Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó

BỌ Y T E
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
= s o C ữ e #

LÊ THỊ LA
XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
PROPRANOLOL TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ.
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2002-2007)
Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Kieu Anh
Th.s Nguyễn Thị Tlutnh Duyên.
Nơi thực hiện : Phòng thí nghiệm trung tâm
Trường đại học dược hà nội
Thời gian thực hiện : T3/2007- T5/2007
HÀ NỘI, THÁNG 5- 2007.
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài này, em đã luôn nhận
được sự quan tâm hướng dẫn tận tình của các thầy cô, sự động viên, giúp đõ
của bạn bè và người thân.
Để bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc của mình, em vô cùng
cảm ơn: TS. NGUYEN th ị KIỀư a n h .
THS. NGUYỄN THỊ THANH DUYÊN.
Những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình, giúp đỡ
em hoàn thành tốt khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các cô làm việc tại Phồng thí nghiêm trung
tâm- nơi em thực hiện đề tài của mình đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi để em hoàn thành khoá luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên
Bộ môn phân tích- độc chất đã tạo điều kiện cho em trong quá trình nghiên
cứu, thực hiện đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
- Bộ môn dược lý.

- Bộ môn công nghiệp Dược đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện
đề tài tốt nghiệp.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ, những người thân trong
gia đình và bạn bè đã hết lòng quan tâm, động viên em trong suốt quá trình
học tập.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Lê Thị La
DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance
Liquid Chromatography).
LOQ: Giới hạn định lượng
MeCN: Acetonitril
MeOH: Methanol
PRO: Propranolol
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối
Apro: Diện tích pic của propranolol
CpRO: Nồng độ propranolol.
SK: Sắc ký
USP : Dược điển Mỹ (The United States of Pharmacopoiea)
THF: Tetrahydrofuran
PTSH: Phân tích sinh học
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮVIÊT TẮT
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan vê Propranolol 2
1.1.1. Đặc điểm hoá lý của Propranolol

2
1.1.2. Tính chất dược lý 2
1.1.3. Dược động học 3
1.1.4. Liều lượng và cách dùng 4
1.1.5. Các dạng bào chế của Propranolol 4
1.1.6. Các phương pháp định lượng propranolol 4
1.2. Đại cương về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7
1.2.1. Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 7
i
1.2.2. Phương pháp sắc ký phân bố pha đảo 8
1.2.3. Một số thông số đặc trưng 9
1.2.4. Các phương pháp định lượng bằng HPLC
11
1.3. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích sinh học 12
1.3.1. Khái niệm 12
1.3.2. Các mức độ thẩm định phương pháp phân tích sinh học(PTSH)

12
CHƯƠNG 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP THựC HIỆN 15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 16
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VẦ NHẬN XÉT


20
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó 20
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chÓ24
2.2.3. Phân tích nồng độ PRO trong huyết tương chó sau khi uống viên
Hémipralon LP 80 m g

.
29
2.3. BẦN LUẬN 30
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng PRO trong huyết tương chó

30
2.3.2. Phân tích nồng độ PRO trong mẫu thực

32
KẾT LUẬN 34
3.1. Kết luận 34
3.2. Đê xuất 35
PHỤ LỤC 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỂ
Hiện nay ở Việt Nam, bệnh tim mạch đang là một trong bốn bệnh không
lây nhiễm nguy hiểm ngày càng có xu thế gia tăng. Bệnh thường xảy ra với
những người già đó là những đối tượng rất dễ quên uống thuốc. Để hạn chế
những nhược điểm này người ta đã thay thế dạng bào chế thông thường bằng
các dạng bào chế tác dụng kéo dài và mang lại hiệu quả điều trị vượt trội. Các
dạng thuốc này còn có những ưu điểm như: có khả năng kiểm soát được quá
trình giải phóng dược chất, giảm tác dụng phụ và nâng cao hiệu quả điều trị.
Propranolol là hoạt chất thuộc nhóm chẹn /3 -adrenergic, được dùng để điều trị
tăng huyết áp, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, loạn nhịp tim Trên thế giới,
các dạng bào chế tác dụng kéo dài của propranolol đã được nghiên cứu đưa vào
sử dụng. Ở nước ta, dạng bào chế này vẫn đang được nghiên cứu và thử nghiệm.
Nghiên cứu sinh khả dụng ra đời vào những năm 1960 nhằm đánh giá
chính xác chất lượng thuốc trên cơ thể sống. Trong nghiên cứu sinh khả dụng,
việc phận tích nồng độ thuốc trong dịch sinh học là chìa khoá để tính toán các
thông số dược động học, sinh khả dụng. Tuy nhiên, để khẳng định phương pháp

phân tích dược chất trong dịch sinh học là chính xác và tin cậy thì cần phải tiến
hành thẩm định.
Để góp một phần nhỏ vào sự nghiệp phát triển chung của ngành Dược,
chúng tôi chọn đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng propranolol
trong huyết tương chó
Với 2 mục tiêu chính :
1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó.
2. Thăm dò định lượng propranolol trong huyết tương chó sau khi
uống viên nang propranolol 80 mg tác dụng kéo dài.
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Propranolol.
1.1.1. Đặc đỉểm hoá lí của Propranolol [5]
a) Cấu trúc hoá học của Propranolol
• Công thức:
• Công thức phân tử : C16H21 N 02 .
• Phân tử lượng : 259.
• Tên khoa học : 1 - isopropylamiĩio- 3( 1 -Naphthyl-loxy) propan-2 -ol.
¥
b) Tính chất hoá lý
• Propranolol hydrochlorid: Là bột kết tinh trắng, hoặc trắng ngà, không
mùi, vị đắng. Tan trong nước, alcol, không tan trong ether, benzen, ethyl acetat.
Nóng chảy 163°c -166°c. Phát huỳnh quang ở pH 4-5.
• Propranolol hydrochloric! ổn định nhất ở pH =3 và phân huỷ nhanh ở pH kiềm.
1.1.2. Tính chất dược lý [3], [4], [9]
1.1.2.1. Cơ chế tác dụng của propranolol
2
Propranolol ức chế tác dụng của các chất dẫn truyền thần kinh giao cảm
bằng cơ chế cạnh tranh ở các vị trí gắn thụ thể p . Propranolol chẹn cả thụ thể
/? I và (ĩ

2
nên được coi là một thuốc chẹn p -adrenergic không chọn lọc.
Tác dụng chẹn /? gây co thắt phế quản do tác dụng ngăn cản giãn mạch
của p -adrenergic do vậy cần thận trọng với bệnh nhân hen phế quản.
1.1.2.2. Chỉ định
Tăng huyết áp, đau nửa đầu, giật rung vô căn.
Đau thắt ngực (trừ đau thắt ngực thể Prinzmetal).
Điều trị dài ngày sau nhồi máu cơ tim.
Loạn nhịp tim, phòng và điều trị các rối loạn nhịp nhanh có thể xảy ra khi
gây mê.
1.1.2.3. Chông chỉ định
■ Hen, suy tim kèm xuất huyết, block nhĩ thất độ II và III, mạch chậm
(dưới 50 nhịp/phút), mẫn cảm với thuốc, giảm huyết áp, u tuỷ thượng thận, rối
loạn tuần hoàn ngoại vi, sốc tim.
■ Bệnh Raynaud, phối hợp với amiodaron.
9
1.1.3. Dược động học [9]
1.1.3.L Hấp thu
Propranolol được hấp thu gần như hoàn toàn ở đường tiêu hoá. Sau khi
uống 30 phút, đã xuất hiện trong huyết tương và sau 60-90 phút đạt nồng độ tối
đa trong máu. Với dạng bào chế tác dụng kéo dài, sau khi uống khoảng 6 giờ thì
đạt nồng độ tối đa trong máu và giữ nồng độ ổn định trong khoảng 24giờ.
1.1.3.2. Phân bô
Propranolol được phân bố rộng rãi vào các mô trong cơ thể kể cả phổi, gan,
thận, tim, Thuốc dễ dàng qua hàng rào máu não, nhau thai và sữa mẹ. Trên
90% propranolol liên kết với protein huyết tương.
1.1.3.3. Chuyên hoá và thải trừ
3
Propranolol được chuyển hoá gần như hoàn toàn ở gan, có ít nhất 8 chất
chuyển hoá được tìm thấy trong nước tiểu. Chỉ có 1-4% liều được thải qua phân

dưới dạng không chuyển hoá và dạng chuyển hoá. ở những bệnh nhân suy thận
nặng, có sự tăng đào thải bù trừ qua phân.
1.1.4. Liều lượng và cách dùng [9]
> Tăng huyết áp: Dựa trên đáp ứng của mỗi cơ thể. Khởi đầu là 20-40
mg/lần. Tăng dần liều cho đến khi huyết áp ổn định ở mức độ yêu cầu. Thông
thường có hiệu quả khi dùng 160-240 mg/ngày.
> Đau thắt ngực: 80-320 mg/ngày. Nên phối hợp với nitroglycerin.
> Loạn nhịp tim: 10-30 mg/lần, 3-4 lần /ngày. Uống trước khi ăn và
trước khi ngủ.
> Nhồi máu cơ tim: 180-240 mg/ngày chia làm nhiều lần.
> Run vô căn: Khởi đầu 40 mg/lần, 2 lần/ngày. Thường đạt hiệu quả
điều trị tốt với liều 1 2 0 mg/ngày.
1.1.5. Các dạng bào chế của Propranolol [3], [7]
- Viên nén: Inderal 40 mg, propranolol 80 mg,
- Thuốc tiêm, dung dịch: Syprol 50 mg/5 ml, Inderal 1 mg/ml-,.;.
- Viên nang tác dụng kéo dài: Hémipralon 80 mg, Inderal LA 160 mg,
1.1.6. Các phương pháp định lượng propranolol
Có 3 phương pháp định lượng cơ bản là:
- Phương pháp hoá học.
- Phương pháp quang phổ uv.
- Phương pháp HPLC.
* Phương pháp hoá học: Định lượng PRO trong nguyên liệu [10], [11],
[17], [18]
- Dùng HCIO4 0,1M, chỉ thị là 1 - naphtholbenzenin.
4
1 ml HCIO4 0,1M tương đương với 0,02958g propranolol hydrochlorid.
- Hoà tan 0,250 g propranolol hydrochloric! trong 25 ml alcol.
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1M, xác định điểm tương đương bằng đo thế.
* Phương pháp quang phổ ƯV: Định lượng PRO trong chế phẩm bào chế [10]
- Chuẩn bị dung dịch propranolol trong methanol có nồng độ 2 0 |ig/ml.

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 290 nm.
* Phương pháp HPLC: Đây là phương pháp được dùng phổ biến nhất
hiện nay để định lượng hoạt chất không chỉ trong nguyên liệu, trong các dạng
bào chế mà còn cả trong dịch sinh học.
- Định lượng PRO trong nguyên liệu ĩ20 ỉ
+ Cột sắc ký: C18 (4,6X 250 mm; 5um).
+ Pha động: Hoà tan 0,5g sodium dodecyl sulfat trong 18 ml H3PO4 0,15M,
thêm 90 ml acetonitril và 90 ml methanol, pha loãng với nước tới 250 ml.
+ Bước sóng: 290 nm.
- Định lượng PRO trong chế phẩm bào chế [20].
+ Cột sắc ký: C18 (4,6 X 150 mm; 5|0,m).
+ Pha động: KH2P04 0,05M- MeCN (65:35)
+ Bước sóng: 220 nm.
- Định lượng PRO trong dịch sinh học: Để định lượng propranolol có thể
dùng 2 loại detector là detector hấp thụ u v và detector huỳnh quang.
+ Dùng detector hấp thụ UV: Có thể định lượng theo một số điều kiện sắc ký sau:
Tài
liệu
Cột sắc ký
Pha động
Xử lý mẫu
Bước
sóng
[19]
Hypersil BDS C18
Na2H P0450mM pH
Kết tủa protein bằng
2 1 0
(4,6x250mm ;
5- MeCN (62:38).

MeCN. Ly tâm tốc độ
nm
5|j,m).
1 0 0 0 0 vòng/ phút.
5
[1 2 ]
Nucleosil C18 (4 , 6
X 250mm; 10
um).
KH2P 0 4 0,02 M-
MeCN (80:20).
Kết tủa protein bằng
MeCN và chiết bằng
ethylacetat.
235
nm
[15]
Zorbax c 18(4,0 X
150mm; 5|im ).
H3PO4 0,25%-
MeCN (75:25).
Bảng 1.1: Một sô điều kiện sắc ký dùng cho detector hấp thụ UV+ Dùng
detector huỳnh quang:
Tài
liệu
Cột sắc ký Pha động Xử lý mẫu
Bước sóng
[16] LiChro-
CARTR RP-
Select B(4 X

125 mm; 5
um).
KH2P 0 4 5mM-
TEA lmM pH 5,0-
MeCN-THF
(70:20:5:5).
Chiết bằng
CH2C12.
Ă- ex =280 nm;
Ẳ em =333nm.
[13} Lichrosorb CN
(250 X 4 mm;
1 0 |j,m).
MeOH- Đệm
acetat 0,03 M pH
5,5(65:35).
Kết tủa protein
trong huyết
tương bằng
NaCl- Na2C 0 3
(4:1)
Ầ ex =285 nm;
Ằ em =405nm
[14]
Lichrosorb
C18(250 X 4,6
mm; 1 0 ịa.m).
MeOH-dung dịch
chứa 1% natri
octyl sulfat và

1,3% H3P 04
(65:35).
Chiết bằng hỗn
hợp n-butanol và
n-heptan(2 :8 )
Ằ ex =280 nm;
Ẳ em =333 nm.
( Ầ ex : Bước sóng kích thích, Ẳem : Bước sóng phát xạ)
Bảng 1.2: Một sô điều kiện sắc ký dùng cho detector huỳnh quang
6
1.2. Đại cương về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [6]
Các phương pháp hiện đại hay được dùng trong nghiên cứu sinh dược học
của thuốc nhưng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đặc biệt là HPLC pha
đảo với detector uv là phương pháp hay được dùng hơn cả, do tính ưu việt về
độ nhạy, độ chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế và khả năng ứng dụng rộng rãi
trong thực tiễn.
HPLC là phương pháp phân tích sử dụng kĩ thuật tách các chất trong hỗn
hợp dựa vào ái lực giữa các chất với 2 pha. Khi ta bơm pha động với áp suất cao
qua cột tuỳ thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ di chuyển qua cột
với tốc độ khác nhau dẫn tới sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được phát hiện bởi detector và được
chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được đưa ra máy in hoặc hiển
thị trên màn hình.
Tuỳ thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc ký khác
nhau. Trong khoá luận này, chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp sắc ký phân
bố pha đảo.
1.2.1. Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Máy HPLC gồm các bộ phận chính theo sơ đồ khối sau:
Thải
7

1.2.2. Phương pháp sắc kỷ phân bô pha đảo
Có thể phân tích thành 2 dạng tuỳ thuộc vào pha tĩnh:
* Sắc ký lỏng- lỏng : pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất
mang rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự
phân bố giữa 2 pha lỏng.
* Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo nên
dẫn chất siloxan. Hiện nay, sắc ký pha liên kết chiếm ưu thế, thay thế cho sắc
ký lỏng-lỏng.
o Pha tĩnh:
* Hay dùng nhất là loại chế tạo từ Si02 (silica). Nhóm -OH trên bề mặt hạt
silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan.
* Tính chất phân cực của pha tĩnh phụ thuộc vào gốc R. Với SK pha đảo
thì R là nhóm ít phân cực như: octyl (C8 ), octadecyl (C18), phenyl.
\ \ I Ch3
v/v"'-ny' Sj

OH + Cl § .

p g.
o

s

R
^ ^ ^ ! h 3 . .
Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất
siloxan
* Liên kết siloxan chỉ bền vững trong khoảng pH 2-8, ngoài khoảng này
liên kết rất dễ thủy phân. Vì vậy, sắc ký các base ở pH 8-12 thường dùng cột
polyme.

© Phân biệt SK pha thuận, pha đảo:
Hai SK này khác nhau phụ thuộc vào độ phân cực tương đối của pha động
và pha tĩnh.
* Trong SK pha thuận, dùng pha tĩnh lỏng phân cực như: cyano, amino,
diol, Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexan, iso propyl ether.
Khi chạy sắc ký, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, nếu tăng độ phân
cực của pha động thì thời gian lưu giảm dần.
* Trong SK pha đảo thì ngược lại, các chất phân cực nhất được rửa giải đầu
tiên. Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu tăng lên.
Trong phương pháp HPLC quy định sự tách các chất là tổng hợp của các
tương tác: chất tan- pha tĩnh, chất tan- pha động, pha tĩnh- pha động. Tổng của
3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải đầu tiên khi lực lưu giữ là
nhỏ nhất và ngược lại.
© Pha động:
Trong SK pha đảo, có 3 dung môi thường dùng là: MeCN, MeOH, THF.
Để làm pha động thường chọn hỗn hợp 1-2 dung môi trên với nước dung
dịch đệm nhằm đảm bảo tương tác với chất tan để tách hỗn hợp nhiều chất.
Hỗn hợp thường dùng nhất là MeCN với nước. MeCN có ưu điểm là có độ
nhớt thấp nên có thể SK ở áp suất thấp và có thể đo độ hấp thụ u v đến 190nm.
MeOH được lựa chọn thứ hai, vì độ nhớt cao hơn và giới hạn đo ở vùng
u v là 205nm.
THF ít dùng hơn vì độ ổn định kém hơn, cân bằng với pha tĩnh chậm hơn.
© Một số chú ý để đảm bảo cho pic cân đối:
* Cột sắc ký: dùng thêm cột bảo vệ
* Pha động: tinh khiết.
- Để giảm hiện tượng kéo đuôi, thường thêm vào pha động TEA 30 mM,
TEA sẽ liên kết với 1 số vị trí hoạt động mạnh trên bề mặt silica nên ngăn cản
lưu giữ chất phân tích ở các vị trí đó.
1.2.3. Một sô thông số đặc trưng [6]
1.2.3.1. Hệ số dung lượng : k ’

Là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong 2 pha cộng với
sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất
9
tan trong pha động ở thời điểm cân bằng, k’ dùng để mô tả tốc độ di chuyển của
1 chất, được tính theo công thức sau:
Trong đó : Qs và QM là lượng chất phân bố trong pha tĩnh và pha động.
Bằng thực nghiệm, hệ số dung lượng được tính theo cách sau:
ỵy _ tạ ~ tp
k’ : Phụ thuộc vào bản chất các pha, bản chất chất tan, nhiệt độ và đặc
điểm của cột. k’ càng lớn thì tốc độ di chuyển càng thấp, pic bị doãng, độ nhạy
kém và tR kéo dài. Nhưng k’ thấp thì tRnhỏ do đó khả năng tách kém.
Thường chọn điều kiện phân tích sao cho k’ nằm trong khoảng từ 1-5 là tốt nhất.
1.2.3.2 Thời gian lưu (tR)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống
sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc đồ.
So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu . thử và mẫu chuẩn làm
trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
1.2.3.3. Sô đĩa lí thuyết (Biểu thị hiệu lực cột sắc ký)
Bằng thực nghiệm, ta có công thức:
N = 5,54
l w0,5 )
í t V
hoặc N= 16
\ wb)
Nếu cột có chiều dài là L thì ta có công thức sau: H = —
N
Trong đó: H là chiều cao đĩa lí thuyết.
10
Cột có N lớn (hay H nhỏ) là cột có hiệu lực cao.
1.2.3.4. Độ phân giải (RJ.

Là đại lượng đo mức độ tách của 2 pic liền kề trên cột sắc ký, được tính
theo công thức sau:
tị _ 2 ( t R B ~ Ì r.A ) p _ R,B~ t R B)
s= WA + WB ; s= w ^ + w ” ”
Trong đó:
Ír A’ Ír b : Là thời gian lưu của 2 pic liền kề của chất A và B.
WA, WB : Là độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B.
W 1/2A, W 1/2B : Là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A và B.
Nếu: Rs =l,5 : 2 pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%.
Đê tăng Rs, có các biện pháp sau:
- Tăng N: Dùng cột dài hơn hoặc giảm tốc độ dòng pha động.
- Tăng k’: Thay đổi tốc độ pha động.
-Tăng a : Thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động.
Yêu cầu: Rs >1 , giá trị tối ưu Rs =1,5.
1.2.4. Các phương pháp định lượng bằng HPLC[6]
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
Đáp ứng phân tích (chiều cao hoặc diện tích pic) tỷ lệ với nồng độ của chất
phân tích. Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:
- Phương pháp chuẩn ngoại.
- Phương pháp chuẩn nội.
- Phương pháp thêm chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích.
11
Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng phương pháp chuẩn ngoại để định
lượng propranolol trong dịch sinh học. Do vậy, chúng tôi tập trung giới thiệu
phương pháp định lượng này.
Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2
mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
Trong đó, có thể sử dụng phương pháp chuẩn hoá 1 điểm hoặc nhiều điểm.
* Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của

mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:
c* = sx^
Trong đó, cx: nồng độ mẫu thử.
c s: nồng độ chất chuẩn.
sx: diện tích của pic mẫu thử.
Ss: diện tích của pic mẫu chuẩn.
* Chuẩn hoá nhiều điểm:
- Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký.
- Vẽ đổ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic với
nồng độ của chất chuẩn.
- Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của mẫu
thử cần xác định.
Chú ý: Độ lớn của diện tích pic mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính
của đường chuẩn.
1.3. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích sinh học[2]
1.3.1. Khái niệm
Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp
để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế.
1.3.2. Các mức độ thẩm định phương pháp phân tích sinh học(PTSH)
12
Có 3 mức độ thẩm định là:
- Thẩm định đầy đủ: rất quan trọng đối với:
+ Xây dựng và triển khai phương pháp PTSH lần đầu.
+ Thuốc mới.
- Thẩm định chéo: Là so sánh các thông số thẩm định khi hai hay nhiều
phương pháp phân tích được sử dụng để cung cấp dữ liệu.
- Thẩm định một phần: Được sử dụng khi có những thay đổi trong phương
pháp PTSH đã được thẩm định. Trong đó có một số trường hợp cần phải tiến
hành thẩm định một phần là:

+ Thay đổi chất chống đông khi lấy dịch sinh học.
+ Thay đổi loại mẫu sinh học (ví dụ thay huyết tương bằng nước tiểu).
+ Thay đổi trong quá trình xử lý mẫu.
+ Thay đổi chủ thể thử nghiệm (ví dụ: huyết tương chuột cống thay bằng
huyết tương chuột nhắt).
+ Thay đổi khoảng nồng độ cho thích hợp hơn
Nếu quy trình tiến hành đã thẩm định có thay đổi thì phải tiến hành tái
thẩm định. Tùy theo mức độ thay đổi mà việc tái thẩm định phải tiến hành gồm
• * M
các tiêu chí được hướng dẫn ở bảng sau:
Các thông sô thay đổi
Các thông sô tái thẩm định
Dung môi chiết, đệm, dung môi hoà
tan mẫu sắc ký.
Độ tuyến tính, độ tìm lại, tính chọn
lọc, LOQ, độ chính xác, độ ổn định
trong quá trình phân tích.
Cột sắc ký, thành phần pha động
(thay đổi rõ ràng về thời gian lun),
loại detector, bước sóng.
Độ tuyến tính, tính chọn lọc, LOQ,
độ chính xác, độ đúng.
13
Mở rộng khoảng nồng độ của đường
chuẩn.
Độ tuyến tính, LOQ (nếu nồng độ
giảm), độ chính xác, độ đúng.
Chuẩn nội
Độ tìm lại, tính chọn lọc, độ chính
xác, độ đúng.

14
CHƯƠNG 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC HIỆN
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Máy móc- dụng cụ
Cân điện tử, cân kĩ thuật Metller (Thụy Sĩ).
Máy đo pH Metller (Thụy Sĩ).
Máy siêu âm Sonorex (Mỹ).
Máy ly tâm điện Hettich (Đức).
Máy siêu ly tâm Satorius (Đức).
Máy lắc xoáy Labinco (Hà Lan).
Tủ lạnh sâu Frigor (Đan Mạch).
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Thermo Finigan (Mỹ).
Ống nghiệm thuỷ tinh borosilicat nút xoáy 1 0 ml.
Ống nghiệm chứa chất chống đông EDTA.
Ong ly tâm teflon 1,5 ml.
Pipet tự động Biohit (Phần Lan) 0,5-10|il :10-100|il: 100-1000|!l
Bình định mức, pipet và dụng cụ thuỷ tinh đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng
thí nghiệm phân tích.
2.1.1.2. Hóa chất- chất đối chiếu- mẫu thử
- Hoá chất:
+ Acetonitril: loại dùng cho HPLC (Merck- Đức).
+ Natri acetat: loại dùng cho phân tích.
+ Methanol: loại dùng cho HPLC (Merck- Đức).
+ Dichloromethan: Đạt tiêu chuẩn PA (Trung Quốc).
15
+ KH2P 04 : Đạt tiêu chuẩn PA (Merck- Đức).
+ NaOH: loại dùng cho phân tích.
- Chất đối chiếu: Propranolol hydroclorid 99,0%.
- Chế phẩm thử: Viên nang Hémipralon LP 80 mg. Số lô: P001 UTAV.

Hạn dùng: 09- 2008.
Nhà sản xuất: Beaufour Ipsen Pharma (Pháp).
- Động yật thí nghiệm: Chó đực, nặng 12 kg, đạt tiêu chuẩn động vật thí
nghiệm.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết
tương
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc propranolol
Cân chính xác 56,7 mg propranolol hydrochlorid tương ứng với 50 mg
propranolol. Hoà tan vừa đủ trong 10 ml hỗn hợp methanol- nước (65: 35). Lắc
đều, nồng độ của dung dịch gốc là 5 mg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc pha thành
các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ từ 2,5- 125 Ị-ig/m trong nước. Cho lOịil
dung dịch ở mỗi nồng độ vào từng 490 |il huyết tương trắng để xây dựng đường
chuẩn hoặc thẩm định phương pháp.
- Xử lý mẫu: Mẫu nghiên cứu được đựng trong ống nghiệm có nút xoáy kín,
dung tích 1 0 ml và được xử lý theo hai phương pháp là: chiết bằng dung môi
hữu cơ và kết tủa protein.
+ Chiết bằng dung môi hữu cơ dichloromethan [8 ]: Quy trình chiết được
thực hiện theo sơ đồ sau:
16
Hình 2.1: Sơ đồ chiết propranolol trong huyết tương
+ Kết tủa protein bằng MeCN. Theo phương pháp này, chúng tôi đã sử
dụng nhũng lượng MeCN khác nhau và tốc độ ly tâm thay đổi để xác định điều
kiện định lượng tốt nhất.
- Điều kiện sắc ký: Chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký phân bố pha
đảo với detector hấp thụ ƯV.
Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đó và điều kiện sẵn có của phòng thí
nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký như: Cột sắc ký, pha
I • h ư -v ỉẽ.N'*
động, bước sóng để thu được pic PRO sắc nét, riêng biệt, thời gian phân tích

hợp lý, độ nhạy phù hợp yêu cầu phân tích.
2.I.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích định lượng Propranolol
trong huyết tương [2]
Phương pháp phân tích propranolol trong dịch sinh học cụ thể là trong
huyết tương thỏ đã được thẩm định [8 ]. Theo quy định [2], khi thay đổi: chủ thể
thử nghiệm (từ thỏ sang chó), thay đổi trong quá trình xử lý mẫu chúng tôi
tiến hành thẩm định một phần phương pháp phân tích. Với các tiêu chí cần thẩm
định là: tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, độ đúng, độ chính xác, độ
tuyến tính, LOQ.
a) Đánh giá tính phù hợp của hệ thống HPLC
Tính phù hợp của hệ thống HPLC được xác định bằng cách tiêm 6 lần 1
mẫu propranolol chuẩn trong huyết tương đã được xử lý theo điều kiện đã chọn.
RSD của các thông số: thời gian lưu, diện tích pic propranolol phải không
lớn hơn 2%.
b) Độ chọn lọc
Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, mỗi mẫu có 500 [ủ huyết tương:
3 mẫu không thêm propranolol chuẩn.
3 mẫu thêm propranolol chuẩn.
Xử lý mẫu, tiến hành sắc ký.
Yêu cầu:
Tại vị trí tương ứng với pic propranolol kết quả phân tích của mẫu trắng
không được xuất hiện pic.
c) Khoảng nồng độ tuyến tính
Tiến hành tại 7 điểm nồng độ của propranolol, các nồng độ đều nằm trong
khoảng từ LOQ đến ULOQ (dự đoán), tiến hành trong cùng ngày phân tích.
Xử lý mẫu, tiến hành sắc ký.
18
Thiết lập mối tương quan giữa tín hiệu đáp ứng (diện tích pic) với nồng độ
propranolol biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồi quy.
Yêu cầu: Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị tương quan

hồi quy phải không nhỏ hơn 0,99. Đường hồi quy phải được xây dựng trong
cùng ngày phân tích.
d) Giới hạn định lượng
Cách tiến hành: Thêm 10|^il dung dịch propranolol chuẩn vào từng mẫu
huyết tương trắng với các nồng độ thấp dần.
Xử lý mẫu, tiến hành sắc ký.
LOQ là nồng độ thoả mãn điều kiện: Tại vị trí tương ứng với pic
propranolol, chiều cao pic thu được của mẫu thêm propranolol chuẩn phải gấp
khoảng 1 0 lần chiều cao nhiễu đường nền của mẫu trắng.
e) Độ chính xác
Cách xác định: Thêm propranolol chuẩn vào mẫu trắng để đạt nồng độ
nằm trong khoảng 10-30% của thang đường chuẩn.
Làm tại nồng độ này 6 mẫu. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký.
Yêu cầu: RSD phải không lớn hơn 15%.
f) Độ đúng.
Cách tiến hành: mẫu thử trong huyết tương được chuẩn bị giống như phần
xác định độ chính xác.
Chuẩn bị mẫu thử trong dung môi hoà tan ở nồng độ tương ứng với nồng
độ ở mẫu thử trong huyết tương.
Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký.
Tính phần trăm giữa đáp ứng thu được của propranolol trong mẫu huyết
tương và đáp ứng của propranolol trong dung môi hoà tan.
Yêu cầu: Kết quả trung bình thu được ở mỗi nồng độ phải sai không quá
15% so với giá trị thực.
19
2.1.2.3. Thử nghiệm trên động vậ t
- Cho chó uống một viên Hémipralon LP 80 mg với khoảng 15ml nước.
- Lấy mẫu:
+ Lấy 2,5 ml máu ở tĩnh mạch chi sau tại thời điểm sau 5 giờ uống thuốc
cho vào ống nghiệm có sẩn EDTA.

+ Lắc nhẹ, máu được để lạnh ngay và ly tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút.
+ Hút 500 Ịil huyết tương cho vào ống nghiệm có nút xoáy, đậy kín và bảo
quản ở -30°c trước khi phân tích.
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương
chó
2.2.1.1. Điều kiện sắc ký
* Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như sau:
+ Cột sắc ký: Dùng các cột C8 , C18, CN.
+ Pha động: Khảo sát trên 3 hệ dung môi là:
^ MeCN: KH2P04 0,05M pH 6,5 ±0,1 (35: 65) (1)
Dung dịch 0,5g SDS trong 18 ml H3P04 0,15M. Thêm 90 ml
MeCN, 90 ml MeOH, bổ sung nước vừa đủ 250 ml (2)
^ CH3COONa 0,03M pH 5,5±0,1: MeOH (35: 65) (3)
+ Bước sóng: Khảo sát tại 2 khoảng bước sóng: 220-230 nm và 290 nm.
+ Lưu lượng dòng: 1 ml/phút.
+ Thể tích mẫu tiêm: 50 ỊLil.
* Kết quả cho thấy:
- Cột sắc ký: cột C18 (Hypersil ODS) là phù hợp, có khả năng tách chọn lọc
20