Khảo sát một số phương pháp điều chế l cystin từ tóc, sừng

m
BỘ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ
L-CYSTIN TỪ TÓC, SỪNG
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHOÁ 200# - 2005)
s ' ị i ^ - x
/ ') '■ - \
V u Cụ
Giáo viên hướng dẫn ': Ths. ^Nguyễn Đình Luyện
Ths. Nguyễn Thị Trinh Lan
Sình viên thực hiện : Nghiêm Thanh Hoàng
Nơi thực hiện : Bộ món Công nghiệp - Dược, phòng GMP
Trường ĐH Dược HN
Thời gianthực hiện : 3/2005 - 5/2005
■■ ■'
g '
HÀ NỔI, THÁNG 5 - 2é05 K . v ; ; -MÓ
V - ý
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp “Khảo sát một số phương
pháp điều chế L-cystin từ tóc, sừng”, được sự giúp đỡ hết sức tận tình của
thầy Nguyễn Đình Luyện và cô Nguyễn Thị Trinh Lan, tôi đã hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp với mục đích và nội dung đề ra đúng thời gian qui định.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Đình Luyện và cô
Nguyễn Thị Trinh Lan cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật
viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược, phòng thí nghiệm GMP - Trường Đại
học Dược Hà nội.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các phòng ban, bộ môn của
trường đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đc tài.
Xin kính chúc các thầy cô luôn luôn mạnh khỏe và ngày càng thu được

nhiều thành tích mới trong công tác nghiên cứu cũng như trong giảng dạy.
Hà nội, ngày 27 tháng 5 năm 2005.
Sinh viên
Nghiêm Thanh Hoàng
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VÂN ĐỂ 1
PHẨN 1 : TỔNG QUAN 2
1. ĐẠI CƯƠNG 2
1.1. Tổng quan về acid amin 2
1.1.1. Acid amin 2
1.1.2. Cấu tạo hóa học của acid amin 3
1.1.3. Phân loại acid amin 3
1.1.4. Tính chất của acid amin 4
1.2. Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin 4
1.2.1. Cấu dạng xoắn a 5
1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p 6
1.3. Lịch sư nghiên cứu, tính chất lý hóa và ứng dụng của
L-cvstin 7
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu 7
1.3.2. Cấu tạo hoá học 9
1.3.3. Tính chất lý hóa 10
1.3.3.1. Lý tính 10
1.3.3.2. Hóa tính 11
1.3.4. Cách xác định L-cystin tạo thành 13
1.3.5. Tác dụng sinh học và ứng dụng 15
2. PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ 16
2.1. Điều chế theo Vogel 16
2.2. Điều chế theo Gortner và Hoffman 17
2.3. Các phương pháp điều chẻ khác 17

PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN c ứ u 20
1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
1.1. Nguyên liệu 20
1.2. Hoá chất và thuốc thử 20
1.3. Thiết bị và máy móc 21
1.4. Phương pháp nghiên cứu và cách xác định
hàm lượng L-cystin tạo thành 21
2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 23
2.1. Khao sát sự ảnh hưởng của nồng độ acid
tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 23
2.2. Khảo sát anh hương của thời gian thủy phân
tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 26
2.3. Khảo sát và tối ưu hóa giai đoạn tách
và tinh chế L-cystin 29
2.4. Kết quả phân tích phổ và biện giải các phổ 31
2.5. Kiểm nghiệm một sỏ tiêu chuẩn của L-cystin điều chê
được theo tiêu chuẩn Dược điển Anh BP 1998 33
3. BÀN LUẬN 33
PH Ầ N 3 : K ẾT L U Ậ N V À Đ Ể X U Â T 35
TÀ I LIỆ U T H A M K H Ả O 37
PHỤ LỤC
ĐẶT VÂN ĐỂ
Cystin là một acid amin chiếm tỷ lệ đáng kể trong thành phần của tóc,
sừng, móng thuộc nhóm acid amin có chứa lưu huỳnh [8].
Về mặt hóa học, Cystin được cấu tạo từ hai phân tử Cystein liên kết với
nhau qua cầu nối disulfide. Trong tự nhiên Cystin thường tồn tại dưới dạng L-
cystin với tên khoa học là : L(-)-3,3'-Dithiobis(2-aminopropanoic acid).
Trong y học, người ta đã sử dụng L-cystin để điều trị một số bệnh da
liễu như: rụng tóc, trứng cá, bệnh vảy nến Gần đây L-cystin còn được dùng
trong các trường hợp tổn thương giác mạc, do tác dụng ức chế colagenaza làm

biểu mô giác mạc nhanh thành sẹo.
Ngoài ra, L-cystin còn được dùng để tổng hợp nhiều dẫn xuất có ứng
dụng trong lâm sàng như : N-acetylcystcin, L-cystein, S-carboxy-Metylcystein
Đc điều chế L-cystin người ta có thể đi từ con đường tổng hợp hóa học
hoặc chiết từ dịch thủy phân protein [8J.
Trcn thế giới cũng như ở Việt nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu
điều chế L-cystin từ tóc, sừng, lông gà, lông cừu [11][15][19] Nhằm hoàn
thiện quy trinh điều chế L-cystin, chúng tôi tiến hành đc tài nghicn cứu
“ Khảo sát inột sô phương pháp điều chê L-cystin từ tóc, sừng “ với những
inục tiêu sau :
1. Khảo sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu
suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là tóc.
2. Khao sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu
suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là sừng.
3. Nghiên cứu cải tiến các phương pháp tách và tinh chế L-cystin nhằm
tiết kiệm năng lượng và phụ liệu.
4. Điều chế một lượng L-cystin đạt tiêu chuẩn cho quá trình tổng hợp
Acetylcystein tiếp theo.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Tổng quan về acid amin
1.1.1. Acid amin
Acid amin là sản phẩm thủy phân cuối cùng của pcptid và protein, là
đơn vị cấu tạo xây dựng nên các phân tử peptid và protein. Một số acid amin
có chức năng quan trọng như dẫn truyền thần kinh (glycin và acid glutamic)
hay đóng vai trò trung gian trong sinh tổng hợp urê (acid argininosuccinic,
citrulin). Người ta đã phân lập được trên 20 acid amin từ các dịch thủy phân
protein thiên nhiên, các chất này đều thuộc loại a-aminoacid. [4]
Thông thường người ta thu được các acid amin từ quá trình thủy phân
protein với các tác nhân khác nhau như: acid, kiềm, enzym Để đánh giá chất

lượng các chế phẩm acid amin, người ta tiến hành kiểm nghiệm bằng nhiều
phương pháp khác nhau: phương pháp Kendan, phương pháp Ninhydrin,
phương pháp sắc ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion
Ớ nước ta hiện nay, đa số các chế phẩm acid amin phải nhập từ nước
ngoài trong khi nhu cầu sử dụng các chế phẩm này làm thuốc lại rất lớn. Do
vậy việc nghiên cứu về acid amin đóng một vai trò quan trọng và có nhiều ý
nghĩa trong thực tế.
1.1.2. Cấu tạo hoá học của acid atnin
Acid amin là những hợp chất acid hữu cơ mạch thẳng trong đó một hay
hai nguyên tử hydro trên carbon a được thay thế bằng nhóm amin. Các acid
amin trong tự nhiên đều là acid L- a amin.
H
lĩ
0
Acid a -amin
2
Tất cả các acid amin trừ glycin (R-H) đều có carbon a bất đối mang
hoạt tính quang học làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực.
Mặc dù trong tự nhiên có khoảng 300 acid amin nhưng cũng chỉ có 20
acid amin được tìm thấy trong protein. Người ta gọi đó là những acid amin
chuẩn. [4]
1.1.3. Phân loại acid amỉn [4]
• Theo mức độ phụ thuộc vào gốc R có trong phân tử acid amìn có thể
chia các acid L- a amin thành 2 nhóm lớn: acid amin phân cực và acid amin
không phân cực.
Không phân cực
Alanin, Isolcucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin,
Tryptophan, Valin.
Phân cực
Acid aspartic, Acid glutamic, Arginin, Asparagin,

Cystein, Glutamin, Glycin, Histidin, Lysin, Serin,
Threonin, Tyrosin.
• Mặt khác, theo cấu tạo hóa học của nhóm R: Các acid L- a amin
được phân thành 7 nhóm :
o Nhóm acid amin mạch thẳng: Glycin, Alanin, Valin, Leucin,
Isoleucin.
o Nhóm acid amin chứa hydroxyl (OH): Serin, Threonin,
Tyrosin.
o Nhóm acid amin chứa lưu huỳnh: Cystein, Methionin.
o Nhóm acid amin acid (chứa carboxyl hay amid): Acid
aspartic, Asparagin, Acide Glutamic, Glutamin.
o Nhóm acid amin kiềm (chứa nhóm basic): Arginin, Lysin,
Histidin.
3
o Nhóm acid amin chứa nhân thơm: Histidin, Phenylalanin,
Tyrosin, Trytophan.
o Nhóm imin: Prolin.
1.1.4. Tính chất của acid amin
• Tính tan và điểm chảy của acid amiti [4]
Sự có mặt của nhiều nhóm ion hoá trên acid amin làm cho chúng dễ tan
hơn trong dung môi phân cực như: nước, ethanol, không tan trong các dung
môi không phân cực như: benzen, hexan hay ete.
Điểm chảy của chúng thường cao (trên 200°C) do lực ion của mạng kết
tinh.
• Các phản ứng hoá học đặc trưng của acid amin
Đó là các phán ứng đặc trưng cho các nhóm amin và carboxyl như phản
ứng acetyl hoá, phản ứng formyl hóa hay este hóa:
1.2. Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin [2][4]
Keratin là protein rắn chắc, không tan trong nước, chiếm tỷ lệ cao trong
tóc, sừng, móng và lông của hầu hốt các loài động vật kể cả con người.

o Phản ứng với Ninhydrin.
o Phản ứng với Fluorescamin.
o Phản ứng Biurê.
o Phản ứng Foln xác định acid amin chứa lưu huỳnh
(a)
Ị ht
\Ị tt*
tutr \'1 //»< ỉutit 1'tilb
(b)
Hình l: ịa): cấu trúc tóc; (h): cấu tạo sợi tóc;(c): Keratin
Thông thường Keratin có 2 cấu dạng chính đó là a-keratin và p-keratin,
a-keratin thường được tìm thấy ở người và động vật có vú còn p-keratin
thường có trong các loài chim và bò sát. Cấu trúc của ị3-keratin cứng rắn hơn
so với a-keratin.
Ngoài vai trò giúp ổn định cấu trúc tế bào Keratin còn có tác dụng bảo
vệ cơ thể tránh được các tác nhân có hại từ môi trường bên ngoài.
1.2.1. Cấu dạng xoắn a
Là cấu dạng điển hình cho cấu trúc của a-keratin. Khoảng cách một
chu kỳ xoắn là 0,54 nm (gồm 3,5 gốc acid amin). Các nhóm R của nguyên tử
carbon a đều chĩa ra ngoài trung tâm xoắn. Cấu dạng xoắn a (hình 2) có
những đặc điểm quan trọng sau đây :
• Cấu trúc bền vững nhờ có các liên kết Hydro tạo ra giữa H (thuộc nhóm
NH của mỗi liên kết peptid) với o (của nhóm c o thuộc gốc acid amin thứ
4 trong chuỗi). Như vậy mỗi liên kết peptid đều góp phần tạo sự bền vững
tối đa cho phân tử Keratin.
• Liên kết Hydro nói trên làm giảm tính chất ưa nước của vùng xoắn a.
• Là cấu dạng bền vững nhất của chuỗi polypeptid do có thể tạo xoắn a một
cách tự nhicn mà không cần nhiều năng lượng.
Hình 2: Cảu dạng xoắn a-keratin
1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p

Là điển hình cho cấu trúc của P-keratin. Nó có hình dáng giống như
một tờ giấy gấp nếp và hầu như hoàn toàn duỗi thẳng hình zigzag (không bị
cuộn lại như cấu dạng xoắn a).
Trong cấu dạng p :
6
• Các chuỗi polypeptid cạnh nhau có thể song song (có cùng hướng từ N-
tận đến C-tận) hay đối song (hướng ngược nhau). Hai cấu trúc này giống nhau
mặc dù độ dài lặp lại trong cấu trúc song song ngắn hơn (0,65 nm so với 0,70
nm trong cấu trúc đối song).
• Khoảng cách giữa các acid amin cạnh nhau theo đường trục là 0,35 nm
(trong cấu dạng xoắn a là 0,15 nm).
• Các liên kết Hydro tạo bởi các nhóm -NH- và - CO- có thể nằm trong
cùng một chuỗi nhưng cách xa nhau hay giữa các chuỗi polypeptid khác nhau.
• Các gốc R của acid amin cạnh nhau nằm ở những vị trí gấp khúc
1.3. Lịch sử nghiên cứu, tính chất lý hoá và ứng dụng của L-cystin
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu
Do L-cystin thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong
lĩnh vực dược lý học, tế bào học, sinh hóa học, phóng xạ học nên từ lâu nó đã
được tổng hợp và lưu hành trên thị trường. L-cystin có thể được điều chế bằng
nhiều phương pháp khác nhau. Người ta đã tổng hợp được L-cystin từ Serin
hay Acid acrylic, hoặc có thể sinh tổng hợp từ các enzym, Tuy nhiên
phương pháp thủy phân L-cystin từ protein vẫn đơn giản và có ý nghĩa thực tế
hơn cả.
Qua điều tra nghiên cứu người ta thấy L-cystin có tỷ lệ cao trong
Keratin của lông, tóc, sừng, móng: [9]
zigzag.
Tóc
Lông lợn
14%
14,4%

Sừng
Len
12,1%
10,3%
7
<J b e
Hình 4: Nguồn nguyên liệu L-cystin
a: Tóc; b: Sừng; c: Lông
Do đó nguyên liệu chủ yếu để chiết tách L-cystin là các Keratin.
Quá trình chiết L-cystin từ protein nhìn chung đều dựa trên sơ đồ
nguyên lý sau:
Thủy phân
|/ (H®, OH ®enzym) . pH=5
Keratin

-
► Acidamin

► L-cystinị
t° v
Để thủy phân Keratin người ta có thể dùng các tác nhân acid hoặc kiềm.
Nhưng thực tế tác nhân acid phù hợp hơn vì kiềm phá hủy L-cystin và nhiều
acid amin khác. Trong các acid, acid clohydric được dùng phổ biến hơn cả.
Vấn đề cần nghiên cứu trong quá trình thủy phân là các yếu tố ảnh
hướng đến hiệu suất L-cystin như: nồng độ acid, lượng acid sử dụng, thời gian
thủy phân và nhiệt độ thủy phân. Theo một số tài liệu, nhiều tác giả sử dụng
acid clohydric 37% với thể tích gấp 2 lần khối lượng tóc [7][ 11], một số lại sử
dụng acid ở nồng độ loãng hơn (20-30%) để thủy phân với lượng acid gấp từ
2- 4 lần tóc [15][16]. Theo Gortner và Hoffman [15] thì nên thủy phân tóc
trong acid clohydric 20% vì dung dịch này tương đối ổn định và ít nguy hiểm

hơn dung dịch acid đậm đặc.
Ngoài ra, các tài liệu còn cho rằng thời gian thủy phân không nên kéo
dài quá 8-10h [15] vì L-cystin dễ bị racemic hóa khi đun lâu trong acid. Tuy
8
nhiên thời gian thủy phân còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện nhiệt độ , nếu
đun trực tiếp trên bếp điện, bếp dầu hoặc cách cát thì chỉ cẩn 6-8h, trong khi
nếu đun cách thủy thì phải cần tới 120-144h để thủy phân hoàn toàn protein.
Sau khi thủy phân được một hỗn hợp các acid amin người ta kết tủa L-
cystin bằng cách đưa về điểm đẳng điện ở pH=5. Tác nhân trung hòa thường
dùng là: NaOH, KOH, Amoniac, Amoni acetat, Natri acetat. Ở đây những
nghiên cứu trước cho thấy nếu chỉ dùng NaOH đặc dễ gây môi trường quá
kiềm làm L-cystin bị phá hủy.
Hiệu suất chiết tách L-cystin thường đạt cao nhất (5%) khi sử dụng
nguyên liệu là tóc, tác nhân thủy phân là acid clohydric 37% với tỷ lệ acid :
tóc bằng 2:1 và thời gian thủy phân là 6h nếu đun sôi trực tiếp hoặc 12h nếu
đun sôi cách thủy.
Tuy nhiên một số hạn chế của các phương pháp này còn chưa được giải
* quyết như: sử dụng acid clohỵdric đặc làm dung môi thủy phân dễ gây độc,
khả năng ăn mòn thiết bị cao, ô nhiễm môi trường
Sau khi thủy phân, sản phẩm thu được là L-cystin thô chứa cả Humin
(chất mầu), Tyrosin và các tạp chất khác. Humin là những acid hydro và
polycarboxylic với 2-4 nhóm -COOH. Chúng có trọng lượng phân tử cao, hấp
Ihu ánh sáng, ở dạng vô định hình, có mầu và cấu trúc chưa chứng minh được.
Tạp chất Tyrosin có thể được loại bằng cách rửa nước nóng nhiều lần và tránh
để kết tủa L-cystin quá lâu [15].
Để tẩy mầu và loại bỏ tạp chất người ta thường sử dụng các chất hấp
phụ bề mặt kết hợp với nhiều lần hòa tan kết tủa. Đối với L-cystin thô người ta
hay dùng than hoạt, có the sử dụng than hoạt ở tỷ lệ 2-5% so với dung dịch và
xử lý như vậy từ 2-5 lần.
1.3.2. Câu tạo hoá học

9
L-cystin có cấu trúc ổn định, là sản phẩm oxy hóa của L-cystein. L-
cystin được biết đến như một disulfide amino acid bởi nó được cấu thành từ 2
phân tử Cystcin nối với nhau bằng cầu nối disulfide. L-cystin có thể tạo thành
L-cystein nhờ sự khử hóa. Nó được phát hiện vào nãm 1810 và được chấp
nhận là một thành phần của protein vào năm 1899.
c o o c o o
su — CH
H -C -H 3N
Cystein
Cystein
2h ^ 1 ^ 2h
c o o -
+ I
H3N— C -H
c h 2- s
s — c h 2
Cystin
1.3.3. Tính chất lý hoá
l .3.3.1. Lý tính [ 18]
■0 0 C-CH-CH2-S-S-CH2-CH-C00
n h 3+
c6h12o4n2s2
M=240,30
N= 11,66% s=
s=26,69%
1 +
NÌỈ3+
Hình 5: Tinh thê L-cystin
10

L-cystin có dạng bột kết tinh màu trắng, thực tế không tan trong nước
và alcol. Có thể hoà tan được trong dung dịch kiềm loãng, khả năng tan trong
nước (g/1) ở nhiệt độ 25°c là 0,112, ở 50°c là 0,239, ở 75°c là 0,523, ở 100°c
là 1,142. L-cystin có góc quay cực từ -215° đến -225° (5%, HC1 IM), nhiệt độ
nóng cháy khoảng 260-26l°c.
1.3.3.2. Hoútính [3]
L-cystin có cấu trúc của một a-amino acid do vậy nó có thể tham gia
các phán ứng tương tự như các a-amino acid khác.
o Phản ứng Biurê:
Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, các liên kết peptid trong protein
kết hợp với ion Cu tạo phức hợp màu tím ở dưới dạng anion. Phản ứng này tạo
phức có màu bền vững và ổn định được dùng để định lượng protein.
R' Ọ
— C H c — N H — C H — c — N H — C H

o
o
R"
R"
— C H c — N H — C H — c — N i l — C H

R' o
CuS04
■

»
Kiềm
R' Ọ
— Cll C = N — CH— c — N — C H

0‘
o
,Cu
— CH c — N — CH— C — N = C H

R' o
2 Na
o Phản ứng với Ninhydrin
Nguyên tắc: Ninhydrin là chất oxy hoá mạnh, khi đun nóng có khả
năng khử nhóm amin và nhóm carboxyl của a-amino acid tạo Ninhydrin khử,
C 02, NH3 và aldehyd. Sau đó Ninhydrin và Ninhydrin khử lại phản ứng tiếp
11
với NH3 tự do tạo thành phức hợp màu tím có độ hấp thu cực đại ở Ằ, = 570
nm. Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin.
r- ~ COO H
/ )H Ị
+ Hị N
C

0,1
II R
1 ^ Ỵ \ / 0H
/ \ + nh3 + c = 0 + co2
v ^ c H
\
c
/
/
c —N = c
\

Ọ — n h 4
/
/
c —N = c
\
o Phản ứng với Fluorescamin:
Nguyên tắc: Tạo sản phẩm huỳnh quang với a-amin của acid amin, đây
là phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng ngàn nano gram.
H R
+ H

N

c

coo'
H H
Fluoresca m in
Acid am in
o Phản ứng Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh
Nguyên tắc: L-cystein và L-cystin khi đun nóng trong môi trường kiềm
sẽ phản ứng với muối chì tạo sulfur chì PbS màu đen xám. Cơ chế phản ứng
như sau:
12
CH2

SH r
I CH2

OH

C H -N H 2 + 2NaOH

► L - N H 2 + NajS + H20
“ OH COOH
Pb(CH3COO)2 + 2NaOH

* pb(OH)2 + 2CH3COONa
Pb(OH)2 + 2NaOH

► Pb(ONa)2 + 2 H20
Na2S + Pb(ONa)2 + H20 —— —► Pbs I + 4 NaOH
1.3.4. Cách xác định L-cystin tạo thành: [6]
Sau khi thủy phân Keratin hoàn toàn thành L-cystin người ta có thể sử
dụng các phương pháp phân tích khác nhau để xác định L-cystin có trong dịch
thủy phân như: phương pháp Kendan, phương pháp Se ren sen, phương pháp sắc
ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion,
Phương pháp Kendan :
Phương pháp Kendan dựa trên cơ sở dùng acid sulfuric đậm đặc để vô
cơ hóa nguyên liệu, các chất hữu cơ bị đốt cháy thành C 0 2 và H20 còn Nitơ
được chuyển thành (NH4)2S04.
Khi cho dung dịch NaOH tác dụng với (NH4)2S04 thì NH3 sẽ giải
phóng ra, cất kéo NH3 theo hơi nước và chuyển tới bình đựng dung dịch
H2S 04 N/50 chuẩn độ. Chuẩn độ H2S04 dư bằng dung dịch NaOH N/50, từ đó
tính ra hàm lượng Nitơ toàn phần có trong dịch thủy phán.
Phương pháp này đánh giá được hàm lượng Nitơ toàn phần có trong chế
phẩm. Tuy nhiên phương pháp này khó phân biệt được lượng Nitơ trong L-
cystin và lượng Nitơ có nguồn gốc khác.
❖ Phương pháp Nỉtơformon (phương pháp Serensen)
Serensen đã dựa vào tính chất hóa học của các acid amin để định lượng
Nitơ của acid amin có trong dịch thủy phân, các acid amin đều có nhóm -

COOH và -NH2, cả 2 nhóm này đều yếu, quá trinh điện ly kém, khi gặp dung
dịch formon thì nhóm -NH2 chuyển thành nhóm metylenic -N=CH2, làm mất
tính kiềm của các acid amin, do vậy mà tính acid của nhóm -COOH mạnh hơn
và có thể định lượng được bằng một chất kiềm mạnh với chỉ thị màu là
phenolphtalein.
Phương trình phản ứng:
D pu — COOH ^ — CH COOH
— CH COOH + HC ^

* I + h 20
N il, H N = c , l ;
R — CH — COOH R — CH — COONa
+ NaOH

► I + H2O
N = C H 2 N = C H 2
Phương pháp Serensen đã xác định hàm lượng Nitơ amin có trong dịch
thủy phân, nhưng có thể gây sai số vì điểm tương đương khó nhận thấy, mặt
khác nếu không dùng đủ lượng formon để khóa nhóm NH2 thì sẽ gây sai số
thiếu.
❖ Phương pháp Pepe-Steven
Pcpe-Steven đã dựa vào khả năng tạo phức của acid amin với đồng bền
vững trong môi trường kiềm có dung dịch đệm photphat. Hai tác giả đã đề
nghị xác định hàm lượng Nitơ amin theo phương pháp định lượng ion gián tiếp
(phương pháp thừa trừ) theo phương trình phản ứng :
^ y ° ^ c^ °
R— C —COOH + Cu++ + H2N - C — R

► I I
N H 2 CO OH r ^H C ' N H 2 H 2 ls rH C ^ R

14
*
Cu++ + KI

► Cui + h
I2 + Na2s20 3

► Na2s 40 6 + Nal
Như vậy việc xác định hàm lượng Nitơ amin được chuyển sang xác định
hàm lượng I2 từ đó để tính ra hàm lượng Cu++ liên kết trong phức chất và suy
ra hàm lượng acid amin Irong dịch thủy phân.
♦> Phương pháp sắc ký giấy:
So sánh Rị của mẫu ihử với R, của mẫu chuẩn trong cùng một điều kiện,
từ đó suy ra acid amin có trong mẫu thử. Hệ dung môi sử dụng là n- butanol :
acid acetic : nước = 4:1:5. Hiện màu bằng thuốc thử Ninhydrin.
❖ Phương pháp tách các acid amin bằng sắc ký trao đổi ion
Dùng nhựa trao đổi ion để tách riêng các acid amin có trong dịch thủy
phân. Các nhựa thường được sử dụng trong sắc ký tách acid amin là: Dowex-
50, Dowex 2x8, Amberlite-IR-4B, Amberlite IRC-120, Amberlite IRC-50,
Wofatit Kps-200,
Các acid amin thường được tách ricng biệt nhờ cột chứa cationit gắn
Na+, H+ và anionit gắn O H . ở môi trường có pH khác nhau, các acid amin
tách ra và hòa tan vào dung dịch rồi dịch chuyển theo dung dịch với tốc độ
dịch chuyển khác nhau. Người ta hứng dung dịch theo từng phần nhỏ, mỗi loại
acid amin được phân bố theo những phần nhất định. Kỹ thuật sắc ký trao đổi
ion có ý nghĩa rất lớn trong việc định tính, định lượng và tách từng acid amin
riêng biệt ra khỏi dung dịch thủy phân.
1.3.5. Tác dụng sinh học và ứng dụng
L-cystin chiếm một tỷ lệ lớn trong tóc khoảng 14% và 12,1% trong
sừng, ngoài ra nó còn chiếm một tỷ lệ ít hơn trong da (2 đến 4%). L-cystin

tham gia vào quá trình tổng hợp Keratin (chất sừng) của tóc và móng. Nó thúc
15
đẩy sự tăng sinh của tế bào mầm ở các vùng tạo chất sừng và có ảnh hưởng
đến sự tăng trưởng của chúng. Tác dụng này đã được chứng minh qua các thử
nghiệm có đánh dấu bằng phóng xạ ở các nhân của tế bào mầm.
L-cystin được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về lông, tóc, móng
như : tóc móng dễ gẫy, chẻ; chống rụng tóc; hoạt hóa sự mọc tóc, chăm sóc và
giúp cho tóc móng tăng trưởng. Ngoài ra nó còn được sử dụng để điều trị các
chứng ngứa và các bệnh lý biểu bì da, tóc, móng; sạm da, chàm, ban da, nổi
mề đay; viêm nhiễm mụn nhọt, trứng cá trên da
L-cystin thường xuất hiện dưới dạng các chế phẩm như: viên nang mềm
500m g X 12 vỉ X 5 viên, viên nén bao film hộp 20 viên,
Một số chế phẩm có trên thị trường hiện nay như : Blooming, L-cystin
500, có công dụng điều trị các bệnh về suy nhược cơ thể, các chứng liên
quan đến da, tóc, biểu bì. Liều lượng trung bình dành cho người lớn và trẻ em
trên 8 tuổi là 1 viên nang 500mg X 2 lần mỗi ngày, nên dùng liên tục 2-3
Iháng hoặc 10-20 ngày mỗi tháng.
2. PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ :
2.1. Phương pháp điều chê theo V ogel:
• Nội dung phương pháp [19]
Thuỷ phân
Keratin

—

► HOOC-CH-CH2-S—S-CH2-CH-COOH
(Tóc, sừng) 0 N H 2 N H 2
L-cystin
Cân 500g tóc cho vào bình cầu ba cổ, thêm vào 1000 ml hỗn hợp acid
hydrochloric đặc và acid formic theo tỷ lệ 1:1. Đun cách dầu hồi lưu ở nhiệt

độ 120 C cho đến khi phản ứng Biurê trở nên âm tính (khoảng 20h). Tẩy màu
bằng khoảng 12g than hoạt, lọc nóng và cô đặc dịch lọc đến khi tạo thành sirô
có khối lượng không đổi. Hòa tan phần sirô trong 250ml nước cất, thêm từ từ
16
dung dịch Na acetat 50% cho đến khi dung dịch có pH khoảng từ 4-5. Để yên
hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa tủa
nhiều lần bằng 50ml nước cất 60°c. Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan
trong 750ml acid hydrochloric IM và tẩy màu bằng 5g than hoạt. Nếu dịch
lọc vẫn có màu vàng nhạt, tiếp tục tẩy màu bằng 5g than hoạt. Điều chỉnh dịch
lọc đến pH-4-5 bằng Na acetat 50%. Để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng
khoảng 5-6h. Tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng 50ml nước cất 60°c.
Khối lượng L-cystin thu được: 25g. Hiệu suất phản ứng: 5%.
Chú ỷ: Sản phẩm thô có thể chứa Tyrosin. Một phần của nó được loại bởi than
hoạt và rửa bằng nước nóng. Nhưng khi kết tinh lại có thể sản phẩm vẫn chứa
Tyrosin nếu thời gian kết tinh để quá 5-6h.
2.2.Phưưng pháp điều chế theo Gortner và Hoffman :
• Nội dung phương pháp [15]
Gortner và Hoffman tiến hành thí nghiệm với dung dịch acid HC1 20%,
lượng acid sử dụng gấp 2-4 lẩn khối lượng tóc. Sau khi tiến hành thủy phân
được hỗn hợp các acid amin, tiến hành kết tinh L-cystin bằng cách đưa về
điểm đẳng điện ở pH=5. Để trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, tiến hành
tinh chế bàng dung dịch HC1 IM và chất hấp phụ bề mặt. Kết quả thu được
sản phẩm L-cystin thô. Ở đây 2 tác giả không sử dụng acid HC1 đặc vì theo
các ông dung dịch acid 20% là tương đối ổn định và ít gây nguy hiểm hơn so
với acid đậm đặc. Hiệu suất L-cystin thu được từ 4-5%.
2.3. Các phương pháp điều chê khác :
Các tác giả này đã khảo sát phản ứng thủy phân tóc bằng acid HC1 đặc
theo những cách khác nhau cụ thể như sau:
Trong bình cầu dung tích 1 lít cho 200g tóc khô sạch và một thể tích
acid clohydric nồng độ 30% hoặc 37% theo tỷ lệ acid/tóc bằng 2:1. Hỗn hợp

đun sôi với sinh hàn hổi lưu trực tiếp trên bếp điện trong thời gian 10 giờ. Sau
khi để nguội đến nhiệt độ phòng, dung dịch thủy phân được trung hòa từ từ
với dung dịch NaOH 30% đến pH = 5, thử phản ứng Biurê để xác định mức độ
thủy phân. Tủa đcn xuất hiện, để qua đêm, lọc và hòa tan trở lại trong acid
clohydric 5%. Lọc để loại hợp chất không tan, rửa tủa bằng 50ml HC1 5%
(chia 3 lẩn). Khử màu toàn bộ dung dịch lọc bằng cách đun nóng với 20g than
hoạt và lắc trong 1 giờ. Lọc và rửa than bằng một ít HC1 5%. Trung hòa dịch
lọc màu vàng nhạt bằng dung dịch NaOH 30% đến pH=5. Để kết tủa trong 3-
4h, lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước nóng để loại Tyrosin. Sản phẩm thu được là
L-cystin, có thể tinh chế bằng một lần hòa tan và kết tủa nữa. Tủa được thử
phản ứng Millon để xác định tạp chất Tyrosin. Hiệu suất phản ứng là : 5%.
2.3.2. Theo tác giả Bành Đức Lâm:
• Nội dung phương pháp [8]
Cho 1 kg tóc vào bình thủy phân 4 lít (có thể chia vào 5 bình nhỏ 1 lít).
Thêm 2 lít HC1 37%. Đậy kín. Ngâm trong thời gian 1 tuần. Tóc mòn ra thành
dịch. Tiến hành thủy phân cách thủy dưới sinh hàn hồi lưu. Sau từng thời gian
2h, 4h, 14h, 16h lấy một lượng nhỏ dịch đang thủy phân, để nguội. Thử
phản ứng Biurc đến khi âm tính thì ngừng thủy phân, để nguội dịch thủy phân.
Trung hòa bằng dung dịch Na acctat 50% đến pH=5. Để kết tủa trong 4h. Lọc
lấy tủa bằng phễu hút chân không. Hòa tan tủa trong 200ml HC1 5%. Khử
màu dung dịch bằng than hoạt (tỷ lệ than hoạt bằng 2% thể tích dịch lọc) :
đun nóng dịch lọc đến 60°c cho than hoạt vào khuấy đều trong 30’. Để yên
3h. Lọc loại than hoạt và rửa than bàng 50ml HC1 5%. Trung hòa dịch lọc
bằng dung dịch Na acetat 50% đến pH=5. Để kết tủa 4h. Lọc lấy tủa. Rửa tủa
18
nhiều lần bằng nước nóng, sản phẩm thu được là L-Cystin thô. Có thể tinh chế
bằng cách hòa tan và kết tủa lần nữa. Sấy ở nhiệt độ 60-70°C đến khô.
Hiệu suất sản phẩm thu được là: 5%
19
PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u :
1.1.Nguyên liệu:
Nguyên liệu chính được sử dụng để chiết xuất L-cystin là tóc. Tóc được
thu mua tại các hiệu cắt tóc. Trước khi sử dụng nguyên liệu cần phải loại bỏ
các tạp chất cơ học. Đặc biệt khi rửa nguyên liệu cần chú ý loại bỏ các chất
dầu mỡ và dầu tự nhiên. Nên rửa sạch nguyên liệu bằng nước nhiều lần sau đó
ngâm nguyên liệu trong nước xà phòng, vò kỹ. Rửa lại cho hết xà phòng. Đổ
khô.
Ngoài ra một nguyên liệu khác chứa hàm lượng L-cystin tương đối cao
cũng được sử dụng là sừng trâu, bò. Nguyên liệu này được thu mua từ các lò
mổ và những nơi chế biến đồ thủ công mỹ nghệ. Dạng nguyên liệu là những
phế phám không còn được sử dụng để gia công chế biến. Trước khi sử dụng
tiến hành loại bỏ phần tủy, rửa sạch, để khô.
1.2.Hóa chất và thuốc thử :
Bảng 1: Bảng hóa chất và thuốc thử được sử dụng trong klióa luận
Tên hoá chất và thuốc thử
Nguồn gốc
Acid clohydric đậm đặc Trung Quốc
Acid Formic
Trung Quốc
Natri acetat
Trung Quốc
NaOH
Trung Quốc
Nước cất
Xí nghiệp Dược phẩm TW II
Than hoạt
Việt nam
Chí thị mầu vạn năng
Merck (Đức)

20
1.3.Thiết bị và máy móc:
• Bình cầu 3 cổ 1 lít
• Sinh hàn hồi lun
• Nhiệt kế thủy ngân-Trung Quốc
• Máy khuấy từ IKA-Đức
• Tủ hốt Labconco-Mỹ
• Máy cất quay Buchi B-480-Thụy Sỹ
• Dụng cụ thủy tinh sạch, sấy khô
• Cân phân tích METTLER TOLEDO AB204S-Thụy Sỹ
• Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S-ĐỨC
• Phân cực kế A-KRUSS PlOOO-Đức
• Máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp
• Tủ sấy Memmert-Đức
1.4.Phương pháp nghiên cứu và cách xác định hàm lượng L-cystin tạo
thành.
1.4.1. Phương pháp nghiên cứu:
Như đã trình bày ở phần tổng quan, phương pháp nghiên cứu mà chúng
tồi lựa chọn để điều chế L-cystin là thủy phân tóc, sừng trong môi trường acid.
Phương pháp này được khái quát hóa dưới dạng sơ đồ như sau:
*
21