Bước đầu nghiên cứu sử dụng BC làm vật liệu kết dính

ii
LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự chỉ dạy và
giúp đỡ:
- Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh – Bộ môn Công nghệ Sinh Học – Đại học
Bách Khoa Tp HCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề có liên quan,
tặng một số hóa chất, sửa từng lỗi chính tả và luôn động viên tinh thần tôi trong suốt
thời gian làm luận văn.
- Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh Học
– Đại học Bách Khoa Tp HCM – hướng dẫn tận tình về các vấn đề có liên quan và
tặng giống vi sinh vật sử dụng trong đề tài.
- Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên và các cán bộ trong phòng thí nghiệm 102, 108
và 117 của Bộ môn Công nghệ Sinh Học – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.
- Các cán bộ phòng thí nghiệm khoa vật liệu của trường Đại Học Nông Lâm
đã tận tình giúp đỡ cung cấp các thông số, số liệu.
- Các anh chị cao học phòng thí nghiệm 108 chỉ bảo, giúp đỡ và cho mượn
một số dụng cụ thí nghiệm.
- Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã cùng
học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn.
- Cha, mẹ, anh, chị và em trong gia đình tôi đã động viên tinh thần và giúp
đỡ tôi vể mặt kinh tế để tôi an tâm thực hiện luận văn này.
Xin gởi đến những lời cám ơn chân thành.



iii
MỤC LỤC

Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Các từ viết tắt vi
Danh mục bảng và danh mục hình vii
Chƣơng 1: Mở đầu 1
Chƣơng 2: Tổng quan 2
2.1. Các vi sinh vật sản sinh Bacterial Cellulose (BC) 2
2.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn Acetobacter Xylinum 3
2.2.1. Phân loại 3
2.2.2. Đặc điểm về hình thái 3
2.2.3. Đặc điểm về sinh lý 4
2.2.4. Đặc điểm về hóa sinh 4
2.2.5. Đặc điểm về Cellulose vi khuẩn 5
2.3. Sinh tổng hợp BC 8
2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình tạo BC 13
2.4.1. Lên men bề mặt 13
2.4.2. Lên men chìm 13
2.4.3. Ảnh hưởng của phương pháp lên men 14
2.4.4. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ 15
2.4.5. Ảnh hưởng bởi pH 15
2.4.6. Ảnh hưởng bởi Oxy 15
2.4.7. Ảnh hưởng bởi nguồn dinh dưỡng 16
2.5. Ứng dụng của BC 16
2.5.1. Ứng dụng BC trong công nghiệp mỹ phẩm 16


iv
2.5.2. Ứng dụng BC trong y học 17
2.5.3. Ứng dụng BC trong thực phẩm 17
2.5.4. Ứng dụng BC trong công nghệ sản xuất giấy 17

2.5.5. Ứng dụng BC trong sản xuất audio 17
2.5.6. Ứng dụng BC trong công nghiệp 18
2.5.7. Ứng dụng BC trong công nghiệp làm ván ép 18
2.6. Tổng quan về enzyme 21
2.6.1. Khái niệm về enzyme 21
2.6.2. Enzyme cố định 24
Chƣơng 3: Vật liệu và phƣơng pháp 28
3.1. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và môi trƣờng 28
3.1.1. Vật liệu 28
3.1.2. Hóa chất 28
3.1.3. Dụng cụ 28
3.1.4 Môi trường 29
3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 29
3.2.1 Phương pháp DNS 29
3.2.2 Phương pháp Bradford 29
3.2.3 Các công thức tính toán 29
3.3. Nội dung thí nghiệm 30
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát các đặc tính sinh học của A. xylinum 30
3.3.2. Thí nghiệm 2:Thử nghiệm trong quá trình lên men BC để kết dính vật
liệu xơ dừa và mùn cưa. 30
3.3.3. Thí nghiệm 3: Sử dụng BC lên men tĩnh (S-BC) làm chất kết dính vật liệu
xơ dừa và mùn cưa 30
3.3.4. Thí nghiệm 4: Tạo màng BC kết hợp celite cố định enzyme. 31


v
3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 31
Chƣơng 4: Kết quả và bàn luận. 35
4.1. Kết quả khảo sát đặc tính sinh học của A.xylinum 35
4.1.1. Kiểm tra vi thể 35

4.1.2. Kiểm tra đại thể 35
4.2. Kết quả khảo sát quá trình nhân giống 37
4.3. Kết quả khảo sát quá trình lên men tĩnh tạo BC để làm chế phẩm kết dính
với xơ dừa và mùn cƣa. 38
4.4. Kết quả khảo sát trong quá trình lên men BC kết dính với xơ dừa và
mùn cƣa. 41
4.5. Kết quả sử dụng BC làm chất kết dính vật liệu xơ dừa và mùn cƣa. 42
4.5.1. Kết quả đối với độ bền nén 43
4.5.2. Kết quả đối với độ bền kéo 46
4.5.3. Kết quả đối với vị trí đứt cách tâm 48
4.5.4. Kết quả đối với góc uốn cong 50
4.5.5. Kết quả đối với tỷ lệ ngậm nước 51
4.6. Kết quả tạo màng mỏng BC kết hợp celite cố định enzyme Termamyl,
enzyme AMG và hỗn hợp enzyme Termamyl với AMG 54
4.6.1. Kết quả hiệu suất cố định protein 54
4.6.2. Kết quả hiệu suất thủy phân của các chế phẩm enzyme cố định 55
4.6.3. Kết quả khảo sát sự rửa trôi của các chế phẩm enzyme cố định qua các
lần tái sử dụng 57
4.6.4. Kết quả khảo sát tái sử dụng của các cp enzyme cố định 59
Chƣơng 5: Kết luận và đề nghị 61
Tài liệu tham khảo 63
Phục lục 67


vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT

BC : Bacterial cellulose – cellulose vi khuẩn.
S-BC : (satic-BC) cellulose vi khuẩn được sản xuất bằng nuôi cấy tĩnh.
A-BC : (agitated-BC) cellulose vi khuẩn được sản xuất bằng nuôi cấy chìm.

DAP : (NH)
4
HPO
4
(diamonium hydro phosphate).
SA : (NH)
2
SO
4
(ammonium sunfate).
BSA : Bovine serum albumin.
DNS : dinitrosalicylic acid.
sp : sản phẩm.
ss : so sánh.
hl : hàm lượng.
cp : chế phẩm.
dd : dung dịch.


vii


2.1 Acetobacter xylinum. 4
2.2 6
2.3 - -BC. 7
2.4 A.xylinum 9
2.5 10
2.6 A.xylinum 10
2.7 A.xylinum 12
2.8 14

2.9 14
Hình 2.10 α-amylase 21
Hình 2.11 glucoamylase 23
h 3.1 28
3.2 28
Hình 4.1 Hình dạng vi khuẩn Gram âm A.xylinum 35
Hình 4.2 Hình dạng đại thể A.xylinum trên môi trường đặc 35
Hình 4.3 Ống cấy chuyền vi khuẩn A.xylinum 36
Hình 4.4 Ống nhân giống cấp 1 vi khuẩn A.xylinum 37
Hình 4.5 Erlen nhân giống cấp 2 vi khuẩn A.xylinum 37
Hình 4.6 BC kết dính xơ dừa trong quá trình lên men 41
Hình 4.7 BC đã lên men 7 ngày 42
Hình 4.8 BC kết dính với vật liệu xơ dừa và mạt cưa 42


viii
Hình 4.9 Sản phẩm BC kết dính với xơ dừa sau khi ép tạo ván 43
Hình 4.10 Sản phẩm kết dính với mạt cưa 53
Hình 4.11 Sản phẩm kết dính với xơ dừa 53
Hình 4.12 DD protein nhuộm Brashford bị rửa trôi qua các lần tái sử dụng 57
Hình 4.13 Tái sử dụng enzyme cố định để xác định hàm lượng glucose 59


2.1 . 2
Bảng 4.1 Mật độ tế bào theo thời gian lên men 37
Bảng 4.2 Kết quả các chỉ tiêu khảo sát theo thời gian khi lên men tĩnh 39
Bảng 4.3 Độ bền nén của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 43
Bảng 4.4 Độ bền kéo của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 46
Bảng 4.5 Vị trí cắt cách tâm của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 48
Bảng 4.6 Góc uốn cong của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 50

Bảng 4.7 Tỷ lệ ngậm nước của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 51
Bảng 4.8 Mối tương quan giữa ∆OD và mật độ protein chuẩn 54
Bảng 4.9 Kết quả hiệu suất cố định enzyme 54
Bảng 4.10 Tương quan giữa ∆OD và nồng độ glucose chuẩn 56
Bảng 4.11 Hiệu suất thủy phân tạo đường khử của các chế phẩm enzyme cố định 56
Bảng 4.12 Số liệu xác định phần trăm protein cố định qua các lần tái sử dụng 58
Bảng 4.13 Hiệu suất thủy phân tạo đường khử của các enzyme cố định qua các lần tái
sử dụng 59



ix

Đồ thị 4.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A.xylinum 38
Đồ thị 4.2 Sự thay đổi pH theo thời gian 39
Đồ thị 4.3 Sự thay đổi nồng độ chất khô theo thời gian 40
Đồ thị 4.4 Sự thay đổi khối lượng BC theo thời gian 40
Đồ thị 4.5 So sánh độ bền nén của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 44
Đồ thị 4.6 So sánh độ bền nén của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 25% với FRAMA 44
Đồ thị 4.7 So sánh độ bền nén của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 30% với FRAMA 45
Đồ thị 4.8 So sánh độ bền nén của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 35% với FRAMA 45
Đồ thị 4.9 So sánh độ bền kéo của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 46
Đồ thị 4.10 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 20% với FRAMA 47
Đồ thị 4.11 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 25% với FRAMA 47
Đồ thị 4.12 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 30% với FRAMA 47
Đồ thị 4.13 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 35% với FRAMA 48
Đồ thị 4.14 Ss vị trí đứt cách tâm của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 49
Đồ thị 4.15 Ss vị trí đứt cách tâm của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 20% với FRAMA. 49
Đồ thị 4.16 Ss vị trí đứt cách tâm của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 35% với FRAMA . 50
Đồ thị 4.17 So sánh góc uốn cong của các sản phẩm kết dính và ván ép FRAMA 50

Đồ thị 4.18 So sánh tỷ lệ ngậm nước của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 51
Đồ thị 4.19 Ss tỷ lệ ngậm nước của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 20% với FRAMA 52
Đồ thị 4.20 Ss tỷ lệ ngậm nước của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 25% với FRAMA 52
Đồ thị 4.21 Tương quan giữa ∆OD và nồng độ albumin 54
Đồ thị 4.22 Hiệu suất cố định protein 55


x
Đồ thị 4.23 Biểu diễn sự biến thiên giữa ∆OD và nồng độ glucose chuẩn 56
Đồ thị 4.24 Hiệu suất thủy phân tạo đường khử của các chế phẩm enzyme cố định 57
Đồ thị 4.25 Phần trăm protein cố định qua các lần tái sử dụng 58
Đồ thị 4.26 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các chế phẩm enzyme cố định 60

Sơ đồ và q
Sơ đồ 2.1 Các phương pháp cố định enzyme 26
2.1 S . 20
Qui trình 3.1 Tạo BC kết dính mùn cưa. 33

Chƣơng 1: Mở đầu

1
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU

Trên thế giới, Acetobacter xylinum đã được nghiên cứu rất nhiều theo hướng
sử dụng BC làm vật liệu mới trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Các kết quả đạt
được cho thấy tiềm năng ứng dụng độc đáo trong các lĩnh vực khác nhau như: thực phẩm,
y học, dược phẩm, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý môi trường …
Phế liệu nông lâm nghiệp là vấn đề lớn trong xử lý chất thải, gây ảnh hưởng đến
môi trường. Hiện nay một số công ty và nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng phế liệu để
sản xuất nhiều sản phẩm có giá trị cho đời sống, một trong số các sản phẩm đó là ván ép.

Tuy nhiên do công nghiệp sản xuất ván ép vẫn còn dùng loại keo kết dính hữu cơ gây độc
cho sức khỏe công nhân và ảnh hưởng đến môi trường nên cần thiết nghiên cứu thay thế
loại keo hữu cơ thông thường bằng loại keo có khả năng kết dính cao nhưng vẫn đảm bảo
sức khỏe con người và môi trường sống. Quan sát thấy cellulose vi khuẩn có những
tính chất đặc biệt như độ bền sợi cellulose cao, khả năng giữ nước tốt và có tính kết dính,
chúng tôi sử dụng BC để thử nghiệm khả năng là chất kết dính tạo sản phẩm kết dính
từ phế liệu nông nghiệp và hướng tới ứng dụng trong sản xuất ván ép.
Tên đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu sử dụng BC làm vật liệu kết dính”.
Mục tiêu nghiên cứu: Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm để khảo sát khả năng
sử dụng cellulose vi khuẩn do vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo ra làm tác nhân kết dính
trong sản xuất ván ép và vật liệu cố định enzyme.
Nội dung nghiên cứu:
- Khảo sát đặc điểm sinh học của Acetobacter xylinum
- Sử dụng BC làm tác nhân kết dính xơ dừa và mùn cưu.
- Tạo màng BC kết hợp celite cố định enzyme.
Chƣơng 2: Tổng quan

2
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Các vi sinh vật sản sinh Bacterial Cellulose (BC)
Ngoài thực vật, nấm và tảo có cellulose là thành phần cấu trúc cơ bản hình thành
nên vách tế bào, cellulose còn được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn, được gọi là
cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) (bảng 2.1). Con đường tổng hợp và
cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài thì
khác nhau [14]. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm
cellulose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer
hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loại mà trạng thái
kết tinh của cellulose khác nhau. Từ đó tính chất vật lý của sản phẩm như độ bền,
độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính cũng
khác nhau [26]. Năm 1988, Jonas và Farah đã chứng minh cellulose được tổng hợp bởi

một số vi sinh vật. Nguồn cellulose được sản sinh bởi vi sinh vật được gọi chung là
Microbial cellulose (MC).
Bảng 2.1 Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn [23]
Giống
Cấu trúc Cellulose
Acetobacter
Achromobacter
Aerobacter
Agrobacterium
Alcaligen
Pseudomonas
Rhizobium
Sarcina
Zoogloea
Lớp sợi ngoại bào tạo thành các dãy.
Sợi
Sợi
Sợi ngắn.
Sợi
Các sợi không tách biệt.
Sợi ngắn.
Cellulose dị hình.
Chưa xác định rõ cấu trúc.
Chƣơng 2: Tổng quan

3
Acetobacter xylinum (A.aceti ssp. xylinum, A. xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose
hữu hiệu nhất. Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các
loài là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G. intermedius [14].
Những nghiên cứu về cellulose vi khuẩn tập trung vào đối tượng A. xylinum cả về

nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng rộng rãi [23].

2.2. Sơ lƣợc vi khuẩn Acetobacter Xylinum
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên. Có thể phân lập được các giống vi khuẩn này từ không khí, đất, nước,
lương thực, thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả … Có khoảng 20 loài thuộc giống
Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa đáng kể.

2.2.1. Phân loại
Theo Bergey, A. xylinum thuộc hệ thống phân loại sau:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
Loài: Acetobacter xylinum [5]

2.2.2. Đặc điểm về hình thái
Thông thường A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể
di động (có tiêm mao đơn hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiêm mao).
Tế bào A. xylinum đứng riêng l hoặc kết thành chuỗi dài, có khả năng tạo váng dày
trên môi trường nuôi cấy [3]
Khuẩn lạc của vi khuẩn A. xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc
đạt tới 2-5 mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên,
dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, ria mép khuẩn lạc nhẵn.

Chƣơng 2: Tổng quan

4

Hình 2.1 Acetobacter xylinum

A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm Gram của chúng có thể bị
biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. A. xylinum thuộc loại
vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa
môi trường lỏng và môi trường khí [1], [21], [17].

2.2.3. Đặc điểm về sinh lý
Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 đến 30
0
C và pH từ 5,4 – 6,3
[21]. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của A. xylinum là 5,5 và chúng không
phát triển ở nhiệt độ 37
0
C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu [19].
A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic
vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [30].
Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ,
nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành
từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy [7].

2.2.4. Đặc điểm về hóa sinh
A.xylinum không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất, đồng thời
trên bề mặt môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose.
Ngoài ra, đặc điể ng định danh A. xylinum bao gồm: phản ứng catalase
dương tính, oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO
2
và H
2
O, không tăng trưởng trên
môi trường Hoyer, không tạo sắc tố nâu, tổng hợp cellulose [1],[21].
Chƣơng 2: Tổng quan

5
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào
chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển glucose
thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị [17].

2.2.5. Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC)
2.2.5.1. Đặc điểm về cấu trúc
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc
glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4 glucan. Các nghiên cứu cơ bản về BC
cho thấy, BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose
thực vật). Tuy nhiên, cấ n và thuộc tính của BC khác với PC.
Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp
(subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc
tự nhiên. Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm
trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon). Trong khi
chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm
hay gỗ bulô (Betula) là 14.000 – 40.000 nm (hình 2.2). Những dải vi sợi cellulose
mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 μm làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc,
được ổn định bởi các nối hydrogen [2],[14],[20].
BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ
polymer hóa từ 2.000 – 6.000; một vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000,
trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000 – 14.000. So với PC, BC có
độ kết tinh cao hơn, thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn
và dễ uốn nắn hơn [2],[14],[20]. BC được hình thành qua một quá trình phức tạp
gồm nhiều giai đoạn, cho sản phẩm có kích thước khác nhau theo sơ đồ sau:

Sợi sơ cấp – subfibril vi sợi – microfibril bó – bundle dải – ribbon
(rộng 1,5nm) (rộng 3,0 – 3,5nm) (rộng 40 – 60nm)
Chƣơng 2: Tổng quan

6




Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện
nuôi cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của
dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy.
Các miếng BC này được gọi là BC trên môi trường tĩnh (S-BC: Static BC).
Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc
trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu
hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên
các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể
tế bào A. xylinum. Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh
nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi trường lắc (A-BC:
Agitated-BC). A-BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và
các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Các sợi đan lưới với nhau
trong môi trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có cả hai hướng song song và
vuông gốc [2],[14].
Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC
được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scanning electron
Hình 2.2 Cấu trúc cellulose
(a) Cellulose vi khuẩn (x 20000)
(b) Cellulose thực vật (x 200)
Chƣơng 2: Tổng quan

7
microscope). Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo
chiều đan chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối rắm và cong (hình 2.3) [22].

Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A-BC (0,1-0,2μm) lớn hơn sợi S-BC
(0.05 – 0.10μm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết
tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [2],[13].













2.2.5.2. Chức năng sinh lý của cellulose đối với A. xylinum
A. xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp. Trong môi trường
tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành
nên lớp vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ. Những tế bào vi khuẩn
sản xuất cellulose được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là
vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường
lỏng và không khí. Vì vậy, các chủng vi khuẩn sản xuất BC có thể sống ở những
nơi cống rãnh. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên
bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng
hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose.
Hình 2.3 Cấ - -BC
(a) A-BC được tạo ra từ môi trường lắc
(b) S-BC được tạo ra từ môi trường tĩnh
Chƣơng 2: Tổng quan

8
Một vài tác giả cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum
còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu
nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme
exo-glucanase hay endo-glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được
phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum sản xuất cellulose [14].
Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào
vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như
giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật
gây bệnh. Các vi khuẩn A. xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong
lớp vỏ bao. Cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím.
Khoảng 23% tế bào A. xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím.
Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3%
[2],[14].

2.3. Sinh tổng hợp BC
A. xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp. Chúng có thể sử dụng
nguồn carbon là các monosaccharide, cụ thể là D-glucose để tạo ra cellulose ngoại bào
chỉ trong vài ngày. Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, A. xylinum tạo ra màng cellulose
ngay trên bề mặt tiếp xúc giữa môi trường và không khí. Quá trình tổng hợp BC
đã được chứng minh gồm 5 giai đoạn cơ bản do 5 enzyme khác nhau xúc tác tạo thành
để chuyển hóa dần cơ chất ban đầu là D-glucose thành UDP-glucose qua các sản phẩm
trung gian là glucose-6-phosphat và glucose-1-phosphate. Sau đó, sản phẩm cuối
UDP-glucose sẽ được liên kết tạo chuỗi polymer bởi enzyme cellulose synthase.
(hình 2.4, 2.5)
Vị trí hình thành cellulose ở chu chất (giữa màng ngoài và màng tế bào chất).
Sợi cellulose được tiết ra ngoại bào nhờ các cấu trúc lỗ trên màng tế bào vi khuẩn.
Các phức hợp tổng hợp cellulose gọi là TC-terminal complex phân bố thành hàng
ngang ở chu chất có vai trò chuyển hóa tiếp UDP-glucose thành cellulose. Đầu tiên,

từ phức hợp chỉ tạo ra được chuỗi gồm 6-8 glucan được gọi là sợi sơ cấp (subfibril),
Chƣơng 2: Tổng quan

9
sau đó các sợi sơ cấp kết lại thành vi sợi có kích thước lớn hơn (microfibril), kế tiếp
các vi sợi này sẽ gắn kết với nhau thành các dải ribbon. Cuối cùng, các dải ribbon này
tụ họp hình thành nên màng cellulose [16]. Quá trình đó được mô tả qua hình 2.6.
Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách
chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc tác và
các protein điều hòa. Tiến trình này bao gồm sự tổng hợp uridine diphosphoglucose
(UDPGlc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa glucose vào
chuỗi β-1,4 glucan, và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon), được hình thành từ
hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẻ. Con đường và cơ chế của sự
tổng hợp UDPGlc tương đối được biết nhiều, trong khi đó cơ chế phân tử của
sự polymer hóa glucose vào mạch dài và các mạch nhánh, sự đẩy ra bên ngoài tế bào
của chúng và sự kết hợp thành sợi cần được làm sáng tỏ hơn [14].

Hình 2.4 Vị trí quá trình biến dƣỡng carbon và tổng hợp
cellulose ở A.xylinum

Chƣơng 2: Tổng quan

10

Hình 2.6: Sự tổng hợp vi sợi bởi A.xylinum

Hình 2.5: Con đƣờng dự đoán của quá trình sinh tổng hợp
và tiết ra cellulose khi glucose đƣợc tế bào A.xylinum
hấp thụ từ bên ngoài

Chƣơng 2: Tổng quan

11
Cellulose được tổng hợp từ A. xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng
carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý tế bào liên quan đến hoặc là chu trình pentose
phosphate hoặc là chu trình Krebs, đi kèm với quá trình sinh tạo glucose (hình 2.7).
Quá trình glycose giải không hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì nó không
tổng hợp được enzyme quan trọng của con đường này đó là phosphofructose kinase.
Ở A. xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với tiến trình dị hóa oxid hóa
và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từ những phản ứng dị dưỡng.
Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các quá trình đồng hóa khác, bao gồm sự
tổng hợp protein [14].
A. xylinum chuyển nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol, pyruvate,
dihydroxyacetone, và các dicarboxylic acid thành cellulose, thường có hiệu suất 50%.
Dicarboxylic acid đi vào chu trình Krebs nhờ quá trình decarboxyl hóa để thành
pyruvate, chuyển thành hexose thông qua con đường sinh tạo glucose, tương tự đối với
glycerol, dihydroxyacetone và các hợp chất trung gian của chu trình pentone

phosphate [14]. Con đường chuyển hóa carbon của A. xylinum được mô tả chi tiết qua
hình 2.7.
Tiền chất trực tiếp của cellulose là UDPGlc (uridine diphosphoglucose),
là sản phẩm của con đường phổ biến ở các sinh vật, bao gồm cả thực vật, liên quan tới
sự phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate, được xúc tác bởi glucokinase,
tiếp đến là quá trình đồng phân hóa hợp chất này thành glucose-α-1-phosphate, được
xúc tác bởi photphoglucomutase và cuối cùng chuyển thành UDPGlc bởi enzyme
UDPGlc pyrophosphorylase. Enzyme cuối cùng này dường như quan trọng liên quan
đến quá trình tổng hợp BC. Một vài đột biến không tổng hợp cellulose (Cel-) thiếu
enzyme này (Valla và cộng sự, 1989). Hơn nữa, hoạt động của pyrophosphorylase thay
đổi ở những chủng A. xylinum khác nhau và hoạt động cao nhất được phát hiện ở các
sinh vật tổng hợp cellulose hữu hiệu nhất, như là A. xylinum ssp. sucrofermentans
BPR2001. Chủng này thích sử dụng fructose hơn, biểu lộ sự hoạt động cao của
phosphoglucoisomerase và có một hệ thống phosphotransferase. Hệ thống này chuyển
fructose thành fructose-1-phosphate và tiếp đến là fructose-1,6-biphosphate [2], [14].
Chƣơng 2: Tổng quan

12

Hình 2.7: Con đƣờng chuyển hóa Carbon của A. xylinum
PTS: hệ thống chuyển đổi phosphor GK: glucokinase
IPFK: frurose-1-phosphate kinase PGM: phosphoglucomutase
Glc-6-P: glucose-6-phosphate UGP: pyrophosphorylase UDPGlc
Glc-1-P: glucose-1-phosphate CS: cellulose synthase
Fru-6-P: frutose-6-phosphate PGI: phosphoglucomutase
Fru-bi-P: frutose-1,6-bi-phosphate FK: frutokinase
UDPGlc: uridine diphosphoglucose PGA: phosphogluconic acid
FBP:frutose-1,6-biphosphate phosphatase
G6PDH:glucose-6-phosphate dehydrogenase

Chƣơng 2: Tổng quan

13
2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình tạo BC
2.4.1. Lên men bề mặt
Môi trường lỏng chứa trong khay với chiều sâu không quá 5cm và tế bào
mọc lớp trên bề mặt tiếp xúc trực tiếp với không khí. Kiểu này còn gọi là
lên men tĩnh. Cellulose vi khuẩn được tạo ra trong trường hợp này sẽ nằm ngay ở
mức phân cách giữa môi trường không khí và môi trường dinh dưỡng. Các tiền sợi
cellulose được đẩy ra từ các lỗ xếp song song theo trục dọc trên bề mặt tế bào
vi khuẩn, chúng kết tinh thành sợi và phun vào môi trường nuôi cấy.
Chúng tạo thành lớp màng keo gồm các bó sợi cellulose chống lên và xoắn vào
nhau bao quanh các tế bào A. xylinum. Do đó, cellulose thu được trong quá trình

lên men bề mặt (S-BC) chỉ có một hình dạng duy nhất là dạng lớp màng.
Trong lên men bề mặt, môi trường lên men được đưa vào các khay có bề mặt
rộng thoáng. Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được sử dụng rộng rãi ở
các nước trên thế giới. [31].

2.4.2. Lên men chìm
Lên men chìm là kiểu lên men chủ yếu trong công nghiệp. Khi nuôi với
quy mô lớn hay mật độ tế bào cao, nhu cầu oxy chỉ được thỏa mãn bằng không khí
mạnh nhờ thiết bị thổi khí.
Phương pháp lên men chìm còn gọi là phương pháp lên men bề sâu.
Khi lên men chìm, vi sinh vật được phân bố đều trong toàn bộ dung dịch lên men và
phát triển theo chiều sâu của môi trường. Do đó nuôi cấy chìm được tiến hành
trong các thiết bị lên men có thổi khí.
Phương pháp lên men chìm thường tạo ra cellulose vi khuẩn có dạng hạt nhỏ
có các kích thước khác nhau, hình tròn hay hình elip hoặc có sợi không đồng đều.
Hình dạng A-BC thu được trong lên men chìm rất đa dạng phụ thuộc vào kiểu
thiết bị lên men chìm và cả các chế độ trong lên men chìm.


Chƣơng 2: Tổng quan

14
2.4.3. Ảnh hưởng của phương pháp lên men
Ngày nay, sản xuất BC được thực hiện bằng nhiều phương pháp lên men
khác nhau như nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phương pháp
nào để thực hiện là tùy thuộc vào định hướng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có
đặc tính hóa lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phương pháp khác nhau [13].
Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt
môi trường nuôi. S-BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco,
màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC

(A-BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng hột nhỏ,
hoặc hình cầu, hình elip). Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC
công nghiệp và cho các ứng dụng khác của A-BC như: mỹ phẩm, vật liệu,
chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chưa được nghiên cứu và tiến hành
ở Việt Nam [2].
Theo các nhà nghiên cứu thì phương pháp nuôi cấy chìm cho hiệu suất
sinh tổng hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt
lượng oxy cho tế bào hoạt động. Đồng thời BC này còn có khả năng giữ nước cao
hơn từ phương pháp tĩnh. Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thường phát sinh các
chủng đột biến Cel
-
một cách ngẫu nhiên sau thời gian lên men. Các chủng Cel
-
này
sẽ không còn khả năng sản sinh BC nữa, vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể
sau đó.









Hình 2.8: BC ở điều kiện
nuôi cấy tĩnh
Hình 2.9: BC ở điều kiện
nuôi cấy lắc
Chƣơng 2: Tổng quan

15
2.4.4. Ảnh hưởng bởi nhiệt đ
Nhiệt độ tối ưu cho sản sinh cellulose là 25 – 30
0
C. Ở nhiệt độ thấp quá trình
lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó
sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [33].

2.4.5. Ảnh hưởng bởi pH
Nhìn chung, khoảng pH tối ưu để sản sinh BC là 4-7. Theo Hestrin và
Schramm (1954) cho rằng pH dưới 7 là quan trọng hơn cả. Còn Fiedler và cộng sự
thì cho pH=5-7 thì tối ưu. Hầu hết pH bằng 5 hay 6 được dùng trong các
nghiên cứu. Nhưng để sản xuất cellulose công nghiệp thì pH=4-4,5 thì cho kết quả
ưu thế hơn do giảm sự tạp nhiễm [13]. A. xylinum đồng thời cũng sản xuất ra 2 loại:
enzyme cellulase và bacterial cellulose. Các nghiên cứu gần đây cho thấy,
tuy đồng thời cùng sản xuất 2 loại: cellulose và cellulase nhưng có thể khống chế
độ pH của môi trường dinh dưỡng để điều chỉnh mức độ sản sinh ra 1 trong 2 loại
này. Khi pH ở mức từ 4 - 4,5 thì lượng BC được sản sinh ra nhiều nhất, còn pH ở
mức từ 5 – 5,5 thì lượng enzyme cellulase được sản sinh cao hơn [27].
Theo S. Hestrin và M. Schramm (1954), HCl và NaOH thích hợp dùng để
điều chỉnh pH môi trường [24].

2.4.6. Ảnh hưởng bởi Oxy
Nồng độ O
2
liên quan trực tiếp đến việc sinh tổng hợp BC [28]. Khi không khí
giàu O
2
(duy trì nồng độ O

2
lớn hơn 39%) được cho vào tại thời điểm 8h sau khi
nuôi cấy thì sản lượng BC tăng lên 1,5 lần và năng suất BC tăng từ 11% lên
đến 18%. Tuy nhiên, với nồng độ O
2
như thế, nhưng cho vào từ khi bắt đầu
nuôi cấy thì số lượng tế bào suy giảm một cách nhanh chóng và hầu như vi khuẩn
không sản sinh BC nữa. Điều này tác giả giải thích vì số lượng tế bào sống sót
tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy quá thấp nên không thể tìm thấy BC trong điều kiện
nồng độ O
2
hòa tan cao (vì trong điều kiện này đã làm ức chế vi khuẩn).
Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, tại nồng độ O
2
10% và 15% một vài chủng
Chƣơng 2: Tổng quan

16
A. xylinum cho sản lượng BC cao hơn ở nồng độ O
2
là 20% [27]. Khi nồng độ O
2

tăng đến 30% sẽ làm giảm đáng kể sản lượng BC trong khi sự tăng trưởng của
tế bào vẫn tiếp tục duy trì [27],[29].

2.4.7. Ảnh hưởng bởi nguồn dinh dưỡng
2.4.7.1. Nguồn Carbon
Những cơ chất được đánh giá là cho sản lượng BC cao, bao gồm: glucose,
sorbitol và manitol. Glycerol, galactose, lactose, sucrose và maltose được xem là

cơ chất thích hợp. Những cơ chất mà vi khuẩn này không có khả năng sử dụng để
tạo màng cellulose là sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetate
[19]. Nguồn carbon từ glucose được cho là thích hợp trong việc tăng hiệu suất
khả năng sản sinh BC [21].
2.4.7.2. Nguồn Nitrogen
Môi trường được dùng để nghiên cứu là môi trường có 0,5% cao nấm men
và 0,5% pepton [19]. Đối với một số dòng A. xylinum lại cho thêm tryptophan,
dịch chiết ngô vào trong môi trường. Tuy nhiên dịch chiết ngô cho hiệu quả
hơn cả. Các acid amin như methionin, glutamate thì luôn cần phải có trong
môi trường vì những acid amin này có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển
của tế bào và sự tổng hợp cellulose [21]. Ammonium dihydrogen phosphate có
thể được sử dụng thay cho cao nấm men như một nguồn cung cấp nitơ và thêm
vào một lượng nhỏ dịch chiết bột bắp (từ 0,125 tới 0,5 ml/l) thì gia tăng sản
lượng BC [17].

2.5. Ứng dụng của BC
2.5.1. Ứng dụng BC trong công nghiệp mỹ phẩm
Huyền phù BC vừa có khả năng giữ ẩm cao mà không bám lại lên làn da
sau khi rửa và cũng không gây các tác dụng phụ như các chất giữ ẩm khác, do đó
được hưởng ứng như: kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất tăng độ
dày và bền cho nước làm bóng móng tay, ổn địng trạng thái và cấu trúc mỹ phẩm.