Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất 5 nitrofurfural

BỘ Y TÊ'
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM THỊ THANH HUYỂN
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN ,
KHÁNG NẤM CỦA MỘT s ố DẪN c h ấ t
5 - NITROFURFURAL
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC s ĩ KHOÁ 1997 - 2002)
NGUỜI HUỒNG DẪN : T.s CHU THỊ LỘC
TH.S ĐINH THỊ THANH HÁI
NƠI THỤC HIỆN ; BỘ MÔN VI SINH HỌC'
THỜI g Ìa N thục hiện : 01/3/2002 - 28/5/2002
HÀ NỘI THÁN(Ỉ 5 - 2002
£ ề í e ả ề ề L Ờ9L
^ ) ố i n iề m líú ih . tr/mxỊ. ữ à Lồ ng , ỉĩiỀ t đ tt iA u . ỉẤ e , e m æ ù i e h ú t t t íù u ih . eAtn.
Ố*L ^ĩỉỈMÍt th ị 'JCài^ ^.S- &tML t ít ị <£ệ^ đ ă tậ n tìn h ehí tmtì- OÁ
hưâng. dẫti em hiMUL thành, tếí kítơú ItJián. nàụ,.
ốm. củng, æùt bùụ. tở- Lờttq. b iâ ơn. tổ i OliỊunỉ n. QfMÂunjq, ^ ạ t,
3 C ^ Qlạâtụễn. (Ị)ăn. s^ỉn. eùnjQ, íóỉư i thè. cáe ihầy, eê- ạióbO- tễ(ô*ig. (Bộ- mởn 'Tũúú.
lútu. CỂỈ- OỈL (Bỗ- mòn. iln íi hjờc. đã. ehtì- ent nhữitg, Lài ehi d ẫ tt (ịu í (%áu úà. tọiO-
¿DỀu kiện ttuiẠn Lời đẽ. em ÚuỊe. hiỀtt tố t liíậ ti ũăn. lố t ttạhiÂ^L eỉUL m ình.
(X>in. edm Ơ*L q la đ in h OÁ bẹưt Ixè đ ã ctậnụ. lùêtt aà qiújfL đẵ lờ i tmng.
iỉLốl títằ i gẦxurt lồ i th ite fùjên. kPtoú. luân.,
'TCà, QĨẠi njgÁụ. 2 7 tháng. 5 nAitt 2002
Sinh. aìẦn
^ tiạ m íh i Çiftxjuth. 'ĨCuựỈM.
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn để Ị
Phần 1 - Tổng quan 2
1.1. Tổng hợp và tác dụng sinh học của dẫn chất 5- nitrofurfural. 9
1.1.1. Cấu trúc hoá học & tác dụng kháng khuẩn của các thuốc

nhóm nitroíuran. 2
1.1.2. Tình hình nghiên cứu về lổng hợp & tác dụng sinh học của
các dẫn chất 5 - nitrofurfural trong những năm gần đây. ^
1.2. Khái quát chung về vi sinh vật. 9
1.2.1. Một số đặc điểm chung về vi sinh vật. 9
1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, khả năng gây bệnh của các
chủng vi sinh vật kiểm định.
1.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp vi sinh
vật.
11
14
1.3.1. Phương pháp định tính. ị 4
1.3.2. Phương pháp xác định nồnơ độ ức chế tối thiểu (MIC).
1.3.3. Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC). 19
Phần 2 - Thực nghiệm và kết quả OQ
2.1. Nguyên liệu và phương pháp 20
2.1.1. Nguyên liệu 20
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm 92
2.2. Thực nghiệm và kết quả 23
2.2.1. Thử định tính tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 23
2.2.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 27
2.2.3. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 33
Phần 3 - Kết luận chung
Tài liệu tham khảo
ĐẶT VẤN ĐỂ
Kháng sinh hay nhóm thuốc kháng khuẩn, kháng nấin có vai trò quan
trọng trong việc phòng chữa bệnh cũng như chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cho
cộng đồng. Nhóm thuốc này có thể có nguồn gốc từ thiên nhiên, tổng hợp hay
bán tổng hợp.
Hiện nay, khi mà mức độ kháng thuốc của vi sinh vật (VSV) ngày càng

tăng thì việc tìm ra những kháng sinh mới, những thuốc kháng khuẩn, kháng
nấm mới có hoạt lực mạnh hơn, phổ tác dụng rộng hơn là một yêu cầu cấp
thiết.
Từ lâu, nhiều dẫn chất nitrofuran đã được dùng làm thuốc kháng khuẩn
như Nitrofurantoin, Nifuratel, Furazolidon [14]. Ngoài ra, còn được sử dụng
trong điều trị một số bệnh do kí sinh trùng gây ra như Nifuroxim (điều trị
bệnh do Trichomonas), Nifurtimox (điều tri bệnh Chagas do Trypanosoma
cruzi) [14,20,29].
Vái đề tổng hợp và nghiên cứu tác dụng sinh học của các dẫn chất 5 -
nitrofurfural vẫn đang được quan tâm ở cả trong và ngoài nước [4,8,15,22,24].
Trong hai năm gần đây, Nguyễn Quang Đạt, Đinh thị Thanh Hải và
cộng sự [4,5,13] đã công bố kết quả tổng hợp và sơ bộ thăm dò tác dụng
kháng khuẩn, kháng nấm của hai dãy chất gổm 24 dẫn chất được tạo ra bằng
phản ứng ngưng tụ 5 - nitrofurfural với các hợp chất có nhóm methylen hoạt
động là: thiazolidin —2,4 -dion, 2 -thioxo 4 -thiazolidinon (rhodanin) và các
dẫn chất base Mannich của chúng. Các kết quả thăm dò sơ bộ cho thấy các
dẫn chất này có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Candida albicans khá
mạnh.
Hấp dẫn hởi kết quả công bố trên, trong khoá luận này, chúng tôi đã
tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 24 dẫn chất 5-
nitrofurfural với các mục tiêu như sau:
1. Thử định tính tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 24 dẫn chất.
2. Xác .định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 4 dẫn chất.
3. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của 4 dẫn chất.
Từ kết quả nghiên cứu có thể sơ bộ kết luận về mối liên quan giữa cấu
trúc hoá học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nán của một số dẫn chất 5 -
nitrofurfural. Với các mục tiêu ttên, chúng tôi hy vọng sẽ đóng góp một phần
nhỏ bé vào việc nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của dãy chất
này.
PHẦN 1 - TỔNG QUAN

1.1. Tổng hợp và tác dụng sinh học của dẫn chất 5-ĩiitrofurfural.
1.1.1. Cấu trúc hoá học và tác dụng kháng khuẩn của các thuốc nhóm
nitroýuran.
5 - Nitì:ofurfural được nhà bác học Pháp R.Marquis tổng hợp thành
công vào năm 1905 [35] nhưng chỉ đến khi M. c. Dodd và w. B. Stillman [24]
phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của 5- ĩiitroíuiíural vào năm 1944 thì việc
nghiên cứu dẵy chất này mới phát triển nhanh chóng tại nhiều nước trên thế
giới. Đến nay đã có khoảng hàng nghìn chất được tổng hợp và trên 30 chất đã
được dùng rộng rãi trong y học [26,27]. Các dẫn chất 5- nitrofarfural được
dùng làm thuốc điều tn nhiễm khuẩn có công thức cấu tạo chung là:
5,
O2N o CH = N - R
6 7
Theo kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới cho thấy hai yếu
tố cấu trúc là nhóm -NO2 gắn vào vị trí 5 và nhóm - C=N - gắn vào vị trí 2 của
vòng Furan là cần thiết đối vói tác dụng kháng khuẩn và các dẫn xuất mói
thường được tạo ra bằng cách thay đổi nhóm thế - R gắn vào nguyên tử N của
liên kết-C =N - [26,27].
Xét mối liên quan cấu trúc - tác dụng ngưòi ta nhận thấy nhóm -NO2
gắn vào vị trí a của nhân Furan có tác dụng quyết định hoạt lực kháng khuẩn.
Nếu đưa nhóm -NO2 vào vị trí ß thưcmg làm tăng độc tính. Vị trí a còn lại là
gốc R. Nhìn chung gốc R có cấu trúc như sau:
R= — C = N

N
( X = o, s,
X
Sự đưa nhóm vinyl vào thường làm tăng tác dụng;
R = — C = c

C = N — N— c

( X = o, s,-NH )
X
Bảng 1. Một số thuốc kháng khuẩn thuộc dãy Nitroíuran [11,14,20,29].
STT Công thức cấu tạo Tên gốc
Tên biệt
dược
Công dụng
1
NF-CH = N-NH - CO - NH2
Nitrofurazon Puracin,
NFZ,
Nitroíural,
Puracilin
Điều tậ nhiễm
khuẩn ngoài
da (vết ứiương,
vết bỏng)
2
NF-CH=N-NH-OC— OH
Nifuroxazid
Erceíuryl,
Pentoíur
Điều trị nhiễm
khuẩn đường
ruột, Iv trực
khuẩn, viêm
ruột kết mạn
và bán cấp.

3
NF-CH = N-NH - CO -CO - NH2
NifuraÌdezon
Enteríùr
Điều tụ bệnh
kiết lỵ
4
NF-CH=N-1
NH
Nitroíuran-
toin_
Puradantin,
Puradoin,
Niíasets
Điều trị nhiễm
khuẩn đường
niệu.
5
NF-CH=N- ^
0
/
Furazolidion puroxone,
NiMidon
Diệt khuân
đường ruột và
dùng trong thú
y-
Ghi chú:
NF ^ O2N O"
Theo I. L. Kitaep và B. I. Buzukin [36] tác dụng của các nitrofuran là do

có sự liên hợp sau:
ứ l
N Í n H - C - Y
á .
Nếu kéo dài mạch liên hợp hoặc đưa nhóm phân cực vào thì nhóm này
sẽ tưofng hỗ với nhóm nitro nhận điện tử làm tăng tác dụng kháng khuẩn. Nếu
thêm nhóm ion hoá mạnh vào thì làm giảm khả năng hấp thu trên tế bào vi
khuẩn dẫn tới làm giảm tác dụng kháng khuẩn.
* Cơ chê tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 5- nitrofurfural.
Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 5- nitrofurfural có thể
được trình bày như sau:
Dẫn xuất nitrofuran ức chế chu trình Krebs của tế bào vi khuẩn, làm
giảm sản xuất năng lượng cần cho sinh sản và tổn tại của vi khuẩn. Với nồng
độ vừa phải, thuốc ức chế tổng hợp ADN, ARN của vi khuẩn, nồng độ gấp đôi
làm ngừng hẳn tổng hợp ADN, ARN. [11]
Một tài liệu khác [22] đã công bố rằng cơ chế tác dụng kháng khuẩn
của các dẫn chất nitrofuran có liên quan tới sự khử nhóm nitro bỏi enzym khử
nitro của vi khuẩn, thành các chất trung gian như gốc nitro, nhóm nitroso,
hydroxylamin và cuối cùng là nhóm amin. Các chất trung gian này ở dạng
nguyên thể hay sau khi acetyl hoá đã tưorng tác và làm tổn thưoíng ADN của vi
khuẩn.
Theo cơ chế trên, Akerblom E.B. [19] còn nhận xét thấy mối liên quan
giữa thế khử của nhóm nitro và hoạt tính kháng khuẩn. Các chất nitrofuran có
nhóm carbonyl liên hợp ở vị trí 2 có thể bị khử dễ dàng do gốc anion [la]
được tạo thành trong giai đoạn khử đầu tiên có thể được ổn định do sự liên hợp
'ö-
JQ'
'N'
'0
la

? \
T H = C—c —R2
Ri
N
u
h f)
0 '" ^ c h ^ ^ ^ c -R2
Ib Ri
•Q‘
'^ ''N ^ O " ^ C H - C = C - R2
=0
Ic
I
R,
Nhóm thế Ở vỊ trí 2 (nhóm carbonyl liên hợp) có thể làm tăng hoạt tính
kháng khuẩn của hợp chất nittofuran do làm dễ dàng sự khử hoá nhóm nitro
như trình bày trên đây. Các nhóm thế cổng kềnh ở vỊ trí 2 có thể làm giảm tác
dụng của dẫn chất nittofuran đối vói vi khuẩn Gram âm, có thể do sự cản trở
không gian đối vói sự thâm nhập của nitrofuran vào tế bào vi khuẩn .
1.1.2. Tình hình nghiền cứu vê tổng hợp và tác dụng sinh học của các dẫn
chất 5 - niừofurfuraỉ trong những năm gần đáy.
Các dẫn chất 5- nitroủiríiiral là tác nhân kháng khuẩn đáng chú ý bỏd
chúng có cấu trúc đơn giản, phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng diệt Idiuẩn ở
nồng độ thấp, thải trừ nhanh ra khỏi cơ thể và nhìn chung ít có hiện tượng
kháng thuốc [26,27].
Do những ưu điểm trên, các dẫn chất 5 - nitrofurfural vẫn đang tiếp tục
được nghiên cứu nhằm tìm ra những thuốc kháng khuẩn, kháng nấm mới có
hoạt phổ rộng và khắc phục hiện tượng kháng thuốc của các kháng sinh khác.
Năm 1975, Aries Robert và cộng sự [21] đã ngưng tụ 5 - nitrofurfural
vói Ampicillin tạo ra chất mói có tác dụng kháng khuẩn mạnh, ngăn cản sự

nhòfn thuốc của vi khuẩn:
O2N o CH = N - CHPhCO - N—
CH3
-CH3
\
COOH
Ngoài các dẫn chất nitrofuran có cấu trúc được nối với gốc R bằng cầu
azomethin và hvdrazon, việc gắn trực tiếp các niưoũiran với các ceton- a, Ị3-
ethylenic là một hướng nghiên cứu mới rất đáng quan tâm. Kết quả nghiên
cứu của Nazarova và Babeschkina [37] cho thấy các dẫn chất này có tác dụng
ỉcháng khuẩn rõ rệt như chất 3- methvl-3- (5’- nitro- 2'- furyi)- 3- buten- 2- on.
O2N
CH
. C - S o
b r
L.Ya.Ladnaya và N.M.Turkevich [28] đã lổng hợp và thừ tác dụng
kháng khuẩn của các dẫn chất ngưng tụ của 5- nitrofurfural với thiazolidin -
2,4 - dion:
-NH
O2N o (CH =CH)n-CIÍ^^^^^S^^O (n-0, 1)
R = H ; 5 - Br ; 6 - C1
Các chất này có tác dụng mạnh với các vi khuẩn đường ruột.
Nhà nghiên cứu Thuỵ Điển Akerblom E.B. [19] đã tổng hợp và thừ tác
dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 5- nitrofurfural mà phân tử có chứa gốc
5- nitrofuryl, nhóm ceton - a, p - ethylenic, nhân thiazolidin - 2,4 - dion,
nhân rhodanin:
O2N' 'O
(CH==CH)n-i-cir
N— R,
n=0, 1 ; Ri=H;alkylíl2 = 0,S

Các chất đều có tác dụng kháng khuẩn mạnh hoíi nitrofurantoin.
ở Việt nam, nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và tác dụng sinh học
của các dẫn chất nitrofuran đã được công bố và thu được những kết quả đáng
quan tâm.
Năm 1994, tác giả Nguyễn thị Xuàn Thuỷ [16] đã nghiên cứu tổns hợp
5- (5' - nitro 2' - furfuryliden) - thiazolidin - 2,4 - dion và các dẫn chất base
Mannich:
o.
O2N'
N -CH2-N
o
Rị,R9 = aryl, aBcyl
Kết quả thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất này có lác dụng
kháng nấm, kháng khuẩn, chống phân bào trên mô phân sinh thực vật mạnh.
Năm 1996, các tác giả Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Đặng
Thị Kim Huệ [4,5] đã công bố kết quả tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn,
kháng nấm của một số dẫn chất 5 - nitrofurfural có nhóm ceton - a, ị3 -
ethylenic:
+)
+)
ơ2N^
(i)
OỈ3
'CH =C -Ò = 0
bỉ3
O i N ^ o ^ c h = (ị
( 3 ) <
ọ
C—CH3
C—CH3

ì
0
02N'
02N'
( 2 )
^ \ CH3
CH = Ọ-C=N-B
CH3
N-B
'1 1
C—CH3
'O
( 4 )
CH =
C—CH3
ì
0
Kết quả thử tác dụng sinh học sơ bộ cho thấy chất 1, 3 và các dẫn chất
có tác dụng kháng khuẩn và idiáng nấm Candida albicans mạnh.
Trong hai năm gần đây, Đinh thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt và
cộng sự [4,5,13] đã công bô' kết quả tổng hợp và thử hoạt tính kháng Iđiuẩn,
kháng nấm của ba dãy chất được tạo ra bằng phản ứng ngưng tụ 5 -
nitrofurfural vói các hợp chất có nhóm methylen hoạt động như: thiazoiidin -
2,4 - dion, 2 - thioxo 4 - thiazolidinon (rhodanin), imidazolidin - 2,4 - dion
(hydantoin) và các dẫn chất base Mannich của chúng.
-N-H
0,N 0
^ S '^ 0
-N-ỉĩ
0

-NH
H
O2N"
O7N'
0,
N-Π2-N
ch= * ^ ç-A .
0
0 .
O7N ^0
N-Π2-N
C H = ^ sA ,
V
\
\
-N-CH2-N<^
1 °
Các kết quả thực nghiệm sinh học cho thấy các dẫn chất này có tác
dụng kháng khuẩn và kháng nấm Candida albicans mạnh. Một số có hoạt tính
kháng khuẩn mạnh hofn Nitrofurantoin ở cùng nồng độ thử ( 0,5 mg/inl).
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy các dị vòng thiazolidin - 2,4 - dion, 2-
thioxo 4 - thiazoiidinon (rhodanin), imidazolidin - 2,4 - dion (hydantoin) và
yếu tố cấu trúc ceton - a, p - ethylenic có phần đóng góp vào hoạt tính kháng
khuẩn của ba dãy chất nittofuran nêu trên.
Từ một số kết quả đáng chú ý trên, nhằm tìm hiểu thêm về mối liên
quan giữa cấu trúc hoá học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của một số
dẫn chất 5 - nitrofurfural, trong khoá luận này, chúng tôi đã tiến hành thử
định tính tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, xác định nồng độ ức chế tối
thỉểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối tliiểu (MBC) của một số dẫn chất mà
các tác giả trên tổng hợp được và bước đầu đã thu được một số kết quả đáng

quan tâm.
1.2. Khái quát chung về vi sinh vật.
1.2.1. M ột số đặc điểm chung về vi sinh vật [2,6,9].
Vi sinh vật (VSV) có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất.
Từ lâu con người đã nhận thức được sự tồn tại của chúng và đã có nhiều ứng
dụng ừong đời sống. Nhưng chỉ đến năm 1675, khi Lewwenhook người Hà
Lan, phát minh ra chiếc kính hiển vi có sức phóng đại 270 lần thì con người
mới quan sát được hình dạng của chúng. Và Louis Pasteur, nhà khoa học vĩ
đại người Pháp với những phát kiến quan trọngcủa mình đã mở đầu một kỷ
nguyên mới trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh lý học v s v .
v s v gồm có v s v nhân thật (Eucaryotes) và v s v nhân nguyên tíiuỷ
(Procaryotes) [9]. Chúng có kích thước rất nhỏ bé (thường tính bằng micromet
hoặc nanomet) nhưng hấp thụ nhiều và chuyển hoá nhanh. So với các sinh vật
khác thì v s v có tốc độ sinh trưởng và phát triển cực kỳ lớn. Trong điều kiện
nuôi cấy thích hợp, trung bình cứ 20’ - 30' có một chu kỳ phân chia tế bào gọi
là thời gian thế hệ. Qiúng có khả năng thích ứng mạnh với các biến đổi bất lợi
của môi trưòíng và cũng rất dễ phát sinh ra biến dị. Những biến dị này có ũiể
có lợi (ví dụ làm tăng hiệu suất sinh kháng sinh) hoặc có hại (ví dụ xuất hiện
khả năng kháng thuốc).
* Vi khuẩn (VK) là những v s v nhân nguyên thuỷ (Procaryotes). Người
ta phân loại chủng dựa theo nhiều yếu tố khác nhau:
- Theo hình dạng, chúng có 3 loại chủ yếu là :
+ VK hình cầu: Tụ cầu ( Ví dụ: Staphylococcus aureus)
Song cầu ( Ví dụ: Diplococcus pneumonia)
+ ỴK hình que: Ví dụ: trực khuẩn ũiương hàn Salmonella typhi,
trực khuẩn hiếu khí sinh nha bào Bacillus subtilis
+ VK hình xoắn: Ví dụ: phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae, xoắn
khuẩn giang mai Treponema pallidum.
- Theo tính chất bắt màu Gram, người ta chia VK ra làm 2 nhóm là VK
Gram(-) và Gram (+).

- Theo đặc tính hô hấp thì VK được chia thành 3 nhóm: hiếu khí, kị khí
và kị khí không bắt buộc.
- Theo phương thức dinh dưỡng, ngưòd ta chia VK ra làm 2 loại: tự
dưỡng và dị dưõtig.
* Trao đổi chất của vi khuẩn gồm có 2 quá trình: Đổng hoá và dị hoá.
Đổng hoá là quá trình chuyển hoá các chất hữu cơ đơn giản thành các chất
phức tạp. Còn dị hoá là quá trình ngược lại, nghĩa là phân giải các chất hữu cơ
phức tạp thành những chất đơn giản hơn. Hai quá trình này diễn ra đổng thời
trong tế bào VK.
* VK sinh sản chủ yếu theo hai hình thức: đa số VK sinh sản vô tính
bằng cách tự nhân đôi và một số sinh sản bằng cách hình thành nha bào. Khi
gặp điều kiện sống bất lợi thì một số VK có khả năng hình thành nha bào. Nha
bào của VK có sức đề kháng cao với nhiệt độ, hoá chất, áp suất thẩm thấu,
bức xạ V V. và có thể sống từ hàng chục đến hàng trăm năm.
* Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, quá trình sinh trưởng và phát triển
của VK trải qua 4 pha (.2,6,23,25].
thời gian
Đường cong phát triển của vi khuẩn khi nuôi cấy tĩnh.
(1) pha lag (pha tiềm tàng, pha thích ứng)
(2) pha sinh trưởng log (pha luỹ thừa)
(3) pha ổn định
(4) pha suy tàn (pha tử vong)
Ngoài chất dinh dưỡng, quá trình sinh trưcmg và phát triển của vi khuẩn
còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố nuôi cấy khác như nhiệt độ, độ ẩm, pH, chát
sát khuẩn.
V V.
1.2.2. Đặc điểm hinh tháiy sinh lý và khả năng gáy bệnh của một số loài
vsv.
Trong tự nhiên, v s v phân bố rất rộng rãi. Chúng có mặt ở khắp mọi
nơi; trong đất, trong nước, trong không khí và trên cơ thể của nhiều loài sinh

vật khác. Chúng có vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hoá vật chất
nhưng đồng thời có rất nhiều loaị v s v gây bệnh cho người và động thực vật.
Trong khoá luận này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 10 loài v sv
hay gặp nhất, gồm 9 loài vi khuẩn và một loài vi nấm.
* Esherìchia coli ( trực trùng đại tràng)
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-), không sinh nha bào, có lông.
- Hô hấp: hiếu khí hoậc kị khí không bắt buộc.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trường nuôi cấy thông
thưòng. Điều kiện thích hợp là pH = 5,5 - 8; 1*"= 3TC.
+ Môi trường canh thang; gây đục, để lâu có cặn, có mùi thối đặc
biệt.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc trắng xám, nhờn, bóng.
- Khả năng gây bệnh: E.coli sống cộng sinh nhưng có thể gây nhiễm
trùng cơ hội như viêm đường ruột, sinh dục, tiết niệu
* Salmonella typhi (trực khuẩn thương hàn)
- Đặc điểm hình thái: Trực khuẩn Gram (-), không sinh nha bào, có
lông toàn thân.
- Hô hấp: kị khí không bắt buộc.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trường nuôi cấy thông
thường.
+ Môi trường canh thang: đục đều có vẩn.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc trắng đục, bờ đểu, nhẩn
bóng.
- Khả năng gây bệnh: gây bệnh thương hàn, nhiễm độc thức ăn
* Shigella ýlexneri (trực khuẩn iỵ)
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-), khổng sinh nha bào, khổng
có lông.
- Hô hấp: hiếu khí boậc kị khí tuỳ tiện.
- Đặc điểm nuôi cấy:
+ Môi trưèfng canh thang: đục đều, lắc có vảy óng ánh.

+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc, trắng đục, mọc gọn theo
đưòỉng cấy.
- Khả năng gây bệnh: gây bệnh lỵ trực ìdiuẩn.
* Proteus mirabilis
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-), không sinh nha bào, có
nhiều lông.
- Hô hấp : hiếu khí.
- Đặc điểm nuôi cấy:
+ Môi trường canh thang: phát triển nhanh thành từng đám tạo
màng dày. gày vẩn đục.
+ Môi trường thạch thưòíig: khó mọc thành khuẩn lạc.
- Khả nãng gây bệnh: sống cộng sinh ở ruột. Khi xâm nhập vào cơ quan
khác cổ thể gây một số bệnh như nhiễm trùng đường niệu, nhiễm
trùng huyết, viêm màng não thứ phát
* Pseudomonas aerugỉnosa (trực khuẩn mủ xanh)
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-), có một lông ở một đầu,
không sinh nha bào.
- Hô hấp: hiếu khí tuyệt đối.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trong môi trường nuôi cấy thông
thường, thích hợp nhất ở t = 37”C; pH = 7,2-7,5.
+ Môi trường canh thang; tạo váng trên bề mặt.
+ Môi trường thạch thường; Khuẩn lạc nhỏ, màu xanh, bề mặt
nhẩn hoặc sù sì.
- Tính chất đặc trưng; có khả năng sinh 2 loại sắc tố là tluorescin (có
màu xanh vàng) và pyocyanin (có màu xanh lục nhạt).
- Khả năng gây bệnh: là nguyên nhân của những bệnh nhiễm trùng cơ
hội. Tại nci nhiễm trùng chúng gây ra tổn thưong có mủ màu xanh.
Gặp điều kiện thuận lợi, có thể gây nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm
mạc, viêm màng não
* Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng)

- Đặc điểm hình thái; cầu khuẩn Gram (+) mọc thành từng đám, không
hình thành nha bào, không di động.
- Hô hấp: hiếu khí hoặc kị khí tuỳ tiện.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát ttiển trên môi trường nuồi cấy thông
thưòmg.
+ Môi trường canh thang: sau 5 - 6 giờ làm đục môi trường, sau
24 giờ có hiện tượng lắng cặn.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc tương đối tròn, mép đểu
đặn, màu vàng sẫm.
- Khả năng gây bệnh: có thể gây nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm trùng
huyết, nhiễm độc thức ăn, viêm một cấp
* Bacillus cereus
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (+), có khả năng sinh nha bào.
- Phân bố: có nhiều trong không khí, đất, phân bón.
- Đặc điểm nuôi cấy:
+ Môi trưòmg canh thang: làm đục môi trường.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc màu trắng đục.
- Khả năng gây bệnh: không gây bệnh.
* Bacillus pumỉlus
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (+), có khả năng hình thành nha
bào.
- Phân bố: có nhiều trong không khí, đất, phân bón.
- Đặc điểm nuôi cấy;
+ Môi trường canh thang: làm đục môi trường.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc màu trắng sữa, bể mặt
nhẵn.
- Khả năng gây bệnh: không gây bệnh.
* Sarcina lutea
- Đặc điểm hình thái: bát luỹ cầu, Gram(+), mọc thành chùm tíieo hình
lập phương, có từ 6 - 8 coccus.

- Phân bố: có trong đât, nước, không khí, ruột.
- Đặc điểm nuôi cấy:
+ Môi trường canh thang: làm đục môi trường.
+ Môi trường thạch thường; khuẩn lạc màu vàng nhạt.
- Khả năng gây bệnh; thường không độc nhưng tham gia vào quá trình
gây mủ các vết thương.
* Vỉ nấm Candida albicans
- Đặc điểm sinh thái; là v s v Eucaryote, cơ thể là những tế bào nhỏ
hình trứng, có khi có chồi nhỏ.
- Sinh sản: vô tính bằng cách nảy chồi, hữu tính bằng cách hình thành
túi bào tử.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trường nuôi cấy thông
thường. Môi trường Sabouraud là môi trường nuôi cấy cơ bản.
Điều kiện thích hợp là pH = 5,8 - 6,2; t° = 25 - 28°c.
+ Môi trường Sabouraud lỏng; tạo váng trên bề mặt.
+ Môi trường Sabouraud đặc: khuẩn lạc to, nhẩn, màu trắng đục.
- Khả năng gây bệnh: là nấm men ký sinh trong ống tiêu hoá, gặp điều
kiện thuận lợi có thể gây bệnh như: tưa lưỡi ở trẻ em, viêm thực quản,
viêm da, viêm âm đạo,
1.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bàng phương pháp v s v .
Muốn nghiên cứu hoạt lực tác dụng của một chất kháng khuẩn và phổ
kháng khuẩn của nó, ta phải dùng phương pháp v s v .
Phương pháp v s v xác định hoạt tính kháng khuẩn dựa trên mức độ ức
chế của chất thử đối với sự phát tìiển của v s v chỉ thị.
1.3.1. Phương pháp định tính [1,7,10,23,25].
Phương pháp này được thực hiện trên môi trường đặc dựa trên nguyên
tắc: sự khuếch tán của chất thử vào môi trường sẽ ức chế sự phát triển của
v sv chí thị tạo các vòn2 vô khuẩn có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng
độ chất Ihử.
Phương pháp định tính có thể được thực hiện theo các kỹ thuật khác

nhau:
l.3.1.1. Cấy theo đườm thẳns góc.
Trên đĩa thạch dinh dưỡne đục một rãnh thẳng dọc theo đường kính
hoặc theo một đường cát tuyến ở mép hộp. Cho chất thử vào rãnh đã được làm.
Sau đó cấy các v sv chỉ thị thành những đường thẳng góc và sát với rãnh chất
thử. Sau thời gian nuôi cấy, quan sát vùng ức chế vsv. Hoạt tính kháng khuẩn
được sơ bộ xác định bằng cách đo khoảng cách từ rãnh chất thử đến chỗ v sv
bắt đầu phát triển.
ưu điếm của phương pháp này là có thể thử tính ức chế của chất thử
với nhiều chủng vsv trên cùng một đĩa Petri.
1.3.12. Dùns ốns thép khôns sỉ.
Trên mặt đĩa thạch dinh dưỡng có trộn v s v chỉ thị, đặt các ống thép
không gỉ hình trụ có kích thước: cao lOmm, đường kính ngoài 8mm, đường
kính trong 6mm. Cho chất thử với một lượng bằng nhau vào các ống trụ. Sau
thời gian nuôi cấy, đo vòng vô khuẩn được tạo thành quanh ống trụ.
13.1.2. Đuc lỗ thach.
Dùng khoan nút chai hoặc dụng cụ riêng vô trùng để đục lỗ trên đĩa
thạch dinh dưỡng đã có v s v chỉ thị tạo các lỗ có đường kính 6-7mm, chiều
cao 7-8mm. Cho chất thử vào lỗ thạch. Đo vòng vô khuẩn được tạo thành sau
thời gian nuôi cấy.
1.3.1.4. Dùns khoanh siấy loc.
Phương pháp này được dùng khá phổ biến để xác định tính mẫn cảm
của v s v với các chất kháng khuẩn. Đặc biệt được dùng nhiều trong bệnh viện
để làm kháng sinh đồ [10].
Các khoanh giấy sắc ký có đường kính 7 - 8mm được tẩm chất thử với
một hàm lượng nhất định theo mục đích nghiên cứu. Để khô ở 37”c - 40‘’c.
Đặt các khoanh giấy này lên mặt đĩa thạch dinh dưỡng đã có v s v chỉ thị. Đo
vòng vô khuẩn sau thời gian nuôi cấy.
1.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởns đến kích thước vòns vô khuẩn.
Kích thước vòng vô khuẩn có thể bị thay đổi phụ thuộc vào độ dày của

lớp thạch, nồng độ v s v chỉ thị và thành phần của môi trường. Đổng thời còn
phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của chất thử. Tuy nhiên trong các điểu kiện
thí nghiệm ổn định có thể dựa vào vòng vô khuẩn đế sơ bộ đánh giá mức độ
mẫn cảm của v sv với chất thử.
Ví dụ: Gọi đường kính vòng vô khuấn là d
d >25mm : v s v mẫn cảm mạnh
15 <d <25 : v sv mẫn cảm
10< d < 15: v s v mẫn cảm yếu
d <10mm : v s v không mẫn cảm (kháng)
1.3.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) [23,25,31].
MIC (Minimal Inhibitory Concentration) là nồng độ thấp nhất của một
chất kháng sinh hay kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoàn toàn sự phát triển
của một vs v trên invitro [23,25,31,34].
Nồng độ ức chế tối thiểu không có V nghĩa trona điều trị. Kết quả điều
trị phải dựa vào tính chất dược lý như nồng độ kháng sinh trong máu, nồng độ
kháng sinh ớ vị trí nhiễm trùng, đường hấp thu và thải trừ của kháng sinh
Một chủng có sức đề kháng với kháng sinh tức là MIC của kháns sinh
đó lớn hơn nồng độ kháng sinh trong cơ thể. Kháng sinh này coi như không có
tác dụng. Nồng độ kháng sinh trong cơ thể phải bằng hoặc lớn hơn MIC thì
kháng sinh mới có khả năng kìm khuẩn.
Trên lâm sàng việc xác định MIC là rất quan trọng, ở những bệnh nhân
bị nhiễm khuẩn thì yêu cầu điều trị là phải đạt được một nồng độ kháng sinh
nhất định tại vị trí nhiễm khuẩn, ở nồng độ này, kháng sinh phải có khả năng
ức chế sự phát triển của v s v gây bệnh. Để xác định v sv nhạy cảm hay
kháng kháng sinh, cần phải biết rằng với mỗi đường đưa thuốc vào cơ thể thì
nồng độ kháng sinh tại vị trí nhiễm khuẩn có đủ để ức chế v s v gây bệnh hay
không? Người ta nhận thấy có sự iiên quan giữa MIC và liều có tác dụng trong
invivo [25].
Bảng 2: Liên quan giữa sự nhạy cảm của một số chủng vsv gây bệnh với liều
điều trị của Chloramphenicol theo đườns tiêm bắp [25, p.iOO].

' Mức độ nhạv cảm của
; vsv
1
i
Khoảng nồng độ ức chế
trèn invitro
1
Liều yêu cầu để đạt
được nổns độ ức chế
trên invivo
-rất nhạy cảm
<4mg/ml
20-25mg/kg/ngày
(0,5g/lx3/ ngày)
-nhạy cảm
4-7mg/ml
30-50 mg/kg/ngày
(lg/lx3/ngày)
-nhạy cảm vừa phải
7-lOmg/ml
60-7 Omg/kg/ngày
(l-l,5g/lx4/ngày)
-kháng
>10mg/ml
Không thực hiện được ở
điều kiện thông thưòíng '
Việc xác định MIC được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu các thuốc
kháng sinh và các chất kháng khuẩn. Nó đánh giá được hoạt lực tác dụng của
thuốc với VK và mức độ nhạy cảm của chúng. Dựa vào giá trị MIC50 và
MIC90 ngưòi ta có thể xác định được mức độ nhạy cảm của một loài vsv với

kháng sinh [33,34].
* Loài vi khuẩn nhạy cảm thưòtig xuyên với kháng sinh:
> 90% số chủng có MIC < c
< 10% số chủng phân lập kháng kháng sinh hay tính nhạy cảm với
kháng sinh giảm (MIC > G).
Ví du: Penicillin G và liên cầu
Hình 1: Chủng nhạy cảm
thường xuyên
* Loài nhạy cảm vừa phải với kháng sinh:
> 90% số chủng có c < MIC < c.
Ví dụ: Macrolid và Hemophilus influenzae
Hình 2: Chủng nhạy
cảm vừa phải
* Loài vi khuẩn kháng kháng sinh;
> 50% số chủng kháng kháng sinh (MIC > C)
Ví dụ: Penicillin G và Staphyloccocus aureus
Hình 3; Chủng kháng
kháng sinh
Chú thích: c và c là nồng độ giới hạn trên và nồng độ giới hạn dưới của thuốc
trong invivo.
Có nhiều phương pháp để xác định MIC trong đó có 2 phương pháp hay
được sử dụng nhất là phương pháp pha loãng trong môi trườna lỏna vằ pha
loãng trong môi Irưòng đặc [15,25,33,34]. Trong điều kiện tiến hành khoá
luận, chúng tôi chọn phươns pháp pha loãns; trong môi trường lỏng do phươns
pháp này có độ chính xác cao, dễ thực hiện, và rất tiện lợi cho việc thử nồnơ
độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC).
Cơ sở của phương pháp này là [34] trong một dãy các ốne nghiệm cho
cùng một thể tích môi trường dinh dưỡng lỏng đã tiệt trùng, pha loãng các
dung dịch thử vào môi trường theo một tỷ lệ nhất định tuỳ theo yêu cầu phép
thử. Cho vào mỗi ống một lượng vsv chỉ thị như nhau sao cho nồng độ vsv

trong mỗi ống khoảng 10^ tế bào/ml. Sau thời gian nuôi cấy, xác định nồng độ
thấp nhất của chất thử ức chế hoàn toàn sự phát triển của v sv .
1.3.3. Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
[25,31,33].
Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC = Minimal Bacteriostatic
Concentration) là nồng độ nhỏ nhất của một kháng sinh có thê ngăn chặn sự
phát triển của một v sv sau khi đã được cấy truyền sang môi trườns đặc
không có kháng sinh, hoặc là nồng độ kháng sinh mà ở đó 99,9% số tế bào
của vsv bị tiêu diệt [33].
Trẽn lâm sàng MIC thường được sử dụng nhiều hofn nhưng việc xác
định MBC cũng có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt là ở những bệnh nhân bị suy
giảm miễn dịch nghiêm trọng hoặc những bệnh nhân cần đạt được mức độ tối
ưu trong điều trị nhiễm khuẩn [33].
Người ta thưorng tiến hành xác định MBC ngay sau khi xác định MIC
bằng cách cấy truyền những ống không có vsv phát triển trong xác định MIC
sang môi trường dinh dưỡng đặc không có kháng sinh, ở nồng độ thấp nhất
mà VK không phát triển lại đirơc sau thời gian nuôi cấy là MBC.
PHẨN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu và phưong pháp thực nghiêm.
2.1.1. Nguyén liệu
2.Ỉ.Ỉ.I.Hoáchất
24 Chất là sán phám ngưng tụ của 5 - nitrofurfiiral với thiazolidin- 2.4-
dion, 2- thioxo 4- thiazoiidinon và các dẫn chất base Mannich có côna thức
được ghi ở bảng 3.
2.1.12. Môi trườns dinh dưỡns:
* Môi trường thạch nền (MTl)
Thạch
: 18,Og
Nước cất vđ : lOOOml
* Môi trường cao thịt - cao men (MT2)

Peptôn
Cao men
Thạch
10,Og Cao thịt
3,0g Glucose
15,0g Nước cất vđ
pH = 7,2 ± 0,2
* Môi trường Sabouraud (MT3)
Pepton : lO.Og
Thạch : 15,0g
Glucose
Nước cất vđ
pH = 5,8 ± 0,2
* Môi trường canh thang cao thịt - cao men (MT4)
l,5g
l,Og
lOOOml
; 20,Og
; lOOOmi
10,0g
3,0g
lOOOml
Pepton
Cao men
Nước cất vđ
Đóng ống 4,3 ml
* Môi trường Sabouraud lỏng (MT5)
Pepton ; 10,Og
Nước cất vđ : lOOOml
Đóng ống 4,3 ml

Cao thỉt
Glucose
pH = 7,2±0,2
1.5g
l,Og
Glucose :
pH = 5,8±0,2
20,0g
Các môi tnrờng được hấp tiệt trùng ở 1 atm/ 20'
lĩiíng 3: công thức 24 dẫn chất 5 - nitroturtural
o. ,Ri
N— (CH2— N )n < ^ '
O2N o'
'CH
( 'hâl n
R.
R2
.

7‘^ ' '
R 3
1
0
II
2 1 CH3
CH3
0
3 1 ■ •' M
C4H9
0

4 M
0
5
1 11
0
6 1 II ^ 0 - C I
0
7
1
li
^ 0 ^ “ '
0
8 1 li
0
9
1
^-A
—N 0
0
10
1
~ o
0
11 1 II
H3C
0
12 I 11
- 0 -CH.
0
13

0
11
s
14
1 C2H5 C2H5
s
15
1
It
C4H9
s
l<»
1 II
s
17 1 M
s
18
1 M
.s
19
1
II
s
20 1 II
^ 0 > - '
s
21
—H ^0
s
22 1

- 0
s
23 1 11
K,c
%
s
24 1 II
s
2.1.1.3. Căc chiìiií; V'W kiểm đinh:
Để nghiên cứu, chúng tôi đã dùng 9 chủng vi khuẩn bao gồm 4 chủng
Gram (+), 5 chủng Gram (-) và 1 chủng vi nấm. Các chủng v s v thử là những
chủng quốc tế hoặc được phàn lập tại các viện nghiên cứu của Việt Nam.
* 4 chủng VK Gram (+):
Bacillus pumilus NCTC 824ỉ
Bacillus cereus ATCC 9946
Sarcina lutea ATCC 934ỉ
Staphylococcus aureus ATCC ỉ 2228
* 5 chủng VK Gram (-);
Escherichia coli ATCC 25922
Salmonella typhi DT 220
Shigella flexneri DT 112
Proteus mirabilis BV108
Pseudomonas aeruginosa VM 201
* 1 chủng vi nấm:
Candida albicans ATCC 10231
2.ỉ.1.4. Phươns tiên:
- Hấp tiệt trùng trong nổi hấp Newclave model HL.
- Nuôi cấy v sv trong tủ ấm Incubator Electrically & Kerosene Burner
Heated.
- Dụng cự được sấy tiệt trùng trong tủ Shel Lab LB.

2.1.2. Phương pháp thực nghiệm:
- Thử định tính tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp
khuếch tán trên thạch (Dược điển Việt Nam).
- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng
liên tục của Stephen Gillespie [31].
- Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) bằng phương pháp của
Stephen Gillespie [31].