Bước đầu phát triển bộ KIT chẩn đoán nhanh bệnh lao bằng kỹ thuật polymerase chain reaction

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
• • •
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH
HỌC
DƯƠNG THỊ LOAN
BƯỚC ĐÀU PHÁT TRIỂN Bộ KIT CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH LAO BẢNG KỸ THUẬT
POLYMERASE CHAIN REACTION
LUẬN VĂN THẠC sĩ KHOA HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số : 60- 42- 80
Người hướng dẫn khoa học TS. TRẦN NHÂN DŨNG
Năm 200
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
9LỜI BẢN QUYÈN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn. Các số
liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất
kỳ luận văn nào trước đây.
Người hướng dẫn Tác giả luậnvăn
TS. Trần Nhân Dũng Dương Thị LoanLuận văn đính kèm theo đây, với tên đề tài:
“Bước đầu phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh bệnh lao bằng kỹ thuật polymerase
Chain reactỉon ” do Dương Thị Loan thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận
văn thông qua.
Thư ký ủy viên
Phản biện 1 Phản biện 2
Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Chủ tịch hội đồn
gLỜI CẢM TẠ
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Trần Nhân Dũng người đã dành nhiều thời
gian, hướng dẫn tận tình, động viên, cung cấp nhiều tài liệu, kiến thức quý báu, tạo mọi
điều kiện thuận lợi và tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Tôi muốn gửi lòi cám ơn đến tất cả các thầy cô giảng dạy, các anh, chị, em của Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học cần thơ, đặc biệt là các em
Đỗ Tấn Khang, Trần Yăn Bé Năm, Nguyễn Thị Giáng Đan đã giúp đỡ tôi ữong suốt thời
gian thực hiện đề tài.
về phía trường Đại học Y Dược cần thơ, tập thể Bộ môn sinh lý bệnh - miễn dịch Khoa Y
đã có sự giúp đỡ, tạo cơ hội và cung cấp mọi thứ cần thiết cũng như luôn động viên,
khích lệ tinh thần, để tôi có thể thực hiện và hoàn tất quyển luận văn.
Tôi vô cùng biết ơn Ba mẹ hai bên, chồng, con và tất cả anh chị em trong gia đình đã yêu
thương, luôn luôn thông cảm, cùng chia sẽ những khó khăn, tạo mọi thuận lợi cho tôi yên
tâm, có điều kiện tốt nhất để hoàn thành và đạt được kết quả tốt trong suốt quá trình học
tập của mình.
Yà cuối cùng là lời cám ơn đến tập thể lớp cao học công nghệ sinh học K13.
TÓM LƯỢC
•
Tóm lược Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có khả năng lây lan trong cộng đồng rất
cao, phát hiện sớm vi khuẩn lao là điều chủ yểu trong chiến dịch kiểm soát bệnh lao, việc
điều trị cho bệnh nhân sẽ đạt kết quả khả quan nếu như xét nghiệm phát hiện nhanh vỉ
khuẩn lao có độ chính xác và độ nhạy đáng tin cậy, phản ứng PCR là thử nghiệm khả thi,
đáp ứng được các yêu cầu như: nhanh, nhạy và chính xác. Mặc dù vậy, cho đến nay kỹ
thuật PCR dùng để chẩn đoán bệnh lao vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi, vì thế chúng
tôi thực hiện đề tài này nhằm bước đầu phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh bệnh lao tại
TP cần thơ. Mau được thu nhận từ bệnh viện lao và bệnh phổi TP cần thơ, được bảo
quản và xử lý. ADN được ly trích bằng phương pháp tốt nhất để tránh ngoại nhiễm. Chọn
ba cặp mồi trong sổ rất nhiều các cặp mồi đã được công bố, các thông số trong công
thức của phản ứng PCR đã được điều chỉnh. Theo kết quả nghiên cứu, bước đầu chúng
tôi đã phát triển được bộ kit nhằm góp phần trong chẩn đoán bệnh lao, trong số 127 mẫu

thu được chúng tôi phát hiện được 40,9 % so với soi trực tiếp là 0 % và tương đương với
phương pháp nuôi cấy (được xem như tiêu chuẩn vàng) là 39,37%, và kết quả này gần
như phù hợp với bộ kit thương mại.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Từ khóa: bệnh lao, phản ứng chuỗi, đoạn mồi, độ nhạy, độ đặc hiệu
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
.ABSTRACT
Abstract. Preliminary develop a tuberculosis diagnose kit by the use
of polymerase chain reaction (PCR) method at Can Tho City
Tuberculosis is a highly contagious disease. Early detection on infected patient is
of most importance in the control of tuberculosis. Benefit in therapy may be
improved if a fast and reliable test could be developed. Polymerase chain reaction
(PCR), in principle, is a rapid, cost effective test to be used in the detection of
Mycobacterium tuberculosis. Although there are many PCR methods for this disease
were published, but there are no standard PCR method have been introduced. In this
study, Can Tho Hospital for Tuberculosis was selected to collect samples. Approriate
method was used to treat samples to avoid contamination. Selected method of DNA
extraction was used to obtain best result. Three primers among many primers have
been introduced which were used to test in this study. Different parameters that
influence PCR were modified to obtain high specificity and high sensitivity. To

validate the kit, there are 127 samples were collected from the hospital. Result
showed that PCR test was much better than direct observing under microscope.
Among 127 samples, there was 40,9 % samples were positive while 0 % samples was
observed under microscope. PCR test as good as culturing test (a golden method),
39,37% samples were positive.
Keywords: tuberculosis, polymerase chain reaction, primer, sensitivity, specificity
Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcX Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcX Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
.MỤC LỤC
DANH SÁCH BẢNG
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcX Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcX Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ
Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
TỪ VIẾT TẮT
AFB
acid fast bacilli

BK
bacilli de koch.
BCG
Bacillus Calmette-Guerin
IS 6110
insertion sequence 6110
NA-carrier
nucleotide acid carrier
PCR
polymerase chain reaction
Tuberculin PPD
tuberculin purified protein
derivative
WHO
world heath organization
ZN
Ziehl-Neelsen
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
TCYTTG
Tổ chức y tế thế giới
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
CHƯƠNGI GIỚI THIỆU
•
Bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất trên thế giới

HIV/AĨDS giết 3 triệu người mỗi năm, bệnh lao giết 2 triệu người và bệnh sốt rét giết
1 triệu người ( ) . Hơn 100 năm trước đây, Robert Koch
đã chứng minh được lao là bệnh nhiễm khuẩn khi ông tìm thấy trong đàm người bị
bệnh lao phổi có một loại trực khuẩn hình que kháng cồn, kháng toan được gọi là trực
khuẩn Koch (bacilie de Koch:viết tắt là BK).
Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành
một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước
đang phát triển. Ở các nước này, người dân có mức thu nhập thấp nên sẽ có tỷ lệ
nhiễm lao và mắc lao cao hơn những nước phát triển, nghèo đói và suy dinh dưỡng
làm giảm sức đề kháng của cơ thể là nguyên nhân quan trọng và chủ yếu làm cho
người ta dễ mắc lao ( ỵ
Do vậy việc phát hiện, chẩn đoán sớm và chính xác bệnh lao là yêu cầu bức xúc của
cả xã hội. Để phát triển các kỹ thuật chẩn đoán bệnh lao là điều tất yếu và cần thiết.
Hiện nay chỉ có một công ty ở TP.HỒ Chí Minh đã sản xuất bộ kit
1
dùng để chẩn
đoán bệnh lao bằng kỹ thuật PCR và vói xu hướng ngày nay PCR được xem là qui
trình khá chuẩn góp phần trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh, vừa nhanh chóng,
vừa chính xác và là kỹ thuật xét nghiệm không thể thiếu khi cần chẩn đoán các bệnh
truyền nhiễm ở các phòng xét nghiệm hiện đại (Phạm Hùng Vân. 1996). Tuy nhiên kỹ
thuật này đòi hỏi các phòng xét nghiệm phải được trang bị những thiết bị phù hợp,
với sự phát triển của xã hội hiện nay và trong tương lai gần sẽ có rất nhiều thành phố
1 Là hỗn hợp hóa chất được làm sẳn để xử lý mẫu, trích ADN và PCR master mix.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
trong vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có khả năng để trang bị những loại

thiết bị này. Như vậy, nhu cầu về kit xét nghiệm cho các bệnh nhiễm trùng sẽ rất lớn
và qua đó cho thấy rằng, bộ kit cần được phát triển nhằm có thể theo dõi về tính hiệu
lực một cách thường xuyên trước khi đưa vào qui trình xét nghiệm, để làm được điều
đó bộ kit phải được nghiên cứu và sản xuất tại cho, vói những yêu cầu như trên,
chúng tôi thực hiện đề tài “ Bước đầu phát triển bộ kỉt chẩn đoán nhanh bệnh lao
bằng kỹ thuật polymerase Chain reaction”
Mục tiêu của đề tài:
- Chọn cặp mồi (primers) thích hợp và sử dụng các hóa chất cần thiết để tạo nên bộ
kit hổ trợ cho việc xét nghiệm bệnh lao.
- So sánh bộ kit thử nghiệm chẩn đoán bệnh lao với các xét nghiệm hiện hành.
So sánh kết quả của bộ kit thử nghiệm vói bộ kit được pha chế sẳn (bộ kit thương
mại)
.CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giói và tại Việt Nam
2.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gỉói
Theo con số thống kê của WHO (Tổ chức Y tế thế giới:TCYTTG) có khoảng 2 tỷ
người trên thế giới bị nhiễm bệnh lao. Các chuyên gia cho rằng cần có nhiều loại
thuốc trị lao mới cũng như nhiều phương pháp chẩn đoán mới nhằm phát hiện sớm
bệnh lao đặc biệt là các chủng lao kháng thuốc. Hiện nay bệnh lao vẫn là một trong
số các bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trong các bệnh nhiễm trùng trên thế
giới, nhất là ở các nước đang phát triển trong đó có nước ta. Theo thông báo của
TCYTTG mỗi năm có thêm 8-9 triệu người mắc lao mới và 98% số người chết do lao
thuộc các nước đang phát triển.
Năm 1993, TCYTTG đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

hiểm họa của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc, tỷ lệ điều trị thành công trên
toàn cầu đạt 82%, nhưng ước tính tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân. Như vậy,
còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng
đồng, hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc về khu vực Đông-Nam Châu Á. Mức
độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tói thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con
người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao
sẽ mất trung hình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia
đình. Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu
nhập. Bệnh lao đã tác động mạnh tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm
lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm (Trung tâm truyền thông giáo
dục sức khỏe-BỘ Y tế).
Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của Ngân
hàng thế giới ở Washington D.c với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc
gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm
nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối vói sự phát triển kinh tế xã hội. Bệnh lao là bệnh
của người nghèo, lây lan nhanh ữong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ
sinh và dinh dưỡng kém. Trên 98% số người chết do lao trên toàn cầu thuộc các nước
có thu nhập vừa và thấp, 75 % số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14-55, là tuổi
làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời. Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo
đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển. Với chủ đề ' Bệnh lao có ở một
nơi thì sẽ có ở khắp mọi nơi' mà “Chương trình chống lao thế giới đã đưa ra cho năm
2007” trong điều kiện kinh tế, xã hội của đất nước, các địa phương đang đà phát triển
mạnh mẽ sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho công tác phòng chống bệnh lao. Để thực hiện
có hiệu quả mục tiêu trên cần phải tiếp tục củng cố mạng lưới phòng chống bệnh lao;
tăng cường công tác phát hiện bệnh nhân lao tại tuyến quận, huyện, thị xã và các
tuyến y tế cơ sở; hoạt động giáo dục truyền thông cần thường xuyên hom trên các
phương tiện thông tin đại chúng; đào tạo cho các cán bộ và cung cấp đầy đủ thuốc
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công

nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
men, hóa chất, dụng cụ Bảo đảm tốt công tác phát hiện, quản lý và điều trị, thực
hiện tốt các biện pháp ngăn ngừa, phòng bệnh một cách hợp lý và an toàn.
( ) .
2.1.2. Tình hình bệnh Lao ở Việt Nam
Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Việt Nam đứng thứ
13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG., 2004). Trong khu
vực Tây - Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung quốc và Philipinnes về
số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm.
Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu,
công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao
kháng thuốc và Lao/HIV, nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương
trình phòng chống lao thành một trong những chương trình y tế Quốc gia ừọng điểm.
Cùng với sự đầu tư phát triển các Chương tình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và
Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị
cho Chương trình phòng chống lao. Ban chỉ đạo chương trình chống lao và Chính
quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự
hợp tác và giúp đõ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế. Hiện
nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là
2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%).
Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có:
SỐ mới mắc lao (mọi thể):
130.000
Số lao phổi BK dương tính mới:
60.000
Tổng số trường hợp lao:
260.000
Tổng số lao phổi BK dương tính:

120.000
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Bảng 1. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
(Nguồn. Trung tâm truyền thông giáo dục sức khỏe trung ương
-Bộ Y tế, 2005 )
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình
Dương là vùng dịch tễ lao vào loại trung bình trên thế giới. Trên thực tế chỉ số nguy
cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể sẽ
còn lớn hơn. Điều đó đã làm tăng thêm sự khó khăn đối vói công tác phòng chống lao
không những trong những năm tới mà sẽ còn tồn tại trong thời gian khá dài, ngay cả
khi đã bước sang thiên niên kỷ mới. ( g. vn/Lao/home.asp ) .
2.2. Vi khuẩn họ Mycobacteriaceae Họ Mycobacteriaceae bao gồm các trực khuẩn
có tính chất bắt màu thuốc nhuộm một cách đặc biệt. Vi khuẩn khó bắt màu thuốc
nhuộm base nhưng khi đã bắt màu thuốc nhuộm rồi thì không bị dung dịch cồn, acid
tẩy màu. Người ta gọi chúng là vi khuẩn kháng acid. Phương pháp nhuộm Ziehl-
Neelsen ứng dụng đặc tính trên của vi khuẩn kháng acid. Họ Mycobacteriaceae gồm
nhiều loài; một số sống hoại sinh ở đất, nước, thực vật; một số gây bệnh ở người và
động vật.
Nhóm gây bệnh lao
+ Mycobacterium tuberculosis: vi khuẩn lao gây bệnh lao trên người.
+ Mycobacterium bovis: vi khuẩn lao bò có thể gây bệnh ở ngưòi.
+ Mycobacterium avium: vi khuẩn lao chim, ít gây bệnh ở người, thường gặp
trong lao hạch ở người.
+ Mycobacterium microti: vi khuẩn gây bệnh lao ở chuột Mycobacterium Atipìques:
là các vi khuẩn kháng cồn kháng toan không điển hình: là nhóm vi khuẩn kháng acid

có thể gây bệnh cho người nhưng không gây bệnh ch
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
ochuột lang hoặc thỏ (phân biệt với nhóm gây bệnh lao). Dịch tể học cho thấy nó có thể
gây nên sự nhiễm trùng rộng lớn ở nhiều vùng nhung chứng bệnh tương đối nhẹ.
Mycobacteirum ỉeprae: gây bệnh phong.
2.3. Vỉ khuẩn ỉao (Mycobacterium tuberculosừ)
2.3.1. Đăc đỉểm sinh vât hoc
• m m
23.1.1. Hình thể
Trực khuẩn lao thường gọi là BK (Bacỉỉle de Koch) là trực khuẩn mãnh hơi cong kích
thước 2 - 4|U,m X 0,2 - 0,5fim chúng đứng riêng rẽ hoặc thành từng đám trên tiêu bản.
Khỉ nhuộm Ziehl-Neelsen vỉ khuẩn bắt màu đỏ cố khỉ cho thấy những hạt màu đỏ bên
trong tế bào vi khuẩn do không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của Fuchsin (hình 1) và
(hình 2)
I lĨLi
Hình 2. Vỉ khuẩn
lao dướỉ kính hiển
vi điện tử
(nguồn
Wikipedia)
Người ta có thể thay chữ BK
(bacille de Kock) bằng chữ
AFB (Acid Fast Bacilli) ở môi
trường nuôi cấy Loeweinsteine-
Jensen sau 1 đến 2 tháng vi

khuẩn lao phát triển thành
khuẩn lạc hình súp lơ, màu
trắng ngà (hình 3)
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 14 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 14 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Hình 1. Vi khuẩn lao nhuộm Ziehl-Neelsen (nguồn Wikipedia)
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Hình 3. Khuẩn ỉạc
vỉ khuẩn lao trên môi
trường nuôi cấỹ loewens
taine- Jensen
(nguồn Wikipedia)
2.3.1.2. Cấu tạo hổa
học
Điểm nổi bật của
cấu tạo vi khuẩn lao là
tỷ lệ lipid cao chiếm 10-40% trọng lượng khô của vi khuẩn. Vì sẳn lipid ở vách tế bào
(60%) vi khuẩn có tính chất kị nước nên chúng có xu hướng dính liền với nhau lúc
phát triển ở môi trường lỏng. Tính chất kị nước cũng cắt nghĩã tính chất kháng acỉd và
khả năng chậm phát triển của vi khuẩn. Các chất lipid hay được nghiên cứu là mycozid
c, cord~faetor và các chất sáp. Các chất lỉpỉd cố liên quan đến độc tính của vỉ khuẩn,
như đối với vi khuẩn gây bệnh, sáp D chiếm 6-8%, còn ở chủng không gây bệnh sáp D
chỉ chiếm 2 %.
2.3.1.3. Tính chất nuôỉ cấy và khả năng đề kháng
Vi khuẩn lao là loại hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích nghi 37°c, pH thích nghi 6.7-
7.0, vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường đặc
Lowenstein-Jensen, Ogawa Mark, môi ừường lỏng Sauton.ở môi trường Lowenstein-

Jensen khuẩn lạc xuất hiện khoảng sau một tháng, khô nhăn nheo giống như hoa su lơ
(hình 4). Ở môi trường lỏng Sauton vi khuẩn mọc nhiều ở bề mặt chất lỏng thành
những mảng nhăn nheo, khô và dính vào thành ống.
Vỉ khuần lao phát triển chậm, thời gian nhân đôi là 20-24 giờ trong khỉ của E. coli là 20
phứt. Những chủng cố độc lực cao sẽ tạo thành những khuẩn lạc R. Những chửng cố
độc lực kém tạo thành những khuẩn lạc ít nhăn nheo hơn và phát triển ít cố
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 15 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 15 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
trật tự hơn. So với các vi khuẩn không sinh nha bào khác vi khuẩn lao không đề kháng
hơn với nhiệt, tia cực tím và phenol. Khử trùng theo phương pháp Pasteur (đun 62°c
trong 30 phút) đủ để giết chết vi khuẩn lao. Trái lại vi khuẩn lao đề kháng nhiều hơn
với độ khô và một số chất sát trùng; rất khó giết chết vi khuẩn lao với những chất tẩy uế
thông thường như dung dịch cresyl 5%, nước Javel; cồn iốt chỉ có thể giết chết vi
khuẩn lao trong khoảng từ 2 đến 5 giờ.
2.3.2. Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và sức đề
kháng của cơ thể. Sự nhiễm trùng lần đầu ở một cá nhân thường tạo thành một thương
tổn tự giói hạn nhưng đôi khi chứng bệnh có thể tiến triển, hình như do sức đề kháng
kém hoặc do lượng vi khuẩn xâm nhiễm quá nhiều. Do sự thăng bằng của sức đề kháng
và độc lực của vi khuẩn thương tổn lành và tiến triển có thể tồn tại ở một cơ thể và
chứng bệnh cho thấy sẽ có một quá trình mạn tính lúc bệnh không được điều trị bằng
kháng sinh. Bệnh lao thường diễn biến qua 2 giai đoạn:
- Lao sơ nhiễm: Lần đầu tiên xâm nhập cơ thể vi khuẩn lao thường gây nên thương
tổn ở vùng ngoại vi rất thông khí của phổi. Lúc cơ thể trở nên quá mẫn trong 2-4 tuần
lễ sau thì thương tổn dạng hạt xuất hiện và hạt lao điển hình được hình thành. Lúc này

vi khuẩn lao có thể đến những hạch bạch huyết kế cận và sau đó qua đường bạch huyết,
đường máu và có thể đi khắp cơ thể.
- Lao tái phát: Phần lớn bệnh lao ở người là do sự hoạt động trở lại của ổ bệnh trầm
lặng của lao sơ nhiễm. Những ổ bệnh thường khu trú ở phần dưới hoặc phần đỉnh hoặc
gần đỉnh của phổi, ở đó sự nhiễm trùng dai dẳng nhờ nồng độ oxy cao. Lúc chứng bệnh
được khám phá thì thương tổn bã đậu thường đã hóa lỏng và hang lao hình thành tạo
điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lao phân tán nhanh chóng. Vi khuẩn lao có thể lây
truyền sang người khác qua đàm giải và theo phế quản đến những phần khác nhau của
phổi. Ngoài phổi phần lớn những cơ quan khác của cơ thể cũng có thể là vị trí của bệnh
lao, thông thường là đường tiểu, xương, khớp, hạch, màng phổi, màng bụng.
2.3.3. Miễn dịch và mẫn cảm trong bệnh lao
2.3.3.I.Hiện tượng Koch
Vi khuẩn lao được tiêm dưới da vào đùi phải của chuột lang 10 đến 14 ngày sau một
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
nốt sần được tạo thành ở chỗ tiêm, nốt sần phát triển thành loét. Ngoài ra vi khuẩn còn
xâm chiếm những hạch bạch huyết kế cận. Cuối cùng trong vòng 6 - 8 tuần lễ chuột
chết vì lao toàn thân. Nếu trong tuần lễ thứ 2 hoặc thứ 3 tiêm vi khuẩn lao lần
2 vào đùi trái chuột lang thì sự đáp ứng lần này nhanh hơn, mạnh mẽ hơn nhưng cũng
giới hạn hơn. Thương tổn xuất hiện trong vòng 2-3 ngày, lập tức lở loét nhưng lại lành
nhanh chóng. Những hạch bạch huyết kế cận không bị xâm nhiễm. Như thế cơ thể
chuột lang đã hình thành một sự đáp ứng biến thể với sự nhiễm trùng lần hai, những vi
khuẩn đưa vào lần sau khu trú hơn lần đầu và phát triển chậm hơn. Con vật có thể loại
bỏ những vi khuẩn xâm nhập lần sau, như thế nó đã được miễn dịch một phần nào.
2.3.3.2. Vaccine BCG
Được điều chế từ một chủng lao bò giảm độc bằng cách cấy truyền nhiều lần (230 lần

trong 13 năm) ở môi trường chứa mật bò và glycerin. Vaccine này tăng sức đề kháng
của cơ thể đối với bệnh lao nhưng tính miễn dịch lại không hoàn toàn, ở người nó làm
giảm số người mắc bệnh lao và tỷ lệ tử vong. Tiêm trong da 0,1 ml vaccine, mỗi ml
chứa 0,5 đến 1 mg BCG (BCG :Bacillus Calmette-Guerin là vaccine được hai nhà bác
học người Pháp là Calmette và Guerin đã kiên trì nghiên cứu trong 13 năm từ 1908 đến
1921).
2.3.3.3. Man cảm đối với bệnh lao
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Là mẫn cảm kiểu chậm phát sinh sau khi nhiễm vi khuẩn lao, khám phá tính mẫn cảm
đó bằng phản ứng tuberculin. Phản ứng tuberculin là một loại xét nghiệm nội bì để
đánh giá miễn dịch lao. Bản chất của nó là một phản ứng quá mẫn muộn. Tuberculin là
một sản phẩm chuyển hóa của vi khuẩn lao. Tuberculin dùng trong y tế hiện nay là dẫn
chất protein tinh khiết (tuberculin purified protein derivative: tuberculin PPD) được
điều chế từ sản phẩm chịu nhiệt của môi trường lỏng nuôi vi khuẩn lao. Tiêm 0,1 ml
tuberculin PPD chứa 5 đơn vị tuberculin (5 TU) vào trong da ở mặt trước cẳng tay
(hình 4). Đọc kết quả sau 72 giờ. Nếu tại nơi tiêm xuất hiện nốt cứng đỏ vói đường
kính từ lOmm trở lên là phản ứng dương tính, tức là cơ thể đã có miễn dịch với vi
khuẩn lao.PPD from
Ta iuseierta) 1s injected inio
The area
gj)f
ì&ỊỊr
_JỊỹạgr Y
• '^JỆ ' " y
Hình 4. Tiêm tuberculin

PPD dưới da và đọc kết quả sau 72 giờ (nguồn Medline plus
Medical Encyclopedia Tuberculosis)
Phản ứng tuberculin dương tính trong các trường hợp: BỊ bệnh lao, nhiễm
Mycobacteirum tuberculosis nhưng không mắc bệnh lao, nhiễm Mycobacteirum khác
và sau tiêm vaccine BCG, Phản ứng dương tính mạnh có thể gây hoại tử hoặc loét.
Phản ứng tuberculin xuất hiện khoảng một tháng sau khỉ nhiễm trùng và tồn tại trong
cơ thể nhiều năm và cố khỉ suốt đòi. Phản úng âm tính lúc chưa nhiễm lao, lúc nhiễm
lao chưa quá một tháng, ỉức bị lao nặng trong tình trạng suy nhược không còn phản
ứng, lức mắc bệnh cấp tính như sồi, bệnh Hodgkin.
2.4. Chẩn đoán lao bằng chụp hình x-quang phồỉ
Phương pháp phổ biến hiện nay dùng đề phát hiện bệnh lao là đọc kết quả hình ảnh
phổi qua kỹ thuật chụp bằng tia X (hình 5) đây là một phương pháp quí báu gốp phần
trong chấn đoán ỉao phổi. Phương pháp x-quang cố độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu
thấp. Nhiều bệnh có hình ảnh x-quang phổi giống với lao phổi, lao phểỉ ngược lại cũng
cổ hình ảnh dễ nhầm lẫn với các bệnh phổi khác. Mặt khác rất khó phân biệt tổn
thương ở phổi do lao cũ đã ổn định hay lao mới đang tiến triển, vì thế x-quang không
phải là yếu tố quyết định trong việc chẩn đoán lao phổi. Kết quả chẩn đoán càng phức
tạp hơn khỉ tồn thương ở những người mắc bệnh lao phổi đồng thời cũng bị nhiễm
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 18 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 18 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
HIV/AIDS thì tổn thương sẽ thay đồi nhiều so với những hình ảnh được mô tả trước
đây. Trong trường hợp này để chẩn đoán lao phổi phải phéi hợp nhiều biện pháp, đồng
thời phải kết hợp với nhiều yếu tố khác.
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 19 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 19 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công

nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
ADAJVL
Hình 5. Hình ảnh chụp X quang phổi (nguồn Medline plus
Medical Encyclopedia Tuberculosis)
2.5. Chẩn đoán vi sính vật
2.5.1.Nhuộm theo phương pháp Zỉehỉ~Neelsen và đem soỉ tươi trực tiếp.
Đề biết được một người cố mắc lao hay không thì từ trước đến nay ngoài việc chụp X-
quang phổi còn cố các phương pháp kỉnh điển khác dùng trong chẩn đoán bệnh lao là
làm xét nghiệm đàm tìm vi khuẩn lao (phương pháp soi trực tiếp) mẫu đàm được soi
trực tiếp trên kính hiển vi sau khỉ đã được nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen
(ZN). Chẩn đoán lao phổi bằng xét nghiệm đàm tìm vi khuẩn lao là biện pháp rất cơ
bản, đơn giản, rẻ tiền rất phù hợp vói hoàn cảnh và điều kiện của các nước nghèo, đang
phát triển. Người bệnh nghỉ là bị lao khỉ đến khám, phải lấy đàm 3 lần, mỗi lần mỗi
ngày khác nhau để xét nghiệm tìm vi khuẩn lao.
Cách mẫu lấy như sau:
MSu 1: lấy đàm tại chỗ khi bệnh nhân đến khám.
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 20 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 20 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Mau 2: sau khỉ lấy đàm tại chỗ để cố xét nghiệm đàm lần thứ nhất, người bệnh được
giao cho một cốc đựng đàm để sáng sớm hôm sau khi mới ngủ dậy lấy mẫu đàm đưa
đến phòng khám (xét nghiệm đàm lần thứ hai).
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 21 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 21 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công

nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Mẩu 3: Lấy khỉ bệnh nhân đến đưa mẫu đàm lần 2. Bệnh nhân phải được điều trị ngay
nếu kết quả xểt nghiệm cố 2 lần dương tính trở lên (Chuyên trang Lao của Viện Thông
tin Thư viện Y học Trung ương, Bộ Y tế Việt Nam).
Điều quan trọng là phải hướng dẫn bệnh nhân lấy đàm đứng cách (hình 6) và đủ số
mẫu cần thiết, đem nhuộm và soi tươi trên kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn lao.
Cách đánh giá kết quả đang được sử dụng ở nước ta như sau:
-Khi không có AFB trên 100 vi trường: kểt quả âm tính (-).
-Từ 10 đến 99 AFB trên 100 vi trường: kết quả dương tính (+).
-Từ 1 đến 10 AFB trên 1 vi trường: kết quả dương tính (++).
Sputum sample is obtained by coughing and is examined
in the laboratory
(M m \
w A
-Trên 10 AFB trên 1 vi trường: kết quả dương tính (+++)♦
*v\Cy\M
Hỉnh 6. Cách lấy đàm để xét nghiệm
(nguồn Medline plus Medical
Encyclopedia Tuberculosis)
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 22 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 22 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Theo công trình nghiên cứu của một số nhà khoa học nếu trong lml đàm cố chứa trên
5000 BK (vi khuẩn lao) khỉ đem nhuộm soỉ trực tiếp mẫu đàm sẽ cố kết quả BK dương
tính (+) (thấy được vi khuẩn lâo trên kính hiển vi). Nếu mẫu đàm chứa dưới

5000BK/ml thì ít cố khả năng quan sát được chứng dưới kính hiển vi, do đố trong thực
tế nhiều khỉ về lâm sàng và chụp hình phổi đã cố bỉểu hiện bệnh lao phổi rõ rồỉnhưng
khi thử đàm thì lại cho kết quả BK âm tính (-) (không thấy được vi khuẩn bằng cách
đem nhuộm soi trực tiếp trên kính hiển vi) vì thế cần thực hiện các phương pháp nuôi
cấy.
2.5.2. Phân lập vi khuẩn
Dù kết quả nhuộm thế nào cũng cần nuôi cấy vi khuẩn, vì nuôi cấy nhạy hơn nhuộm.
Hơn nữa đặc tính khuẩn lạc còn cho phép phân biệt vi khuẩn lao với những vi khuẩn
kháng acid không gây bệnh ở người và vi khuẩn kháng cồn kháng toan không điển
hình. Ngoài ra vi khuẩn phân lập còn được sử dụng để làm kháng sinh đồ.Vi khuẩn lao
thuộc loại hiếu khí, chúng phát triển rất chậm, thường từ 1 đến 2 tháng mới tạo được
khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt chứa đường, đạm, dưỡng khí và các loại
muối (Na,Cl,K,Mg ) ngoài ra chúng còn cần các sinh tố nhóm B và hàng loạt các acid
amin, các acid vô cơ và lipid. Tất cả các chất này đều có trong trứng, máu và khoai tây
(môi trường Loeweintein- Jensen) vi khuẩn lao phát triển tốt nhất ở môi trường có pH
từ 6.8 đến 7.2 nhưng vẫn phát triển được trong môi trường có pH acid :5.5 và pH kiềm:
8.0. Nhiệt độ môi trường để BK có thể phát triển là 29°c - 42°c nhiệt độ thuận lọi nhất
là 37°c - 38° c (Bệnh học lao và bệnh phổi, (1994), Tập 1, Nhà xuất bản y học Hà Nội)
Phương pháp nuôi cấy là phương pháp chỉ có thể tiến hành ở các nơi có điều kiện
trang bị kỹ thuật tốt, phải chờ từ 2-3 tháng sau mới trả lòi kết quả được vì vi khuẩn lao
tăng trưởng rất chậm trong điều kiện bình thường, trung bình từ 20 - 24 giờ/1 lần).Vì
vậy việc nuôi cấy để nhận định vi khuẩn cần nhiều thời gian. Các kỹ thuật nuôi cấy như
kỹ thuật BACTEC, MGIT ở các nước phát triển cũng ngày càng được hoàn thiện.
2.5.3. Kỹ thuật sinh học phân tử: kỹ thuật PCR (polymerase Chain
reactỉon)
Những năm gần đây các kỹ thuật sinh học phân tử được đưa vào sử dụng trong lâm
sàng cùng vói một số kỹ thuật hóa sinh và vi sinh học khác đã làm cho việc phát hiện,
chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng trở nên nhanh chóng, chính xác hơn. Kỹ thuật được
nói đến nhiều và đã được đưa vào sử dụng trong nghiên cứu và trong thực tiễn lâm
sàng đó là kỹ thuật PCR do Kary Mullis phát hiện, nhờ đó ông đã nhận được giải

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
thưởng Nobel về hóa học năm 1993. Trong chuyên ngành lao, PCR được dùng để xác
định nhanh vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy và trong các mẫu bệnh phẩm. Ngoài
ra PCR có thể xác định type, gen của các chủng vi khuẩn lao, qua đó phát hiện vi khuẩn
lao gây bệnh cũng như có thể phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc (Phạm Hùng
Vân, 1996).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công
nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT
Nguyên lý của kỹ thuật PCR là sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN vói
việc dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mói bổ sung với sợi
này. Đầu tiên các sợi ADN khuôn mạch đơn sẽ được tạo ra theo cách đơn giản là đun
nóng dung dịch có chứa ADN mạch kép đến nhiệt độ (94°c hoặc 95°C) để làm biến
tính (dénaturation) acid nucleic từ dạng sợi đôi (ds ADN) biến thành sợi đơn (ss ADN).
Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn bắt cặp (annealing) lúc này nhiệt độ cho phản ứng phải
được hạ xuống vào khoảng (55°c - 65°C) với sự hiện diện của những đoạn mồi
(primers) chuyên biệt có sẳn trong dung dịch sẽ bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào
hai đầu của chuỗi acid nucleic khuôn (các đoạn ADN mồi là những đoạn ADN ngắn có
chiều dài từ 18 - 22 nu). Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension) nhiệt độ của phản
ứng ở giai đoạn này là (72°C) là nhiệt độ tối ưu để các men ADN polymerase xúc tác
nhằm nối dài đoạn mồi để hình thành một mạch đôi ADN mói. Như vậy, nếu ta cung
cấp hai đoạn mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN đích ta

sẽ chỉ tổng hợp được một đoạn ADN nằm giữa hai đoạn mồi. Điều đó có nghĩa là để
khuếch đại một trình tự ADN đích xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó
đủ để thiết kế tạo các đoạn mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm một mồi xuôi và
một mồi ngược. Phản ứng PCR là một sự khuếch đại in vitro một trình tự ADN mạch
khuôn vói xúc tác của enzyme trong khoảng 35 hoặc 40 chu kỳ. Phản ứng sẽ được thực
hiện trong một ống nhựa đặt trong một máy có thể điều chỉnh nhiệt độ gọi là máy chu
kỳ nhiệt (máy PCR hay thermal cycler), máy này có thể cài đặt chương trình làm nóng
và làm nguội theo chu kỳ cần thiết (hình 7) Quá trình phản ứng sẽ làm gia tăng số bản
sao một trình tự ADN khuôn ban đầu. Cả hai sợi ADN đều được dùng để làm khuôn
cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi được cung cấp đủ cho cả hai sợi. Trong phản
ứng PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên sao
cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu từ mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn
mồi nằm trên sợi kia. Như vậy sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất
hiện trên mỗi ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để
tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đố lại được dùng làm khuôn
tiếp cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời
các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản úng sẽ tạo ra 2 rn
bản sao (hình 8).
Hình 7. Máy PCR Perkin Elmer 9700
/ì "!
*<>••
•''XÍT
'
'niiiii
nmrn
'TtTTTI ĩ r 1
7ĨII n r
mỉ
ii
nj

•lafkjjiii V,, to u
m
J
j
:
r
ỉ
.
|-||-m r m
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 25 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học
Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 25 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học