].
Căn cứ vào số liên kết ester vào khung diterpenoid, nhóm alcaloid này
lại được chia thành 3 nhóm [15]:
- Nhóm 1: phân tử có 2 nhóm ester liên kết vào khung diterpenoid
(diester alcaloid) như aconitin, mesaconitin,
- Nhóm 2: phân tử có 1 nhóm ester liên kết vào khung diterpenoid
(monoester alcaloid) như benzoylaconin, benzoylmesaconin,
- Nhóm 3 : Không có dây nối ester trong phân tử như aconin,
mesaconin,
b. Alcaloid khác.
Là các alcaloid không có cấu trúc diterpenoid đặc trưng của các loài Ô
đầu, chúng bao gồm các isoquinolin (higenamin, N-demethyl-colletin và O-
methyl-armepavin) và các amin [16].
Vói các tài liệu thu thập được, đã có khoảng 400 alcaloid được phân lập
từ 80 loài thuộc chi Aconitum L [7].
* Hàm lượng alcaloid trong rễ củ của một số loài Aconitum L.
Hàm lượng alcaloid toàn phần, nhóm diesteralcaloid cũng như các
alcaloid trong chi Aconitum L. khác nhau, tuỳ thuộc vào loài, thời kỳ thu hái,

bộ phận dùng , vùng trồng, nhiệt độ môi trưcmg trồng [16].
Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid và một số alcaloid chính
trong củ của một số loài thuộc chi Aconitum L. được thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid và một số
alcaỉoid chính trong củ của một số loài thuộc chi Aconitum L.
Tên, bộ
phận
Địa phương
Alctp
(%)
Diester
alc (%)
Một số alcaloid chính
Tài
liệu
A. carmichaelii Debx.
Phu tử
Trung Quốc
0,82-
1,56
0,07-
0,17
Hypaconitin (0,179%),
mesaconitin (0,027%),
deoxyaconitin (0,013%),
Aconitin (0,003%)
16
Tứ Xuyên 0,77
Mesaconitin (0,4%),
Hypaconitin, aconitin

16
SaPa
1,15-
1,21
0 ,21-
0,34
Aconitin(0,0054-0,0125%)
16
Xuyên
ô
Shensi 0,32
Aconitin, hypaconitin
(0,1%)
16
Đài Loan 0,58
0,27
Aconitin, mesaconitin,
hypaconitin
16
Ôđầu
Nhật Bản,
(Hokkaido)
1,04-
1,1
Mesaconitin + aconitin
(0,14-0,16%),
hypaconitin
16
Nhật Bản,
Honshu

1.09-
1.32
Mesaconitin + aconitin
(0,13-0,23%), hypaconitin
(0,03-0,06%)
16
Thảo ô
Đài Loan
0,41
0,2
Aconitin, mesaconitin,
hypaconitin
16
A. kusnezojfii Reichb.
Bắc Ô
đầu
Trung Quốc
0,7-
1,3
Aconitin, méaconitin,
hypaconitin
16
Bắc
thảo ô
Nội Mông
CỔ
0,3
Aconitin (0,017%),
Mesaconitin(0,051 %)
16

A. brachypodum Diel.
Củ Vân Nam 1,25
Aconitin, neolin
16
A. nagarum Stapf.
Củ Vân Nam
1,3 Aconitin, neolin
16
A. episcopale Lévl.
Củ Vân Nam 2,2
Delavaconitin (1,54%)
16
1.2.1.2. Một sô thành phần khác:
- Polysaccharid: Tomoda và cs. (1986) đã phân lập được 4
polysaccharid là aconitan A, B, c, D từ phụ tử sống Aconitum carmichaelii
Debx. có tác dụng hạ glulose huyết [30].
- Glycosid: Fuzinosid, Yokonosid glucosid [16].
1.2.2. Thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu.
Các công trình nghiên cứu thành phần hoá học của phần trên mặt đất
của cây Ô đầu không nhiều. Một số tác giả đã phân lập được một số Alcaloid
diterpenoid và Flavonoid glycosid từ phần trên mặt đất (thân, lá, hoa ) của một
số loài Aconitum spp., chưa thấy có nghiên cứu nào về phần hạt.
I.2.2.I. Alcaloid diterpenoid.
Một số Alcaloid diterpenoid được phát hiện từ hoa và phần trên mặt đất
( thân, lá, hoa) của một số loài:
Aconitum napellus [18].
Aconitum racemulosum Franch var. pengzhouense [31].
Aconitum tanguticum [32].
+ Hàm lượng alcaioid: Có nghiên cứu về hàm lượng alcaloid toàn phần
trong thân, lá của Aconitum episcopale Lévl. ở Vân Nam (Trung Quốc) là

0,58%, alcaloid chính là delavaconitin chiếm 0,43% [16].
I.2.2.2. Flavonoid
Một số flavonoid glycosid được phân lập từ phần trên mặt đất ( thân, lá,
hoa) và hoa của một số loài:
Aconitum paniculatum [22]
Aconitum napellus subsp. neomontanum [21].
Aconitum vulparia [23].
Và một số loài Aconitum spp. khác [19], [24], [28].
1.2.3. Phương pháp kiểm định alcaloid.
1.2.3.1. Định tính alcaloid.
+ Định tính bằng phản ứng hoá học.
Bằng các thuốc thử chung của alcaloid [4].
+ Định tính bằng sắc ký lớp mỏng [4].
+ Định tính bằng quang phổ tử ngoại.
Kiềm hoá dược liệu, chiết xuất alcaloid bằng ether, chiết lại alcaloid
bằng dung dịch H2SO4 0,5N, quét phổ u v từ 300-200nm [3], [29].
+ Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10].
1.2.3.2. Định lượng alcaloid toàn phần.
Bằng phương pháp acid - base [3], [29].
Tiêu chuẩn về hàm lượng alcaloid toàn phần: Trong Ô đầu phải chứa ít
nhất 0,3% alcaloid toàn phần tính theo aconitin [3]. Trong Xuyên ô chế, Thảo
ô chế phải chứa ít nhất 0,2% alcaloid toàn phần tính theo aconitin [29]
1.2.3.3. Định lượng diester alcaloỉd
Bằng phương pháp đo độ hấp thụ [29].
Giói hạn diester alcaloid trong Xuyên ô chế, Thảo ô chế không được
vưọt quá 0,15% tính theo aconitin [29].
I.2.3.4. Định lượng aconitin.
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10].
+ Giới hạn aconitin trong Phụ tử chế không được vượt quá 0,017% [3],
[29].

1.3. Tác dụng sinh học
1.3.1. Tác dụng sinh học của Phụ tử:
+ Tác dụng trên hệ tim mạch:
- Tác dụng trợ tim, cường tim [11],[14], [16].
- Tác dụng hạ huyết áp [1], [16].
- Tác dụng chống loạn nhịp tim [15], [16].
+ Tác dụng giảm đau [15].
+ Tác dụng chống viêm [14], [15], [16].
+ Tác dụng chống động kinh [15].
+ Tác dụng hạ đường huyết [1].
+ Các tác dụng khác: an thần [16], hạ sốt [16], tăng co bóp cơ trơn [1],
[16],
+ Độc tính của Phụ tử và aconitin
- Độc tính:
a. Aconitin rất độc, LD50 trên chuột nhắt trắng là l,8g/kg thể trọng
(đường uống) và 0,12-0,55g/kg thể trọng (đường tiêm) [16].
b. Khi thủy phân aconitin thành benzoylaconin hoặc aconin có độc tính
thấp hơn. Trên chuột nhắt trắng, LD50 của belzoylaconin cao gấp 200 lần
aconitin và của aconin cao gấp 1000 lần aconitin [16].
c. Phụ tử sống: LDgo của Phụ tử sống Trung Quốc là 5,49g/kg thể trọng
(đường uống) và 0,49-0,7 Ig/kg thể trọng (đường tiêm) [16]
d. Phụ tử chế: Bạch phụ Trung Quốc LD50 =45,00g/kg thể trọng; Phụ tử
chế Sa Pa LD50 =78,75g/kg thể trọng [11].
- Ngộ độc Phụ tử: độc tính của Phụ tử chủ yếu là do aconitin và các
diester alcaloid, các biểu hiện ngộ độc như ngộ độc aconitin: ban đầu là cảm
giác ngứa ran ở lưỡi, miệng và ngón tay' sau đó cơ thể mất cảm giác, tê liệt,
chảy dãi, buồn nôn, nôn, miệng, tứ chi và toàn thân tím tái, mạch chậm,
choáng váng, hồi hộp, tụt huyết áp, đại tiểu tiện không tự chủ, thân nhiệt hạ,
loạn nhịp tim, suy hô hấp, sốc và hôn mê [1], [15].
1.3.2. Tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu:

Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô
đầu hiện nay còn rất ít.
+ Tác dụng chống oxy hoá: Flavonoid glycosid trong hoa của một số
loài Aconitum spp. như A.napellus, A.paniculatum, A.vulparia [17] và
Alcaloid trong phần trên mặt đất ( thân, lá, hoa ) của Aconitum laeve [27] có
tác dụng chống oxy hoá.
+ Tác dụng quét gốc tự do: của flavonoid glycosid trong một số loài
Aconitum spp. [17].
+ Tác dụng chống viêm: Alcaloid trong phần trên mặt đất của Aconitum
laeve có tác dụng chống viêm [27].
+ Tác dụng ức chế hoạt động của tyrosinase: của alcaloid trong phần
trên mặt đất của Aconitum laeve [27].
1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền:
1.4.1. Phụ tử sống
Phụ tử sống thưòfng chỉ được dùng ngoài [3], [6], [13], được bào chế
dưới dạng cồn Ô đầu, dùng để chữa đau dây thần kinh ngoại biên, viêm phế
quản cấp, viêm thanh quản, viêm họng, cảm cúm, ho, thấp khớp [2], [6].
1.4.2. Phụ tử chế:
- Tính vị, quy kinh: vị cay, ngọt, tính rất nóng, rất độc, quy vào 3 kinh
tâm, thận, tỳ [14], [29], vào cả 12 kinh [2].
- Công năng, chủ trị:
+ Hồi dương cứu nghịch: dùng trong trường hợp tứ chi lạnh, mồ hôi tự
vã ra, người lạnh toát, chân tay co quắp, mạch nhỏ muốn tuyệt [1], [14], [29].
+ Bổ hoả trợ dương: dùng trong trường hợp tâm thận dương hư, liệt
dương [29].
+ Khứ hàn, giảm đau: dùng trong các chứng phong hàn, đau nhức
xương khớp, chân tay lạnh [14].
+ Ấm thận hành thủy: dùng trong trường hợp viêm cầu thận mạn tính,
hoặc chức năng thận kém, lưng gối đau lạnh [14].
+ Kiện tỳ vị: dùng trong trường hợp tỳ vị hư hàn, đau bụng tiêu chảy do

hàn tà nhập lý [14].
+Kiêng kỵ: những người âm hư, dương thịnh; trẻ em; phụ nữ có thai,
đang cho con bú không dùng [14]. Không dùng chung vói Bán hạ, Bạch cập,
Bối mẫu, Qua lâu nhân [3], [29].
1.4.2. Phần trên mặt đất:
Rất ít tài liệu đề cập đến việc sử dụng phần trên mặt đất của cây Ô đầu
làm thuốc chữa bệnh.
Dược điển Trung Quốc 2005 có chuyên luận “Thảo ô diệp” (Folium
Aconiti kusnezoffii) là lá khô của cây Bắc Ô đầu {Aconitum kusnezoffii
Reichb.). Đây là vị thuốc thường được dân tộc Mông cổ sử dụng [29]:
- Công năng: thanh nhiệt, giải độc, giảm đau.
- Chủ trị: chứng sốt nóng, đau bụng ỉa chảy, đau đầu, đau răng.
- Kiêng kỵ: phụ nữ có thai không được dùng.
Phần 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu.
2.1.1. Nguyên liệu:
Các mẫu nghiên cứu được lấy từ các bộ phận của cây Ô đầu Sa Pa có
tên khoa học là Aconitum carmichaelii Debx., họ Ranunculaceae [8] (Hình
2.1) do công ty cổ phần dược phẩm TRAPHACO cung cấp bao gồm:
- Thân được thu vào tháng 9-2004.
- Hoa được thu vào tháng 9-2004.
- Hạt được thu vào tháng 10-2004.
- Lá được thu vào tháng 9-2004.
- Phụ tử sống được thu vào tháng 9-2004.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
a. Thiết bị:
- Máy cân đo độ ẩm Prerisa (Thụy Sỹ).
- Máy quang phổ tử ngoại - khả kiến U-2010 (Hitachi) - Nhật Bản.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Merck - Hitachi D7000.
- Bản mỏng Silicagel 60P254 (Merck).

- Buret định lượng chính xác.
- Các dụng cụ thí nghiệm hoá học.
b. Hoá chất nghiên cứu:
- Dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N; NaOH 0,1N; HCl 0,1N của Công ty
Hóa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật TPHCM.
- Cồn tuyệt đối C2ỈỈ5OH do Công ty cổ phần hóa chất tinh khiết Hà Nội
cung cấp
- Aconitin chuẩn của hãng Latoxan - Pháp.
- Các hóa chất và thuốc thử khác ở Khoa Hoá thực vật- Viện Dược liệu
và phòng Kiểm ta chất lượng, công ty TRAPHACO.
Hình 2.1. Cây Ô đầu Sa Pa
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
a. Định tính:
- Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng các phản ứng hoá học [4].
- Định tính alcaloid bằng SKLM [3].
- Định tính alcaloid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [10].
b. Định lượng:
- Định lượng alcaloid toàn phần: định lượng bằng phương pháp acid-
base [29].
- Định lượng diester alcaloid : bằng phưoỉng pháp đo độ hấp thụ tử
ngoại - khả kiến [29].
- Định lượng aconitin: bằng phương pháp HPLC [10].
2.2. Thực nghiệm và kết quả.
2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ:
Mẫu nghiên cứu: Thân, lá, hoa, hạt và phụ tử sống.
• Định tính chất béo, carotenoid, sterol, phytosterol. Qio vào bình cầu
5g bột dược liệu, thêm 20ml ether dầu hỏa, đun hồi lưu cách thủy trong 30
phút. Lọc, thu dịch lọc, bay hơi dung môi đến đậm đặc được dung dịch A.
- Định tính chất béo: Nhỏ 1-2 giọt dung dịch A lên tờ giấy lọc, sấy khô
nếu thấy để lại vết dầu mỡ thì phản ứng dương tính.

Kết quả: phản ứng dương tính vói Phụ tử và hạt.
- Định tính caroten: dịch A cô đến cắn, thêm 2 giọt H2SO4 đặc, phản
ứng dương tính khi thấy có màu xanh nâu.
Kết quả: Phản ứng dương tính với thân, lá, hoa, hạt.
- Định tính sterol: dịch A cô đến cắn, hòa tan cắn trong 2ml chloroform,
thêm 10 giọt anhydrit acetic. Thêm từ từ theo thành ống 2ml H2SO4 đặc, nếu
chỗ giáp giói xuất hiện màu xanh lục. Lắc nhẹ, màu xanh khuếch tán lên trên
thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng dưofng tính với Phụ tử, lá, hoa.
• Định tính flavonoid: lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích
150ml, thêm 50ml cồn 90°, đun sôi cách thủy 15 phút, lọc:
+ Riêng với bột lá: dịch lọc đem bốc hơi trên cách thuỷ đến cắn,hoà tan
cắn với 30ml nước nóng, lọc, bốc hơi dịch lọc tới cắn, hoà tan cắn với 30ml
cồn 90°.
- Phản ứng cyanidin: cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít
bột Mg kim loại, sau đó cho 5 giọt HCl đặc. Đun sôi cách thủy trong vài phút.
Phản ứng dưofng tính khi dung dịch xuất hiện màu hồng hay đỏ.
Kết quả: Phản ứng dương tính vói lá, hoa.
- Phản ứng với FeClg 5%: cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết, thêm 1-2
giọt dung dịch FeClj 5%. Phản ứng dương tính khi thấy dung dịch xuất hiện
màu xanh đen.
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu.
- Phản ứng với kiềm: nhỏ một giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc rồi để
cho khô. Quan sát dưói ánh sáng thường không thấy có màu hoặc màu vàng
nhạt. Hơ nhẹ lên miệng lọ NH4OH đặc. Phản ứng dưoỉng tính khi thấy màu
chuyển sang vàng đậm hơn.
Kết quả; Phản ứng dưcmg tính vói lá, hoa, hạt.
- Phản ứng diazo hóa: cho vào ống nghiệm mỗi ống 2ml dịch chiết:
+ ống 1: ống chứng
+ ống 2: thêm vào đó vài giọt thuốc thử diazo mới pha. Phản ứng

dương tính khi thấy ống 2 xuất hiện màu vàng cam rõ ràng, trong khi ống 1
màu vàng nhạt.
Kết quả: Phản ứng dương tính với cả 5 mẫu.
• Định tính coumarin: lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung
tích 150ml, thêm 50ml cồn 90°, đun sôi cách thủy 15 phút, lọc:
+ Riêng với bột lá: dịch lọc đem bốc hơi trên cách thuỷ đến cắn, hoà tan
cắn với 30ml nước nóng, lọc, bốc hơi dịch lọc tới cắn, hoà tan cắn với 30ml
cồn 90°.
- Phản ứng mở, đóng vòng lacton: cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml
dịch chiết. Ống 1 thêm Iml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Đun
cách thủy cả 2 ống đến sôi, để nguội. Quan sát thấy ống 1 có màu vàng, ống 2
không thay đổi. Thêm vào mỗi ống 2ml nước cất, thấy ống 1 vẫn có màu vàng
nhưng nhạt hơn, còn ống 2 trở nên đục trắng. Sau đó cho vào 2 ống một vài
giọt HCl đặc. Thấy ống 1 mất màu vàng và trở nên đục trắng giống ống 2 thì
phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính với cả 5 mẫu.
- Phản ứng diazo hóa:
+ Chuẩn bị thuốc thử: hòa tan 0,9g acid sulfanilic trong 3ml HCl đậm
đặc, pha loãng vói nước đến lOOml. Lấy lOml dung dịch ngâm trong nước đá
10 phút, thêm lOml dung dịch NaNOj 4,5% cũng được ngâm trong nước đá 10
phút. Lắc đều , ngâm trong nước đá 15 phút.
+ Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết dược liệu, kiềm hóa
bằng dung dịch NajCOg 2%, đun cách thủy, để nguội, thêm vào đó vài giọt
thuốc thử diazo mới pha, phản ứng dương tính khi thấy dung dịch trong ống có
màu vàng cam.
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu.
- Quan sát huỳnh quang: nhỏ lên giấy lọc 2 giọt dịch chiết phụ tử trong
cồn, nhỏ thêm 1 giọt NajCOj. Hơ nhẹ cho khô. Lấy 1 miếng kim loại che đi
một nửa vết, sau đó soi đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm, thấy phát huỳnh
quang xanh. Bỏ miếng kim loại ra, thấy nửa còn lại sáng dần lên cho đến khi

bằng bên không che thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu.
• Định tính tanin: lấy 5g bột dược liệu cho vào cốc, thêm 30ml nước
cất, đun sôi vài phút rồi lọc, thu dịch lọc được dung dịch B:
- Phản ứng vói FeClg: cho vào ống nghiệm Iml dịch B, thêm 1-2 giọt
FeClj 5%. Phản ứng dương tính khi thấy dung dịch trong ống có màu xanh
đen.
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu.
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho vào ống nghiệm Iml dịch B,
thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, phản ứng dương tính khi thấy có tủa
bông xuất hiện.
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu.
• Định tính acid hữu cơ: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch B ở trên và vài
tinh thể NajCOj khan, phản ứng dương tính khi thấy có bọt khí nổi lên .
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu.
• Định tính đường tự do: cho vào ống nghiệm 2ml dịch B ở trên, thêm
0,5ml thuốc thử Fehling A; 0,5ml thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy 15
phút, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa đỏ gạch.
Kết quả: Phản ứng dương tính với cả 5 mẫu.
• Định tính acid amin: Lấy 2ml dịch B ở trên cho vào ống nghiệm,
thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 0,5% đun cách thủy sôi 15 phút, phản ứng
dương tính khi thấy xuất hiện màu xanh tím.
Kết quả: Phản ứng dưofng tính với cả 5 mẫu.
• Định tính glycosid tim:
+ Cho khoảng lOg bột dược liệu vào một bình nón dung tích 250ml,
thêm lOOml cồn 25°, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Gạn dịch lọc vào
cốc có mỏ dung tích lOOml, thêm vào dịch lọc 3ml dung dịch chì acetat 30%
khuấy đều, để lắng tủa, lọc qua giấy lọc.Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống
nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat, nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng
Iml chì acetat vào dịch chiết, khuấy đều, lọc. Kiểm tra tiếp cho tới khi dung

dịch không còn tủa với chì acetat. Chuyển dịch lọc trên vào bình gạn dung tích
250ml. Chiết hỗn hợp glycosid bằng 25ml chloroform (chia làm 3 lần: lOml,
lOml, 5ml). Lắc đều, gạn lấy lớp chloroform. Gộp dịch chiết vào trong cốc có
mỏ, lắc đều. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm đã sấy khô, bốc hơi trên nồi
cách thủy đến khô. cắn còn lại được tiến hành làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Liebermann- Bourchard: cho vào một ống nghiệm có chứa
cắn ở trên 0,5ml anhydric acetic, lắc đều để thuốc thử hòa tan hết cắn. Đặt
nghiêng ống nghiệm 45° và cho thêm đồng lượng H2SO4 đặc (0,5ml) theo
thành ống nghiệm. Dịch lọc trong ống nghiệm được chia thành 2 lớp (lớp
anhydric acetic ở trên), phản ứng dưoỉng tính khi thấy ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp
chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ. Lắc nhẹ ống nghiệm, lớp chất lỏng phía
trên có màu xanh lá cây.
Kết quả: Phản ứng dương tính với phụ tử, hoa, lá.
- Phản ứng Keller- Kiliani: cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol
90, lắc đều cho cắn được hòa tan hết. Thêm vài giọt dung dịch sắt III chlorid
5% pha trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 45°. thêm đồng lượng H2SO4
đặc theo thành ông nghiệm. Phản ứng dương tính khi thấy ở mặt tiếp xúc giữa
2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ. Lắc nhẹ ống nghiệm, lớp chất lỏng
phía trên có màu xanh lá cây.
Kết quả: Phản ứng dưofng tính với phụ tử.
- Phản ứng Baljet:
+ Chuẩn bị thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm 1 phần dung dịch acid
picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% lắc đều.
+ Tiến hành: cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90%. Lắc
đều, cho cắn vào hòa tan hết. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (3-5 giọt), phản
ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu đỏ cam ,
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu.
Á-
- Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90°, lắc
đều cho cắn được hòa tan hết. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và

2 giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu.
• Định tính antraglycosid
- Phản ứng Bortraeger: cho 5g bột dược liệu vào bình có dung tích
lOOml, thêm 20ml H2SO4 10%. Đun cách thủy 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc
vào bình gạn, lắc vói ether ethylic trong 2 phút. Để yên cho tách thành 2 lớp,
loại phần nước, cho 5ml dung dịch NaOH 10% vào phần ether ethylic, lắc,
quan sát thấy xuất hiện màu đỏ ở lớp nước thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu.
- Phản ứng vi thăng hoa: cho khoảng 3g bột dược liệu vào trong một
nắp chai bằng nhôm. Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi bay hết hơi
nước trong dược liệu. Đặt lên trên miệng nắp nhôm một phiến kính, trên phiến
kính đó có để một miếng bông có tẩm nước lạnh. Sau 10 phút, lấy phiến kính
ra để nguội, soi dưới kính hiển vi, nếu thấy tinh thể thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu.
• Định tính Saponin: lấy Ig bột dược liệu , thêm 5ml cồn, đun sôi cách
thủy 15 phút, lấy 3 ống nghiệm. Cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N; vào ống
thứ hai 5ml NaOH 0,1N; ống thứ ba 5ml nước cất. Cho vào mỗi ống 3 giọt
dung dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả ba ống trong 15 giây,
phản ứng dưcmg tính khi quan sát thấy các ống có bọt.
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu.
• Định tính alcaloid: lấy 2g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích
50ml có nút mài, thấm ẩm bằng NH4OH đặc, sau 10 phút thêm 20ml ether
(thuốc thử), lắc đều, nút kín và để yên 30 phút, thỉnh thoảng lắc. Gạn lấy lớp
ether, lọc, bốc hơi trên cách thủy tới khô, được cắn. Hòa tan cắn thu được ở
trên bằng 5ml H2SO4 10%, cho vào 3 ống nghiệm:
• ống 1: nhỏ thêm 2 giọt thuốc thử Mayer thấy tủa trắng (phản ứng
dương tính)
• ống 2: nhỏ thêm 2 giọt thuốc thử Dragendoĩff thấy tủa đỏ cam
(phản ứng dưofng tính)

• ống 3: nhỏ thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat thấy tủa nâu (phản
ứng dương tính).
Kết quả: Cả 3 phản ứng đều dương tính vói cả 5 mẫu.
Kết quả định tính thành phần hóa học của các bộ phận trên mặt đất của
cây Ô đầu Sa Pa được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây ố đầu:
s
Tên nhóm
Phản ứng
Kết quả
Đánh
T
T
chất
PTS
Thân Lá Hoa Hạt
giá
1
Chất béo
Dấu hiệu để
lại vết mỡ
trên giấy
lọc
+
-
- -
+++
Có trong
Phụ tử
và hạt

2
Carotenoid
H2SO4 đậm
đặc
-
+++ +++ +++ +
Có trong
thân, lá,
hoa, hạt
3 Sterol
Libermaim-
bourchardt
+
- + +
-
Có trong
Phụ tử,
lá, hoa
Cyanidin
-
-
+ +
-
4.
Flavonoid
NH4OH đặc
-
-
+++
+++ +++

Có trong
FeClg 5%
+++ +++ +++
+++ +++
lá,hoa
Diazo hóa
++ ++
+++ +++
+++
5
Coumarin
Mở, đóng
vòng lacton
+ +
+ ++ ++
Không
có
Diazo hóa
+++ +++
+++ +++ +++
Phát huỳnh
quang
-
-
-
-
-
6
Tanin
FeCl3 5%

+++ +++
+++ +++ +++
Không
có
Gelatin
-
- -
- -
7 Acid hữu cơ
Với
Na2C03
+ +
+ + +
Có trong
tất cả
các bộ
phận
8
Glycosid
tim
Liebermann
Bourchardt
+
-
+
+
-
Không
có
Keller-

Kiliani
+ - -
-
-
Baijet
-
-
-
- -
Legal
-
- -
-
-
9
Antra
glycosid
Bortraeger
- - -
-
-
Không
có
Vi thăng
hoa
-
-
- -
-
10 Saponin Tạo bọt

-
-
-
-
-
Không
có
11 Đường tự do
Fehling
++ ++ +++
+++ +++
Có trong
tất cả
các bộ
phận