Nghiên cứu chế biến vị thuốc đơn lá đỏ và tác dụng chống khối u của đơn lá đỏ

B Ộ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
BQl
s v . NGTTYỄN PHỨ C Á H H
NGHIÊN
cúu
CHẾ BIẾN VỊ THUỐC DƠN LÁ Dỏ
VÀ TÁC DỤNG CHỐNG KHÔI u CỦA ĐƠN LÁ Dỏ
[ExcoecarìacoclììnchỉnensỉsVm, Euphorbiaceaeỉ
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC KHÓA 1997-2002)
QUc^ 4 ^ THS . NGUYỄN THÁI AN
TS . TRẦN LƯU VÃN HIẾN
Al«c Uực ụ *s: BỘ MÔN DƯỢC HỌC cổ TRUYẼN
PHÔNG ĐÔNG Y THựC NGHIỆM •
VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM
3/ 2002-5/2002
B à N ội, tíầáttg S/2 0 0 2
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kúứi ừọng và biết ơn sâu sắc nhất, em xin bày tỏ lòng biết Cín chân ứiành tói :
ThS. Nguyễn Thái An
TS . Trần Lưu Vân Hiền
Là những người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và dành rất nhiều thời gian, công
sức giúp đỡ em ttong suốt thòi gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cũng nhân dịp này, em xin được bày tỏ lòng biết ơn tới sự giúp đỡ của PGS. TS.
Phạm Xuân Sinh, GS. TS. Trần Mạnh Bình, PGS. TS. Bế Thị Thuấn, TS. Đỗ Ngọc
Thanh. Cùng toàn thể các thầy cô và cán bộ Bộ môn Dược học cổ truyền, Bộ môn
Dược liệu, Phòng Đông y thực nghiệm - Viện Y học cổ truyền Việt Nam, Phòng thí
nghiệm Trung tâm trường Đại học Dược, Thư viện Đại học Dược đã giúp đỡ tạo điều
kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Một lần nữa em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2002

Sinh viên
Nguyễn Phúc Ánh
MỤC LỤC
Trang
PHẦNI. ĐẶT VÂN ĐỂ 1
PHẦN II. TỔNG QUAN
2
2.1. Đặc điểm thực vật 2
2.1.1 Tên khoa học 2
2.1.2. Bộ phận dùng
2
2.1.3. Mô tả thực vật
2
2.1.4. Đặc điểm vi học
3
2.1.5. Phân bố 5
2.1.6. Trổng trọt thu hái và chế biến 5
2.2. Thành phần hoá học 6
2.3. Tác dụng sinh học 7
2.4. Công dụng 8
PHẦN III. THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
10
3.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 10
3.1.1. Nguyên liệu 10
3.1.2. Phương pháp nghiên cứu 10
3.2. Kết quả và nhận xét 11
3.2.1. Xác định một số nhóm chất bằng phản ứng hoá học

11
3.2.2. Định lượng flavonoid toàn phần 19

3.2.3. Định tính flavonoid bằngSKLM

20
3.2.4. Định lượng tanin toàn phần 22
3.2.5. Phân lập các polyphenol
24
3.3. Tác dụng chống khối u của đơn lá đỏ 24
3.3.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 24
3.3.2. Kết quả nghiên cứu 26
3.3.3. Nhận xét 28
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ ĐỂ XUÂT 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO
30
Chữ viết tắt
MDA: Malonyl dialdehyd.
SKLM: Sắc ký lớp mỏng.
TT: Thuốc thử.
YHCT: Y học cổ truyền.
PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỂ
Từ xa xưa, cây cỏ đã được loài người sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Ngày
nay, thời đại của khoa học kỹ thuật hiện đại, con ngưòd đã có thể tổng hợp được
các hoạt chất có cấu trúc và tác dụng tương tự các thành phần có nguồn gốc
thiên nhiên. Tuy nhiên các loài thảo dược hiện nay vẫn được tiếp tục sử dụng.
ở Việt Nam, việc sử dụng cây cỏ làm thuốc là một tập quán có từ lâu đời.
Với điều kiện khí hậu của vùng nhiệt đới, cây cỏ nước ta rất phong phú và đa
dạng, trong đó có nhiều loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh.
Cây Đơn lá đỏ (Excoecarỉa cochinchinensis Lour.) đã được dùng làm
thuốc từ lâu theo kinh nghiệm dân gian để chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, dị ứng,
ỉa chảy Những nghiên cứu gần đây về vị thuốc này cho thấy trong Đơn lá
đỏ có các thành phần tanin, flavonoid Đây là những hợp chất hiện đang

được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm về tác dụng chống oxy hoá
(antioxydant), ức chế sự phát triển của HIV, khối u
Bên cạnh đó, tuỳ thuộc vào mục đích điều trị mà vị thuốc được sử
dụng ở các dạng chế biến khác nhau. Nhằm mục tiêu tìm hiểu sự thay đổi
tác dụng và thành phần hoá học của dược liệu Đơn lá đỏ ở dạng chế biến và
không chế biến, đồng thời bước đầu đánh giá khả năng chống khối u thực
nghiệm của vị thuốc Đơn lá đỏ và hỗn hợp các polyphenol chiết xuất từ
dược liệu Đơn lá đỏ, khoá luận tiến hành nghiên cứu với hai nội dung sau:
1. Nghiên cứu về thành phần hoá học của các mẫu dược liệu chế biến và
không chế biến ,
2. Nghiên cứu khả năng chống khối u thực nghiệm của Đơn lá đỏ .
PHẦN II-TỔNG QUAN
2.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT:
2.1.1. Tên khoa học:
Excoecaria òíco/ơr Hassk. [4], [7], [10], [14], [20].
Excoecaria cochinchinensis Lour. [5], [14], [24].
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
- Tên Việt Nam : Đơn lá đỏ hay còn gọi là Đơn tướng quân, Đơn tía, Đơn
mặt quỉ, Đơn mặt trời, Liễu đỏ [5^ .
- Tên Trung Quốc : Hồng bối quế hoa [14], Bách thiên liễu [10].
2.1.2. Bộ phận dùng :
Cành non, lá, rễ .
2.1.3. Mô tả thực vật :
Cây nhỏ, cao 0,4-Im, toàn thân có nhựa mủ trắng, cây phân cành rất
nhiều [18]. Cành nhỏ, gầy, dài, màu tía [14].
Lá mọc đối, hình trái xoan thuôn dài, phía cuống nhọn, phía đầu có mũi
nhọn ngắn, dài 6-12cm, rộng 1,2 - 4cm [14], mặt trên lá có màu lục thẫm, mặt
dưới lá có màu đỏ tía, mép lá có răng cưa [5], [15], [24], cuống ngắn 5-lOmm
[12]. Gân lá hình lông chim [18].
Hoa mọc thành bông ở kẽ lá hay đầu cành, bông hoa đực dài 2cm, bông

hoa cái ngắn hơn, cùng gốc hay khác gốc [15]. Cây ra hoa vào các tháng 4, 5,
6[12],[18]. (X em hìnhl)
Hình l:Ả nh cây Đơn lá đỏ.
Hoa đực có 3 nhị, chỉ nhị mảnh, bao phấn đính lưng, bao phấn hình bầu
dục. Hoa cái có bầu trên hình trứng, 3 lá noãn hàn liền tạo thành bầu có 3 ô,
đính noãn trung trục [18] .
Công thức hoa [18]: * đ K3C0A3G0
* ? K3CoAe^
Quả nang 3 mảnh, đường kính chừng Icm. Hạt hình cầu màu nâu nhạt,
đường kính 4mm [14], hạt có mồng. Nội nhũ dầu[18].
2.1.4. Đặc điểm vi học :
Theo tài liệu [18] đã xác định đặc điểm vi học của dược liệu Đơn lá đỏ
bao gồm : vi phẫu lá, vi phẫu thân, soi bột lá .
Mình 2 Sơ đồ tổng qiiáí vi phẫu lá.
1. Biểu bì
2 . Mỏ clày
3. Mổ mềm
4. Mô clạii
, 5. Bó li be - gỗ
6. ồng nhựa mu-
Sơ đồ vi pliẫu lliân :
1. Biểu bì
2. Mổ dày
3. Mô Iiiềiii vỏ
4. Sợi
5. Mô mềm riiộl
6. Ông nhựa niỉi
7. Bó li be - gỗ
Hình 3-Sơ dồ tổng quát vi phẫu thân.
oo

oo
6
7-
Hiiili 4: Đỵc (liểin bộ( lá
2.1.5. riiAn bố:
1. Tế bno lỗ kiư
2. Sợi
3. Mạch xoắn
4. Mảnh inô mềm
5. Mảnh mô mềm chứa chất míiii
6. Ti nil bộ(
7. 'ỉ inh (hể caiixi oxalal
ở Việ( Nam, Đ(tn lá (l(S niọc lioang liay đnực trổng ở nliiềii iKĩi nliư ;
Long An, Tiền Giang, Đồng Thííp, Hậu Giang, An Giang
ở phía bắc, cây được (rồng nhiều Ỉ1 làng hoa Ngọc ĩlà - Hà Nội, Tliái
Bình, Nam Định Ngoài ra, cfty còn đirợc trồng ở Quảng 'ĨAy, Ví1ii Nam
(Trung Quốc) 119],124]
Cây dược (rồng làm cảíih, lấy lá và cành non làm Ihiiốc |4|, |51, 114]
những cây mọc hoang llniờng to cao iKm, U1 íl có màu đỏ tín hơn, có khi míit
clirới cổ màu xanh, phiến lá liìnli nicìc thiiôn (lài [ 141.
2. ỉ.6. 'rrồng (rọf, thu hái VÍ1 chế biến:
-Trổng (rọl:
Tliưcìiig gieo hạt VÌIO vụ (lông xuân |41, híiy (lAm cành vào mùa xnAn và
đầu hè, có nơi Irồiig bằng rễ cAy 112|.
- Thu hái, chế biến:
Thường thu hái quanh năm, hái lá, cành non vào buổi sáng sófm, mang về
phơi âm can cho héo, sau đó cắt khúc 3-6cm, tiếp tục phơi nắng cho khô, có khi
sấy ở nhiệt độ 50 ° c trong 2-3 giờ. Rễ lấy về sao vàng hay phoi khô [14].
2.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC:
Các công trình đã nghiên cứu cho biết thành phần hoá học của cây Đơn lá đỏ

gồm: flavonoid, tanin, coumarin, saponin, đường khử, anthraglycosid [12],[18].
Trên sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy, flavonoid xuất hiện 4 vết với Rf
khácnhau[12],[18].
Sắc ký lớp mỏng saponin có 4 vết [18].
Sắc ký lớp mỏng coumarin có 3 vết [18].
Sắc ký lớp mỏng tanin có 10 vết [17].
Sắc ký chế hoá tách được một chất có phổ u v Ẳ =270nm và 215nm.
Phổ IR hấp thụ ồ 3 2 7 8 c m 1 6 5 4 c m 1 6 1 1 ,6 c m ', 1524cm-', 1220cm ',
1025cm-', 7669cm-'; Nhiệt độ nóng chảy từ 209-214 ° C[ 12].
Sắc ký cột phân lập tanin thu được 2 chất:
- FAD 1: dự kiến là acid gallic có phổ u v Ằ =272nm, 216nm. Phổ
IR hấp thụ ở 1245cm"', 1447cm‘', 1541cm"‘, 1619cm“', 1705cm ',
3 4 0 0 c m , 3285cm ■'. Nhiệt độ nóng chảy từ 251-253 ° c [17].
- FAD 2:dự kiến là acid ellagic: có phổ u v A =203nm, 255nm, 303nm,
367nm. Phổ IR hấp thụ ở 1193cm-', 1336cm ' , 1447cm-', 1509cm-', 1619cm ' ,
1699cm"', 3074cm“' , 3558cm''. Nhiệt độ nóng chảy là 361-363°c [17].
sắc ký cột phân lập anthocyan thu được một chất FAD 9 có phổ u v
^rnM^=212nm, 274nm, và phổ IR có các đỉnh 1214cm"’, 1450cm ',
1 6 1 4 c m , 1709cm-', 2 8 5 0 c m , 3393cm ' [13].
Hàm lượng flavonoid toàn phần định lượng bằng phương pháp đo quang trên
các mẫu ở một số địa phương như sau: mẫu dược liệu của Thái Bình 1,42%; Nghĩa
Đàn - Nghệ An 1,38%; Nam Đàn - Nghệ An 1,35%; Tuyên quang 1,31%; Hà Nội
1,10% [12].
Hàm lượng Flavonoid toàn phần định lượng bằng phương pháp cân là
4,12% [18].
Hàm lượng tanin toàn phần định lượng theo phương pháp bột da
(DĐVNII - tập 3) là 10,64% [17].
Từ nhựa cây đã chiết được một số thành phần có cấu trúc kiểu áaphnan
và tigỉian [22 ].
2.3. TÁC DỤNG SINH HỌC:

- Độc tính : lá Đơn lá đỏ không có độc tính cấp [18]
- Đơn lá đỏ có tác dụng chống dị ứng, chống choáng phản vệ, đặc biệt
là khi kết hợp với Kim ngân hoa, nâng cao tỷ lệ súc vật sống sót qua cơn
choáng phản vệ [14], [15].
- Đơn lá đỏ kết hợp với Thương nhĩ tử và Kinh giói dưới dạng chè nhúng
có tác dụng chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hoá [16].
- Nhựa cây độc với cá [4], [5], [14]. Hợp chất daphnan diterpen ester
được chiết từ nhựa gây kích ứng da [12].
- Đơn lá đỏ có tác dụng kháng khuẩn, tác dụng trên các vi khuẩn
Bacillus subtilis; B. mỵcoides; B. cereus; B. pulmilus[\5^ và có tác dụng
kháng nấm Candida albicans tốt [15], [18].
- Dịch chiết flavonoid từ lá đơn đỏ có tác dụng ức chế rất tốt đối với vi
khuẩn Gram(+) như Bacillus subtilỉs; B. cereus; B. pulmilus; Sarcina lutea.
- Dịch chiết saponin có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn Gram(+) kém
nhưng lại có tác dụng tốt trên nấm Candida albicans [12].
Thử tác dụng của một thành phần tách từ hỗn hợp flavonoid toàn phần bằng
sắc ký chế hoá, nhận thấy nó có tác dụng trên cả chủng Staphylococcus aureus [12].
Dịch sắc lá Đơn đỏ, tanin toàn phần và chất FAD1 phân lập từ tanin
toàn phần có tác dụng chống oxy hoá [17].
2.4. CÔNG DỤNG :
- Tính vị, công năng, chủ trị:
+ Tính v ị: Đơn lá đỏ có vị đắng ngọt, tính mát [4], [5].
+ Công năng: Thanh nhiệt, giải độc, khu phong trừ thấp, lợi tiểu, hoạt
huyết, giảm đau, chỉ ngứa [4], [5], [14].
+ Chủ trị: Thường dùng chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, đi lỵ, đái ra máu,
đại tiện ra máu, ỉa lỏng lâu ngày [4], [5], [14].
ở Thái Lan, lá cây còn được dùng làm thuốc trợ đẻ [5] và lợi tiểu [23].
Người ta thưòỉng phối hợp Đơn lá đỏ với các vị thuốc như : Đơn tướng quân,
Mã đề, Kim ngân hoa dùng để chữa dị ứng, mẩn ngứa, mề đay, mụn nhọt [19\
Rễ cây chữa kinh nguyệt không đều, trừ phong thấp [19].

- Dofn thuốc có Đơn lá đỏ dùng trong nhân dân:
+ Chữa mụn nhọt, mẩn ngứa: Dùng 20-30g lá sắc uống, dùng riêng
hay phối hợp với lá Thài lài tía, Bầu đất tía, Đậu ván tía [4], [5], [10].
+ Chữa đi lỏng lâu ngày: Dùng 15g lá khô sao vàng, ứiêm một miêhg gừng
nưỚQg, sắc với 3 bát nước, cô đên còn lại một bát chia làm 3 lần uống trong ngày [4],
[5], [14],
+ Chữa đại tiện ra máu và trẻ em đi lỵ; Lấy một nắm lá, sắc uống [4],
[5], [10].
+ Chữa Zona mẩn ngứa, mất ngủ: Lá tươi 400g, sao vàng, để nguội. Thêm
600ml nước, sắc còn 200ml(một bát) chia làm 2-3 lần uống trong ngày [14].
+ Chữa mụn nhọt, lở ngứa, viêm cơ: Lá đơn đỏ kết họfp vód Kim ngân hoa,
Ké đầu ngựa, Sài đất, Thổ phục linh, Hà thủ ô, Hoàng đằng, Huyền sâm, Kê huyết
đằng, Lá móng tay, Bồ công anh, Ngưu bàng tử mỗi vị 12g sắc uống [3], [14].
PHẦN III - THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
3.1.1. Nguyên liệu, súc vật, hoá chất:
Nguyên liệu: các mẫu nghiên cứu được thu hái và chế biến ở Hà Nội,
có ký hiệu lần lượt như sau:
Lá tươi: LI Lá khô : L2
Lá khô sao vàng : L3 Cành non: L4
Súc vật thí nghiệm : chuột nhắt trắng có trọng lượng 24 ± 1 g do Viện
Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội cung cấp .
Benzo [ỡé] pyren và dầu Ba đậu (Croton oil) của hãng Sigina .
3.1.2. Phương pháp nghiên cứu :
3.12.1. Hoá học :
- Định tính các hợp chất theo tài liệu [2], [9]
- SKLM theo tài liệu [17]
- Định lượng Aavonoid toàn phần bằng phương pháp cân [18]
- Định lượng tanin theo DĐVNII tập 3 bằng phương pháp bột da[8]
- Phân lập các polyphenol toàn phần bằng sắc ký cột theo tài liệu [9]

- Độ ẩm dược liệu được xác định trên máy PRECICA- HA60
- Cất thu hồi dung môi trên máy BUCHI ROTAVAPOR R-114
- Đo phổ ư v trên máy UV- VIS Spectrophotometer carry IE Varian
[Úc] tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Đại học Dược.
- Đo phố hồng ngoại trên máy FT-IR Spectrophotometer 1650 Perkin
Elmer (USA) tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Đại học Dược .
3.1.22. Nghiên cứu tác dụng chống khối u:
- Mô hình tạo khối u thực nghiệm được tiến hành theo phương pháp đã
được R.Ramanathan miêu tả [23], tác nhân gây khối u là Benzo [a] pyren và
dầu Ba đậu (croton oil) được bôi trên vùng da đã nhổ sạch lông.
- Nghiền gan thận chuột trên bộ nghiền đồng thể Relex.
- Xử lý kết quả trên phần mềm Excell.
- Đo quang trên máy ELX 800 (Biotex- Instrument).
- Ly tâm trên máy lEC Centra 4R.
- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi NIKON.
3.2. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT :
3.2.1. Xác định một sô nhóm chất bằng phản ứng hoá học :
32.1.1. Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hoả
Cân 5g dược liệu mỗi loại đã tán nhỏ cho vào bình cầu rồi chiết với
ether dầu hoả bằng bộ chiết Soxhlet trên nồi cách thuỷ sôi cho đến khi dung
môi trong bình chiết không màu. Lọc dịch chiết qua bông, cất thu hồi bớt
dung môi, dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính .
* Định tính chất béo :
Chấm 3 giọt dịch chiết ether dầu hoả trên giấy bóng mờ, hơ trên bếp
điện đến khô , không thấy để lại vết mờ, chứng tỏ dịch chiết của cả 4 mẫu thử
đều không có chất béo .
* Định tính carotenoid :
Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, để bốc hơi dung môi, cắn còn lại
màu nâu, thêm 2 giọt H2SO4 đặc thấy xuất hiện màu xanh lá ở cả 4 mẫu thử .
Chứng tỏ dịch chiết có carotenoid.

^Định tính phytosterol:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, để bốc hơi dung môi đến khô, cho
vào ống nghiệm Iml anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm Iml H2SO4 đặc theo thành
ống nghiệm. Kết quả cho thấy, ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện
một vòng tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh. Sơ bộ kết luận trong
dịch chiết của cả 4 mẫu thử đều có phytosterol.
32.1.2. Định tính các thành phần trong dịch chiết cồn:
Bã dược liệu sau khi chiết bằng ether dầu hoả để bay hơi hết dung môi,
cho vào bình cầu dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90°, lắp sinh hàn hồi lưu,
đun cách thuỷ sôi trong 30 phút, lọc. Dịch lọc để làm các phản ứng định tính :
* Định tính flavonoid :
- Phản ứng Cyanidin: cho Iml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm một ít
bột Mg kim loại, và vài giọt HCl đặc, đun nóng trên nồi cách thuỷ thấy xuất hiện
màu hồng đỏ ở cả 4 mẫu thử. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với kiềm :
+ Phản ứng với hơi amoniăc: nhỏ 3 giọt dịch chiết cồn lên tờ giấy lọc,
hơ nóng nhẹ cho khô, trên giấy có vết màu vàng nâu nhạt, hơ lên miệng lọ
amoniăc đã được mở nút, thấy màu vàng của vết tăng lên rõ rệt ở cả 4 mẫu
thử. Phản ứng dương tính .
+ Phản ứng với dung dịch NaOH 10% : cho Iml dịch chiết cồn vào ống
nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa đục và màu
của dịch chiết vàng đậm hơn so vơí dịch chiết ban đầu ở cả 4 mẫu . Phản ứng
dương tính.
- Phản ứng với dung dịch FeClj 5%: cho Iml dịch chiết cồn vào ống
nghiệm thêm vài giọt dung dịch FeClj 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen ở cả 4
mẫu. Phản ứng dương tính .
Qua các phản ứng trên sơ bộ kết luận trong dịch chiết của cả 4 mẫu thử
đều có flavonoid .
* Định tính coumarin:
- Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào ống nghiệm, mỗi ống 1 ml

dịch chiết cồn, ống 1 cho thêm 0,5 ml NaOH 10 %, ống 2 để nguyên, cho cả 2
ống đun trên nồi cách thuỷ sôi trong vài phút, ống có kiềm xuất hiện nhiều tủa
đục vàng. Thêm vào mỗi ống 2ml nước cất thì cả 2 ống đều trong, thêm vào ống
có kiềm vài giọt HCl đặc không thấy xuất hiện tủa, nhưng màu vàng của dung
dịch đều đậm hơn so với dịch chiết ban đầu ở cả bốn mẫu. Phản ứng dương tính.
- Soi huỳnh quang: nhỏ hai giọt dịch chiết cồn lên giấy lọc, sau đó nhỏ tiếp
lên một giọt NaOH 10%. Để khô rồi đem soi dưới ánh sáng tử ngoại ở Ả 366
nm thấy có vết màu xanh hơi vàng.
Sau đó cũng làm một mẫu thử khác tương tự: nhỏ hai giọt dịch chiết
cồn lên giấy lọc, thêm một giọt NaOH 10%, để khô, che nửa vết chất thử
bằng một mảnh kim loại rồi soi dưới ánh sáng tử ngoại trong 30 giây thấy
bên không bị che có màu xanh hơi vàng. Lấy miếng kim loại ra thấy chỗ bị
che không có màu, để một lúc lại sáng màu lên như bên không bị che mảnh
kim lo ạ i.
Qua các phản ứng trên thấy cả bốn mẫu thử đều có coumarin .
*Định tính Saponin:
- Quan sát hiện tượng tạo bọt khi lắc với nước: cho vào ống nghiệm to
3ml dịch chiết cồn, thêm 5ml nước cất, lắc mạnh trong 5phút, để yên thấy cột
bọt tương đối bền vững. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng Salkowski: lấy 1 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm thêm Iml
acid H 2 SO 4 đặc từ từ theo thành ống nghiệm, thấy xuất hiện một vòng nâu đỏ ở giữa
hai lớp chất lỏng và dịch chiết ở phía trên có màu xanh. Phản ứng dương túứi.
Sơ bộ kết luận có saponin ở cả 4 mẫu thử.
3.2.1.3. Định tính alcaloid:
Lấy 2 gam dược liệu mỗi loại cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm
30 ml dung dịch H 2SO4 2%, đun sôi trong 30 phút, để nguội, lọc dịch chiết
vào bình gạn dung tích 100 ml, kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N
đến pH kiềm (thử bằng chỉ thị màu). Chiết alcaloid dưới dạng bazơ bằng
chloroform (10 ml X 3 lần). Sau đó chuyển alcaloid dưới dạng bazơ sang dạng
muối bằng cách lắc với dung dịch H 2SO4 2%. Gạn lấy lớp nước để làm các

phản ứng định tính :
- Phản ứng với thuốc thử Mayer: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm
con, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện tủa trắng hay vàng
nhạt ở cả 4 mẫu thử. Phản ứng âm tính .
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: cho Iml dịch chiết vào ống
nghiệm, thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa nâu ở
cả 4 mẫu thử. Phản ứng âm tính.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: cho Iml dịch chiết vào ống
nghiệm, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff, không thấy kết tủa vàng cam
hay đỏ ở cả 4 mẫu thử. Phản ứng âm tính.
Qua các phản ứng trên sơ bộ kết luận cả 4 mẫu thử đều không có
alcaloid
3.2.14. Định tính glycosỉd trợ tim:
Lấy 5g dược liệu mỗi loại cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50
ml nước cất, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Gạn dịch vào cốc có mỏ,
loại tạp bằng lưcmg thừa dung dịch chì acetat 20%, lọc loại tủa. Dịch lọc
chuyển vào bình gạn, chiết hỗn hợp glycosid trợ tim bằng cách lắc với 20 ml
chloroform (chia 3 lần) dịch chiết được chia đều vào 6 ống nghiệm sạch khô
rồi bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ. cắn để làm các phản ứng định tính.
- Phản ứng Liberman: cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml anhydrid
acetic, lắc cho tan hết cắn, Đặt nghiêng ống nghiệm một góc 45° , thêm đồng
lượng H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm , ở mặt phân cách giữa hai lớp chất
lỏng không thấy xuất hiện vòng tím đỏ và lófp chất lỏng phía trên không có
mầu xanh khi lắc nhẹ ở cả 4 mầu thử. Phản ứng âm tính.
- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml côn 90° , lắc cho
tan hết cắn, thêm 2-3 giọt thuốc thử Baljet vừa mới pha, không thấy xuất hiện
màu da cam ở cả 4 mẫu. Phản ứng âm tính.
- Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml cồn 90”, lắc cho
tan hết cắn thêm 3 giọt thuốc thử Natri nitroprusiat 0,5% và 2 giọt dung dịch
NaOH 10%, không thấy xuất hiện mầu đỏ ở cả 4 mẫu. Phản ứng âm tính,

- Phản ứng Keller-Kiliani: cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml dung
dịch F eC lj
5
% pha trong acid acetic. N ghiêng ống nghiệm và cho từ từ H2SO4
đặc theo thành ống nghiệm, không thấy xuất hiện màu đỏ giữa 2 lớp ở cả 4
mẫu thử. Phản ứng âm tính.
- Phản ứng với thuốc thử xanthydrol: cho vào ống nghiệm chứa cắn
0,5ml cồn 90”, lắc cho tan hết cắn. Thêm 0,5ml dung dịch chất thử xanthydrol,
đun trong nồi cách thuỷ sôi vài phút, không thấy xuất hiện màu đỏ ở cả 4 mẫu
thử. Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận trong dịch chiết của cả 4 mẫu đều không có glycosid trợ
tim.
32.1.5. Định tính anthraglycosid:
- Phản ứng Bomtraeger: Lấy Igam dược liệu đã cắt nhỏ cho vào ống
nghiệm to, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập dược liệu rồi đun trực tiếp
trên bếp sôi trong vài phút. Để nguội, lắc với ether ethylic. Gạn lấy lớp ether
rồi cho thêm Iml NH4OH đặc, lắc, lớp kiềm có màu hồng. Phản ứng dương
tính.
- Phản ứng vi thăng hoa: cho vào nắp nhôm một ít dược liệu. Hơ nhẹ
trên nguồn nhiệt đến khi bay hơi hết nước trong dược liệu. Đặt lên trên miếng
nhôm
1 lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh, sau một
thời gian (5-10 phút) lấy lam kính ra, để nguội. Phản ứng dương tính khi soi
dưới kính hiển vi thấy xuất hiện tinh thể hình kim màu vàng.
Kết luận: Cả 4 mẫu thử đều có anthraglycosid.
3.2.1.6. Định tính tanin:
Cho vào bình nón dung tích lOOml khoảng 2 gam dược liệu mỗi loại
thêm 20 ml nước cất, đem đun sôi trên bếp qua lưới amiăng trong thời gian
khoảng 5 phút, lọc nóng, dịch lọc được làm các phản ứng:
- Phản ứng với dung dịch PeClg 5%: Lấy Iml dịch vào ống nghiệm thêm

vài giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện màu xanh đen ở cả 4 mẫu thử.
Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với dung dịch gelatin 2%: Lấy Iml dịch cho vào ống nghiệm
thêm vài giọt gelatin. Thấy xuất hiện tủa bông trắng ở cả 4 mẫu thử. Phản ứng
dương tính.
- Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: cho vào ống nghiệm Iml dung
dịch thử, thêm 2-3 giọt chì acetat 10% thấy xuất hiện tủa bông trắng ở cả 4
mẫu thử. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng phân biệt tanin pyrogallic và pyrocathechic:
+ Phản ứng với nước Brom bão hoà: Lấy Iml dung dịch thử cho vào
ống nghiệm, thêm từ từ 2 - 3 giọt nước Brom, lắc đều, không thấy xuất hiện
tủa. Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng Stiasny: Lấy 2ml dung dịch thử thêm 5ml dung dịch formol
và 5ml acid HCl đặc, đun sôi cách thuỷ 3 phút, không thấy có kết tủa. Phản
ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận cả 4 mẫu thử đều có tanin và không phải là tanin
pyrocathechic.
3.2.1.7. Định tính đường tự do :
Lấy Iml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm, thêm Iml thuốc thử
Fehling A và Iml thuốc thử Fehling B, đun cách thuỷ trong 15 phút thấy xuất
hiện tủa đỏ gạch ở cả 4 mẫu. Sơ bộ kết luận trong dịch chiết của cả 4 mẫu đều
có đường tự do.
Kết quả định tính sơ bộ xác định một sô nhóm chất hoá học được tóm
tắt trong bảng 3.1.
I s
^ /-y
TT
Nhóm chất
Phản ứng đinh
với các thuốc thử

Kết quả
Kết luân
sơ bộLI
L2
L3 L4
1
Alcaloid
+ Thuốc thử Mayer
- - - - Không
+Thuốc thử Bouchardat
- - - -
có
+ Thuốc thử Dragendorff
- - - -
2
Antraglycosid
Phản ứng Borntraeger
+ + +
+
Có
Phản ứng vi thăng hoa +
+
+
+
3 Carotenoid
+ H2SO4 đặc
+ + + +
Có
4
Chất béo

Thử trên giấy
- - - -
Không
có
5 Coumarin
Phản ứng mở và đóng vòng Lacton
++ ++ ++ +
Soi huỳnh quang dưới ánh sáng
Có
u v
++ ++ ++
+
6 Đường tự do
+Thuốc thử Fehling
++
++
++
+ Có
7 Glycosid
Phản ứng Liberman
-
- - -
Trợ tim
Phản ứng Baijet
- - -
-
Phản ứng Legal
- - - -
Không
Phản ứng Keller- Kiliani -

- - -
có
Phản ứng Xanthydrol -
- - -
8 Phytosterol Phản ứng Liberman
+
+
+ +
Có
9 Saponin
Hiện tượng tạo bọt khi lắc với ++
++ ++ +
Có
nước
Phản ứng Salkowski ++
+4-
++ +
1 0
+ FeCl3 5%
+++
+++ +++
+ Có
Tanin
+ Gelatin 2%
+++ +++
+++
+
Tanin
+ Chì acetat 10% +++
+++ +++

+
Không
Phản ứng Styasni
- -
- -
có
Phản ứng với nước Brom bão hoà
- - -
-
Tanin
pyrocath
echic
11 Phản ứng Cyanidin
+++ +++
+++
+
Flavonoid
+ Kiềm
+++ +++ +++
+
Có
+ FeCl3 5% +++
+++ +++
+
Nhận xét: Kết quả định tính sơ bộ bằng phản ứng hoá học cho thấy cả 4 mẫu
thử (Ll, L2, L3, L4) của dược liệu Đơn lá đỏ đều chứa các nhóm chất gồm ;
carotenoid , đường tự do, coumarin, antraglycosid, saponin, tanin, flavonoid. Không
có alcaloid, glycosid trợ tim, chất béo.
3.2.2. Định lượng Flavonoid toàn phần:
Nguyên liệu: các mẫu : Lá tươi: Ll; Lá khô: L2.

Lá khô sao vàng: L3; Cành: L4.
Tiến hành : Cân chính xác 2g dược liệu đã xác định độ ẩm cho vào
bình cầu rồi dùng bộ chiết Soxhlet, loại tạp bằng ether dầu hoả trên bếp cách
thuỷ cho đến khi dung môi trên bình chiết không màu. Dược liệu được để ra
ngoài không khí cho bay hơi hết dung môi, thêm 50ml cồn rồi cho vào bình
cầu có ống sinh hàn hồi lưu. Đun trên nồi cách thuỷ sôi 30 phút, lọc dịch
chiết. Thêm dung môi và chiết tiếp 2 lần nữa, gộp các dịch chiết, cất thu hồi
dung môi, còn dịch nước đem cô cách thuỷ tới còn khoảng 20ml. Để nguội,
thêm từng giọt gelatin 2%, khuấy đều cho tới khi hết tủa bông trắng. Lọc loại
tủa, chuyển dịch lọc vào bình gạn và chiết “flavonoid” bằng ethylacetat cho
đến khi dịch chiết hết màu vàng. Dịch chiết được lọc qua phễu lọc có Na2S04
khan vào một cốc khô đã sấy đến khối lượng không đổi. Cân cắn, hàm lượng
flavonoid toàn phần được tính theo công thức:
x% = — ^— xioo.
m{\-b)
Trong đó: a: khối lượng cắn thu được,
b: độ ẩm dược liệu (%),
m: Khối lượng dược liệu(gam).
Kết quả định lượng flavonoid toàn phần được thể hiện trong bảng 2.
STT
Kết quả (%)
L,
L.
L 3
L 4
1
2,16
4,24 4,02
1,48
2

2,04
4,18 3,98
1,36
3 2,10 4,20 4,06 1,42
TB 2,10
4,20
4,02 1,42
Nhận xét: Bằng phương pháp cân đã định lượng được hàm lượng
flavonoid trong các mẫu dược liệu chế biến và không chế biến. Kết quả sơ bộ
cho thấy khi sao vàng hàm lượng flavonoid chỉ bị giảm đi rất ít.
3.2.3. Định tính flavonoid của các mẫu thử bằng SKLM
- Tiến hành định tính trên bản mỏng Silicagel tráng sẵn G60 F254 của
hãng Merck
- Hệ dung môi khai triển: nhằm chọn hệ có khả năng tách tốt nhất các
thành phần trong flavonoid toàn phần, tiến hành thăm dò 6 hệ dung m ô i:
Hệ 1: Toluen: Ethylacetat: acid formic (5: 6 : 1)
Hệ 2: Toluen: Ethylacetat: acid formic (5: 4: 1)
Hệ 3: Chloroform: Aceton : Toluen (5; 7: 8 )
Hệ 4 : Toluen : Aceton (19: 1)
Hệ 5 : Ethylacetat: n-Butanol: Acid acetic: Nước (5: 3: 1:4)
Hệ 6 : Chloroform: Acid acetic (9:1)
Quan sát các vết dưới ánh sáng thường, hơi NH3, soi dưới đèn tử ngoại ở
bước sóng 254nm, 366nm.
Kết quả thăm dò 6 hệ dung môi nhận thấy hệ 2 cho kết quả tách
tốt nhất