Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hòe ( sophora japonica l fabaceae )

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG ĐÌNH HỢP
NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHIÊT XUẤT RUTIN
TỪ HOA HOÈ
{Sophora japónica L. - Pabaceaè)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 1997-2002)
Người hướng dẫn : PGS. TS.TừM inh Koóng
KS. Nguyễn Việt Hương
Nơi thực hiện : BM. Công nghiệp Dược.
Trung tâm GMP.
Thời gian thực hiện: 2/2002- 5/2002
Hà Nội, 5/2002
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện công trình tốt nghiệp này, em đã nhận được
sự giúp đỡ của nhiều thầy cồ giáo, đặc biệt là:
Thầy giáo PGS TS.TừM ỉnh Koóng
Cô giáo KS. Nguyễn Việt Hương
những người đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành công trình này.
Với lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ofn các thầy cô
Đồng thời, em xin cảm ơn bộ môn Công nghiệp dược, phòng thí nghiệm
GMP đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành công trình này, cảm ơn các
thầy cô, các bộ môn đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và rèn luyện tại
trường.
Hà Nội 5/2002
s v Hoàng Đình Hợp
MỤC LỤC.
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
Phần I: TỔNG QUAN 2
1. Nguồn nguyên liệu để chiết rutin 2

2. Cây hoè 3
2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
3
2.2. Thành phần hoá học 3
2.3. ứ ig dụng 4
3. Rutin 5
3.1. Công thức hoá học và tính chất
5
3.2. Định tính, định lượng 6
3.3. Tác dụng dược lý 8
3.4. ứ ig dụng 8
4. Chiết xuất rutin 9
4.1 .Phương pháp chiết bằng nước 9 /Ị^/^
4.2.Phương pháp chiết bằng cồn 10
Phần II: [th ự c n g h iệ m v à k ế t q u ả 12
1. Nguyên vật liệu 12
1.1 Ng
jyên liệu 12
1.2 Dung môi hoá chất
12
1.3 Thiết bị dụng c ụ 12
2. Phương pháp thực nghiệm
13
2.1. Định lượng rutin trong hoa hoè 13
2.2. Phương pháp chiết bằng nước ở 100°c
13
2.3. Phương pháp chiết bằng nước ở 120°c
16
2.4. Phương pháp chiết bằng cồn 60°

17
2.5 . Phương pháp chiết bằng dung dịch kiềm loãng ^

18
2.6. Phương pháp xử lý số liệu 19
3. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 19
3.1.Định lượng rutin trong hoa hoè
19
3.2 .Phương pháp chiết bằng nước ở 100°c
20
3.3 .Phương pháp chiết bằng nước ở 120°c

21
3.4.Phương pháp chiết bằng cồn 60°
22
3.5.Phương pháp chiết bằng dung dịch kiềm loãng

23
4. Bàn luận 27
Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
30
LKết luận 30
2.Đề xuất 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
CÁC CHỮVIẾT TẮT
DC:
Dịch chiết
DD:
Dung dịch
DĐVN:

Dược điển Việt Nam
DĐ:
Dược điển
DL:
Dịch lọc
PP:
Phương pháp
PPCX:
Phương pháp chiết xuất
ĐẶT VÂN ĐỂ
•
Rutin là một chất có tác dụng làm giảm tính thấm của mao mạch, tăng
sức bền của thành mạch, trong y học được ứng dụng để phòng và điều trị
nhiều chứng bệnh liên quan đến tổn thương thành mạch như trĩ, chảy máu đáy
mắt , các chứng bệnh có thể dẫn đến tai biến mạch máu như vữa xơ động
mạch, rối loạn tuần hoàn, giòn mao mạch Đặc biệt, hiện nay tỉ lệ người có
nguy cơ mắc và mắc các bệnh này ngày càng gia tăng.
Ngoài ứng dụng trong y học rutin còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực khác như bao màu, nhuộm thực phẩm—
Do đó nhu cầu sử dụng rutin trên thế giới ngày càng tăng.
?
ỡ'nước ta, hoa hoè là dược liệu có hàm lượng rutin cao hơn nhiều so với
các dược liệu cho rutin khác như mạch ba góc, bạch đàn cho rutin kể cả hoè
ở một số nước khác trên thế giới như hoè ở Hungary ( khoảng 12%). Mặt
khác, điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng ở nước ta rất thuận lợi cho cây hoè phát
triển, thu hái và chế biến dược liệu. Hoè là cây dễ trồng, giống nhân khá
nhanh, kỹ thuật trồng đơn giản, đầu tư vốn không nhiều, 3 đến 4 năm đã có
thể thu hoạch, thu hái đơn giản nên cây hoè mọc hoang và được trồng rất
nhiều trên khắp cả nước. Đây là nguồn nguyên liệu lớn và vô cùng quý giá để
chiết rutin mà thiên nhiên ưu đãi chúng ta.

Để khai thác có hiệu quả nguồn nguyên liệu này cần nghiên cứu kỹ
thuật chiết xuất rutin từ hoa hoè như thế nào cho có hiệu quả kinh tế, tính khả
thi và độ an toàn cao. Với mong muốn được góp một phần nhỏ vào việc
nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hoè- Sophora japónica L Fabaceae.”
Phần I
TỔNG QUAN
1. Nguồn nguyên liệu để chiết rutin
Người ta đã tìm thấy rutin có ở 62 họ thực vật với khoảng 150 loài trong
đó có 70 loài thuộc 28 họ thực vật chứa rutin dưới dạng vết[17]. ^'
Trong cây rutin phân bố chủ yếu ờ một số bộ phận nhất định như ở hoa
(Hoè), lá (Bạch đàn cho rutin , Mạch ba góc)
Tuy rutin có ở khá nhiều cây nhưng chỉ có một số cây chứa rutin với
hàm lượng cao có khả năng dùng làm nguyên liệu để chiết rutin là:
- Ruta graveolens L. có khoảng 2%.
- Fagopyrum esculentum Moench. có khoảng 4%
- Fagopyrum tataricum L. có khoảng 6 %
- Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell. có khoảng 8 %
- Sophora japónica L. có khoảng 18%
Các nguồn nguyên liệu chính để sản xuất rutin trên thế giới hiện nay là:
- Sophora japónica L,: Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Pháp.
- Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell: Anh, Mỹ, úc.
- Fagopyrum esculentum Moench và Fagopynim tatarỉcum L :
Pháp, Mỹ, Việt Nam. [16]
3>
& nước ta, hoa hoè có hàm lượng rutin rất cao (25- 35%). So với một số
dược liệu khác như fnạch ba^ócr(2- 3%), bạch đàn cho rutin (10%) thì hoa hoè
có hàm lượng lớn hơn nhiều [8 ]. Mặt khác, cây hoè mọc hoang và được trồng
khắp nơi ở nước ta. Vì vậy, nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất rutin ở
nước ta hiện nay là hoa hoè [16].

2. Cây hoè: Sophora japónica L. , họ Đậu -Fabaceae
2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố.
Hoè là loại cây gỗ, to, cao có thể tới 15m, thân thẳng có chỏm lá tròn.
Cành cong queo. Lá kép lông chim lẻ, có 9-13 lá chét hình trứng, đỉnh nhọn,
nguyên dài khoảng 3cm, rộng 1,5 - 2,5 cm. Cụm hoa hình chuỳ ở đầu cành,
hoa dài 4- 8 mm rộng 2- 3mm, phần đài chiếm 2/3 toàn bộ chiều dài, đài hình
chuông, tràng hình bướm màu trắng ngà phía dưới có cuống ngắn. Khi khô
hoa trở nên vàng, vị hơi đắng. Quả loại đậu không mở, dày và thắt nhỏ lại ở
giữa các hạt [4,8].
Phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á*: Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên.
Vùng Trung Capea dơ, Bán đảo Crưm [16]. ở một số nước Châu Âu cây hoè
được trồng làm cảnh [8 ].
ở nước ta, cây hoè được trồng và mọc hoang ở khắp nơi, đặc biệt được
trồng nhiều ở Thái Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An [8 ].
Qua thực tế trồng trọt và thu hoạch sản phẩm, người ta thấy có hai loại
cây hoè khác nhau là hoè tẻ và hoè nếp. Hoè tẻ là cây có ít cành, hoa thưa và
nở không đều, cụm hoa ở ngọn cành và kẽ lá. Hoè nếp là cây nhiều cành,
mang nhiều hoa và nở đều [6 ]. Hoè nếp cho năng suất nụ hoa cao gấp ba lần
hoètẻ[16].
2.2. Thành phần hoá học.
Thành phần hoá học chủ yếu của cây hoè là các flavonoid, ngoài ra còn
một số hợp chất khác:
- Lá chứa 6 ,6 % flavonoid toàn phần trong đó có 4,7% là rutin.
- Vỏ quả chứa 10,5% flavonoid toàn phần trong đó 4,3% là rutin, ngoài
ra còn có sophoricosid, sophora biosid và một số flavonoid khác. Trong quả
xanh có 8 flavonoid, ngoài rutin còn có kemppherol- 3- sophorosid , henistein.
- Các bộ phận khác như gỗ, thân, hạt đều có những flavonoid khác nhau
đã được phân lập và đã biết cấu trúc hoá học nhưng không có ý nghĩa thực t ế .
- Hoa hoè có 14 Aavonoid được phát hiện [19], ngoài rutin còn có quercetin,
betulin triterpenoid nhóm lupan, sophoradiol là dẫn chất của nhóm olean[8 ].

Tuỳ từng điều kiện cụ thể về khí hậu, thổ nhưỡng, trồng trọt, cách thu
hái và thời gian thu hái mà hàm lượng rutin trong hoa là khác nhau. Thông
thường thu hái vào lúc nụ hoè còn non thì hàm lượng rutin đạt cao nhất[5]. Nụ
hoè ở nước ta chứa khoảng 25- 35% rutin [16]. DĐVN II quy định hàm lượng
rutin đã được sấy khô trước 60°c trong 6giờ không được thấp hơn 2 0 %[2 ].
2.3. ứng dụng,
Người ta thường sử dụng nụ hoè và hoa hoè vói tên gọi hoè mễ và hoè
hoa trong nhiều lĩnh vực : trong đời sống hàng ngày dùng hãm để uống, trong
y học dùng làm thuốc , trong công nghiệp chiết xuất dùng để chiết xuất
rutin DĐVN qui định dược liệu không chứa quá 10% hoa đã nở.
Trong y học, ngoài sử dụng hoa hoè người iịa còn dùng các bộ
phận khác của cây như quả với tên gọi hoè giác, nhưng ít hơn
Theo quan điểm của y học cổ truyền, vị hoè hoa thuộc nhóm chỉ huyết.
- Tính vị: vị đắng, tính bình.
- Quy kinh: can và đại tràng.
- Công năng - chủ trị:
+ Lương huyết chỉ huyết: dùng trong trường hợp huyết nhiệt gây chảy
máu như chảy máu cam, lỵ, trĩ, băng kinh, băng huyết, đại tiện ra máu
+ Thanh nhiệt bình can: dùng trong trường hợp can hoả thượng viêm
gây đau mắt đỏ, đau đầu
+ Thanh phế chống viêm: dùng trong bệnh viêm thanh đới nói không ra
tiếng
+ Hạ huyết áp: dùng hoè sao vàng trong bệnh cao huyết áp, trị co thắt
động mạch vành
3. Rutin.
Rutin là một flavonoid thuộc nhóm flavon được phân lập đầu tiên vào
năm 1842 từ cây Cửu lý hương {Ruta graveolen) bởi Veyss [8 ]. Đến năm 1904
Schnidt mới xác định rõ công thức hoá học của rutin [7]. Đến năm 1962, rutin
đã được tổng hợp toàn phần [24].
3.1. Công thức hoá học và tính chất.

Rutin (3,3',4',5,7 pentahydroxy flavone -3-Rutinosid) [8 ].
__
.0 H
C12H21O9
OH ô
Khi thuỷ phân tạo thành quercetin, glucose và rhamnose
Quercetin (3,3',4',5,7 pentahydroxy flavone) [8].
OH
OH
OH Ô
- Rutin là bột kết tinh màu vàng hay hơi vàng ánh xanh, không mùi. Để
ngoài ánh sáng có thể có màu hơi sẫm lại. Tinh thể ngậm 3 phân tử nước
chuyển sang dạng khan khi sấy 12 giờ ở 110°c dưới áp suất giảm (lOmmHg)
[21].
- Rutin rất khó tan trong nước lạnh (1/10.000), tan trong nước sôi (1/200),
khó tan trong cồn (1/650), tan trong cồn sôi (1/60), tan trong methanol,
isopropanol và trong các DD kiềm loãng, không tan trong aceton, ether,
cloroform, ether dầu hoả, benzen và các acid [3].
- Do cấu trúc là một glycosid nên rutin rất dễ bị thuỷ phân bởi các men có
sẵn trong dược liệu hoặc bởi các acid. Với DD kiềm nó rất ít bị ảnh hưởng, chỉ
ở điều kiện DD kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì cấu trúc của rutin bị phá vỡ, cụ
thể là vòng c sẽ mở tạo thành một dẫn chất acid thơm và một dẫn chất phenol
[8].
3.2. Định tính và định lượng.
3.2.1. Định tính rutin.
- Phản ứng cyanidin: DD rutin trong cồn khi thêm bột Mg và acid HCl đặc
cho màu tím đỏ [8].
- Phản ứng với DD NaOH cho màu vàng từ nhạt đến đậm tuỳ thuộc vào độ
kiềm và thời gian, đặc biệt khi phản ứng với DD NaOH 1% cho màu vàng
chanh [24].

- Phản ứng với DD FeCl35% cho màu xanh lục [8 ].
- Sắc ký: thường dùng 2 loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy [26].
+ Sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng: Chất hấp thụ sillicagel G.
Dung môi thường dùng:
Benzen- AtOAc (3:1)
CHCI3- MeOH(15:l)
Benzen- Aceton (9:1)
Toluen- Aceton (19:1)
CHCI3- CH3COOH (9:1)
MeOH 80% (VA^).
+ Sắc ký giấy.
Giấy sắc ký: What man số 1, số 3.
Dung môi thường dùng:
TB A: n- BuOH- CH3COOH- H2O (3:1:1).
BAW: n- BuOH- CH3COOH- H2O (4:1:5).
Forestal: CH3 COOH- HCl- H2O (30:3:10).
Benzen- CH3 COOH- HjO (125:72:3)
CH3CI3- CH3COOH- H2O (13:6:1).
Phenol-H2O (3:1).
Hiện màu bằng đèn tử ngoại (UV) ở bước sóng 366nm hoặc bằng hơi amoniac
soi đèn tử ngoại (UV).
3.2.2. Định lượng:
Để xác định hàm lượng trong chế phẩm hoặc trong dược liệu người ta
có thể dùng các phương pháp sau:
- Phương pháp cân: [2]
+ Nguyên tắc: chiết xuất rutin bằng cồn sau đó thuỷ phân rutin bằng
DD acid loãng được quercetin, lọc lấy kết tủa, sấy rồi cân và tính ra
hàm lượng rutin.
- Phương pháp đo quang [8 ].

+ Nguyên tắc: rutin tạo màu với kiềm và một số thuốc thử khác nhau
như: Amoni molipdat, tiến hành phản ứng cyanidin rồi đo quang.
- Phương pháp quang phổ .
+ Nguyên tắc: rutin hoà tan trong ethanol có đỉnh hấp phụ cực đại ở
^,max = 362,5nm và A,2max= 258nm. Với 325,2 ở x = 362,5.
Người ta dựa vào tính chất đó để định lượng rutin.
+ Ngoài ra người ta còn dùng một số phưoỉng pháp khác để định lượng
rutin như:
Phương pháp đo iod [23]
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp [1].
3.3 Tác dụng dược lý:
- Rutin có hoạt tính của vitamin p, tức là có tác dụng làm bền vững thành
mạch, làm giảm tính thấm của mao mạch, tăng sự bền vững của hồng cầu[8 ].
Rutin có hoạt tính của vitamin p là do cấu trúc có hai nhóm -OH phenol tự do
ở vị trí 3' và 4' [7]. Theo Paris, Vairel thì rutin có hoạt tính của vitamin p
mạnh nhất [15]. Theo Paưot, cơ chế tác dụng của rutin là do nó có tác dụng ức
chế sự phá huỷ của adrenalin, adrenalin làm tăng sức chịu đựng của mao mạch
do đó làm vững bền thành mạch [4].
- Rutin làm hạ thấp trương lực cơ nhẵn, chống co thắt [8 ], chống phóng xạ
tia X, chống viêm thận cấp [14]. Cơ chế chống viêm là do rutin ức chế con
đường sinh tổng hợp prostagladin [8 ].
- Dạng muối natri của rutin có tác dụng làm giảm nhẹ phù nề của tĩnh mạch
khi bị viêm [14].
- Sau khi bị oxy hoá, rutin có tác dụng làm tăng đường huyết của thỏ [14].
3.4. ứng dụng,
- Rutin được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: y học, công nghệ bao màu,
nhuộm thực phẩm
- Trong y học, rutin được dùng phòng và chống những biến cố của xơ vữa
động mạch, các trường hợp suy yếu tĩnh mạch, xuất huyết như tử cung xuất
huyết, ho ra máu, đại tiện ra máu, chảy máu cam. Là thuốc điều trị trĩ, chống

dị ứng, thấp khớp. Ngoài ra còn được dùng trong các trường hợp tổn thương
ngoài da do bức xạ, làm cho vết thương chóng lành sẹo [8 ].
- Trong khoa mắt, được dùng cho các trường hợp viêm võng mạc có xuất
huyết, chảy máu đáy mắt [12].
- Rutin có thể được dùng đơn độc hoặc được phối hợp với các chất khác để
nâng cao hiệu quả điều trị như :
+ Với Vitamin C: làm tăng cường tác dụng của vitamin c đặc biệt là
khả năng hấp thu vào các cơ quan khác nhau [25]. Dùng trong biểu hiện tổn
thương mao mạch, xuất huyết dưới da, võng mạc, cao huyết áp.
+ Với Vincamin: dùng chữa các chứng rối loạn tâm thần, cải thiện trí
nhớ, chức năng thần kinh giác quan ở người già.
+ Với Nicotinamid: dùng trong các biểu hiện chức năng hay thực tổn
của suy tĩnh- bạch mạch, giãn tĩnh mạch nguyên phát, cơn đau trĩ.
+ Ngoài ra còn phối hợp với cholin, khellin, papaverin
- Các dạng bào chế của Rutin:
Rutin được bào chế dưới dạng viên hay dạng hoà tan trong nước dùng
để uống, ở dạng đơn độc hay phối hợp với các hợp chất khác với nhiều tên biệt
dược khác nhau.
+ Dạng viên:
Viên bao phim: Rutin, Mevon 500, Ido rutin, Vinca"rutin (phối hợp
với Vincamin)
Viên bao đường: Rutin c (phối hợp với Vitamin C )
+ Dạng hoà tan trong nước: Rutin thường được chuyển thành dạng muối
hoặc dẫn chất dễ tan trong nước như Morpholylethylrutosid, Rutosid
natripropylsulíonat [8 ].
4. Chiết xuất rutin.
Các phương pháp chiết xuất rutin đều dựa trên tính chất có khả năng hoà tan
khác nhau trong các dung môi của rutin.
Có nhiều phương pháp chiết rutin nhưng có thể xếp thành hai loại chính
như sau:

+ Phương pháp chiết bằng nước.
+ Phương pháp chiết bằng cồn.
4.1. Phương pháp chiết bằng nước:
4.1.1. Chiết bằng nước sôi:
- Phương pháp này dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong nước sôi và
nước lạnh, có thể chiết bằng áp xuất thường hoặc áp xuất cao. Dùng nước sôi
để chiết rutin trong hoa hoè, dịch chiết để nguội sẽ có tủa rutin, lọc lấy tủa
thu được mtin.
- Một số tác giả ở Anh, Mỹ, Pháp, úc, Rumani, đã dùng phương pháp
này để chiết rutin. ở nước ta, Nguyễn Văn Đàn và cộng sự cũng đã dùng
phương pháp này để chiết rutin từ Mạch ba góc [7].
- Vì nước là dung môi có khả năng hoà tan rộng, nên dịch chiết lẫn
nhiều tạp chất do đó tiarớc khi chiết thường dùng acid loãng để khử bớt tạp.
4.1.2. Chiết bằng dung dịch kiềm loãng:.
- Dựa vào cấu trúc của rutin có nhóm chức -OH phenol tự do ở vị trí 3’,
4’ tạo muối dễ tan trong môi tiirờng kiềm. Dùng nước kiềm để chiết rutin, acid
hoá dịch chiết để rutin kết tủa, lọc lấy tủa thu được rutin.
- Có thể chiết bằng kiềm nóng hay kiềm nguội với các loại kiềm khác
nhau và nồng độ khác nhau.
- Phương pháp này đã được áp dụng ở Hungary, Rumani. ở nước ta, Bộ
môn công nghiệp dược tiirờng Đại học dược Hà nội, xí nghiệp Dược phẩm TW
II cũng đã nghiên cứu phương pháp này.
4.2. Phương pháp chiết bằng cồn:
- Phương pháp này dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong cồn sôi và
cồn lạnh. Người ta dùng cồn sôi để chiết rutin, dịch chiết đem cô đặc sau đó
để nguội rutin sẽ kết tủa, lọc lấy tủa thu được rutin.
- Thường người ta dùng cồn etylic là chủ yếu. Có một số tác giả dùng
cồn me ty lie (Schinller và Kugler; Kohlmay và Hauye; Couch), ở Mỹ đã dùng
isopropanol.[7]
- Cồn hoà tan cả clorophyl, các sắc tố khác, nhựa và chất béo mà chúng

ta cần loại bỏ. Có thể loại bỏ chúng trong quá trình tinh chế bằng các cách
sau:
- Kết tinh lại trong nước.
- Dùng dung môi để loại như: ete, tetracloruacarbon, ete dầu hoả.
Đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về phương
pháp chiết xuất rutin, và đã đưa vào ứng dụng trong sản xuất tuy còn nhiều
vấn đề chưa được thống nhất. Để đánh giá các phương pháp, phải xét trên hiệu
quả kinh tế của phương pháp, chất lượng sản phẩm thu được, khả năng áp
dụng vào thực tiễn và độ an toàn trong sản xuất.
Phần II
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
1. Nguyên vật liệu.
1.1 Nguyên liệu
- Hoa hoè: mua tại phố Lãn ông đem về sấy khô lại và định lượng.
1.2 Hoá chất và dung môi
- Cồn etylic.
- Na2C0 3
1.3 Trang thiết bị
- Bình chiết nguội.
- Nồi cách thuỷ.
- Bếp điện.
- Sinh hàn hồi lưu.
- Bộ dụng cụ cất thu hồi cồn.
- Nồi hấp.
- Tủ sấy shellab.
- Máy lọc hút chân không.
- Phễu buchner.
- Bộ chày cối sứ.
- Cân kỹ thuật sartorius.
- Cân phân tích sartorius.

- Pipet chính xác.
- Bình định mức.
- Máy quang phổ cary 100 kèm một máy vi tính và một máy in.
2. Phương pháp thực nghiệm.
2.1. Định lượng rutin trong hoa hoè: bằng phương pháp cân.
Theo DĐVNl tập I trang 311
Tiến hành
Cân chính xác 2 gam bột dược liệu, ngâm với 20 ml acid clohidric 0.5
phần trăm trong một chậu kết tinh, thỉnh thoảng khuấy mạnh. Sau 2 giờ gạn
dịch chiết qua phễu lọc. Rửa bột trong chậu nhiều lần với nước, nước rửa mỗi
lần lại lọc qua phễu, cho đến khi DL trung tính với giấy quỳ. Chuyển hết bột
dược liệu lên phễu, dùng nước rửa chậu và cũng lọc qua phễu lọc. Giấy lọc và
bột dược liệu được chiết với 20ml cồn 95° trong nồi cách thuỷ cổ sinh hàn
ngược. Sau khi cồn sôi 15 phút, làm nguội bình và gạn qua phễu lọc vào 1 cốc.
Bột lại được chiết với 20ml cồn 95°, cũng làm như trên. Tiếp tục chiết với
những lượng lOml cồn 95° cho đến khi dịch chiết không màu và không cho
vàng với DD natrihidroxid 0,1N. Rửa bình và phễu với lOml cồn 95° nóng.
Tập trung các dịch chiết và rửa lại, cho vào một bình cầu 200ml và làm bốc
hơi trên nồi cách thuỷ đến gần khô. Thêm vào bình lOOml DD acid sulfuric
2% đun sôi với ống sinh hàn ngược trong 1 giờ. Sau khi để nguội, để bình 3
giờ trong tủ lạnh ở 0°c. Thu toàn bộ tủa quercetin vào một phễu thuỷ tinh xốp
( số 3 hoặc số 4). Rửa tủa 4 lần, mỗi lần với 5ml nước đã để tủ lạnh. Kiểm tra
xem DL đã trung tính hoá có khử thuốc khử Fehling không. Sấy khô tủa
quercetin trong 2 giờ ở 125°c và cân. Khối lượng tủa p thu được nhân với
2,019 sẽ cho hàm lượng rutin trong 2 gam dược liệu.
Hàm lượng phần trăm rutin của dược liệu.
p X 2,019 X 50
2.2. Phương pháp chiết xuất rutin bằng nước ở 100'^c.
Nước là dung môi có khả năng hoà tan rộng nên dịch chiết thường lẫn
nhiều tạp chất. Để giảm bớt lượng tạp chất trong dịch chiết chúng tôi tiến

hành loại bót tạp chất trong nguyên liệu trước khi đưa vào chiết xuất bằng acid
loãng.
2.2.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất:
2.2.2. Cách tiến hành:
a. Xử lí muvên liêu: Cân lOOg nguyên liệu cho vào bình rửa, thêm vào đó acid
clohidric 0,5%, tới ngập dược liệu 2cm, thỉnh thoảng khuấy, sau 15 phút tháo
bỏ nước acid, làm như thế 3 lần. Sau đó rửa bằng nước lã cho đến hết phản
ứng acid. Nguyên liệu thu được đem sấy khô
ở
100°c và xay thô.
b. Chiết xuất', nguyên liệu sau khi được xử lí cho vào bình chiết, thêm 2000ml
nước vào rồi đun sôi trong 20 phút. Sau đó rút dịch chiết. Làm như thế 4 lần,
(lần thứ 4 lấy lOOml dịch chiết để nguội acid hoá đến pH = 3 thấy dịch chiết
còn rất ít tủa). Gộp dịch chiết lại, để nguội, cho rutin kết tinh tự nhiên 14 giờ ở
nhiệt độ phòng. Sau đó lọc lấy tủa bằng phễu buchner. Tủa thu được sấy ở
60°c cho đến khô được rutin thô.
c. Tinh chế’, nghiền rutin thô thành bột mịn, hoà tan bằng cồn 95° sôi trong
bình có sinh hàn hồi lưu, lọc nóng bằng phễu buchner. DL thu được đem cất
thu hồi một phần cồn. Sau đó để rutin kết tinh tự nhiên 12 giờ ở nhiệt độ
phòng. Lọc lấy tủa bằng phễu buchner, rửa tủa bằng nước cất ngay trên phễu
lọc. Tủa thu được sấy
ờ
60°c cho đến khô thu được rutin tinh khiết.
2.23. Định lượng:
Theo DĐ Liên Xô X ( USSRP X) Y
Cách tiến hành
Cân chính xác khoảng 0.025g chế phẩm thử, hoà tan trong vài chục ml
ethanol tuyệt đối nóng. Lọc nóng DD qua phễu xốp thuỷ tinh số 4, rửa 2 lần
phễu lọc bằng ethanol tuyệt đối nóng, mỗi lần lOml. Chuyển DL vào một bình
định mức lOOml, để nguội, thêm cồn tuyệt đối đến vạch, lắc đều. Lấy chính

xác 5ml DL trên cho vào một bình định mức 50ml, thêm ethanol tuyệt đối đến
vạch, lắc đều. Xác định độ hấp thụ của DD thu được trong cốc đo dày Icm ở
bước sóng 362,5nm (D2) và 375nm (D|) với mẫu trắng là ethanol tuyệt đối.
Nếu tỉ số D1/D2 ở trong khoảng 0,875 ± 0,004, hàm lượng rutin trong
chế phẩm được tính theo công thức:
D2 X1000
325,5 X a
Trong đó 325,5 là của rutin tinh khiết, khan trong ethanol tuyệt đối
ở bước sóng 362,5nm.
a là lượng chất tan trong mẫu thử đem định lượng tính ra g.
Nếu tỉ lệ D1/D2 vượt quá 0,879 hàm lượng rutin tính theo công thức:
14,60 XD2 -13,18 xD|
a
Quercetin:
Trong phần định lượng ở trên, nếu tỉ lệ D1/D2 nhỏ hơn 0,879 thì coi như
có hàm lượng quercetin thấp hơn 1%. Nếu tỉ lệ D1/D2 vượt quá 0,879 thì hàm
lượng quercetin trong chế phẩm tính theo công thức:
5,943 xDj - 5,200 XD2
2.3. Phương pháp chiết xuất rutin bằng nước ở 120®c.
2.3.1.Sơ đồ quy trình chiết xuất:
Như mục 2.2.1 nhưng thay 100°c bằng 120°c.
2.3.2. Cách tiến hành:
a. Xử lí nsuyên ỉiêu: thực hiện như mục 2.2.2a.
b. Chiết xuất: Nguyên liệu sau khi được xử lí cho vào 1 bình chiết rồi thêm
2000 ml nước. Đặt bình chiết vào nồi hấp đun sôi ở 120°c trong 10 phút. Sau
đó rút lấy dịch chiết. Làm như thế 4 lần (lần thứ 4 lấy khoảng 100 ml dịch
chiết, để nguội, acid hoá đến pH=3 thấy tủa còn rất ít). Gộp dịch chiết lại, để
nguội, cho rutin kết tinh tự nhiên 14 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó lọc lấy tủa
bằng phễu buchner. Tủa thu được đem sấy ở 60°c cho đến khô được rutin thô.
c. Tinh chế: thực hiện như mục 2.2.2 c.

2 3 3. Định lượng:
Thực hiện như mục 2.23
2.4. Phương pháp chiết bằng cồn 60®.
2.4.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất:
Bã dược liệu ^
Dược liệu
Xay thô
r
Dươc liêu đã đươc xử
lý
Lọc
r
1
Dịch chiết
Cồn thu hồi ^
Tạp không tan
trong nước ^
Cất thu hồi cồn
Đẽ kết tinh
Lọc
Cồn 60
lọc
Để kết tinh
Lọc
Sấy khô
H2O, 100"C
2.4.2. Cách tiến hành:
a. ỵử lí nsuyên liêu: lấy nguyên liệu, xay thô.
b. Chiết xuất. Cân lOOg nguyên liệu đã qua xử lí, cho vào bình chiết, thêm
600ml cồn 60°, đun sôi cách thuỷ có sinh hàn hồi lưu trong 2 0 phút rồi lấy

dịch chiết. Làm như thế 4 lần (lần thứ 4 lấy 50ml dịch chiết, pha loãng với
50ml nước, rồi acid hoá đến pH = 3 thấy tủa còn rất ít). Gộp dịch chiết lại,
đem cất thu hồi một phần cồn. Sau đó để nguội dịch cô, cho rutin kết tinh tự
nhiên 14 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa bằng phễu buchner. Tủa thu được
đem sấy ở 60°c cho đến khô thu được rutin thô.
c. Tinh chế: Nghiền rutin thô thành bột mịn, hoà tan trong nước sôi, lọc nóng
qua phễu buchner. DL thu được để nguội, cho rutin kết tinh tự nhiên 12 giờ ở
nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa bằng phễu buchner, loại bỏ nước lọc. Tủa thu
được đem sấy ở 60°c cho đến khô được rutin tinh khiết.
2.43. Định lượng: tiến hành như mục 2.2.3.
2.5. Phương pháp chiết rutin bằng kiềm loãng.
2.5.1. Sơ đồ quy trình chắxuất: như mục 2.2.1 nhưng thay nước ở 100°c bằng
DD Na2 CO3 1%, ở điều kiện thường.
2.5.2. Tiến hành :
a. Xử lí nsuyên liêu: thực hiện như 2.2.2 a-
b. Chiết xuất', nguyên liệu sau khi được xử lí, cho vào bình chiết nguội thêm
vào lOOOml DD Na2CƠ3 1%. Ngâm trong 8 giờ, thỉnh thoảng khuấy mạnh,
sau đó rút lấy dịch chiết. Làm như thế 4 lần (lần thứ 4 lấy khoảng lOOml dịch
chiết đem acid hóa đến pH = 2,5- 3 thì thấy tủa còn rất ít). Gộp dịch chiết lại,
đem acid hoá bằng DD acid HCl 10% đến pH = 2,5- 3. Để rutin kết tinh tự
nhiên 14 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa bằng phễu buchner. Tủa thu được
đem sấy khô ở 60°c cho đến khô được rutin thô.
c. Tinh chế: thưc hiên như muc 2.2.2.C.
2.5.3. Định lượng:
Thực hiện như mục 2.2.3
2.6. Phương pháp xử lý số liệu.
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê ứng dụng trong y dược.
Xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, khoảng tin cậy.
1 n
n i=i

S ' = (x . - x)^
n - 1 ^ ^ ‘ ^
s
= x ± t
VĨT
Trong đó:
X - giá trị trung bình
s - độ lệch chuẩn,
n - số lần thí nghiệm,
ụ - khoảng tin cậy
Hiệu suất giai đoạn chiết xuất được tính theo công thức:
,0/N_mT xioo
T1cx(%) =
ở đây: r|cx -hiệu xuất giai đoạn chiết xuất.
- khối lượng rutin thô.
m^L ■ lượng dược liệu .
Hiệu suất giai đoạn tinh chế được tính theo công thức:
ở đây:
ĩ]tc - hiệu suất giai đoạn tinh chế.
m^c - khối lượng rutin đã tinh chế
3. Kết quả thực nghiệm,và hkậtv xét.
3.1 Định lượng rutin trong hoa hoè: thực hiện như mục 2 .1, thí nghiệm được
làm 3 lần , kết quả được ghi ở bảng 1.
Bảng 1: Hàm lượng rutin trong hoa hoè.
STT
n iD L (g )
mtủa (g)
Hàm lượng rutin (%)
1 2
0,2892

29,19
2
2 0,3125
31,54
3 2 0,3086
31,15
TB 2
0,3034
30,63
Kêt quả : hàm lượng rutin trong hoa hoè khoảng 30,63%, vậy dược liệu đạt
tiêu chuẩn DĐVNI tập I (yêu cầu > 20%).
3.2. Phương pháp chiết xuất rutin bằng nước ở lOO^C.
3.2.1. Tiến hành: như mục 2.2.2
Sau khi tiến hành giai đoạn chiêt xuất và tinh chế, kết quả được ghi ở bảng 2.
Bảng 2: Hiệu suất chiết xuất rutin và hiệu suất tinh chế.
STT
mDL(g)
niT(g)
ĩlcx (%)
T|jc(%)
1 100 17,86 17,86
14,06
78,72
2 100 18,28 18,28
14,65
80,14
3
100 18,15 18,15
14,37
79,17

4 100 18,20 18,20
14,42
79,23
5 100
17,35
17,35
13,81
79,59
TB 100 17,87±0,52
17,87 + 0,52
14,26 ±0,41
79,37 ±0,66
Kết quả: hiệu suất của giai đoạn chiết xuất trung bình là 17,87, hiệu suất của
giai đoạn tinh chế trung bình là 79,37.
Nhận xét: pp chiết xuất bằng nước sôi thì đơn giản, dễ thực hiện , nhưng hiệu
suất thấp.