Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC



BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ


ĐỀ TÀI :
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ
SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ
BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO
MÃ SỐ CS. 2005. 23. 92


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
TS. Trần Thanh Thúy


TP. HỒ CHÍ MINH - 2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ


ĐỀ TÀI :
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ
SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ
BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO
MÃ SỐ CS. 2005. 23. 92


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
TS. Trần Thanh Thúy


TP. HỒ CHÍ MINH - 2006

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về probiotic 3
1.1.1. Lƣợc sử nghiên cứu probiotic 3
1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật đƣợc sử dụng trong probiotic 3
1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic 5
1.1.4. Vai trò của probiotic 8
1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN 11
1.2. Sơ lƣợc về vi sinh vật probiotic 13
A. Vi khuẩn lactic 13
1.2.1. Đặc điểm hình thái 14
1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic 14

1.2.3. Quá trình lên men lactic 16
1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình 16
1.2.3.2. Lên men Lactic dị hình 17
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn lactic 17
1.2.4.1. Nguồn cacbon 17
1.2.4.2. Nguồn nitơ 18
1.2.4.3. Các muối vô cơ 18
1.2.4.4. Các chất sinh trƣởng 18
1.2.4.5. Oxy 19
1.2.4.6. Nhiệt độ 19
1.2.4.7. pH 20
1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sình học phục vụ đời sống 20
B. Nấm men 21
1.3. Tổng quan về heo 24
1.3.1. Vị trí phân loại của heo 24
1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con 24
1.3.2.1. Đặc điểm bộ máy tiêu hóa 24
1.3.2.2. Thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột 25
1.3.3. Các bệnh đƣờng ruột ở heo con 25
1.3.3.1. Bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli 25
1.3.3.2. Tiêu chảy do Saimonella (Phó thƣơng hàn) 26
1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị 26
1.3.4.1. Phòng bệnh 26
1.3.4.2. Điều trị 27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.1. Vật liệu 29
2.1.1. Nguyên liệu 29
2.1.2. Môi trƣờng (xem Phần phụ lục) 29
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 29
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp Koch [13] 29

2.2.2. Xác định khả năng sinh axit tổng bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25],
[36], [37] 29
2.2.3. Định lƣợng axit lactic bằng phƣơng pháp chuẩn độ Therner [12], [13], [25],
[36], [37] 30
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 30
2.2.5. Xác định hoạt tính ức chế vỉ khuẩn kiểm định bằng phƣơng pháp khoan lỗ thạch [12],
[13], [25], [36], [37]. 32
2.2.6. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của vi khuẩn lactic 33
2.2.7. Phƣơng pháp bảo quản giống VK lactic bằng phƣớng pháp đông khô 34
2.2.8. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi
trƣờng thạch [12], [13], [36], [37] 35
2.2.9. Khảo sát sự sinh trƣởng và và các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của vi
khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đo mật độ quang [12], [13] 35
2.2.10. Khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng tạo sinh
khối của tế bào nấm men bằng phƣơng pháp cân sinh khối tƣơi 38
2.2.11. Phƣơng pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic [12], [13], [36], [37] 38
2.2.12. Tạo chế phẩm probiotic 39
2.2.13. Phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa 40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42
3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng VSV có các đặc tính phù hợp với yêu cầu tạo chế phẩm
probiotic 42
3.1.1. Phân lập và sơ bộ tuyển chọn Vklactic 42
3.1.2.Tuyển chọn các chủng VK lactic - probiotic 42
3.1.2.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng 43
3.1.2.2. Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định 44
3.1.2.3. Khảo sát hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh 46
3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn lactic tuyển
chọn 48
3.2.1. Các đặc điểm hình thái của chủng B, N
4

, L
2
48
3.2.2. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng B, N
4
, L
2
48
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men 52
3.3.1. Khả năng đề kháng các kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae 52
3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định 53
3.3.3. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men 54
3.4. Ảnh hƣởng một số điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối các chủng nghiên
cứu 55
A. Vi khuẩn lactic 55
3.4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy 55
3.4.2. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi
khuẩn lactic 57
3.4.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy 57
3.4.2.2. pH ban đầu 59
3.4.2.3. Nguồn thức ăn nitơ 60
3.4.2.4. Nồng độ cao nấm men 62
3.4.2.5. Nguồn thức ăn cacbon 63
3.4.2.6. Nồng độ saccharose 64
3.4.3. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện
tối ƣu 65
B. Nấm men 66
3.5. Tạo chế phẩm probiotic 68
3.5.1. Đông khô các chủng VSV 68
3.5.2. Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm 68

3.5.3. Đóng gói tạo chế phẩm probiotic 71
3.6. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm 72
3.6.1. Khả năng sống sót của các chủng vsv sau quá trình đông khô 72
3.6.2. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm 73
3.7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic 75
3.8. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa 76
3.8.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa 76
3.8.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa 78
3.8.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC 84
PHỤ LỤC i




BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CNSH
Công nghệ sinh học
ĐHNN
Đại học Nông nghiệp
ĐHQG
Đại học Quốc gia
ĐHSP
Đại học Sƣ phạm
MT
Môi trƣờng
PTN
Phòng thí nghiệm
SHPT

Sinh học phân tử
TB
Tế bào
TBC
Tế bào chất
TG
Thế giới
VK
Vi khuẩn
VN
Việt Nam
VSV
Vi sinh vật
Mẫu 1.10

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ
Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu sử dụng Vi sình vật để sản xuất chế phẩm
probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo.
Mã số: CS.2005.23.92
Chủ nhiệm đề tài: Trần Thanh Thủy Tel:0908 402 475
Email:
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM
Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :
1. TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. TS. Võ Thị Hạnh, Phòng Vi sinh, Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM.
Thời gian thực hiện: 1 năm.
1. Mục tiêu: Sử dụng một số chủng VSV có lợi (Vi khuẩn lactỉc, nấm men) tạo chế
phẩm có khả năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo cỏ hiệu quả.
2. Nội dung chính:

- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có hoạt tính cần thiết của
chủng probiotic.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng VSV đã
tuyển chọn.
- Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho sự tạo sinh khối các chủng.
- Tạo chế phẩm probiotic.
- Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm.
- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.
3. Thành quả chính đạt đƣợc (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế - xã hội):
- Đã có 2 bài báo :
"Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm men Saccharomyces sp.02", Tạp chí Khoa
học Trƣờng ĐHSP TP.HCM năm 2006.
" Đặc điểm các chủng vi khuẩn lactic dùng trong chế phẩm probiotic phòng và trị
bệnh tiêu chảy cho heo," Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trƣờng ĐHBK Hà Nội, năm 2006).
- Hoàn thành 1 luận văn Thạc Sĩ Sinh học, 2 cử nhân Sinh học.
Mẫu 1.10
SUMMARY
Project Title:
Onfirst study on utilliation microorganisms stains to produce the preparation
probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs
Code number: CS.2005.23.92
Coordinator: Dr. Trần Thanh Thủy Tel: 0908 402 475
Implementing Institution : Hồ Chí Minh city University of Pedagogy
Cooperating Institution(s):
Dr. Nguyễn Thị Hoài Hà - Center of Biotechnology Việt Nam national University, Hà
Nội
Dr. Võ Thị Hạnh - Institute of Tropical Biology, National center for Science and
Technology of Việt Nam.
Duration: from 6/ 2005 to 6/2006
Objectives:

On first study on utilization microorganisms stains to produce the preparation
probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs
Main contents:
- Isolation and selection of some acid lactic bacteria, yeast strains with high probiotic
activity.
- Studies biological characteristisct of the yast and acid lactic bacteria strains.
- Studies the optimal conditions for their receiving biomass .
- Research on technology to produce probiotic.
- To appraise the quality of products.
- On first test probiotic on weaned piglings, we find good resuls.
Results obtained :
+ " Lactic acid bacteria characteristics in probiotic for preventing and treatirtg the
digestive disorder of pigs ", proceeding of the 20
th
scientfic conference Ha Noi University of
Technology, 10/2006.
+ "Studying some biological characteristisct of the strain Saccharomyces sp.02,
Journal of science Ho Chi Minh city University of Pedagogy, 7/2006.
+ Finish 1 dissertation of Biology master, 2 dỉssertation Biology bachelors.
1

MỞ ĐẦU
Đã từ lâu, VK lactic và nấm men vốn nổi tiếng với vai trò quan trọng trong các thực
phẩm lên men đem lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. Những năm gần đây, nhóm
VSV này đƣợc biết đến nhiều hơn với chức năng "VK probiotic" nhằm ngăn ngừa, hạn chế
dịch bệnh cho ngƣời và vật nuôi. Probiotic là chế phẩm có bổ sung các vi sinh vật sống có lợi
giúp cải thiện sự cân bằng hệ VSV tự nhiên nơi đƣờng ruột, có khả năng cạnh tranh và đối
kháng với mầm bệnh, tiết các chất trung hòa các độc tố, tăng cƣờng chuyển hóa thức ăn, bổ
sung các dƣỡng chất (protein, khoáng, vitamin), kích thích miễn dịch trên cơ thể ngƣời cũng
nhƣ vật nuôi.

Trong chăn nuôi heo, bệnh tiêu chảy là căn bệnh khá phổ biến, gây thiệt hại không
nhỏ đến năng suất và chất lƣợng sản phẩm nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh này
thƣờng dẫn đến hiện tƣợng loạn khuẩn khiến tiêu chảy kéo dài cùng với những hậu quả
nghiêm trọng cho sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ môi trƣờng sinh thái. Phƣơng pháp hữu hiệu
nhất khắc phục tình trạng này là tái lập cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột bằng cách bổ sung
một hệ vi khuẩn có lợi mới dƣới dạng các chế phẩm probiotic.
Phòng bệnh bằng chế phẩm tiền sinh học hay còn gọi là probiotic nhằm tăng cƣờng
khả năng tự đề kháng bệnh cho vật nuôi là cách làm có hiệu quả lâu bền và an toàn sinh học.
Trên thị trƣờng hiện đang lƣu hành nhiều loại chế phẩm probiotic ngoại nhập nhƣ Bye (Mỹ),
Neo-Perk-Porcine (Anh), Lacfeed 66G (Nhật), cho kết quả tốt nhƣng không ổn định và giá
thành còn cao.
2

Do đó, việc nghiên cứu sử dụng các VSV có lợi để tạo chế phẩm probiotic nhằm khắc
phục tình trạng trên là việc làm hết sức cần thiết trong điều kiện hiện nay. Đó cũng chính là
lý do khiến chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu : "Bước đầu nghiên cứu sử dụng các vi sinh
vật tạo chế phẩm Probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo"
Mục tiêu của đề tài:
Sử dụng một số chủng VSV có lợi (VK lactic, nấm men) nhằm tạo chế phẩm có khả
năng phòng và trị bệnh đƣờng ruột cho heo con hiệu quả.
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có các hoạt tính cần thiết
của một chủng probiotic.
2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng VSV
đã tuyển chọn.
3. Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho sự tạo sinh khối các chủng.
4. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống và tạo chế phẩm probiotic.
5. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm.
6. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.
7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic quy mô PTN.

Đề tài được thực hiện tại:
- Phòng thí nghiệm Sinh lí - Sinh hóa - Vi sinh Trƣờng ĐHSP Tp.HCM
- Phòng thí nghiệm Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM.
- Phòng thí nghiệm CNSH và SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG
Hà Nội.
- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm tại trại chăn nuôi heo xã Đại Hải, huyện Kế Sách,
tỉnh Sóc Trăng.
3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về probiotic
1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic
Khái niệm probiotic đầu tiên đƣợc mô tả nhƣ là hệ VSV trong thức ăn bổ sung cho
ngƣời và vật nuôi.
Năm 1925, Beach là ngƣời đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có
chứa các VK "Lactobacillus acidophiỉus" [46].
Năm 1965, thuật ngữ probiotic đƣợc đƣa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mô
tả những VSV có khả năng kích thích sinh trƣởng của một số vật nuôi.
Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng trƣởng của
heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46].
Năm 1989, Fuller (Anh), cùng nhiều nhà khoa học khác nhƣ Lee (Singapore),
Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) đều thống nhất trong định nghĩa
: "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt
cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột" [41], [42],
[46].
1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic
Hiện biết có khoảng gần 20 loài VK đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotic. Các VK
lactic có lợi giữ vai trò chính đƣợc sử dụng nhƣ L. acidophỉlus, Lactobacillus delbrueckii
subs, Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve,Enterococcus
faecium ,

4

Chúng có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của VSV gây bệnh.
Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đƣờng ruột, tạo môi trƣờng không thuận lợi cho
VSV có hại phát triển. Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H
2
0
2
, sản xuất các
enzym tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (B
1
, B
2
, B
6
, B
12
), khử độc
tố trong đƣờng ruột [1], [42], [46].
Tham gia vào thành phần VSV probiotic còn có nấm men nhƣ Saccharomyces
cerevisiae và Sac. bouiardij. Nấm men ngoài khả năng làm cân bằng hệ VSV trong đƣờng
ruột còn có vai trò tạo ra sinh khối nhanh, sinh khối giàu axit amin, các vitamin (nhóm B, D),
tiết các chất có khả năng hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng lên men chuyển hóa
glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi khác trong đƣờng ruột hoạt động và
sinh sản. Nấm men còn tiết các enzym tiêu hóa nhƣ amylase, protease, và còn có khả năng
đề kháng lại với tất cả các kháng sinh (trừ kháng sinh nấm). Chính vì vậy, chúng có thể tồn
tại ở bất cứ nơi nào trong đƣờng ruột của vật nuôi mà hoàn toàn không bị kháng sinh tiêu diệt
[1], [11], [42], [46].
Có thể tóm tắt đặc điểm chung của VSV probiotic là :
- Có khả năng gắn vào tế bào.

- Loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại.
- Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh.
- Tạo ra các chất chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh.
- Không lan truyền rộng, không gây ung thƣ và không gây bệnh.
5


Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước [46], [56]

Sản phẩm, nhà sản
xuất, xuất xứ
Chủng VK lactic
sử dụng
Chức năng
Dạng sản phẩm
LC1, Nestlé (Mỹ, Pháp,
Ý, Anh, Đức)
L. bulgaricus
L. johnsonii
Kích thích hệ thống
miễn dịch
Sữa lên men
PAIGEN TWINU,
Cp-Meiji (Thái Lan)
L. bulgaricus
L. acidophilus
Tăng cƣờng sức khỏe
Sữa lên men
Lactinex, Hynson (Mỹ)
L. bulgaricus

L. acidophilus
Tăng cƣờng sức khỏe
Thuốc bột
BioI, Viện Sinh học
nhiệt đới TP. HCM (Việt
Nam)
L. acidophilus
Saccharomyces
sp.
Phòng chống các rối
loạn tiêu hóa, giảm
tiêu hao thức ăn cho
heo
Bột mịn
Organic Green, Han
Poong (Nam Triều Tiên)
L. acidophilus
Phòng chống bệnh
tiêu chảy cho heo
Bột mịn
Ultra levure
(Pháp)
Saccharomyces
boulardii
Phòng chống rối loại
tiêu hóa, tăng cƣờng
sức khỏe
Viên viên nhộng
Emitan
(Trƣờng ĐHNN I Hà

Nội)
Endomycosis CG2
Chữa chứng tiêu chảy,
tăng chuyển hóa thức
ăn
Chế phẩm dạng bột
mịn
1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic
- Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh
Khi cung cấp thƣờng xuyên các VSV có lợi dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đông
khô cho ngƣời và động vật với liều lƣợng thích hợp (1,2 tỉ CFU/ kg thức ăn/ngày), chúng sẽ
phát triển, chiếm ƣu thế và cạnh tranh với các VSV có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh
dƣỡng, về khối lƣợng các chất sinh ra bởi VSV [15], [41], [42], [46].
6

- Sản xuất các chất kháng khuẩn
Tác nhân ức chế VK gây bệnh của VK lactic không chỉ là axit lactic mà còn bởi
những chất ức chế đặc hiệu khác nhƣ axit hữu cơ, ethanol, H
2
O
2
, diacetyl, [11], [46], [48].
Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sản sinh axit lactic thì nhóm VK
lactic lên men dị hình tạo ra cả những axit hữu cơ khác nhƣ axit acetic, axit formic, axit
propionic, Những sản phẩm này làm giảm pH của môi trƣờng và khi pH đạt đến một mức
nào đó sẽ đủ để loại trừ những VSV gây hại trong đƣờng ruột. Chẳng hạn nhƣ các VSV gây
thối hỏng thực phẩm (B. subtilis, p. vulgaris, B. mensenterium, Clostridum), các VSV gây
bệnh nhƣ E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium,
Salmonella cholerasuis (gây sốt thƣơng hàn). Một số loài nhƣ Lactococcus lactis,
Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H

2
0
2
khi chuyển từ môi trƣờng kị khí sang hiếu khí.
H
2
O
2
có khả năng ức chế Staphylococus aureus một loại tụ cầu vàng gây nhiễm độc thức ăn.
[1], [11]. Hoạt tính ức chế của Diacetyl tăng lên trong môi trƣờng axit, ức chế mạnh hơn đối
với VK G
-
và nấm mốc, đặc biệt với M. turberculosis (VK gây bệnh lao).
- Kháng khuẩn do sinh bacteriocin
Bacteriocin của VK lactic là các phân tử protein có khả năng ức chế các VK có quan
hệ chủng loại gần với chủng VK sinh bacteriocin đó. Những nghiên cứu gần đây cho thấy
một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK G
+
và G
-
.
7

Cơ chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt nhƣ sau : bacteriocin đƣợc hút bám
trên màng tế bào VSV nhạy cảm với nó, làm giảm thế năng của màng, gây những thƣơng tổn
không thể khắc phục đƣợc. Sau đó, chúng dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm thay đổi pH nội
bào, dẫn đến phá vỡ hoặc làm suy giảm động lực proton, đồng thời gây ra sự thoát các axit
amin tích tụ và các thành phần nội chất khác của tế bào ra ngoài môi trƣờng qua các lỗ thủng
trên màng. Cuối cùng, tế bào chết do mất năng lƣợng [41], [42], [46], [48].
Zymocin là một loại kháng sinh do một số chủng nấm men tiết ra nhằm chống lại sự

cạnh tranh giữa các chủng cùng loài hoặc chủng thuộc họ gần. Chúng có bản chất là
polipeptit hay glucoprotein. Do tính chọn lọc cao nên zymocin còn có tiềm năng chống lại
một số bệnh nan y. Theo Nguyễn Kim Minh Tâm (2001), Saccharomyces boulardii có khả
năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficili (gây viêm ruột kết màng giả),
trung hòa nội độc tố của E. coli, Vibrio cholerae nên đƣợc dùng trị tiêu chảy cấp tính cho
ngƣời.
- Cân bằng hệ vi khuẩn trong đƣờng ruột
Đã có nhiều bằng chứng cho thấy khả năng phục hồi và duy trì sự cân bằng hệ VSV
đƣờng ruột nhờ chế phẩm probiotic có VK lactic hoặc có nấm men. Khi cho bệnh nhân bị
chứng rối loạn dạ dày hay đƣờng ruột sử dụng L. acidophilus, B. biỷidum và B. breve sẽ làm
gia tăng số lƣợng của Lactobacillus và giảm số lƣợng của E. coli trong ruột. Bệnh nhân sử
dụng thuốc trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số VSV có lợi trong đƣờng ruột
8

nên ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm có Bifidobacterium sp. và L. acidophilus để phục hồi hệ
VK đƣờng ruột cho những bệnh nhân này [46].
1.1.4. Vai trò của probiotic
a. Với con ngƣời
- Phòng và trị bệnh tiêu chảy, bệnh nhiễm khuẩn ở dạ dày, đường ruột.
Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophilus và L. reuteri sẽ làm giảm 1/2
số trẻ bị tiêu chảy do Rotavirus và giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể,
[11], [41], [46]. Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đông
khô cho trẻ em thì khoảng 95% trẻ em sẽ giảm thời gian tiêu chảy ngay sau ngày đầu tiên và
ít nôn mửa, không tiêu ra máu ngay sau ngày thứ hai chữa trị [41], [42], [46].
- Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa
Khi cơ thể thiếu enzym B-galactosidase, đƣờng lactose sẽ không đƣợc tiêu hóa thành
glucose và galactose và bị chuyển ngay xuống ruột già. Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi
những VK đƣờng ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng. Điều này gây bất lợi
cho việc tiêu hóa sữa. Nhƣng nếu thay sữa bằng sữa lên men, lƣợng lactose sẽ giảm đi, đồng
thời enzym B-galactosidase đƣợc tăng cƣờng nhờ VK lactic sẽ có tác dụng làm giảm đi

những triệu chứng của bệnh này.
- Phòng và trị một số bệnh khác
Việc sử dụng các chế phẩm Probiotic hay sữa chua với liều lƣợng thích hợp sẽ có khả
năng chữa khỏi trên 50% số ngƣời bị táo bón, làm giảm lƣợng cholesterol, cải thiện tình trạng
bệnh nhân bị bệnh gan mãn
9

tính [41], [46]. Những bệnh nhân nhiễm trùng đƣờng hô hấp và đƣờng niệu có hàm lƣợng
Candida ở trong phân (10
5
tế bào/g phân) rất cao. Khi bệnh nhân uống Bifidobacterium, hàm
lƣợng Candida sẽ giảm đáng kể và sự nhiễm trùng cũng giảm [41], [42], [46].
Các VK lactic trong chế phẩm probiotic còn có khả năng làm giảm các enzym
Nitroreductase, Azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiền ung thƣ thành chất gây
ung thƣ [11], [46]. Chúng có khả năng làm thoái hóa khối u hạn chế sự giảm bạch cầu trong
điều trị phóng xạ, kéo dài sự sống cho bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung và ung thƣ bàng quang
[46], [48].
Bên cạnh đó, nấm men trong chế phẩm probiotic còn có khả năng cung cấp các
vitamin thuộc nhóm B đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, protein giúp tăng cƣờng
sức đề kháng cho ngƣời bệnh, cho những ngƣời ăn kiêng.
b. Với vật nuôi
- Cải thiện tỷ lệ tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn
Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho
ngƣời sản xuất. Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một hay nhiều chủng VK lactic có
chức năng cải thiện khu hệ VSV đƣờng ruột, nâng cao chất lƣợng sản phẩm, tận dụng thức
ăn,
Nghiên cứu trên heo con 4 tuần tuổi và heo trƣởng thành với 4 lô thí nghiệm. Kết quả
thu đƣợc cho thấy, khi sử dụng L. acidophilus với liều lƣợng 750mg/kg thức ăn đối với heo 4
tuần tuổi, đã làm cho heo tăng trọng bình quân mỗi ngày là 0,159 kg và tăng khả năng chuyển
hóa thức ăn. Axit

10

lactic giúp heo con gia tăng khối lƣợng cơ thể nhƣng nó không có tác dụng trên heo trƣởng
thành [15], [42], [42], [46].
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên
heo con và heo trưởng thành [46]
Chỉ tiêu
Đối chứng
Lactobacillus
S. faecium
Axit lactic
Lƣợng chế phẩm lấy
vào
0
750mg/kg
thức ăn
1250mg/kg
thức ăn
220mg/kg
thức ăn
Heo con :
Tăng trọng trung bình
mỗi ngày (kg)

0,145


0,159

0,134


0,145

Hệ số tiêu tốn thức ăn
3,09
2,43
2,82
2,61
Heo trƣởng thành :
Tăng trọng trung bình
mỗi ngày (kg)

0,84


0,83


0,83


-

Hệ số tiêu tốn thức ăn
3,17
3,20
3,20
-

Bổ sung chế phẩm Saccharomyces cerevisiae cho heo con đang bú có khả năng làm
giảm tỷ lệ tiêu chảy 4,8%, làm tăng trọng lƣợng heo con sau cai sữa từ 2-3% so với đối chứng
và làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn trong 17ngày [ll], [42], [46]. - cải thiện sự đề kháng bệnh
Khảo sát trên 312 heo con mới sinh, chia 2 lô thí nghiệm. Ở lô có sử dụng chế phẩm
probiotic - VBP (B. pseudolongum preparation), còn lô đối chứng không sử dụng chế phẩm.
Khi sử dụng chế phẩm VBP cho heo ngay sau khi sinh với liều lƣợng 0,5g/ ngày, liên tục
trong 10 ngày và tiến hành theo dõi bệnh tiêu chảy trong 3 tuần. Kết quả là hiếm thấy bệnh
tiêu chảy ở nhóm cho ăn VBP trong suốt tuần đầu heo mới sinh. Trong khi đối chứng có hơn
60% mắc bệnh tiêu chảy. Hơn thế, các độc tố đƣờng ruột do các
11


VK gây bệnh sinh ra có thể đƣợc trung hòa bởi probiotic. Từ đó làm giảm tỷ lệ tiêu chảy và
giảm tỷ lệ chết trên heo con do tiêu chảy.
Bảng 1.4. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi [46]
Vật nuôi
Probiotic
Liều sử dụng
Ảnh hƣởng
Bò đực cai sữa
B. pseudolongum
l g/ngày
Giảm sự xuất hiện bệnh
tiêu chảy
Heo còn bú
B. pseudolongum
0,5 g/ngày
Giảm sự xuất hiện bệnh
tiêu chảy, sức khỏe tốt hơn
Heo cai sữa

L. bulgaricus
500 ml/1l
36 g/1l
Tỷ lệ % E. coli thấp ở trực
tràng, giảm tỷ lệ chết ỡ heo
1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN
a. Những nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc
Ở Việt Nam hiện nay, có thể kể đến các công trình nghiên cứu về lĩnh vực này của
Viện Thú y quốc gia :
+ Yaourt và canh trùng Subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của heo con
(Đào Trọng Đạt, Vũ Đình Hƣng, 1962).
+ Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đƣờng ruột của gia súc (Lê
Thị Tài và cộng sự, 1968 - 1978).
+ Chế phẩm VSV (Saccharomyces boulardi) với bệnh phân trắng heo con (Phan
Thanh Phƣợng và cộng sự, 1968 - 1978).
+ Chế phẩm Biolactyl để phòng trị bệnh đƣờng ruột của heo (Phan Thanh Phƣợng và
cộng sự, 1979 - 1984).
+ Chế phẩm BioI để phòng trị bệnh đƣờng ruột của heo (Viện Sinh học nhiệt đới TP.
HCM, 2003).
12

Các nghiên cứu trên khẳng định việc sử dụng chế phẩm probiotic đều cho kết quả tốt
trong phòng, trị bệnh đƣờng ruột cũng nhƣ khả năng điều hòa và kích thích sự sinh trƣởng
của heo.
Năm 2002, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã sử dụng chế phẩm VITOM.l và VITOM.3 của
Nga trong phòng trị bệnh đƣờng tiêu hóa trên heo và gà. Kết quả thu đƣợc là trọng lƣợng heo
tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát
(VITOM.3).
Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002), nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm
EM1 trên heo con đã cho thấy chế phẩm này có tác dụng ức chế đối với E. coli, Salmonella,

Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Sreptococccus, Clostridium, Sarcina lutea. Kết
quả số lƣợng VK E. coli trong phân giảm, tỷ lệ tiêu chảy giảm và heo tăng trọng nhanh.
b. Những nghiên cứu và ứng dụng ở ngoài nƣớc
Theo Lema và cộng sự (2001), để kiểm tra sự bài thải của VK E. coli Q157, ông đã
trộn các VK probiotic với liều 6 x 10
6
CFU/ kg thức ăn liên tục trong 7 tuần. Kết quả cho
thấy lô 4 có sự bài thải VK E. coli trong phân thấp hơn các lô khác. Khác biệt này hoàn toàn
có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng probiotic.
Kyriakis và cộng sự (1999), nghiên cứu ảnh hƣởng của probiotic LSP 122 đến việc
phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên
4 lô : lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng VK B. toyoi với liều 10
6
tế bào/kg thức ăn và lô
4 sử dụng B. licheniformis với liều 10
6
và 10
7
tế bào/kg thức ăn. Kết quả thí nghiệm
13

giữa các lô khác biệt hoàn toàn và có ý nghĩa so với lô đối chứng (P< 0,05). Ngoài ra, tăng
trọng/ngày, tiêu tốn thức ăn ở lô thí nghiệm cũng cải thiện hơn so với đối chứng. Trong đó, lô
sử dụng 10
7
tế bào B. licheniformis cho kết quả tốt nhất. Theo Tuomola và cộng sự (1999),
làm thí nghiệm dùng các VK probiotic cho thấy Lactobacillus, L. johnsonii và L. rhamnosus
làm giảm sự bám dính của E. coli từ 90 - 91% ; riêng S. typhimurium bị giảm khả năng bám
dính đến 77% bởi L. johsonii và 83% bởi L. casei.
Mặc dù, các công trình nghiên cứu những khía cạnh khác nhau, sử dụng các chế phẩm

có thành phần vi khuẩn probiotic khác nhau nhƣng đều có chung kết luận là probitic đã ảnh
hƣởng có lợi trên nhiều mặt với cơ thể vật nuôi.
1.2. Sơ lƣợc về vi sinh vật probiotic
A. Vi khuẩn lactic
Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Scheele lần đầu tiên đã tách đƣợc axit lactic từ sữa
bò lên men chua.
Năm 1847, Blondeau đã công nhận axit lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản
ứng lên men.
Năm 1857, Louis Pasteur (Pháp) chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt
động của một nhóm VK đặc biệt gọi là VK lactic.
Năm 1873, Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium
lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis). Từ đó đến nay các nhà khoa học đã phân lập
đƣợc nhiều loại VK lactic khác nhau và
14

công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic đã đƣợc hình thành từ năm 1881.
Trong tự nhiên, VK lactic có mặt ở nhiều nơi : trong phân, rác, niêm mạc ruột, Đặc
biệt có nhiều trong sản phẩm lên men chua. VK lactic ngày càng đƣợc ứng dụng trên qui mô
lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus,
[1], [11], [14], [47], [50].
1.2.1. Đặc điểm hình thái
VK lactic là tên gọi của một nhóm VK thu nhận năng lƣợng nhờ phân giải
cacbonhydrat và sinh ra axit lactic. Chúng đƣợc xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc
dù nhóm VK này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả dạng que ngắn, que dài và cả
VK hình cầu), song về mặt sinh lí chúng lại tƣơng đối thống nhất với nhau trong các đặc
điểm sau :
+ Đều là VK Gram dƣơng (G
+
).
+ Không tạo thành bào tử.

+ Hầu hết không di động.
+ Là VSV hiếu khí tùy ý hoặc kỵ khí không bắt buộc.
+ Đều thuộc loại đa khuyết dƣỡng.
1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic
VK lactic bao gồm các chi : Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter, Enterococcus,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus,
Vagococcus và Bifìdobacteriwn. Những VSV đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp thực
phẩm thuộc về các chi
15

nhƣ Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Trong đó Lactobacillus chiếm
vị trí quan trọng nhất [11], [14], [47], [50].
* Streptococcus
Tế bào hình cầu hay oval, đƣờng kính nhỏ hơn 2m, dạng đôi hay chuỗi ngắn hoặc
dài, ƣa ấm, nhiệt độ thích hợp khoảng 37
0
C. Có khả năng phân giải nhiều loại đƣờng nhƣ
glucose, mantose, lactose. Chúng đóng góp vào việc tạo hƣơng vị cho sản phẩm, nhất là chất
lƣợng sữa.
* Lactobacillus
Tế bào hình que dài hoặc ngắn, thƣờng dạng chuỗi, kích thƣớc dao động trong khoảng
0.5-1.2 X 1 - 10m. Tế bào không di động; gram dƣơng; không sinh bào tử. Chúng là dạng
kỵ khí không bắt buộc, có thể tăng trƣởng ở nhiệt độ từ 5
0
C- 53
0
C nhƣng nhiệt độ tăng
trƣởng tối thích từ 30
0
C - 40

0
C. Chúng có thể sống ở pH < 5. Một số chủng thuộc loại kỵ khí
nghiêm ngặt.
Lactobacillus gồm 25 loài, chia thành 3 nhóm đồng hình bắt buộc, dị hình bắt buộc, dị
hình tùy ý. Các nhóm VK lactic này đều tạo ra axit lactic nhƣng axit do từng nhóm tạo ra
khác nhau về cấu hình đồng phân của axit lactic. Lacctobacillus đƣợc sử dụng nhiều trong
công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt cũng nhƣ trong việc tạo các chế phẩm
probiotic.
* Leuconostoc
Tế bào hình oval xếp thành từng đôi hay chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài. Chúng có nhu
cầu cao về mặt dinh dƣỡng. Lên men dị hình tạo axit lactic và các sản phẩm phụ nhƣ axit
acetic, etanol, CO
2
; Có khả năng tạo hƣơng
16

thơm cho bơ, sữa chua do tạo thành các chất nhƣ acetylmetyl carbinol hay acetonin [ll], [14],
[47], [50].
* Bifidiobacterium
Là những trực khuẩn kị khí ; lên men lactic dị hình ; sản phẩm chính là là axit lactic
và axit acetic (tỷ lệ 3:1) cùng với một lƣợng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic ; khác biệt
với các VK lên men lactic dị hình khác là không sinh CO
2
. Chúng thuộc loại ƣa ấm, nhiệt độ
sinh trƣởng tối thích từ 31
0
C - 41
0
C [11], [14], [47], [50].
1.2.3. Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đƣờng với sự tích lũy axit lactic trong
môi trƣờng. Có thể tóm tắt theo phƣơng trình sau:



Các loài VK lactic khác nhau về cơ chế lên men glucose. Một vài loài VK lactic lên
men đƣờng tạo axit lactic, nhóm này gọi là lên men đồng hình. Một số nhóm khác ngoài axit
lactic còn tạo rƣợu và CO
2
, nhóm này gọi là lên men dị hình [11], [14], [47], [50].
1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình
Các VK lactic lên men đồng hình phân giải đƣờng theo con đƣờng EMP (Embden -
Meyerhof - Parnas) và cho ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90-98%). Mức độ tạo thành các
sản phẩm phụ thuộc sự có mặt của oxi.
17

Phƣơng trình tóm tắt:
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP + 2Pi  2CH
3
CHOHCOOH + 2ATP
glucose axit lactic
Một số VK lên men đồng hình thƣờng gặp là Lactococus lactis, Lactobacillus
acidophilus, L.casei, L. cremoris, L.helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus lactis, S.
thermophilus, p. cerevisiae [47], [50].

1.2.3.2. Lên men Lactic dị hình
Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài axit lactic (40%), còn có các sản
phẩm khác nhƣ axit succinic, rƣợu etylic (20%), axit acetic (10%), các chất khí còn lại (20%)
[14], [47], [50].
Phƣơng trình tóm tắt:
C
6
H
12
O
6
 CH
3
CHOHCOOH + CH
3
CH
2
OH + CO
2
+ x Kcal
glucose axit lactic etanol
Một số VK lactic lên men dị hình thƣờng gặp là Leuconostoc mensenteroides,
Leuconostoc cremoris, L. brevis, L. fermentum, [11], [14], [47].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic
1.2.4.1. Nguồn cacbon
Nguồn cacbon quan trọng nhất cho VK lactic là monosaccarit và disaccarit. Các
nguồn cacbon này đƣợc dùng để cung cấp năng lƣợng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra
các axit hữu cơ nhƣ axit malic, axit pyruvic, Tùy từng loại VK lactic khác nhau mà ta chọn
nguồn thức ăn cacbon cho phù hợp.