Sản xuất protein trong y học

Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành
Khoa Công Nghệ Sinh Học
SẢN XUẤT PROTEIN
TRONG Y HỌC
TS. TRẦN HOÀNG DŨNG
Tháng 04/2012
Sản xuất protein trong y học
1
Chương 1
DNA - CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG
Những khái niệm chính
 Các thông tin di truyền được chứa trong các axit nucleic.
 DNA là một sợi đôi xoắn song song ngược chiều nhau.
 Cặp base (A với T và G để C) giữ hai sợi xoắn lại với nhau.
 Sự sao chép DNA xảy ra thông qua việc tháo xoắn của các sợi DNA và sao
chép trên mỗi chuỗi.
 Các nguyên lý trung tâm của sinh học phân tử:
DNA phiên mã RNA dịch mã Protein
 Phiên mã là việc sản xuất một bản sao RNA của một trong các sợi DNA.
 Dịch mã là giải mã của một phân tử RNA để sản xuất protein.
Mỗi sinh vật sở hữu các thông tin cần thiết để xây dựng và duy trì một bản sao
sống của chính nó. Các khái niệm cơ bản về di truyền và kết quả cho thấy các gen có
thể được truy hồi trở lại năm 1865 và các nghiên cứu của Gregor Mendel được thảo
luận bởi Orel (1995). Từ những kết quả của thí nghiệm của ông với đậu Hà Lan,
Mendel kết luận rằng mỗi cây đậu Hà Lan có hai alen cho mỗi gen nhưng chỉ hiển thị
một kiểu hình đơn lẻ. Có lẽ thành tích xuất sắc nhất của Mendel là khả năng xác định
đúng một hiện tượng phức tạp mà không có sẵn những kiến thức về các quá trình phân
tử liên quan đến việc hình thành các hiện tượng đó. Sự di truyền qua tinh dịch và trứng
được biết cùng một thời điểm và Ernst Haeckel ghi nhận tinh trùng bao gồm phần lớn
các vật liệu từ nhân, mặc nhiên đã công nhận rằng nhân đóng vai trò về tính di truyền.
1.1. Acid nucleic là vật chất của di truyền

Ý tưởng cho rằng vật chất di truyền là chất truyền từ cha mẹ sang con theo quy
luật tự nhiên đã được thừa nhận như là các khái niệm về sự di truyền đã được kế thừa
trước đây. Cả hai protein và axit nucleic được xem là chất có vai trò quan trọng trong
vật chất di truyền. Cho đến những năm 1940, nhiều nhà khoa học nghiên cứu về
protein. Có hai lý do chính cho việc này. Thứ nhất, protein có nhiều ở các tế bào, mặc
dù số lượng của một protein riêng biệt thay đổi đáng kể từ các loại tế bào khác nhau,
hàm lượng protein tổng thể của tế bào nhất chiếm trên 50% trọng lượng khô. Thứ hai,
axit nucleic có thể dễ dàng để vận chuyển các thông tin phức tạp, cần thiết để truyền
đạt những đặc điểm của tính di truyền. DNA (deoxyribonucleic acid) lần đầu tiên được
xác lập vào năm 1869 bởi nhà hóa học Thụy Sĩ Johann Friedrich Miescher. Ông tách
nhân từ tế bào chất của tế bào và sau đó nó được tách bởi một chất có tính axit từ các
nhân mà ông gọi là nuclein. Miescher cho thấy nuclein có chứa một lượng lớn
phosphorus và không có lưu huỳnh, đặc tính mà có thể phân biệt chúng với protein. Từ
những gì đã được chứng minh cho ta có một cái nhìn tổng thể, ông cho rằng "nếu
muốn giả định rằng một chất đơn lẻ. . . là nguyên nhân của sự thụ tinh thì chúng ta nên
chắc chắn rằng tất cả các suy nghĩ đầu tiên là về nuclein.
Năm 1926 dựa trên ý tưởng về DNA bao gồm bốn nhóm nucleotide khác nhau,
bằng cách xác định các loại hình liên kết mà nó đã tham gia liên kết với các
Sản xuất protein trong y học
2
nucleotide, Levene và Simms đề xuất một cấu trúc của bốn nucleotide (Hình 1.1) để
giải thích trình tự sắp xếp hóa học của nucleotide trong axit nucleic (Levene và
Simms, 1926). Họ tìm thấy một nucleotide đơn của bốn loại đã được lặp đi lặp lại
nhiều lần để tạo thành phân tử acid nucleic dài. Bởi vì cấu trúc của bốn nucleotide là
tương đối đơn giản, axit nucleic không có khả năng làm biến đổi tính chất hóa học của
các vật chất di truyền. Protein có chứa 20 acid amin khác nhau.
Hình 1.1. Đề xuất của Levene Simms năm 1926 về các mô hình bốn nucleotide
của cấu trúc axit nucleic. Vào thời gian đó mô hình này đã được đề xuất, người ta cho
rằng acid nucleic của thực vật và động vật có thể là khác nhau và sự khác biệt giữa
DNA và RNA chưa hoàn toàn được hiểu rõ.

Năm 1928, Frederick Griffith tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng một vài
chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae khác nhau (Griffith 1928). Một số các dòng
sử dụng được gọi là dòng độc hại, chúng gây ra viêm phổi ở cả người và chuột. Một số
dòng khác thì không gây độc và không gây bệnh. Cả hai dòng này có hình thái riêng
biệt trong đó các dòng gây bệnh có một lớp vỏ polysaccharide bao quanh vi khuẩn và
hình dáng bên ngoài mượt mà, tạo bề mặt nhẵn khi được nuôi cấy trên các tấm thạch.
Vi khuẩn không độc thì không có lớp vỏ và tạo một vùng nhám trên cùng một mẫu.
Các vi khuẩn dòng nhẵn thì nguy hiểm vì các viên đường cấu tạo từ lớp vỏ sẽ loại bỏ
hệ thống miễn dịch của động vật nhiễm bệnh và do đó chúng có thể nhân rộng và gây
ra bệnh viêm phổi. Các vi khuẩn gặp khó khăn khi không có các viên nang
polysaccharide nên sẽ không có sự bảo vệ này, do đó chúng dễ dàng xâm nhập và phá
huỷ hệ thống miễn dịch của vật chủ.
Griffith biết rằng chỉ có vi khuẩn độc sống sẽ tạo ra bệnh viêm phổi khi tiêm vào
chuột. Nếu giết chết vi khuẩn gây độc bởi nhiệt sau đó tiêm vào chuột, kết quả cho
thấy không có bệnh viêm phổi cũng giống như vi khuẩn sống không độc, không gây
bệnh khi tiêm vào chuột. Thí nghiệm quan trọng của Griffith (hình 1.2) liên quan đến
việc tiêm vào chuột vi khuẩn sống không độc (avirulent) kết hợp với vi khuẩn độc xử
lý nhiệt. Không có loại tế bào gây ra tử vong ở chuột khi họ tiêm, nhưng tất cả những
con chuột thu được kết hợp tiêm thuốc thì sẽ bị chết. Các phân tích máu của những con
chuột đã chết cho thấy một số lượng lớn các vi khuẩn độc sống khi nuôi trên các tấm
thạch. Griffith đã kết luận rằng nhiệt giết chết vi khuẩn nhẵn và bằng cách nào đó chúng
đóng vai trò chuyển vi khuẩn nhẵn vào vi khuẩn sống. Ông gọi hiện tượng này là hiện
tượng biến nạp và cho rằng nguyên tắc biến nạp có thể là do một số thành phần của viên
nang hay hợp chất polysaccharide là nguyên nhân để tổng hợp nên tác nhân gây bệnh,
mặc dù ông lưu ý rằng các viên đường một mình nó không gây ra bệnh viêm phổi.
Sản xuất protein trong y học
3
Hình 1.2. Các tính năng chính của thí nghiệm của Griffith, kết hợp với dữ liệu
của Avery, MacLeod và McCarty để xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi từ
Streptococcus pneumoniae. Griffith lưu ý rằng tiêm vi khuẩn nhẵn sống vào chuột dẫn

đến sự hình thành của bệnh viêm phổi và cuối cùng đến cái chết của chuột. Xử lý nhiệt
trước khi tiêm vi khuẩn không gây ra sự hình thành của bệnh. Không độc đối với
chủng vi khuẩn, mà không gây ra các bệnh riêng của chúng, có thể được chuyển đổi
bằng cách tiêm kết hợp với xử lý nhiệt vi khuẩn độc hại. Avery, MacLeod và McCarty
xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi.
Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế cầu khuẩn
từ R chuyển sang S. Người ta chứng minh được rằng :DNA tách từ vi khuẩn S nếu
được đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R sang S, phát hiện này khẳng
định DNA là vật chất di truyền. Trong hơn 10 năm trời kể từ sau thí nghiệm của ông,
Oswald Avery cùng với Macleod và McCarty đã tiến hành trở lại thí nghiệm biến nạp
này nhưng dùng trong in vitro.
Năm 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty xuất bản tác
phẩm của họ cho thấy rằng các phân tử đóng vai trò là yếu tố cơ bản chuyển đổi là
DNA (Avery, MacLeod và McCarty, 1944). Họ bắt đầu bằng cách nuôi số lượng lớn tế
bào Streptococcus pneumoniae nhẵn. Các tế bào được thu nhận từ các môi trường nuôi
cấy và sau đó giết chết bởi nhiệt. Sau đó đồng nhất và sử dụng chất tẩy rữa, họ thu
được một phần chiết được kiểm tra bằng cách tiêm vào vi khuẩn sống theo những
nguyên tắc biến nạp. Protein đã được gỡ bỏ từ dịch chiết của chloroform và
polysaccharides được nhiều enzyme tiêu hóa và loại bỏ. Cuối cùng, những phần kết
tuả với ethanol đã tạo ra một khối lượng xơ mà vẫn giữ lại khả năng gây ra biến nạp
của các tế bào vi khuẩn sù sì (avirulent). Từ 75 lít môi trường nuôi cấy của các tế bào
Sản xuất protein trong y học
4
vi khuẩn, sau quá trình thu được 10-25 mg từ các yếu tố hoạt động. Những thí nghiệm
được thiết lập qua một nghi ngờ rằng nguyên tắc biến nạp là DNA. Khối lượng các sợi
sơ được phân tích dựa trên tỷ lệ nitơ / phốt pho, được biểu hiện trùng khớp với tỷ lệ dự
kiến với DNA. Để loại bỏ tất cả các chất gây ô nhiễm có thể xảy ra từ chúng khi giải
phóng, họ tiến hành xử lí với nó với enzym thủy phân protein trypsin và chyomtrypsin
và sau đó họ dùng phương pháp xử lí bằng cách tiêu hóa nó với một RNA enzyme tiêu
hóa ribonuclease, nó sẽ bị phá hủy bất kỳ hoạt động còn lại của protein và RNA nhưng

vẫn giữ lại các hoạt tính chuyển đổi. Việc xác nhận cuối cùng DNA đã được chuyển
đổi bằng cách tiêu hóa dịch chiết với deoxyribonuclease, chúng sẽ bị phá hủy hoạt
động chuyển đổi.
Năm 1944, O.T Avery Mc Carti đã chứng minh được rằng tác nhân biến nạp là
DNA. Phế cầu khuẩn bị xử lí bằng protease hoặc RNA-aza thì hoạt tính biến nạp vẫn
còn: nhưng nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi DNA-aza thì hoạt tính biến nạp không còn
nữa (Cơ sở và phương pháp phân tích sinh học phân tử, T.s Chu Hoàng Mậu, trang 9).
Việc thứ hai chứng minh bằng chứng rằng ADN là vật liệu di truyền đã được
cung cấp bởi các nghiên cứu về sự lây nhiễm của vi khuẩn Escherichia coli bởi một
trong những virus phage T2 . Thường gọi đơn giản là thể thực khuẩn, virus bao gồm
một lớp vỏ protein bao quanh một lõi của DNA (xem hình 1.3).
Hình 1.3. Vòng đời của thể thực khuẩn T2. Trong quá trình xâm nhiễm, vi khuẩn
bám vào các bề mặt của tế bào Escherichia coli. Truyền các thông tin di truyền nhưng
không phải là toàn bộ nhân thể thực khuẩn được chèn vào trong vi khuẩn, nơi nó được
nhân rộng. Các thể thực khuẩn được sao chép, lớp vỏ protein vẫn còn ở bề mặt của vi
khuẩn. Sau khi tổng hợp các nhân thể thực khuẩn mới được sản xuất, ly giải tế bào vi
khuẩn và các nhân thể thực khuẩn được giải phóng vào môi trường xung quanh.
Trong những năm 1950 chúng ta ít được biết về thể thực khuẩn lây nhiễm. Thể
thực khuẩn được biết là hấp thụ vào bề mặt của vi khuẩn, sau đó có một giai đoạn tiềm
Sản xuất protein trong y học
5
ẩn của chúng khoảng mười phút trước khi các virus lây nhiễm bắt đầu được thực hiện,
cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào và phóng thích thể thực khuẩn. Alfred Hershey và
Martha Chase lý luận rằng nếu họ biết bản chất của các protein thể thực khuẩn và acid
nucleic vào đầu của quá trình xâm nhiễm, họ sẽ hiểu hơn về bản chất của những bước
đầu tiến trình.
Hình 1.4. Hershey -Chase thử nghiệm cho thấy acid nucleic là vật chất di truyền.
Hershey và Chase tăng bacteriophages T2 là vi khuẩn có khả năng truyền tải P
32
trong

môi trường (để đánh dấu phốt pho của axit nucleic) hoặc S
35
(để đánh dấu lưu huỳnh
của các protein trong các chuỗi bên của các axit amin methionine và cysteine chứa
lưu huỳnh). Họ sử dụng phóng xạ đánh dấu bacteriophages của chúng để lây nhiễm
một môi trường nuôi cấy mới của vi khuẩn không đánh dấu. Sau khi ủ bệnh ngắn, vi
khuẩn đã được thu nhận bằng cách ly tâm và đưa vào máy khuấy để tách các vi khuẩn
đi từ thể thực khuẩn gắn liền với bề mặt của nó. Họ thấy rằng, khi DNA đã được đánh
dấu, các chất đánh dấu được chuyển vào các tế bào vi khuẩn, trong khi các protein
đánh dấu vẫn được gắn phage thực khuẩn. Họ kết luận là vật chất di truyền -tức là
các vật chất truyền cho con cái - là nucleic acid.
Họ sử dụng đồng vị phóng xạ P
32
và S
35
để thực hiện theo các thành phần phân tử
của các thực khuẩn trong xâm nhiễm (Hình 1.4). Vì DNA có chứa phốt pho nhưng
không chứa lưu huỳnh, P
32
hiệu quả với DNA và bởi vì các protein có chứa chứa lưu
huỳnh nhưng không phốt pho, S
35
được đánh dấu lên protein. Nếu E. coli tế bào được
nuôi cấy trong sự hiện diện của P
32
hoặc S
35
và sau đó bị nhiễm virus T2, các tổng hợp
thực khuẩn mới sẽ có cả một lõi DNA được đánh dấu phóng xạ hoặc protein vỏ đánh
Sản xuất protein trong y học

6
dấu phóng xạ tương ứng. Những thực khuẩn có đánh dấu có thể được phân lập từ môi
trường nuôi cấy bị nhiễm bệnh và được sử dụng để lây nhiễm vi khuẩn khác không được
đánh dấu. Hershey và Chase đánh dấu các thực khuẩn T2 với một trong hai chất phóng
xạ S
35
hoặc P
32
và cho phép chúng hấp thu vi khuẩn không được đánh dấu. Các tế bào
này sau đó được tách ra bằng cách ly tâm. Các tế bào được tạo huyền phù và việc dừng
pha trộn để tách phần bên trong của thể thực khuẩn từ vi khuẩn bị nhiễm bệnh. Những
phần không chứa các vật chất di truyền, mà được nhân rộng trong các vi khuẩn chủ.
Hershey và Chase thấy rằng khoảng 80% của S
35
đánh dấu đã được gỡ bỏ từ các vi
khuẩn trong khi chỉ khoảng 20% của P
32
đánh dấu đã được gỡ bỏ. Họ kết luận rằng hầu
hết các DNA thể thực khuẩn xâm nhập vào tế bào và một dư lượng có ít nhất 80%
protein có chứa lưu huỳnh của thể thực khuẩn vẫn còn ở bề mặt tế bào. Điều này cho
thấy cùng với lúc đó Avery, MacLeod và McCarty cung cấp bằng chứng rằng DNA là
phân tử có vai trò về tính di truyền học. Hershey và Chase hơi nghi nghờ về những phát
hiện của họ và sau đó họ kết luận protein không có chức năng trong nhân thể thực khuẩn
và DNA có một số chức năng (Hershey và Chase, 1952).
1.2 Cấu trúc của acid nucleid
Như chúng ta đã thấy trong phần trên, các vật chất di truyền là DNA hay đúng
hơn axit nucleic. Trong hầu hết các sinh vật, vật chất di truyền là DNA. Tuy nhiên,
một số virus sử dụng RNA (ribonucleic acid) là những khối vật chất xây dựng cho hệ
gen của chúng. DNA và RNA là những phân tử cao phân tử được tạo thành từ chuỗi
tuyến tính của các tiểu đơn vị nucleotide. Mỗi nucleotide có ba phần: một gốc base

nitơ, 5 nguyên tử carbon, đường và một nhóm phosphate (Hình 1.5). Sự kết hợp của
các base và đường được gọi là một nucleoside, trong khi các base-phosphate- đường
được gọi là một nucleotide. Chúng bao gồm đường 2’-deoxyribose, các nucleotide của
DNA được gọi là deoxyribonucleotides, trong khi những thành phần của RNA có chứa
các đường ribose được gọi là ribonucleotides. Các base của nucleotide có thể là bao
gồm một vòng purine hoặc một pyrimidine . DNA và RNA được xây dựng từ hai vòng
purine và hai vòng pyrimidine có chứa nucleotide. Cácvòng purin của cả DNA và
RNA là như nhau bao gồm adenine (A) và guanine (G). Các vòng pyrimidine gồm
cytosine (C) cũng được tìm thấy ở cả hai loại axit nucleic, trong khi pyrimidine gồm
thymine (T) được giới hạn trong DNA, nó được thay thế bởi uracil (U) trong RNA.
Hệ thống đánh số cho nucleotide được sử dụng rộng rãi trong các văn bản này
được thể hiện trong hình 1.5. Mỗi nguyên tử carbon và nitơ trong vòng pyrimidine của
cả hai và vòng purine được đánh số tương ứng 1-6 hoặc 1-9. Các nguyên tử cacbon
của vòng đường hoặc là ribose hoặc deoxyribose được đánh số từ 1 đến 5. Như vậy,
2’-deoxyribose thiếu một nhóm hydroxyl thuộc carbon 2 của vòng đường.Các
nucleotide riêng biệt được kết nối với nhau trong cả DNA và RNA thông qua gốc
phosphate- đường kết nối từ các nhóm hydroxyl trên carbon số 3 của một nucleotide
với nhóm phosphate vào carbon số 5 trên một nucleotide khác. Xem (Hình 1.6. )Hai
nucleotide liên kết với nhau được gọi là một dinucleotide, ba được gọi là trinucleotide
và nhiều kết nối trong một chuỗi dài được gọi là một polynucleotide.
Sản xuất protein trong y học
7
Hình 1.5. Cấu trúc của các purin và pyrimidine các axit nucleic. Các base được
đánh dấu bằng màu da cam và các nhóm đường được đánh dấu bằng màu xanh. Bên
dưới là hệ thống đánh số được sử dụng trong văn bản này. Các nguyên tử của vòng
purine được đánh số từ 1 đến 9 và các thành phần của vòng pyrimidine được đánh số
từ 1 đến 6. Các nguyên tử của các đường được đánh số từ 1 đến 5.
Hình 1.6. Việc liên kết của các nucleotide như adenine và guanine của một
nucleotide. Các phosphate gắn với đường trên vòng của guanine được chỉ định là α, β
hay γ. Trong sự hình thành của các dinucleotide, pyrophosphate (đại diện cho β và γ

phosphate) là bị mất và các liên kết trong đó liên kết phosphodiester các hydroxyl 3’
Sản xuất protein trong y học
8
đến phosphate về các bon 5‘nguyên tử của đường. Các phân tử DNA luôn có một
phosphate 5’tự do và hydroxyl 3’.
Trong những năm 1950, nhà hóa học Erwin Chargaff thực hiện thí nghiệm tìm ra
cấu trúc, thành phần hóa học của axit nucleic và ông nhận ra rằng axit nucleic chứa các
thành phần tỷ lệ không bằng nhau của mỗi nucleotide. Chargaff tách DNA từ một số
sinh vật, cả hai sinh chất và nhân điển hình (Chargaff, Lipshitz và Green, 1952, và
cộng sự Chargaff, 1951; Zamenhof, Brawerman và Chargaff, 1952). Ông thủy phân
DNA vào thành phần nucleotide của nó bằng cách xử lý với axít mạnh và sau đó tách
các nucleotide bằng sắc ký giấy. Thí nghiệm của ông cho thấy các tỷ lệ tương đối của
4 base không bằng nhau nhưng cũng không phải ngẫu nhiên. Số lượng adenine (A)
(residues )dư lượng trong tất cả các mẫu DNA đã bằng với số thymine (T) dư lượng,
trong khi số lượng guanine (G) dư lượng ngang bằng với số cytosine (C) dư lượng
(Bảng 1.1). Chargaff quy định rằng đối với bất kỳ loài nào thì:
A = T và G = C
Tổng các purin = Tổng các pyrimidine
Tỷ lệ phần trăm (C + G) không nhất thiết phải bằng tỷ lệ phần trăm (A+T).
Những phát hiện này mở ra khả năng cho sự sắp xếp chính xác của các
nucleotide trong một phân tử DNA, nhưng ý nghĩa cơ bản của các T = A và G = C sự
tương quan giữa C đã không được đầy đủ nhận thấy cho đến khi cấu trúc ba chiều của
DNA được tìm ra . Như chúng ta sẽ thấy sau này, trong DNA thì A luôn cặp với T và
G luôn cặp với C.
Bảng 1.1 Nguyên tắc Chargaff’s. Tỷ lệ của các loại nucleotide được tách từ DNA
của các nguồn vi sinh vật khác nhau.Trong khi tỷ lệ của các vòng của purine: purine
và pyrimidine: pyrimidine biến thiên rộng, tỷ lệ của purine:pyrimidine được tìm thấy
là hằng số không đổi.
Giữa năm 1940 và 1953 nhiều nhà khoa học quan tâm trong việc tìm kiếm cấu
trúc của DNA. Nhiễu xạ tia X như là một phương pháp xác định cấu trúc protein đã trở

thành một kỹ thuật xác định. Nhiễu xạ tia X liên quan đến việc bắn một tia X tại một
chuỗi chính xác của các phân tử hoặc tinh thể hoặc một sợi. Khi chùm tia X va chạm
Sản xuất protein trong y học
9
vào một nguyên tử trong chuỗi đó chúng sẽ được nhiễu xạ và các chùm tia nhiễu xạ
được phát hiện như những đốm trên phim của tia X. Phân tích các mẫu nhiễu xạ thì
cho biết các thông tin về cấu trúc và hình dạng của các phân tử trong chuỗi. Đầu năm
1938 William Astbury áp dụng các kỹ thuật lên các sợi DNA. Tới năm 1947, ông đã
phát hiện một chu kỳ trong DNA dài khoảng 0,34 nm. Giữa năm 1950 và 1953,
Rosalind Franklin được cải tiến dữ liệu tia X từ các mẫu DNA tinh khiết cao. Công
việc của bà khẳng định có tính chu kỳ và cho rằng cấu trúc của DNA bao gồm một số
dạng xoắn. Franklin đã không đề xuất một mô hình cho cấu trúc của DNA. Thay vào
đó, Linus Pauling và Robert Corey sử dụng dữ liệu của Franklin, cùng với điều đó của
một người khác và đã đề xuất rằng DNA là một chuỗi xoắn ba với phosphate gần trung
tâm của trục và các base ở bên ngoài (Pauling và Corey, 1953).
1.3 Sợi xoắn kép
Franklin đã lưu ý rằng các sợi DNA có thể cho hai loại hình ảnh nhiễu xạ khác
nhau và chúng phụ thuộc vào cách chuẩn bị và lưu trữ các mẫu. Điều đầu tiên (cấu trúc
A) là các sợi tương đối mất nước, thứ hai (Cấu trúc B) đã được phổ biến trên một loạt
các ghi nhận. Bà nhận thấy rằng sự thay đổi từ cấu trúc A đến cấu trúc B được đảo
ngược, tùy thuộc vào mức độ mẫu hydrat hóa (Franklin và Gosling, 1953). Người ta
cho rằng các dạng B của DNA là quan trọng trong cấu tạo sinh học. Dạng DNA (hình
dạng A xoắn phải và hình dạng Z xoắn trái) chắc chắn vẫn tồn tại nhất định trong các
điều kiện và có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển của các tế bào.
Ví dụ, một loại của các protein liên kết đặc biệt với Z-DNA gần đây đã được mô tả
(Schwartz và cộng sự năm 2001). Ở đây chúng tôi sẽ tập trung vào các đặc tính và sự
tương tác của hình dạng cấu trúc B của DNA.
Năm 1953, James Watson và Francis Crick đã cố gắng để xây dựng mô hình
phân tử của ADN và nhận ra rằng các cấu trúc Pauling -Corey là không chính xác, một
số nguyên tử cần phải xích lại gần nhau hơn. Bằng cách kết hợp mẫu nhiễu xạ tia X

của Franklin cùng với nguyên tắc Chargaff, Watson và Crick đã đề xuất mô hình xoắn
kép vào năm 1953 (Watson và Crick, 1953a). Mô hình này thể hiện trong hình 1.7, nó
có các tính năng chủ yếu dưới đây và một trong số đó đã được cập nhật một ít từ mô
hình ban đầu trong ánh sáng của độ phân giải cao trong dữ liệu nhiễu xạ tinh thể tia X.
(A) Hai chuỗi polynucleotide dài cuộn quanh một trục trung tâm, tạo thành một
chuỗi xoắn kép hướng xoắn phải, điều này có nghĩa rằng các các vòng xoắn theo chiều
kim đồng hồ khi nhìn từ trên xuống trục xoắn ốc.
(B) Hai chuỗi được xoắn đối song song, có nghĩa là mỗi chuỗi có một hướng
xoắn đặc trưng và chạy ngược chiều nhau.
(C) Các base của cả hai chuỗi là những cấu trúc phẳng, nằm vuông góc với trục.
Chúng được "xếp chồng lên nhau", cách nhau 0,34 nm và hướng vào bên trong của
đường xoắn ốc này.
(D) Base nitơ của các sợi ngược chiều nhau được liên kết với nhau bởi liên kết
hydro.
Sản xuất protein trong y học
10
(E) Mỗi vòng xoắn hoàn chỉnh có chiều dài là 3,4 nm. Điều này có nghĩa là chỉ
có hơn 10 cặp base từ mỗi sợi (10,4 bp) tạo thành một vòng hoàn chỉnh của đường
xoắn ốc này.
(F) Theo chiều dài của một phân tử, các khe lớn thì rộng và các khe nhỏ thì hẹp
được phân biệt rõ ràng trong cùng đường xoắn ốc.
(G) Kích thước đường kính của đường xoắn được tăng gấp đôi khoảng 2 nm.
Các liên kết của các base nitơ ở trung tâm của đường xoắn ốc là tính năng quan
trọng nhất của mô hình của Watson và Crick. Tuy nhiên, một số tính năng khác cũng
rất quan trọng để hiểu được chuỗi xoắn kép.
1.3.1 Các sợi xoắn đối song song
Bản chất của các sợi xoắn đối song song của hai chuỗi polynucleotide là một
phần quan trọng của chuỗi xoắn kép. Do hạn chế của các góc liên kết của các cặp base
và phosphate , đường, các chuỗi xoắn kép có thể không được hình thành một cách dễ
dàng nếu cả hai chuỗi chạy song song cùng chiều. Một chuỗi xoắn chạy bắt đầu từ đầu

3’đến 5’ và các chuỗi khác chạy bắt đầu từ đầu 5’ đến 3’. Điều này được minh họa
trong hình 1.8.
Hình 1.7. Các Watson và Crick mô hình của DNA
Các danh pháp đầu 5’ và 3’ là bắt nguồn từ hệ thống đánh số của vòng đường mà
chúng ta đã thấy trong hình 1.5. Theo quy ước, trình tự DNA được viết theo hướng 5’
đến 3’. Điều này có nghĩa là một chuỗi DNA duy nhất bắt đầu với một nhóm
phosphate tự do trên carbon 5 của một vòng deoxyribose. Nucleotide bổ sung được
tham gia vào chuỗi thông qua liên kết phosphodiester, mà liên kết các nhóm hydroxyl
trên nguyên tử cacbon 3 của một đường với các phosphate trên nguyên tử cacbon 5 của
một đường liền kề. Chuỗi kết thúc bằng một nhóm hydroxyl tự do trên các nguyên tử
cacbon 3 của đường cuối cùng.
Sản xuất protein trong y học
11
Hình 1.8. Các cặp base của DNA liên kết và bổ sung. Hai chuỗi xoắn này, mũi
tên trong hướng 3 đến 5, được xoắn đối sog song. Các cặp base trên một sợi xoắn
được bổ sung cho nhau trên sợi đối diện, một cặp base A luôn luôn cặp với T và cặp
base G luôn luôn cặp với C.
1.3.2 Cặp Base và cách sắp xếp
Các base của cả hai chuỗi DNA là những cấu trúc phẳng nằm gần vuông góc với
trục xoắn ốc. Các base của chính nó được xếp chồng lên nhau trong mỗi chuỗi. Sắp
xếp này là minh họa tốt nhất qua sự kiểm tra của một mô hình mà máy tính đưa ra để
kiểm tra độ phân giải cao dữ liệu của nhiễu xạ tia X (hình 1.9). Nó có thể được lưu ý
rằng không phải tất cả các cặp base là đều vuông góc với trục xoắn và một số vị trí
xoắn cho thấy các cặp base của các vòng purine và pyrimidine không nằm bằng phẳng
với nhau nhưng chúng xoắn đối với mỗi vị trí khác, như các cánh trong cùng một cánh
quạt (Dickerson, 1983). Các liên kết của một vòng purine (A hoặc G) với một
pyrimidine (T, C) trong vòng xoắn này là quan trọng đối với sự hoàn chỉnh của các
đường xoắn ốc.
Sản xuất protein trong y học
12

Hình 1.9. Máy tính tạo ra mô hình của DNA. Cấu trúc của dạng DNA sợi B gấp
đôi bắt nguồn từ nhiễu xạ tia X có độ phân giải cao của các tinh thể DNA. Nguyên tử
oxy được tô màu đỏ, phosphorus là màu cam, màu trắng carbon và nitơ là màu xanh.
Độ dài liên tục của vòng purine-pyrimidine ghép nối sẽ bị phá vỡ nếu xảy ra các
cặp purine-purine (quá lớn) hoặc pyrimidine-pyrimidine (quá nhỏ). Các cặp
pyrimidine- purine được bổ sung cho nhau và hai sợi của một phân tử ADN đơn lẻ bổ
sung cho nhau. Như vậy, nếu trình tự 5’-ATGATCAGTACG-3’ xảy ra trên một sợi
AND thì các sợi khác phải có trình tự 5’-CGTACTGATCAT-3’. Hai chuỗi được bổ
sung cho nhau:
Chúng ta sẽ thấy trong nhiều chương sau, những ý tưởng của sự phân bổ giữa hai
sợi DNA là cơ sở của nhiều thí nghiệm trong kỹ thuật di truyền. Các liên kết của hai
sợi DNA rất cụ thể, chính xác phù hợp giữa hai sợi DNA. Giống như những liên kết
ở trên có tính ổn định cao và dễ dàng hình thành xoắn. Như chúng ta sẽ thấy sau này,
hai sợi DNA mà không bổ sung cho nhau nhưng có vẫn còn ở mức bổ sung cao vẫn
giữ lại khả năng tương tác với nhau.
Sản xuất protein trong y học
13
1.3.3 Các thông tin có được truyền đến nhau hay không khi mà chúng ta phá vở
các sợi xoắn kép ra xa nhau
Làm thế nào để thông tin có thể tổ chức trong chuỗi DNA được đọc mà không
cần phải làm sáng tỏ các chuỗi xoắn kép? Bản chất bất biến của liên kết giữa đường -
phosphate dường như không thể bị phá vở các trình tự cơ bản DNA. Các khe dọc theo
trục xoắn ốc đã cung cấp một cơ chế mà trong đó các base có thể được phân biệt với
nhau. Như chúng ta có thể thấy trong hình 1.7
Hình 1.10. Sự tương tác giữa các gen ức chế-λ của vi khuẩn λ và DNA. Máy tính
tạo ra mô hình của sự tương tác giữa DNA, chúng được thể hiện bằng cách sắp xếp
màu như trong hình 1.9 và gen ức chế λ, có α-xoắn được thể hiện trong màu xanh lá
cây và được liên kết bởi các axit amin mà không thông qua cấu trúc thứ. Hai phân tử
của gen ức chế λ (một dimer) tương tác với một phân đoạn bp 17 của-DNA chuỗi xoắn
kép. (B) chuỗi xoắn 5 của gen ức chế λ. Mỗi monomer gen ức chế của DNA ràng buộc

miền λ có sợi xoắn 5, đánh số 1-5 từ cuối amin của protein. Đường xoắn 3 nằm trong
rãnh lớn và các chuỗi bên (không hiển thị) mở rộng đến các cạnh của các rãnh lớn,
tiếp xúc với các cơ sở DNA. Hình dạng xoắn 2 và 3 xoắn cuộn ràng buộc motif DNA
được tìm thấy trong nhiều loại protein liên kết ADN. Sợi xoắn 3 là chuỗi xoắn nhận
dạng và có hình dạng chuỗi đặc trưng trình tự ADN trong các khe lớn, trong khi xoắn
2 là chuỗi xoắn ổn định tương tác không đặc trưng với các trục chính của sợi DNA
để cung cấp ổn định cho các protein tương tác DNA.
DNA bao gồm các khe được xếp chủ yếu và một số khe nhỏ dọc theo trục của nó.
Đây là kết quả của các liên kết glycosidic có đính kèm một cặp base với đường trong
vòng của nó, chúng không nằm trực tiếp đối diện nhau qua trục xoắn ốc. Kết quả là
trục chính của các chuỗi xoắn kép liên kết giữa đường- phosphate không đều nhau dọc
theo trục xoắn và các khe hình thành giữa các trục chính không bằng nhau. Các khe
lớn rộng (~ 0,22 nm) và nông, trong khi các khe nhỏ hẹp (~ 0,12 nm) và sâu. Các
nhóm chính bao gồm chủ yếu là nitơ và oxy nguyên tử của mỗi cặp base.
Ngược lại, khe nhỏ được che lấp bởi nguyên tử nitơ và oxy nói chung hoặc là các
vòng purines hoặc pyrimidine. Như vậy, khả năng tương tác các rãnh lớn cho cho thấy
Sản xuất protein trong y học
14
nó phụ thuộc nhiều vào trình tự cơ bản của các rãnh nhỏ. Phát hiện này đã dẫn tới sự
suy đoán rằng trình tự ADN cụ thể nhận ra các protein liên kết DNA bằng cách hình
thành liên kết hydro chủ yếu giữa các nhóm cụ thể ở vị trí bên trong và dọc theo các
đường rãnh lớn. Một trong những cách phổ biến nhất trong đó các protein có thể nhận
ra các chuỗi ADN cụ thể là bằng cách chèn các protein xoắn α vào các rãnh chính của
ADN. Các chuỗi xoắn α, ban đầu được mặc nhiên công nhận bởi Pauling và Corey
năm 1951. Nó là một protein cấu trúc thứ cấp, trong đó một vòng xoắn phải được hình
thành bởi các axit amin trên một chuỗi polypeptide (Pauling và cộng sự năm 1951).
Mỗi axit amin trong chuỗi xoắn chiếm một khoảng cách 0,15 nm, và có 3,6 amino acid
của các chuỗi xoắn (xem phụ lục 1). Đường kính của trục polypeptide trong một xoắn
α là khoảng 0,5 nm, tuy nhiên acid amin chuỗi có kích thước xa trục xoắn ốc. Kết quả
là protein xoắn α có thể để phù hợp với hầu như chính xác vào các rãnh chính DNA

sợi đôi. Acid amin kích thước chuỗi đi từ xoắn α có thể hình thành liên kết hydro với
các cặp base của ADN trong chính các rãnh. Các loại protein-DNA tương tác được thể
hiện trong hình 1.10.
1.3.4 Liên kết hydrogen
Các mô hình Watson và Crick cấu trúc DNA dự đoán rằng hai chuỗi
polynucleotide được giữ với nhau bằng liên kết hydro không cộng hóa trị hơn là tương
tác cộng hóa trị. Điều này đặt ra một số câu hỏi quan trọng như liên kết hydro là gì và
nó đủ mạnh để duy trì tính toàn vẹn của chuỗi xoắn kép?
Để giải quyết câu hỏi đầu tiên, một liên kết hydro là một sự tương tác tĩnh điện
yếu giữa liên kết cộng hóa trị của nguyên tử hydro và một nguyên tử khác với một cặp
điện tử không có ái lực, một đặc tính của liên kết cộng hóa trị giữa nguyên tử oxy và
nitơ. Các nguyên tử hiđrô giả định tích điện dương, trong khi các cặp điện tử không có
ái lực giả định tích điện âm. Các nguyên tử này tích điện trái dấu thì hút nhau bằng
liên kết hóa học yếu.
Nói chung, một liên kết hóa học là một lực hấp dẫn để giữ các nguyên tử với
nhau. Sự hình thành ngẫu nhiên của một liên kết giữa hai nguyên tử tự do liên quan
đến việc giải phóng năng lượng nội bộ của các nguyên tử không liên kết và chuyển đổi
sang một hình thức năng lượng, ví dụ như nhiệt. Lực của một liên kết cụ thể được đo
bằng lượng năng lượng giải phóng theo sự hình thành của liên kết. Các liên kết mạnh
hơn, năng lượng nhiều hơn được giải phóng. Sự thay đổi năng lượng (

G) đi kèm với
sự hình thành liên kết được sử dụng để mô tả lực của một liên kết. Giá trị của

G
được tính theo phương trình sau đây:

G = −RT ln Keq
Trong đó R là hằng số khí (8,314 JK-1 mol
-1

), T là nhiệt độ tuyệt đối và ln Keq là
log tự nhiên của các hằng số cân bằng giữa các liên kết hoặc không liên kết các phân
tử với nhau.Liên kết cộng hóa trị ngắn (0,095 nm) và rất mạnh, với

G giá trị trong
khoảng -100 đến -500 kJ mol
-1
. Liên kết hydrogen là dài hơn (khoảng 0,3 nm) và là
yếu hơn nhiều với giá trị

G trong phạm vi từ -10 đến-30 kJ mol
-1
.
Sản xuất protein trong y học
15
Khi tìm thấy trong các chuỗi xoắn kép, hình thức adenine hình thành 2 liên kết
hyđrô với thymine, và các hình thức cytosine ba liên kết hydro với guanine (xem hình
1.8). Trong khi một liên kết hydro duy nhất giữa chính nó là rất yếu 2500 hay như vậy
liên kết hydro mà giữ lại với nhau mỗi kilobase DNA cung cấp mức độ bất thường của
sự ổn định để xoắn. Điều này cũng có nghĩa là, như chúng ta sẽ thấy dưới đây và trong
các chương sau, có một cặp base AT là kém ổn định hơn về mặt nhiệt động lực học
hơn là một cặp cơ sở GC.
1.4 Biến tính thuận nghịch của DNA
Mạch đôi DNA là một phân tử rất bền. Trong một mẫu mất nước, nó có thể tồn
tại gần như nguyên vẹn trong hàng ngàn năm. Những đoạn DNA đã được phân lập từ
xác ướp Ai Cập cách đây khoảng 3.000 năm. Trong những mẫu này, chuỗi xoắn kép
vẫn còn nguyên vẹn, nhưng DNA đã bị đứt gãy. Hiện tại một chuổi gồm hàng triệu
nucleotide được ghép lại kề nhau thì tạo được một đoạn DNA ngắn, dài khoảng 500-
1000 (bp), với một số mối liên kết đồng hóa trị tạo thành khung phosphodiester bị gãy
vụn.

Tác dụng chủ yếu của liên kết không cộng hóa trị là giữ chặt hai sợi xoắn kép,
đồng thời nó cũng làm cho sợi đôi DNA có thể bị tách ra (biến tính) đơn giản bằng
cách nung nóng. Nhiệt năng được cung cấp cho một đoạn DNA bằng cách nung nóng
sẽ phá vỡ liên kết hydro, nhưng sẽ không ảnh hưởng đến các liên kết đồng hóa trị mà
giữ mỗi chuỗi với nhau (Lin và Chargaff, 1966). Việc tách hai sợi DNA trong một cấu
trúc xoắn được kèm theo những thay đổi về tính chất vật lý của DNA. Một trong
những thay đổi này là sự hập thụ tia UV của DNA. DNA hấp thụ ánh sáng ở bước
sóng 260 nm do sự hiện diện của các liên kết đôi và liên kết đơn xen kẽ trong các
bases DNA (hình 1,5). Mỗi một bases của bốn loại nucleotid có phổ hấp thụ khác nhau
không nhiều, và quang phổ hấp thụ tổng thể của DNA là trung bình cộng của chúng.
Một dung dịch DNA tinh khiết được nhìn thấy trong suốt bằng mắt, và sự hấp thu trở
nên không thể đo được đến khoảng 320 nm. Giảm bước sóng dần xuống thì có một
đỉnh hấp thụ vào khoảng 260 nm, tiếp theo được giảm xuống giữa 220 và 230, và sau
đó dung dịch trở nên mờ đi về bản chất trong tia cực tím. Một dung dịch sợi đôi, DNA
tự nhiên,với nồng độ là 0,05 mg/ml, có độ hấp thụ (hoặc mật độ quang học, OD)
khoảng 1,0 at ở đỉnh cao 260nm.
Khi một chuỗi xoắn DNA được biến tính để trở thành sợi đơn duy nhất, ví dụ
bằng cách nung nóng, tăng hấp thụ. Cùng một nồng độ 0,05 mg/ml dung dịch sợi đôi
DNA mà chúng tôi sử dụng trên sẽ có một mức hấp thụ là 1,5 khi ở dạng sợi đơn. Đây
là số liệu hấp thụ thường được thể hiện dưới dạng hiển thị dưới đây:
1.0 A
260nm
sợi đôi DNA = 50 μg/mL
1.0 A
260nm
sợi đơn DNA = 33 μg/mL
Sự gia tăng hấp thụ như sợi DNA kép trở thành sợi đơn, gọi là hiệu ứng
hyperchromic (Thomas, 1993), cho thấy sự tương tác giữa các điện tử lưỡng cực trong
việc xếp chồng các bases sợi đôi xoắn kép và được trình bày sơ lược trong hình 1.11.
Việc xếp chồng của các cặp bases trong sợi đôi DNA có tác dụng làm giảm sự hấp thu

của riêng nucleotide do sự tương tác cạnh tranh của các cặp bases liền kề trong ngăn
Sản xuất protein trong y học
16
xếp. Ở dạng sợi đơn, không có cạnh tranh như vậy xảy ra và kết quả là DNA sợi đơn
hấp thụ ánh sáng với mức độ lớn hơn so với sợ đôi của nó.
Hình 1.11. Ảnh hưởng của việc nung nóng sợi đôi DNA. Như là một phân tử
DNA sợi kép được đốt nóng trên nhiệt độ môi trường xung quanh, các liên kết hydro
không cộng hóa trị giữ hai sợi với nhau bắt đầu bị phá vỡ. Điều này được đi kèm với
sự gia tăng hấp thụ ở 260 nm. Ở nhiệt độ cao trên 90
0
C hai sợi DNA sẽ hoàn toàn
tách biệt nhau. Quá trình này có thể thuận nghịch. Nếu nhiệt độ giảm tương đối chậm,
hai sợi DNA bổ sung sẽ sửa đổi để tạo ra một phân tử DNA sợi kép kết hợp một cách
chính xác. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nửa số sợi được tách
Khi một mẫu DNA được đun nóng, cấu trúc xoắn bắt đầu tách ra, trong một quá
trình đôi khi được gọi là nóng chảy. Cặp bases A-T chỉ có hai liên kết hyđrô giữ chúng
lại với nhau, các vùng DNA với mật độ A và T cao sẽ tách ra trước. Khi nhiệt độ tiếp
tục tăng, và tăng cao liên tục thì DNA sẽ mang tích chất của một sợi đơn tự nhiên, cho
đến khi hai sợi tách ra hoàn toàn. Nhiệt độ mà tại đó một nửa là DNA sợi đơn được gọi
là nhiệt độ nóng chảy (Tm). Nhiệt độ nóng chảy của toàn bộ phân tử DNA thì không
giống nhau, và được quyết định dựa trên chiều dài của DNA, và tỉ lệ các cặp bases G-
C và A-T. Thông thường những phân tử DNA ngắn có giá trị T
m
thấp, như bao gồm tỉ
lệ cao của các cặp bases A-T. Nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA dài được tính toán
dựa theo phương trình:
T
m
= 16.5(log[Na+]) + 0.41(%GC) + 81.5
0

C
Ở đây [Na
+
] là nồng độ của các ion natri trong các dung dịch DNA và (% GC) là
tỷ lệ phần trăm của G-C còn lại trong mạch đôi. Vì vậy, đối với một phân tử DNA có
chứa 40% GC còn lại (điển hình cho một bộ gen động vật có vú) trong một dung dịch
NaCl có nồng độ 50 mM NaCl, nhiệt độ nóng chảy là 76,4
0
C. Như chúng ta sẽ thấy
trong chương sau, các phân tử DNA ngắn (15-30 bases) thường được sử dụng trong
Sản xuất protein trong y học
17
các thí nghiệm kỹ thuật di truyền. Vì những trình tự bổ sung ngắn, phương trình trên
không còn đúng nữa, và theo dự toán (đôi khi được gọi là quy tắc Wallace) được sử
dụng để xác định Tm (Wallace và cộng sự năm 1979.,):
Tm = 2(AT) + 4(GC)
Trong đó, cứ mỗi cặp bases A-T ở cấu trúc mạch kép đóng góp 2
0
C ổn định của
sợi đôi xoắn kép, trong khi mỗi cặp G-C đóng góp 4
0
C ổn định. Do đó, một
oligonucleotide của 20 bases của sợi đơn DNA có chứa năm chất thừa, còn lại 6 T, 3 C
và 6 G sẽ có một nhiệt độ ủ bổ sung vào chuỗi ADN xấp xỉ 2 (11) + 4 (9) = 58
0
C.
Tầm quan trọng của nhiệt độ ủ sẽ trở nên rõ ràng khi chúng ta nhìn vào phản ứng dây
chuyền polymerase (PCR) và lai tạo acid nucleic trong các chương sau.
Việc làm nóng các chuỗi DNA xoắn kép để tạo ra sợi đơn là cả một quá trình
ngược. DNA sợi đơn được thực hiện bằng cách đun nóng duplex sẽ thay đổi khi nhiệt

độ giảm. Khi nhiệt độ giảm xuống, năng lượng nhiệt đã được sử dụng để phá vỡ các
liên kết hydro giữa các sợi bị giảm theo, và va chạm ngẫu nhiên giữa các sợi sẽ giúp
các sợi gắn lại theo nguyên tắc bổ sung. Nhiệt năng cung cấp giảm tương đối chậm (1-
2
0
C / giây), sự tạo thành mạch kép sẽ hoàn tất. Hai sợi đơn phân tử DNA bổ sung sẽ
đến với nhau và sửa đổi chính xác mạch kép (duplex) ban đầu trước khi mẫu được đun
nóng. Nếu nhiệt độ giảm xuống nhanh chóng, ví dụ như nhúng chìm một mẫu DNA tại
94
0
C trực tiếp vào nước đá, sự điều chỉnh các cặp bases sẽ không xảy ra và các DNA
sẽ được giữ lại ở dạng một đơn tương đối.
1.5 Cấu trúc của DNA trong các tế bào
Các loại axit nucleic được sử dụng để hình thành hệ gen của sinh vật phụ thuộc
vào chính sinh vật đó. Ví dụ, virus có bộ gen gồm hai sợi DNA kép, sợi DNA đơn
hoặc RNA, tùy thuộc vào loại virus. Nhiễm sắc thể của hầu hết các sinh vật nhân
chuẩn bao gồm các sợi đôi DNA. Các bộ gen của các sinh vật prokaryote thường bao
gồm một phân tử DNA vòng tròn. Nghĩa là, thay vì phải có đầu 5’ tự do và đầu kết
thúc 3’, các đầu được nối với nhau để tạo thành một vòng liên tục của chuỗi xoắn kép
ADN. Một số nhiễm sắc thể bổ sung phân tử DNA, gọi là plasmid, được tìm thấy trong
các tế bào prokaryote. Như chúng ta sẽ thấy trong chương 3, hiểu biết như thế nào về
sự phân chia các tế bào với những plasmids có vai trò hoạt động then chốt trong sinh
học phân tử và kỹ thuật di truyền tiên tiến. Phân tử DNA plasmid thường đóng vòng
của sợi đơn hay sợi đôi DNA.Khi nhìn vào cấu trúc của DNA được trình bày trong
hình 1.7, nó rất dễ nhằm lẫn là chuỗi xoắn kép, đúng hơn là một chất rắn thiếu linh
hoạt hơn. Tuy nhiên, không chỉ đơn giảm là vậy. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử
của các phân tử DNA (hình 1.12) cho thấy DNA có dạng chuỗi nhiều hơn dạng que, và
bao xung quanh chính nó để tạo thành một loạt các cấu trúc bất thường. Bên trong một
tế bào nhân chuẩn, DNA được liên kết với một loạt các protein. Ví dụ, protein cần
thiết cho nhân bản của nó, sao chép nó vào RNA và bao bọc của nó trong tế bào. Nhiều

protein cuốn quanh DNA của chính nó, hoặc bằng cách nhốt hoặc bẻ cong phân tử
DNA. Đối với các phân tử DNA thẳng ngắn, loại hạn chế này không phải là một vấn đề
nghiêm trọng. Điểm stress được đặt trong một phần của một phân tử DNA, ví dụ, chuỗi
xoắn kép có thể được thuyên giảm bởi sự tháo xoắn một phần khác của DNA.
Sản xuất protein trong y học
18
Hình 1.12. Hình ảnh của sợi DNA kép được tìm ra bởi kính hiển vi điện tử. DNA
vòng phân lập từ polyoma virus cho thấy nhiều crossings của sợi DNA đôi, chỉ ra rằng
DNA là xoắn cực đại. Sao chép từ Vinograd và cộng sự (1965)
Đầu kết thúc tự do của đoạn DNA dài cho phép quay tương đối tự do quanh sợi
DNA. Đối với các phân tử DNA dạng vòng. Tuy những stress có thể rất khó để chứng
minh. Khi những đầu tận cùng của DNA không tự do, nó không thể lơi lỏng ra và
chống lại sự xoắn tại một nơi nào đó trong phân tử. Kết quả của các phân tử DNA
xoắn trong sự hình thành của DNA xoắn cực
đại (Hình 1,13).
Năm 1965 Jerome Vinograd và các đồng
nghiệp cho rằng các phân tử DNA vòng kín có
thể chấp nhận một hình thức xoắn tròn
'(Vinograd và cộng sự năm 1965.,). Như một
hình thức sẽ có kết quả nếu, trước khi tham gia
kết thúc của một sợi đôi DNA dài thành một
vòng tròn kép kín, một đầu được xoắn tương
đối khác để mở đầu cho một số khuynh hướng
trong phân tử. Như cuộn xoắn DNA của chính
nó được gọi là supercoil. Supercoil chỉ có thể
được hình thành hoặc phá vỡ từ một phân tử
DNA vòng tròn kín bằng cách phá vỡ ít nhất
một trong những khung xương phosphodiester.
Hình 1.13. Sự hình thành của DNA xoắn
cực đại. Một phân tử DNA vòng không chứa supercoil được hiển thị. Hai nửa của phân

tử này đã được đánh dấu màu đỏ và màu xanh để giúp dễ phân biệt. Một lần xoắn trong
phân tử sẽ dẫn đến việc hình thành một cực dương (+) và supercoils cực âm(-). Quá
trình này không dẫn đến một thay đổi số lượng kết nối. Tuy nhiên, khung xương DNA bị
Sản xuất protein trong y học
19
phá vỡ và sau đó được đóng kín lại sau khi một đoạn của DNA đã bị rạn nứt, sau đó là
số liên kết được giảm thành 2. Phân tử bây giờ là không còn xoắn cực đại.
Mức xoắn cực đại trong một phân tử DNA đặc trưng có thể được mô tả bởi số
lượng kết nối của nó (Lc). Con số này tương ứng với số vòng đôi xoắn trong phân tử
tuyến tính ban đầu. Quá trình đưa sự xoắn cực đại vào một phân tử DNA làm giảm
hoặc tăng số vòng xoắn ốc bị mắc kẹt khi vòng tròn được hình thành, và kết quả trong
những thay đổi trong các số liên kết với các loài có vòng khép kín cuối cùng. Sự khác
biệt liên kết (Lc) chỉ thị của các mức độ của cấu trúc xoắn cực đại trong một phân tử
cần quan tâm (Hình 1,13). Các độc giả quan tâm cần tham khảo các tài liệu phổ biến
cho một mô tả đầy đủ hơn của DNA cấu trúc liên kết và các vấn đề liên kết của nó
(Bates và Maxwell, 1993).
Vòng DNA khép kín được phân lập từ tế bào prokaryote thì không có cấu trúc
xoắn cực đại. Nghĩa là, DNA tương đối không được tốt so với trạng thái tuyến tính của
nó. Mặc dù tế bào Eukaryotic có chứa các phân tử DNA tuyến tính, độ dài của DNA
trong nhiễm sắc thể có nghĩa là những điểm hạn chế trong một phần của phân tử DNA
không thể dễ dàng làm giảm bằng cách chuyển sự căng thẳng đến một trong những
đoạn kết thúc. Tương tự thích hợp ở đây là để suy nghĩ về cách bạn sẽ mở gu t một
ô ng nươ c vườn xoắn. Bạn sẽ tháo xoắn bằng cách chuyển xoắn đến hết đường ống.
Cuối cùng, sự quay của ống chính nó sẽ dẫn đến việc giải phóng cho nút thắt này. Đây
là loại hành động để tháo một xoắn hoặc xoắn trong một phân tử DNA tuyến tính sẽ
tương đối đơn giản nếu DNA bị ngắn. Chiều dài phân tử DNA nhiễm sắc thể, tuy
nhiên, gặp một số khó khăn mà làm cho loại hình này tách ra hạn chế không thực tế.
Chiều dài của DNA có liên quan sẽ làm cho nó khó khăn để di chuyển xoắn từ giữa
DNA để kết thúc, và sự kết hợp của các DNA với các protein sẽ tạo nên một rào cản
đối với loại hình chuyển động này. Trở lại với ô ng nươ c, một cách khác để loại bỏ

các nút thắt (mặc dù ít thực tế hơn trong vườn) các đường ống sẽ được cắt để tạo ra kết
thúc mới gần các đoạn của đoạn xoắn. Các đường ống sau đó có thể là không xoắn tại
địa vị trí và chuẩn bị mẫu để loại bỏ các xoắn và cải cách các đường ống. Đó là trong
thời trang còn đối với việc giải quyết các tế bào với các chủng trong DNA. Họ có các
enzym, được gọi là topoisomerases DNA, làm cho các vết cắt trong các phân tử DNA
đơn hoặc sợi đôi phá vỡ khung phosphodiester để cho phép các vị trí và sự tháo xoắn
của chuỗi DNA. Các enzyme topoisomerase sau đó đánh dấu khung xương DNA để
cải cách các phân tử DNA.
1.6. Thể nhân eukaryote
Mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta chứa một lượng lớn DNA. Những nhiễm sắc thể
khác nhau của bộ gen người chứa khoảng 3.2 x 10
9
cặp base của DNA. Vì chúng ta là
những sinh vật lưỡng bội, có hai bộ nhiễm sắc thể, tổng số lượng DNA lớn nhất trong
toàn bộ tế bào của chúng ta là 6.4 x 10
9
cặp base. Tại 0.33 nm cặp base (hình 1.7),
tương ứng với toàn bộ chiều dài ở trên khoảng 2.1 m. Kết hợp của các protein bên
ngoài quấn quanh DNA tạo nhân. Trong kỳ giảm phân, các vật liệu di truyền (cùng với
các protein liên kết) tương đối duỗi thẳng và phân tán khắp trong nhân giống như
Sản xuất protein trong y học
20
nhiễm sắc thể. Khi bắt đầu nguyên phân, nhiễm sắc thể co lại rất nhiều, trong kỳ trước
có thể nhận biết nhiễm sắc thể. Độ dài của chúng co lại khoảng 10 000 lần.
Các vật chất di truyền khi phân lập từ vi khuẩn và vurus bao gồm sợi DNA và
RNA hầu như không có protein. Tuy nhiên, ở sinh vật nhân chuẩn, số lượng đáng kể
của protein kết hợp với DNA để hình thành hình dáng chất nhiễm sắc thể. Quan sát
bằng kính hiển vi điện tử ta thấy rằng cấu trúc sợi nhiễm sắc thể được kết hợp các
mảng tuyến tính của các hạt hình cầu. Các hạt này xuất hiện thường xuyên dọc theo
trục của một nhiễm sắc thể và giống các hạt trên chuỗi. Các hạt, ban đầu gọi là v –

bodies (olins và olins, 1974), ngày nay gọi là thể nhân.
Digestion của sợi nhiễm sắc thể với những nuclease cố định, chẳng hạn như phân
tử nuclease, số lượng các đoạn DNA dài khoảng chừng 200 bp, hoặc nhiều hơn nữa
(Wingert và Von Hoppel, 1968). Nếu digestion của DNA nhiễm sắc thể là ngẫu nhiên,
sau đó các các đoạn có kích thước khác nhau được tạo ra. Do đó điều này đã chứng
minh rằng DNA của nhiễm sắc thể được che chở (bảo vệ) từ sự phân cắt của các
enzyme. Từ DNA chúng sẽ bắt đầu và cắt bởi nulease, và tại hai hay nhiều vị trí được
nối lại với nhau. Các protein kết hợp với ADN trong nhiễm sắc thể được chia thành cơ
bản, histon tích điện dương và ít tích điện dương khi không histones. Protein kết hợp
với DNA, việc sử dụng histone có vai trò cấu trúc quan trọng nhất. Histone chứa một
lượng lớn điện tích dương axit amin lysine và arginine (xem phụ lục1), làm cho nó có
thể liên kết thông qua tương tác tĩnh điện với nhóm phosphate tích điện âm của các
nucleotide DNA. Có năm loại protein histone khác nhau: H1, H2A, H2B, H3 và H4.
Một hạt nhân bao gồm hai bản sao của mỗi histone H2A, H2B, H3 và H4 để tạo thành
một octamer xung quanh histone khoảng 150 cặp base của DNA được bao bọc trong
một chuỗi xoắn kép trái, hình thành khoảng 1,7 vòng xoắn trong nhân (hình 1.14). Gần
đây, để hiểu biết về cấu trúc của các thể nhân, vào năm 1997 Richmond và các đồng
nghiệp đã có thể làm sáng tỏ được cấu trúc tinh thể tia X của phức hợp DNA thể nhân
ở cấp độ phân tử. Tại cấp độ phân tử này, hầu hết các nguyên tử của mỗi histone đều
có thể nhìn thấy, và các chiều chuỗi xoắn DNA rõ ràng vì nó bao quanh các octamer
histone có thể được nhìn thấy (hình 1.15). Cấu trúc ở cấp độ cao phân tử cho biết rằng
amino kết thúc cuối cùng của một số các histon nhô ra từ octamer các và project đi từ
nhân. Ý nghĩa của các amino cuối cùng ở doạn cuối thì có khả năng tương tác với các
thể nhân bên cạnh tạo contacts (sự tương tác, mối quan hệ). Chúng sẽ cạnh tranh
signficance các histone cuối cùng ở xa hơn nữa khi look của biểu hiện gen.
Mở rộng nghiên cứu về cấu trúc của nhân đã cung cấp cơ sở để dự đoán sự hình
thành các sợi chất nhiễm sắc trong nhân tế bào, và chúng cuộn thành các nhiễm sắc thể
mitotic. Mô hình này được minh họa trong hình 1.16. Có 2 nm chuỗi DNA xoắn kép
cuộn ban đầu thành một lõi trong nhân khoảng đường kính 10 nm. Khoảng 200 cặp
base của mỗi DNA liên kết hạt nhân để hình thành "hạt trên dây” có thể nhìn thấy hình

ảnh trong kính hiển vi. Histone H1, nó không phải là một phần của lõi octamer, có thể
được nằm ở vị trí mà DNA hình thành và rời khỏi nhân và có thể chức năng để xác
dịnh các DNA trên thể nhân.
Sản xuất protein trong y học
21
Hình 1.14. DNA bao xung quanh lõi nhân. thể nhân gồm hai phân tử của histone
H4, H3, H2A và H2B. Trong các hình đại diện ở đây chỉ là một monomer của H2A và
H2B có thể quan sát được, các monome khác được đặt ở mặt sau của octamer này.
Gần 150 bp của DNA quấn quanh lõi octamer, tạo thành khoảng hai lần.
Hình 1.15. Cấu trúc của phức hợp DNA-nhân được làm sáng tỏ bằng cách
crystallography X-quang ở cấp độ phân tử. Trong cả hai hình trên, các sợi của DNA
(thể hiện trong màu xanh lá cây và màu da cam) bọc quanh octamer histone. Các lõi
protein là hầu như chỉ nằm bên trong, ngoại trừ phần đuôi histone amino cuối cùng
được mở rộng ra từ cái phức tạp. Điều này được cung cấp bởi Tim Richmond (ETH
Zurich) và được tái bản với sự cho phép từ thiên nhiên (Luger và cộng sự, 1997) bản
quyền (1997) Các nhà xuất bản Macmillan Ltd.
Sự hình thành của nhân đại diện cho mức độ bao quanh, như vậy chiều dài DNA
được giảm xuống còn khoảng một phần ba chiều dài ban đầu. Tuy nhiên, trong hạt nhân,
chất nhiễm sắc không tồn tại trong hình thức duỗi thẳng. Thay vào đó, trong sợi nhiễm
Sản xuất protein trong y học
22
sắc 10 nm đã dược xoắn cuộn từ một sợi dài 30 nm, sợi nhiễm sắc thề ban đầu đó được
gọi là solenoid. Không hiểu rỏ các quá trình chuyển đổi giữa sợi 10 nm và cac1 sợi 30
nm biểu hiện cho đặc tính sinh lý hoặc cho dù điều đó chỉ xảy ra trong ống nghiệm xem
như là kết quả của sự thay đổi nồng độ muối. Tuy nhiên, các sợi 30 nm, gồm nhiều nhân
được kết hợp (đóng gói) chặt chẽ với nhau, nhưng các định hướng chính xác và chi tiết
của cấu trúc không rõ ràng. Gần đây, người ta có thể chấp nhận rằng trong một sợi 30
nm compact xoắn zig-zag mẫu với khoảng bốn nhân cho mỗi 10 nm (Beard và Schlick,
2001). Sự hình thành các sợi 30 nm tạo ra một cấp độ thứ hai của việc đóng gói, khi đó
chiều dài tổng thể của DNA được giảm một nửa so với ban đầu

Hình 1.16. Packaging của DNA trong nhiễm sắc thể nhân chuẩn. Các chuỗi xoắn
kép DNA 2 nm được gói thành nucleosome như minh họa trong hình 1.15. Tại một số
điểm histone H1 ở trong phức tạp, có thể ở DNA / điểm xuất từ nhân. Các thể nhân có
thể hình thành sợi dài 10 nm trong nhân. Các thể nhân có thể tiếp tục kết hợp để tạo
thành một sợi nm 30. tạo ra đường zig-zag trong nhân. Các sợi 30 nm sau đó được bọc
tạo một proteins caffold, chúng có thể gấp cuộn để hình thành các nhiễm sắc thể trong
phân bào, được quan sát dưới kính hiển vi điện tử.
1.7. Sự sao chép DNA
Vào năm 1953, Watson và Crick đã hoàn thành bài viết nổi tiếng của mình về cơ
chế sao vật chất di truyền. Từ việc sắp xếp và tính chất của các base mà mỗi mạch của
các chuỗi xoắn kép ADN có thể làm một khuôn để tổng hợp của một mạch bổ sung
(hình 1.17). Họ cho rằng nếu chuỗi xoắn kép đã unwound, mỗi nucleotide dc tạo ra từ
Sản xuất protein trong y học
23
nột mạch gốc ban đầu theo nguyên tắc bổ sung sẽ có các nucleotide giống với các
nucleotide của mạch còn còn lại (Watson và Crick, 1953b). Như vậy, mỗi mạch DNA
gốc có thể làm một khuôn để tổng hợp một mạch DNA mới, vì thế có thể dẫn đến việc
hình thành hai mạch đôi DNA giống như nhau. Trong mô hình này, DNA mới được
tổng hợp bao gồm một mạch gốc ban đầu và một sợi mới được tổng hợp theo nguyên
tắc bổ sung, do đó, quá trình được gọi là sao chép semi-conservative.
Hình 1.17. Các bản sao của mạch đôi DNA theo đề nghị của Watson và Crick.
Việc tách mạch DNA gốc xoắn kép (màu đen), mỗi sợi có thể làm một khuôn mẫu cho
sự tổng hợp hình thành một chuỗi ADN mới (màu xanh). Điều này được gọi là sao
chép semi-conservative, phân tử DNA mới gồm một chuỗi cũ và một sợi mới.
Hai phương thức khác của bản sao này cũng dựa vào các sợi gốc ban đầu co
nhiệm vụ làm mẫu cho sự tổng hợp DNA mới. Trong nhân bản conservative, những
đường xoắn ốc của mạch gốc ban đầu sẽ được tháo xoắn, một chuỗi xoắn mới tổng
hợp sẽ được hình thành theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung. Hai mạch DNA mới tổng hợp
sẽ kết hợp với nhau sẽ tạo thành một đường xoắn ốc và xoắn của mạch gốc sẽ được
sửa đổi. Trong cơ chế khác, gọi là nhân bản dispersive, mạch DNA gốc từ một sợi có

thể được tách ra và kết hợp một trong các mới sợi tổng hợp, tạo ra những mạch hỗn
hợp giữa ADN mới và cũ.
Matthew Meselson và Franklin Stahl đã cung cấp bằng chứng thực nghiệm cho
rằng nhân bản semi-conservative đã được sử dụng bởi vi khuẩn từ việc sản xuất các
phân tử DNA mới (Meselson và Stahl, 1958). Các kết quả thí nghiệm của tác giả được
mô tả trong hình 1,18. Ông đã đã tăng trưởng các tế bào E. coli cho nhiều thế hệ trong
một môi trường, trong đó các nguồn nitơ duy nhất dẫn xuất của amoni clorua
(15NH4Cl). Điều này có nghĩa rằng DNA của những tế bào E. coli, ở
15
N được kết
Sản xuất protein trong y học
24
hợp với thành phần của base, nặng hơn so với ADN từ các tế bào phát triển về bình
thường amoni clorua (
14
NH
4
Cl). Các dạng bình thường và nặng của DNA có thể được
tách sau khi ly tâm, bằng gradient nồng độ của caesium chloride. Trong điều kiện đó,
các DNA nặng hơn sẽ đi xa hơn các ADN nhẹ hơn. Điều này giúp theo dõi các cấp độ
của mỗi nitơ đồng vị trong việc nha6 bản DNA của vi khuẩn như nó đã được sao chép.
Meselson và Stahl đã đưa vi khuẩn có chứa DNA nặng và chuyển chúng thành phương
pháp di truyền có chứa amoni clorua vào ADN bình thường và sau đó cô lập mỗi thế
hệ kế tiếp. Sau một vòng duy nhất của quá trình sao chép DNA trên phương pháp di
truyền bình thường, hiện nay ông tìm thấy rằng DNA của vi khuẩn có mật độ trung
gian giữa các vị trí dự kiến chứa toàn bộ
15
N và
14
N DNA. Kết quả này phù hợp với

nhân bản semi-conservative, nhưng không phải với nhân bản conservative. Sau khi tế
bào phên chia, Meselson và Stahl đã quan sát sự hiện diện của hai mạch của các mật
độ ban đầu khác nhau tương ứng với vị trí của một loài
14
N/
15
N DNA và lần thứ hai,
các bằng cường độ ánh sáng, tương ứng với vị trí dự kiến của
14
N/
14
N DNA. Chu kỳ
tiếp theo của quá trình nhân đôi DNA dẫn đến một tỷ lệ tăng các
14
N/
13
N mạch DNA.
Các thí nghiệm mô tả ở trên cho thấy rằng nhân bản conservative không xảy ra,
nhưng không thể loại trừ nhân rộng dispersive. Tuy nhiên, Meselson và Stahl, bác bỏ
cơ chế sao chép này trong việc tách các mạch riêng lẻ của DNA sao chép. Họ đun
nóng DNA (hình 1.11) và được cho thấy rằng có sợi riêng lẽ hoặc cường độ
15
N hoặc
14
N chứa DNA sợi đơn, nhưng không phải là của một cường độ trung bình mà có thể
đã được kết hợp nếu một sợi DNA mới tổng hợp có chứa các mạch hỗn hợp của mạch
gốc và mạch vừa được tổng hợp trình tự. Sao chép semi-conservative có cũng được
biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn (Taylor, Woods và Hughes, 1957), và bây giờ được
coi như là cơ chế chung cho nhân đôi DNA.