Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men trong lên men kombucha từ trà thái nguyên (LV01302)

B GIÁO DO
I HM HÀ NI 2
o0o











Chuyên ngành: Sinh thái hc
Mã s: 60 42 01 20

LUC

ng dn khoa h Kim Nhung




i




iáo,


PGS. TS.          

Tôi








này.


Học viên






ii





            
tài khác.




Học viên















iii


 i
 ii
 iii

 vii
 viii
 x
M U 1
1. Lý do ch tài 1
2. Mu 2
3. Nhim v nghiên cu 2
ng và phm vi nghiên cu 2
 2
i c tài 3
NG QUAN TÀI LIU 4
c v trà 4
1.1.1. Ngun gc cây chè 4
1.1.2. Thc vt hc 4
1.1.3. Phân loi sn phm trà 5
n xu- Thái
Nguyên 5
1.1.4.1. Phân loi sn phm trà xanh Thái Nguyên 6
1.1.4.2. n xut trà xanh 7
1.1.5. Giá tr và thành phn hóa hc c 7
1.2. Gii thiu v kombucha 9
c v kombucha 9
m vi sinh vt trong kombucha 11
iv

1.2.2.1 Acetobacter 11
1.2.2.2. Ging vi khun lên men lactic 12
1.2.2.3. Nm men 13
ch ca quá trình lên men kombucha 17
ng nm men trong kombucha 19

1.3. Tình hình nghiên cu kombucha hin nay 21
1.3.1. Trên th gii 21
1.3.2. Các nghiên cu kombucha  Vit Nam 22
U 24
ng nghiên cu 24
2.1.1. Nguyên liu 24
2.1.2. Hóa cht, dng c thí nghim 24
2.1.2.1. Hóa cht 24
2.1.2.2. Dng c thí nghim 24
2.1.3. Các long 24
u 25
 25
p nm men và quá trình quan sát hình
thái trên tiêu bn nhum gram 25
nh s ng t bào vi sinh vt 26
2.2.1.3. Bo qun chng ging 27
nh hot lc lên men 27
nh kh t lng 27
 28
 cn 28
2.2.nh pH 28
ng nm men 29
v

 29
 ng nm men da trên kh  dng
ngun carbon 29
 ng nm men da trên kh  dng
ngun nito 29
 ng nm men du kin nuôi cy 30

m quan 30
2.2.5. X lý s liu bng thng kê toán hc 32
T QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 34
3.1. Phân lp chng nm men có kh  trà Thái
Nguyên 34
3.2. Tuyn chn chúng nm men có kh  trà
Thái Nguyên 36
3.2.1. Hot lc lên men 37
3.2.2. Kh u cn 38
3.2.3. Th nghim kh t lng 39
3.2.4. Chng cm quan cc lên men t 9 chng 39
3.2.5. Nghiên cu hình dng t bào ca 3 chng nm menT
1
, T
17
và T
29
41
ng ca ba chng nm men T
1
, T
17
và T
29
41
 ng nm men da vào kh  dng các ngun
ng 43
3.4.1. Kh  dng ngun carbon khác nhau 45
3.4.2. Kh  dng ngun  48
ng ca nMgSO

4
.7H
2
O 51
3.5.1. ng cu 53
3.5.2. ng ca nhi lên men ti quá trình lên men 54
KT LUN VÀ KIN NGH 57
vi

1. KT LUN 57
2. KIN NGH 57
DANH MC CÔNG TRÌNH CA TÁC GI 58
TÀI LIU THAM KHO 59
vii




CLCQ
MT
Nxb
TCVN

TCN


Nhà 




viii



Bng 1.1.
Thành phn hóa hc ch yu c
8
Bng 2.1.
Các ch  cm quan ca kombucha
31
Bng 2.2.
H s quan trng ca tng ch 
32
Bng 2.3.

Bnh mng sn ph
32
Bng 3.1.
c ca nm men trong các
mu phân l

35
Bng 3.2.
ng khí CO
2
gii phóng sau 7 ngày lên men ca 9
chng n

37
Bng 3.3.
Kh  các n cn khác nhau ca 9
chng nm me 

38
Bng 3.4.
Kh t lng khác nhau ca 9 chng nm men
39
Bng 3.5.
Chng cm quan ca các chng nm men
40
Bng 3.6.

ngtháipháttrinca3 chngnmmen
T
1,

T
17,
T
29

42

Bng 3.7.
ng ca ngun quá trình lên men
44
8.
        
 
2
,  

1,
T
17
và T
29



45
Bng 3.9.


1
, T

17
và T
29


47

 
 
2
,         

1,
T
17
và T
29



48
ix

11.
(NH
4
)
2
SO
4



1
, T
17
và T
29



50
Bng 3.12.
Kh    a chng T
1,
T
17
và T
291
trên môi
ng MgSO
4
.7H
2
O khác nhau

51

men kombucha
53
Bng 3.14.

ng ca nhi ti quá trình lên men
55




















x



Hình 1.1.
 
5
Hình 1.2.

V 
6
Hình 1.3.
Mt s thit b c trong ch bin trà xanh Thái Nguyên.
7
Hình 1.4.
Trà 
10
Hình 1.5.
 phân ging trong t bào n
17
Hình 3.1.
T bào nm men trên kính hin vi quang h phóng
i 1000 ln
35
Hình 3.2.
nh chp khun lc nng th
36
Hình 3.3.
nh chp khun lc nng thch nghiêng
36
Hình 3.4.
T bào nm men chp kính hi  n t quét SEM-
S4800 v i 10.000 ln

41
Hình 3.5.
 th biu di    ng ca 3 chng nm
menT
1

, T
17
và T
29


42
Hình 3.6.
Trà kombucha lên men  các ngun trà xanh Thái Nguyên
44






1


Trà kombucha là loi thc ung lên men trong dung dng, có
tác dng b ng cho sc khc s dng rng rãi  mt s c trên
th gii t i Pháp gi là Champignon De Longuc Vie
(ni Nht g Quc gi là
thy hoài sâm, Nga gi là nc sn xut do quá trình lên
men dch chit trà nh nm trà, nó là mt hn hp phc tp gia nm men và
vi khun. Nh quá trình lên men trong trà kombucha có chu ethanol,
các loi vi sinh vt khác nhau, các acid amin, acid h  
polyphenol, vitamin C và mng ln vitamin nhóm B
c s dng làm thc ung gii khát  
Âu, Nht Bn, Trung Quc , t rt lâu. Trên th giu công trình

nghiên cu v trà kombucha, kt qu  u cho thy trong dch trà
kombucha có cha cht kháng sinh (dit khun và kìm hãm vi khun) có tác
dng chng li mt s vi sinh vt gây bnh. Theo nghiên cu ca Neil
Campbell  Brown, trà kombucha có tác dng: gi, ci thin chc
ng h thng min da bnh, h tr tiêu hóa
Thành phn vi sinh vt trong kombucha có vai trò vô cùng quan trng
trong quá trình lên men.  u cng s c
nm men chuyn Acetobacter s bin
u thành acid. Nu thiu vi khun hoc nm men thì quá trình lên men s
không din ra.  Vit Nam vic s dng trà kombucha còn khá mi m, các
công trình nghiên cu v trà kombucha vn còn khiêm tn nht là các nghiên
cu v nm men. Do   hi    quá trình lên men kombucha
chúng tôi quy nh ch   Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men
trong lên men kombucha từ trà Thái Nguyên.
2

             
kombucha

3.1. Phân l
3.2.             
Nguyên. lên men kombucha
.
ombucha



3.5. 



4.1.1.Mẫu thực vật
- Cây chè
-
-
4.1.2. Mẫu vi sinh vật
 ombucha lên men.



5
5có 
              
3


5.2.     b       


5.3. PhcS dm giác c tìm
hiu mô t ng các tính cht cm quan vn có ca thc phm.
5.4. Xsikc. Chúng tôi x lý các kt qu thng kê
thí nghim theo mt s  trung bình cng, trung bình bình
ch, sai s i din ca trung bình cng, h s bin thiên

u tiên  Vit Nam nghiên cu v ng nm menda
trên kh u kin nuôi cy trong lên men kombucha t
trà Thái Nguyên.

4



1.1.1. Nguồn gốc cây chè
 - nhà thc vt hc Tht tên
khoa hc cho cây chè là Thea Sinensis, chia thành Thea bochea (chè 
Thea viridis (chè xanh), và ngun gc ca cây chè là  Trung Quc. 1823, R.
Bruce (Anh) phát hin ra nhng rng chè di cao 17-20m  vùng Sadiya
thuc Assam - ,  Min, Ving ngun
sông Mê Kông và Vân Nam  Trung Quc. Djemukhatze, vin hàn lâm khoa
hc Liên Xô (1961 - 1977) khnh ngun gc cây chè có  Vit Nam.
Thc t hin nay phc cho rng nguyên sn ca
cây chè là c mt vùng t Assam  sang Min, Vân Nam - Trung
Quc, Vit Nam, Thái Lan. T        ng phía
Nam và mc, trung tâm là vùng Vân Nam  Trung Quu
kin khí hu  [1], [10].
1.1.2. Thực vật học
Tên khoa hc ca cây chè là Camellia sinensis (L) Kuntze (hay có tên
Thea sinensis L.) (1935  Hi ngh khoa hc quc t v thc vt)
Trong h thng phân loi thc vt hc x
Ngành:
Ht kín
- Angiospermae
Lp:
Hai lá mm
- Dicotyledonae
B:
Chè
- Theales
H:
Chè

- Theaceae
Chi:
Chè
- Camellia (Thea)
Loài:
Camellia (Thea) sinensis

5
m thc vt
- R: h r gm có r tr (r cc), r bên và r hp thu.
- Thân và cành cây chè: cc phân ra làm nhiu cp, cành cp I,
cp II, cp III Thân và cành chè to nên khung tán chè.
- Lá chè: lá mc cách, mt có mt lá, hình dc thay
i tùy ging. Lá  gân lá và hình d
  t trong nhng ch tiêu  phân bit ging. Trên mt cành chè có
nhng loi lá: lá vy c, lá cá, lá tht.
- n non ca mc hình thành t các
mm dinh ng gm có tôm và hai hoc ba lá non.
- Hoa chè: thung tính, tràng 5  7 cánh, màu trng hoc pht
hc giao phn là ch yu, t th phn ch chim 2  3%.
- Qu chèng mc thành tu có màu xanh ca
chi, sau màu nâu cha ht. Ht bên trong có th  gieo trng [1], [16].
1.1.3. Phân loại sản phẩm trà
Trà là sn ph bin ca lá chè. Trên th ng có rt nhiu
các loi sn phm trà khác nhau, mi lou có nhng tính ch
riêng, khác nhau v ngo      c   
, trà vàng [1].
1.1.4. Đặc điểm và phương pháp sản xuất trà xanh Tân Cương - Thái Nguyên

 Thái Nguyên
6
Thái Nguyên có nhiu dãy núi cao chng Bc - a
hình t yu d cao t 30 m  100m
so vi mc bin, ri rác mt s nh tròn cao khong 150m. Xã Tân
ch yu là t t phù sa ít
c b  c bit thích hp vi cây chè.   c
a vùng nhi i m, có hai mùa rõ rt là mùa nóng và mùa lnh.
     t khong 1600  1800mm, nhi  khong
22
0
C  23
0
C,  i cao trên 900  1000m nhi trung bình ch
i 18
0
C t khong 82  84%.
Vm khí hu king ln
n h vi sinh vt có trên b mt lá chè làm cho sn ph c
i enzyme và nm men có mt  lá chè r t khong
20
0
C  25
0
C, do vy m nm men khá cao so vi chè  mt s vùng khác.

Phân loi sn phc m thu hái, gm
các loi sau:
- 
- Trà tôm: g

- c sn: g
- Trà ph liu



Hình 1.2. V trí lá chè
7
1.1.4.2
Quy trình ch bin trà xanh bng thit b i




Máy sao

Máy vò
Hình 1.3. Mt s thit b c trong ch bin trà xanh Thái Nguyên




1.1.5. Giá trị và thành phần hóa học của lá chè tươi
Trà xanh có tác du, trm cm, tinh thn minh mn sng
khoái. Ngoài ra ung trà xanh có th phòng ngu tr ng, chng
8
li mt s by, t lc bit trà xanh là mt ngun
t nhiên ca cht chng oxy hóa, sát khun làm gim nhim trùng [1], [10]
Bng 1.1. Thành phn hóa hc ch yu c
Thành phn
ng (% cht khô)

Flavonoid
+ Catechin (C)
+ Gallocatechin (GC)
+ Epicatechin (EC)
+ Epigallocatechin (EGC)
+ Epicatechingallate (ECG)
+ Epigallocatechingallate (EGCG)
19  34
1  2
3  4
1  3
3  6
3  6
8  12
Caffeine
3  5
Acid h
0,5  0,6
ng (glucose, fructose, raffinose, stachyose )
4  5
Ch
7  20
Protein và acid amin
15  20
Pectin
1  2
Lipid
3  6
Acid ha
3  6

Khoáng
5  6
Sc t (chlorophill, carotenoid)
0,5  0,6
Enzyme

Ngun: Tng hp các tài liu v cây chè, 2010
Thành phn các cht hóa h mt mt tham gia trc
tip vào s hình thành chng trà sn phMt
khác quan tr bii hóa h bii ca tannin,
 to nên các tính chn phm.Thành
phn hóa hc ca lá chè rng và phong phú v s ng các chng
tha mt ng ln các cht có giá tr sinh hc cao mà có tính
chn phm trà. Các nhóm chp cht
phenol thc vt, các hp cht ch và h enzyme có sn trong trà[1].
9

1.2.1. Sơ lược về kombucha
Kombucha là mt lo ung lên men nh vi sinh vt t dch chi
 ng
n t u? Cho ti nay có rt nhiu ý kin khác nhau v
dám khnh chc chn ngun gc ca kombucha.
Tuy nhiên,     thuyt v s  i ca kombucha. Mt trong
nhng gi thuyt hin vào trii nhà Tn  Trung
Quc khoc ma s bt tt
gi thuyt khác li cho thy, kombucha là mt loc do mt bác s
i Hàn Qu  Inyoko ca Nht Bn
c các chin binh Samurai s dng nhc chin
u. i rng kombucha xut phát t Nht B
là tên ca mt loi rong bi

trà rong bin. Tuy vy gi thuyt này không mang tính thuyt phc. Mt s ít
thì cho rng kombucha có ngun gc t Ai Cp c i. Li vit rng
y bình trong các cuc chinh chin ca Thành
i ca ông vào cui th k u th k 13. Kombucha
và thng là hai món không th thiu trong các ba v i Hãn này
i ca mình.  các ý kin cho rng kombucha có
ngun gc t Trung Quc bt ngun t
thiên nhiên vi m du tiên trong y thut. T ch
a sang châu Âu bu  Ukraine và Nga vào cui th k 19.
Kombucha tr thành thc ung ph bin  n khi vic
ng tr i chin Th gii th
II xy ra. Tuy nhiên, sau chi dc phc
hi và lan rng. Trong mt vài thp k i sinh và tr nên
ph bin  c Úc và Hoa Kc bit là k t n nay [43].
10
Trà kombucha 
 là SCOBY (symbiotic culture of bacteria and yeast)  

Acetobacter và 
     oxy
hóa.           
gluconic, acid lactic, acid usnic, acid oxalic, các vitamin nhóm B (B
1,
B
2,
B
3,
B
6,
B

12),


Acetobacter Acetobacter xylinum



 [47].



Hình 1.4. Trà kombucha

 

 


11







 [44].
1.2.2. Đặc điểm vi sinh vật trong kombucha

Acetobacter 

1.2.2.1 Acetobacter
Vi khun Acetobacter (vi khun acetic)là tác nhân chính ca quá trình
lên men acetic. Ging vi khun Acetobacter thuch Pseudomonadaceae,
phân b rng rãi trong t nhiên và có th d dàng tìm thy các vi khun này t
không khí t, nc, lng thc thc phm, gim, ru, bia, hoa qu
    t t  20 loài vi khun có kh 
men acetic thuc nhóm Acetobacter [14].
V hình dng t bào vi khun Acetobacter là nhng trc khun hình que
hay hình elip, hình ch, hình cu hoc có hình bán nguyc t bào thay
i tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-    ng riêng r hoc xp thành
chui, có hoc không có tiêm mao, sng và phát triu kin hiu khí
bt buc hóa d ng h.  ng dch th vi
khun Acetobacter có s hình thành màng trên mt thoáng, màng to thành có
 dày mm ca các loi.
Hic khong trên 20 loài có kh o màng, tuy nhiên
trong phm vi nghiên cu ca mình chúng tôi ch quan tâm ti mt s loài vi
12
khun Acetobacter sau:
Acetobacter xylinum: to màng cellulose dày và chc.
Acetobacter orleanoe: to màng mng, chc.
Acetobacter pasteurianum: to màng khô và nhn nheo.
Acetobactersuboxydans: to màng mng và d tan rã.
Acetobacter curvum: sinh acid acetic n    o màng
không chc chn.
ng và phát trin, nhu cng ca vi khun
Acetobacter rt phong phú. Ngun carbon có th c cung cp t các hp cht
u etylic và các acid hn Acetobacter có th s dng các
mui amon làm ngun cung c và phân gii pepton. Mt s 
acid pantothenic và các cht khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S
trng và phát trin ca Acetobacterch t

phân nc mng rt tt cho
s phát trin ca vi khun Acetobacter. Mt s loài Acetobacter còn tng hp
c vitamin B
1
, vitamin B
2
ng sorbose (dùng trong
công nghip sn xuAcetobacter xylinum có th tng hp
c si cellulose ging si bông[5], [47].
1.2.2.2.  vi k lên men lactic
Vi khun lên men lactic thuc h Lactobacterium (Lactobacillaceae), là
nhng vi khun Gng và không sinh bào t, không cha các
men hô h vi khun lactic rng gm
nhiu ging khác nhau, t bào ca chúng có th hình cu hoc hình que, hô hp
tùy tin. Chúng có kh u lo
không có kh i glucid phc tp và tinh bt. Các vi khun
này rt c Nhi
thích hp cho quá trình lên men t 15÷50
0
C. Tuy nhiên mi loài có khong
13
nhit  thích hp khác nhau, nu nhit  ln hn 80
0
C vi khun lactic b
tiêu dit hoàn toàn [4], [14], [47].

*Hình thái và cấu tạo tế bào
T bào nm men thng có dng hình cu, ovan, elip, hình tr, hình
qu  kích thct i ln: ng kính khong 7m, chiu dài:
812m. Hình dng và kích thc t bào thay i, không ng u  các loài

khác nhau,  các la tui khác nhau và iu kin nuôi cy khác nhau.
Nm men thuc nhóm sinh vt nhân chun n bào, t bào nm men
có thành phn và cu to khá phc tp gm thành t bào, màng nguyên sinh
cht, t bào cht, ty th, riboxom, nhân, không bào và các ht d tr
- Thành t bào: thành phn chính là glucan và mannan chim khong
90%, phn còn li là protein, lipid và mt s thành phn nh 
- Màng nguyên sinh cht: là mt lp màng mng bao quanh t bào cht
gm các chp cht phc t
- T bào cht: dng th ng nht, ch 
ca t , nhân, riboxom, không bào, các ht d trn
cu to ch yc, protit, gluxit, lipit và các mui khoáng, enzyme
- Ty th: cu to t khong 30% cht béo, 60  70% protein, ngoài ra còn
cha các enzyme thc hin các phn ng oxy hóa vòng ATC, rt ít acid nucleic.
- Nhân t bào: là cu t bt bin ca nm men, thành phn n ca nhân
là ADN mang thông tin di truyn. Thành phn nucleotit trong ADN ph thuc
tng loài, nhng loài nm men gn nhau có thành ph
- Không bào, các th vùi và các cht d tr trong t bào[15].
* Phân loại nấm men
Có rt nhiu cách phân loi, nm men ch yu gm hai lp là nm men
tht (Ascomyces) và nm men gi (Fungiimporfecti) [4], [47].
14
+ Lp nm men tht (Ascomyces): phn ln nm men dùng trong công
nghip thuc lp Ascomyces  s thuc ging Saccharomyces; ging
Schizosaccharomyces ging Endomyces.
+ Lp nm men gi (Fungi imporfecti) gm: Crrytococus (toscula,
tornlopsis); Mycoderma; Candida; Rhodotorula.
* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
T bào nm men có th sc lp.Quá trình sng ca chúng gm các
m di truyn.
ng

  ng carbon: các hp cht h      i
ng và dn xuu, acid h là ngung
carbon ca nng là ch yu. Nm men có th s
dng nhiu nguuc
+ Dinh dng nit:  nm men khôc nitrat mà ch
có kh  dng các mui amon  dng hòa tan, có th là m hu c
hoc vô . Ngu hu c thng dùng là acid amin, pepton, amid, urê,
. m vô c là các mui amon kh nitrat, sulfa
ng các chng: các vitamin, các purin và prymidin là
nhân t n ca nm men. Nhóm nm men không sinh sc t
ng s dng các vitamin nhóm B, nhóm sinh sc t  cn tiamin, acid
paraaminobenzoic. Ngoài ra nm men cn các cht khoáng: P, S, Mg, Fe, Mn
- Cch vn chuyn các chng qua màng t bào
Các chc nm men s dng s phc v cho quá
ng hoc là cung cng cn thii sng ca t
bào. Các ch c vn chuyn qua thành t bào theo hai con
n.