ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của vi khuẩn bacillus megaterium v1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN






ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY LÔNG GIA SÚC, GIA CẦM CỦA
VI KHUẨN Bacillus megaterium V
1

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN LÊ LAM NGỌC
MSSV: 3103968
LỚP: CNSHTT K36





Cần Thơ, Tháng 11/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY LÔNG GIA SÚC, GIA CẦM CỦA
VI KHUẨN Bacillus megaterium V
1








CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU Nguyễn Lê Lam Ngọc
MSSV: 3103968
LỚP: CNSHTT K36






Cần Thơ, Tháng 11/2014
PHẦN KÝ DUYỆT


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)

TS. Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Lê Lam Ngọc



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

LỜI CẢM TẠ
-
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:
Ban Giám Hiệu, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh
học, cùng tập thể quý Thầy, Cô - trường Đại học Cần Thơ đã dạy bảo, truyền đạt kiến
thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và đóng
góp ý kiến quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Cô Trần Thị Xuân Mai – Cố vấn học tập lớp công nghệ sinh học tiên tiến, khóa
36 – trường Đại học Cần Thơ đã động viên, an ủi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tập thể lớp công nghệ sinh học tiên tiến, khóa 36 cùng lớp bạn Công nghệ Sinh
học, khóa 36 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi về mặt vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận
văn tốt nghiệp.
Kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực, luôn có
cống hiến quý báo cho sự nghiệp giáo dục.
Xin chân thành cảm ơn!


Cần Thơ, ngày 11 tháng 11 năm 2014


Nguyễn Lê Lam Ngọc

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
i
TÓM LƯỢC
Lông vũ chứa khoảng 90% keratin và được thải ra với một khối lượng lớn từ
ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm làm ô nhiễm môi trường. Keratin là một loại
protein rất khó phân hủy bởi các yếu tố vật lý hay hóa học. Sử dụng vi sinh vật, đặc
biệt là vi khuẩn để xử lý nguồn chất thải chứa keratin này có ý nghĩa thiết thực trong
ngành công nghiệp, nông nghiệp như chế biến thức ăn gia súc, gia cầm và sản xuất
phân bón. Enzyme keratinase được tổng hợp nhiều ở Bacillus megaterium V
1
và có
nhiều ứng dụng. Tuy nhiên các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, nồng độ giống
chủng vào, nguồn carbon, nguồn nito và thời gian ảnh hưởng quan trọng đến sự phát
triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme keratinase để phân hủy bột lông của chủng vi
khuẩn trên là rất cần thiết. Vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường
nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của dòng vi
khuẩn Bacillus megaterium V
1
” được thực hiện với mục tiêu xác định các điều kiện
môi trường thích hợp để dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
phát triển và phân hủy
lông gia súc, gia cầm đạt hiệu quả cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phát
triển thuận lợi trong môi trường pH 8,0 tại nhiệt độ thích hợp là 35
o
C và nồng độ
giống chủng 10%. Hoạt động của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy chỉ có bột lông
là nguồn carbon tốt hơn có ý nghĩa so với môi trường có bổ sung nguồn carbon. Ngoài

bột đậu nành và yeast extract giúp làm tăng mật số vi khuẩn, nguồn nitơ NH
4
Cl khi bổ
sung vào môi trường nuôi cấy làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột
lông của vi khuẩn so với môi trường chỉ chứa bột lông như nguồn nitơ duy nhất.
Từ khóa: Bacillus megaterium, keratin, keratinase.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
ii
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG vi
DANH SÁCH HÌNH vii
CÁC TỪ VIẾT TẮT viii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về chất thải lông gia súc – gia cầm 3
2.2. Cấu trúc của keratin 3
2.3. Sơ lược về enzyme keratinase 4
2.4. Sơ lược về vi khuẩn phân giải keratin 5
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của vi
khuẩn. 7

2.5.1 Các yếu tố vật lý 7
2.5.2 Các yếu tố dinh dưỡng 7
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9
2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 9
2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 11
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 13
3.1. Phương tiện nghiên cứu 13
3.1.1. Địa điểm - Thời gian 13
3.1.2. Vật liệu thí nghiệm 13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
iii
a. Giống vi khuẩn 13
b. lông gia súc, gia cầm làm cơ chất 13
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 13
3.1.4. Hóa chất 14
3.1.5. Thiết bị - dụng cụ 14
3.2. Phương pháp nghiên cứu 15
3.2.1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống và xử lý cơ chất. 15
a. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống 15
b. xử lý cơ chất 15
Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
15
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng
phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
15

3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
16
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát
triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
17
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển
và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
17
3.2.6. Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên theo thời gian của dòng vi
khuẩn Bacillus megaterium V
1
18
Phần B: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
19
3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng
phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
19
3.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chủng vào đến sự phát triển và khả
năng phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
19
3.2.9. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát
triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V

1
20
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
iv
3.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển
và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
21
3.2.11. Khảo sát sự phân hủy sợi lông gia súc theo thời gian của dòng vi khuẩn
Bacillus megaterium V
1
21
3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 22
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
26
4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng
phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
26
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến sự phát triển và khả
năng phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
29
4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển
và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V

1
31
4.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1.
33
4.5. Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên theo thời gian của dòng vi
khuẩn Bacillus megaterium V
1.
36
Phần B: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
38
4.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng
phân hủy lông súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
38
4.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chủng vào đến sự phát triển và khả năng
phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
41
4.8. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển
và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
43
4.9. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
45

4.10. Khảo sát sự phân hủy lông gia súc nguyên theo thời gian của dòng vi
khuẩn Bacillus megaterium V
1
48
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
v
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50
5.1 Kết luận 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
vi
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Thành phần hóa chất môi trường bột lông lỏng 13
Bảng 2. Thành phần hóa chất môi trường bột lông rắn 14
Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy bột
lông gia cầm và hàm lượng protein hòa tan của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
. 26
Bảng 4. Mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy sợi lông gia cầm nguyên và hàm lượng
protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
ở tuần thứ 10. 36
Bảng 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy bột
lông gia súc và hàm lượng protein hòa tan của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
38
Bảng 6. Mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy sợi lông gia súc nguyên và hàm lượng
protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
ở tuần thứ 10. 49

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
vii
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Cấu trúc hiển vi của các vi sợi keratin trong tế bào 4
Hình 2: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến mật số vi khuẩn. 29
Hình 3: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến hiệu suất phân hủy bột
lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V
1
. 30
Hình 4: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến mật số của vi
khuẩn Bacillus megaterium V
1
. 31
Hình 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến hiệu suất phân hủy
bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V
1
. 32
Hình 6: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số của vi khuẩn
Bacillus megaterium V
1
. 34
Hình 7: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến hiệu suất phân hủy
bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V

1
. 35
Hình 8: Sợi lông gia cầm nguyên bị phân giải ở tuần thứ 10. 37
Hình 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến mật số của vi khuẩn
Bacillus megaterium V
1
. 41
Hình 10: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến hiệu suất phân hủy bột
lông gia súc và hàm lượng protein của Bacillus megaterium V
1
. 42
Hình 11: Biểu đồ ảnh hưởng Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon
đến mật số của vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
. 43
Hình 12: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến hiệu suất phân
hủy bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V
1
. 44
Hình 13: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số của 45
vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
. 45
Hình 14: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến hiệu suất phân hủy
bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V
1
. 47
Hình 15: Sợi lông gia súc nguyên bị phân giải ở tuần thứ 10 49

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
viii
CÁC TỪ VIẾT TẮT
B. Bacillus
CFU Colony Forming Unit
rpm Rotation per minute
w/v Weight/volume



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
1
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Chăn nuôi là một ngành kinh tế quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, nó vừa
đáp ứng nhu cầu lương thực, thực phẩm cho tiêu dùng hằng ngày của con người vừa là
nguồn thu nhập quan trọng của hàng triệu người dân hiện nay. Tuy nhiên, song song
với những lợi nhuận đó là vấn đề ô nhiễm môi trường nghiêm trọng từ các sản phẩm
chăn nuôi. Lông gia súc, gia cầm thải từ các lò mổ gia súc gây ô nhiễm môi trường,
ảnh hưởng đến sức khỏe người dân sống xung quanh.
Lông gia súc, gia cầm rất khó phân hủy do thành phần chính của chúng là keratin
nguyên chất, một loại protein có khả năng chống lại các tác nhân phân hủy cao, cần
thời gian rất lâu để phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên. Nếu sử dụng phương pháp vật
lý và hóa học để xử lý lông thì tốn rất nhiều năng lượng và không thân thiện với môi
trường. Việc sử dụng phương pháp sinh học là phương pháp hiệu quả, không tốn năng
lượng lại cho hiệu suất phân hủy cao. Bên cạnh đó, nếu được xử lý thích hợp thì phế

phẩm lông có thể trở thành một nguồn protein bổ sung hiệu quả vào thức ăn chăn nuôi
thay thế cho các nguồn protein đắt tiền khác, vừa có thể giải quyết vấn đề môi trường
lại có thể tận dụng nguồn phế phẩm này đem lại hiệu quả cao về kinh tế. Ứng dụng
công nghệ sinh học vi sinh vật đã phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả
năng phân hủy mạnh chất thải chứa keratin mà trong đó dòng vi khẩn Bacillus
megaterium V
1
thể hiện được khả năng phân hủy keratin mạnh. Tuy nhiên, các yếu tố
như pH, nhiệt độ, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nguồn nito và thời gian có
ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme keratinase
để phân hủy bột lông của vi khuẩn
.

Xuất phát từ những vần đề trên đề tài: “Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường
nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của dòng vi
khuẩn Bacillus megaterium V
1
” được thực hiện
1.2. Mục tiêu đề tài
Xác định các điều kiện môi trường thích hợp để dòng vi khuẩn Bacillus
megaterium V
1
phát triển và phân hủy lông gia súc, gia cầm đạt hiệu quả cao.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
2
1.3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon
và nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của dòng

vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
.
Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên và sợi lông gia súc nguyên theo thời
gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
ở các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ
giống chủng vào, nguồn carbon và nitơ phù hợp.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
3
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về chất thải lông gia súc – gia cầm
Theo báo cáo của Cục Chăn nuôi, hằng năm đàn vật nuôi thải ra khoảng 80 triệu
tấn chất thải rắn, vài chục tỷ chất thải lỏng hàng năm. Lông gia súc, gia cầm chiếm
một lượng lớn trong chất thải rắn, khó phân hủy do lượng keratin chiếm đến 90%
trong thành phần cấu tạo và ngày càng tích lũy nhiều trong tự nhiên dẫn đến ô nhiễm
môi trường (Gupta và Ramnani, 2006). Với thành phần chủ yếu là keratin khá tinh
khiết đồng thời được thải ra với một số lượng lớn, chất thải lông gia súc, gia cầm được
xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những nguồn protein đắt tiền khác
để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên việc sản xuất lông làm thành
phần bổ sung cho thức ăn chăn nuôi chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản
xuất theo phương pháp vật lý hóa học còn nhiều hạn chế, không những tiêu tốn rất
nhiều năng lượng mà cũng không thủy phân hoàn toàn được lông còn phá hủy amino
acid làm giảm chất lượng và tỉ lệ tiêu hóa protein.
2.2. Cấu trúc của keratin
Keratin là một protein có cấu trúc dạng sợi, là thành phần chủ yếu cấu thành nên
da, tóc, móng tay… (Eggling, 2003) hoàn toàn không tan, kể cả trong dung dịch acid

hay kiềm. Khi phân giải cho nhiều cystine (7 – 12%) và acid glutamic (4 – 17%). Theo
cấu trúc cơ bản bậc hai, keratin được phân thành hai dạng α (α – helix của tóc) và β (β
– sheets của lông) (Akhtar và Edwards, 1997). Các sợi keratin ở cả hai dạng α-helix và
β-sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Zerdani et al.,
2004). Keratin cũng được phân loại thành keratin cứng và mềm dựa vào hàm lượng
lưu huỳnh. Keratin cứng được tìm thấy ở các phần phụ như lông vũ, tóc, móng guốc và
móng với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài và keratin mềm
được tìm thấy ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mềm dẻo hơn
(Voet và Voet, 1995). Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ liên kết hidro, tương tác kỵ nước
và các cầu nối disulfide tạo nên cấu trúc bền vững của keratin có khả năng kháng lại
tác động của các tác nhân phân hủy vật lý, hóa học và sinh học. Keratin không tan
trong nước, acid loãng kiềm và dung môi hữu cơ cũng như không bị phân giải bởi các
protease thông thường như trypsin, pepsin hay papain (Veslava Matikevičienė et al.,
2009). Tuy nhiên một số loài vi khuẩn vẫn có khả năng phân giải keratin hiệu quả nhờ
vào hoạt tính của enzyme keratinase (Onifade et al. 1998).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
4










Hình 1: Cấu trúc hiển vi của các vi sợi keratin trong tế bào

(Nguồn ngày 6/3/2014)

Lông gia súc có cấu tạo chủ yếu từ protein keratin dạng α – helix, cấu trúc này
bền vững, tương tự cấu trúc β – sheets của keratin có trong lông gia cầm cũng hết sức
chặt chẽ và khó phân giải. Trong tự nhiên, thời gian thật sự để keratin (từ lông gà) tự
phân là 5 – 7 năm (Lê Thị Thu Huyền, 2012).
2.3. Sơ lược về enzyme keratinase
Keratinase thuộc họ protease có khả năng thủy phân keratin trong tự nhiên. Theo
Hiệp hội Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử (IUBMB), keratinase được ký hiệu
là EC 3.4.99. Trọng lượng phân tử 33 kDa (Owen et al., 1989). Ngoài ra, keratinase
còn được gọi là serine protease do 97% trình tự tương đồng với protease có tính kiềm
và nó cũng bị ức chế bởi các chất ức chế tương tự serine. Hầu hết các keratinase được
tìm thấy đến nay đều thuộc loại serine protease và chỉ có một vài metalloprotease cho
thấy có hoạt tính phân giải keratin. Các metalloprotease này thường được tìm thấy ở
các vi khuẩn Gram âm (Brandelli, 2007).
Keratinase là một loại enzyme ngoại bào, chỉ được tạo ra trong sự hiện diện của
keratin trong cơ chất. Keratinase phân giải keratin bằng cách tấn công vào các cầu nối
disulfide (Prasad et al., 2010). Enzyme này có nhiều đặc trưng bề mặt, chúng có thể
phân giải protein dạng sợi như fibrin, elastin, collagen và các protein không có sợi như
casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin,…
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
5
Keratinase có tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
công nghiệp thuộc da, phân bón, thức ăn chăn nuôi, y dược,… Bên cạnh đó, enzyme
này còn có ứng dụng nổi bật là phân hủy prion và protein giống prion (Selvam và
Vishnupriya, 2012). Keratinase được sản xuất chủ yếu bởi một số loài vi sinh vật bao
gồm vi khuẩn, nấm hoại sinh và ký sinh, actinomycetes.
2.4. Sơ lược về vi khuẩn phân giải keratin

Molyneux đã phân lập một số vi khuẩn có khả năng phân giải keratin vào năm
1959. Một số dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Streptomyces có khả năng phân giải
lông vũ cũng được phân lập từ đất và lông vũ ở các cơ sở sản xuất và chế biến gia
cầm. Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia
tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme
ngoại bào. Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ
khí không bắt buộc và hình thành nội bào tử. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc
chi Bacillus rất đa dạng. Khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám. Trong đó các
dòng cho khả năng phân giải keratin tốt thuộc Bacillus sp., B. licheniformis và B.
subtilis (Balaji et al., 2008; Cai et al., 2008; Manczinger et al., 2003; Suh và Lee,
2001). Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, được tìm thấy nhiều trong đất,
nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 30
o
C, sinh enzyme tối đa ở 37
o
C và có khả năng
sinh bào tử ở môi trường khắc nghiệt.
Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hình thành bào tử, hô
hấp hiếu khí và nó được tìm thấy trong đất. Bacillus megaterium phát triển ở nhiệt độ
từ 3 - 45
o
C, tối ưu khoảng 30

– 35
O
C. Một số dòng phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam
Cực đã được tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên đến 63
o
C (theo
ngày 10/4/2014).

Bacillus megaterium là một loại vi khuẩn hoại sinh rất thường có trong đất. Chu
trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân hủy hóa chất hữu cơ thành
các hợp chất đơn giản hơn được thực hiện bởi các loại vi sinh bao gồm nhiều loài vi
khuẩn và nấm khác nhau mà Bacillus megaterium là một trong số đó. Các loài vi sinh
này sử dụng các chất dinh dưỡng từ các vật liệu hữu cơ chết hay hoại sinh để duy trì
nguồn năng lượng cho sự phát triển của chúng. Trong môi trường đất vi khuẩn ở dạng
sinh dưỡng khi có sẵn cơ chất cho chúng phát triển và chuyển thành dạng bào tử khi
chất dinh dưỡng trở nên cạn kiệt. Điều này là một chiến lược sinh tồn được sử dụng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
6
bởi nhiều loại vi sinh chiếm ưu thế trong môi trường sống hiếu khí của đất ngoài vi
khuẩn còn có các loại nấm sợi và các loài xạ khuẩn (actinomyces). Các nhóm vi sinh
đó sống trong đất và tạo ra kháng sinh quần hợp với quy trình tạo thành bào tử của
chúng. Vì có rất nhiều loài vi sinh tạo bào tử có thể có hiệu quả phân giải nhiều hợp
chất polymer sinh học như protein, tinh bột, pectin,… chúng được cho là có vai trò
đáng kể trong chu trình sinh học của carbon và nitrogen. Chính nhờ đặc tính này hiện
nay Bacillus megaterium là một trong những loài vi khuẩn được dùng khá phổ biến
trong lĩnh vực xử lý môi trường (Patricia S. Vary et al., 2007). Bacillus megaterium là
dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông cao. Protein keratinase từ dòng này đã được
nghiên cứu khá phổ biến, đây là nhóm enzyme thương mại có nhiều ứng dụng quan
trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học, liên quan
đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia súc gia cầm và công nghệ da.
Trong số các vi khuẩn Gram dương, các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả
năng phân giải keratin được nhận diện là Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003),
Microbacterium sp. (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Một số
dòng vi khuẩn Gram âm cũng có khả năng phân giải keratin như các loài Vibrio sp.
(Sangali et al., 2000), Chryseobacterium sp. (Riffel et al., 2003) và Xanthomonas sp.
(De Toni et al., 2002). Bên cạnh đó, nhóm xạ khuẩn và nấm cũng có khả năng phân

giải keratin như Streptomyces fradiae (Novel và Nickerson, 1959), Streptomyces sp.
A11 (Mukhopadhyay Chandra, 1990), Streptomyces pactum (Blockle et al., 1995),
Streptomyces albidoflavus (Letouneau et al., 1998).
Một số loài vi khuẩn chịu nhiệt cũng tạo được enzyme keratinase như
Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996),
Thermoanaerobacterkeratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001), Fervidobacterium
islandicum (Nam et al., 2002), và các dòng vi khuẩn ưa kiềm như Nesternkonia sp.
AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp. TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004). Hai
dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A, được
phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho thấy khả năng tạo keratinase trong quá
trình phát triển trên chất thải lông cừu (Gousterova et al., 2005).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
7
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của vi
khuẩn.
2.5.1 Các yếu tố vật lý
Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải keratin của vi khuẩn bị ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố. Các thông số vật lý cho sự sản xuất của vi sinh vật chuyên biệt theo
loài và vì thế thay đổi tùy theo từng dòng vi sinh vật. Các giá trị pH kiềm nằm trong
khoảng từ 6 – 9 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase và sự phân hủy lông gia cầm ở hầu
hết các vi khuẩn. Giá trị pH kiềm được cho là kích thích sự phân hủy keratin do làm
biến đổi các cystine thành lathionine khiến cho keratinase dễ dàng tiếp cận cơ chất.
Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng từ 28 – 50
o
C ở hầu hết các
vi khuẩn. Dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp. kr6 phát triển tối ưu ở nhiệt độ 30
o
C

và pH 8,0 và hoạt động phân hủy lông vũ cũng biểu hiện tối đa ở nhiệt độ này (Riffel
et al., 2003). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn thuộc họ
Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là 30
o
C, và cũng
tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại (Sangali et
al., 1999). Theo Sinoy et al. (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng Bacillus sp. phát
triển thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30 – 40
o
C và pH tối ưu là 6 – 8, hoạt độ
keratinase cũng thu được cao nhất trong khoảng nhiệt độ, pH này.
2.5.2 Các yếu tố dinh dưỡng
 Nguồn nitơ
Vi sinh vật có khả năng hấp thụ nhiều nguồn dinh dưỡng nitơ khác nhau. Tùy
theo đặc điểm dinh dưỡng của từng loài mà nó đòi hỏi các dạng nitơ khác nhau. Các
nguồn nitơ hữu cơ như: bột ngô, bột đậu nành, cám mì, casein, peptone, tryptone, yeast
extract, sữa không béo, và các nguồn nitơ vô cơ như: urea, NH
4
NO
3
, NH
4
Cl, NO
2
-
,
NO
3
-
, thích hợp cho các vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, sản sinh nhanh enzyme

thúc đẩy quá trình phân hủy lông. Brandelli (2000) sử dụng nguồn nitơ bổ sung là
yeast extract và NH
4
Cl cho hiệu quả phân hủy keratin đáng kể. Các dạng nitơ hữu cơ
không những là nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh dưỡng carbon cho vi
sinh vật. Theo nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), NH
4
Cl được bổ sung với
nồng độ 0,1% (w/v) cho kết quả là hoạt động enzyme tăng thêm 12%. Trong trường
hợp bổ sung cả rỉ đường và NH
4
Cl với nồng độ lần lượt là 1% (w/v) và 0,1% (w/v), sự
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
8
phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 đạt hiệu quả
cao.
Bột đậu nành cũng được biết đến như là chất cảm ứng cho sự sinh enzyme
(Cheng et al., 1995; Gradisar et al., 2000).
 Nguồn carbon
Tùy nhóm vi khuẩn mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO
2
,
NaHCO
3
, CaCO
3
, ) hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các
nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào 2 yếu tố: một là thành phần hóa học và

tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh
vật. Trên thế giới hầu như không có hợp chất carbon hữu cơ nào mà không bị hoặc
nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải. Không ít vi khuẩn có thể
đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu mỏ,
parafin, khí thiên nhiên.
Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử
quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân
(amilase, xenlulase, pectinase, lipase,…) để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ
hấu thụ (đường, axit amin, axit béo,…)
Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn carbon khi nuôi cấy phần lớn các
vi sinh vật dị dưỡng. Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các
nồng độ đường không giống nhau. Với vi khuẩn người ta thường dùng 0,5 – 0,2%
đường, còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3 – 10% đường.
Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của
quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế
nữa bởi các công nghệ thông thường. Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản
xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường. Thành phần chính của rỉ đường là
đường, chủ yếu là saccharose một ít glucose và fructose. Thành phần chính xác của rỉ
đường rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết, khí hậu,
giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản xuất đường trong từng nhà
máy. Do vậy, đường thay đổi đáng kể về thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và
độ nhớt.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
9
Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường được chia thành 3 phần: đường, chất hữu cơ
không đường và chất khoáng. Các loại glucide hòa tan (đường đôi và đường đơn) là
thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu. Bên cạnh
đó, rỉ đường là một nguồn giàu chất khoáng, vitamin – kích thích sự sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn.
Theo kết quả nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), bổ sung nồng độ rỉ đường
với 1% thúc đẩy sự hoạt động của enzyme phân hủy lông gia cầm ở dòng vi khuẩn
Bacillus licheniformis MZK-3.
Trong sản xuất Keratinase, có thể dùng một số cơ chất tự nhiên làm nguồn carbon: bột
bắp, rỉ đường, cám mì, cám gạo, cám ngô (Ramnani et al.,2001).
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Theo Sangali et al. (1999) các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin thuộc
họ Vibrionaceae đã được phân lập từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil. Nghiên cứu
cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và tạo ra enzyme phân giải keratin của vi
khuẩn này là 30
o
C.
Sangali và Brandelli (2000) đã phân lập được những dòng vi phuẩn Vibrio sp. từ
chất thải lông gia cầm. Một dòng Vibrio sp. kr2 được khảo sát cho thấy khả năng phân
hủy keratin tốt so với các dòng còn lại. Điều kiện thuận lợi cho những dòng này phát
triển là nhiệt độ trong khoảng 20-30
o
C và pH 6,0. Một nghiên cứu khác về quá trình
phân hủy keratin của dòng vi khuẩn Serratia sp. HPC 1383 nhằm khảo sát những điều
kiện ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme keratinase và hiệu quả của việc phân hủy
keratin bằng vi sinh vật. Kết quả cho thấy rằng enzyme được tạo ra nhiều hơn khi môi
trường dinh dưỡng bổ sung thêm những protein cần thiết cho vi sinh vật phát triển,
như là bổ sung thêm 0,2% yeast extract thì hoạt độ của enzyme tăng lên 130 U/ml so
với mẫu không bổ sung. Enzyme kertinase được khảo sát ở những điều kiện khác
nhau. Kết quả cho thấy nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme keratinase là
60
o
C và pH 10. Enzyme keratinase bị ức chế bởi các tác nhân như b-mercaptoethanol

làm ức chế 39% hoạt tính enzyme, Zn
2+
gây ức chế đến 41% hoạt tính của enzyme
(Khardenavis et al. 2009).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
10
Kim et al. (2001) đã phân lập được một số dòng Bacillus sp. từ nước thải lông gia
cầm. Một trong những dòng được phân lập, có 3 dòng được định danh là Bacillus
subtilis, Bacillus pumilis và Bacillus cereus có khả năng phân hủy hiệu quả lông gia
cầm và tạo ra được lần lược là 142, 96, 109 đơn vị hoạt độ enzyme. Các dòng vi khuẩn
này được khảo sát khả năng phân hủy keratin và những điều kiện ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng và phát triển của chúng. Kết quả cho thấy, dòng B. Subtilis cho hiệu quả
phân hủy tốt nhất, điều kiện môi trường tối ưu cho hoạt động của dòng vi khuẩn B.
subtilis là ở 40
0
C, trong khoảng pH 5 - 9. Hoạt độ enzyme keratinase phân hủy keratin
của dòng này là 161 U/ml sau 84 giờ ủ lắc.
Riffel et al. (2002) đã thực hiện một nghiên cứu cho thấy vi khuẩn
Chryseobacterium sp. dòng kr6 có khả năng phân giải hoàn toàn lông vũ trong quá
trình nuôi cấy. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của dòng này là 30
o
C và pH tối ưu 8,0.
Dưới điều kiện này, lông vũ cũng được phân giải một cách tối đa. Nghiên cứu cũng
cho thấy hoạt tính của keratinase bị ức chế bời EDTA, Hg
2+
, Cu
2+
và được kích hoạt

bởi Ca
2+
.
Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về keratinase từ vi khuẩn và
ứng dụng của enzyme này. Trong đó, keratinase chỉ được sinh ra trong điều kiện môi
trường có sự hiện diện cơ chất có chứa keratin như lông, tóc, móng,… cơ chế phản
ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy phân protein.
Keratinase được ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm sạch và
làm giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp.
Riffel và Brandelli (2006) đã tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ
chất thải lông gia cầm. Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông
gia súc và kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa. Trong đó có ba
dòng Gram âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một
dòng Gram dương (Microbacterium sp.). Những vi khuẩn này có thể phát triển trên
nhiều loại chất thải chứa keratin như bột lông gia súc, lông vũ thô, móng gà, tóc và
len. Hoạt tính phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này
được kiểm tra với hai cơ chất azokeratin và azocasein. Kết quả cho thấy enzyme
keratinase hoạt động trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương
với các enzyme phân gải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
11
Joshi et al. (2007) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. PW-1 có khả
năng phân giải lông vũ từ chất thải gia cầm. Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi
trường cơ bản với lông vũ đóng vai trò là nguồn carbon, nitơ và lưu huỳnh.
Bo Xu et al. (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là
Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90
o
C) và pH rộng (6 – 10).

Nhiệt độ tối ưu là 60
o
C và pH tối ưu từ 7,5 – 8.
Daroit et al. (2009) cũng đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. P45 có khả
năng phân giải protein trên môi trường sữa không béo và môi trường bột lông gia súc.
Dòng Bacillus sp. P45 có khả năng phân giải 90% lông gà sau 72h nuôi cấy trong môi
trường lỏng có bổ sung lông gà. Tuy nhiên, dòng vi khuẩn này không có khả năng
phân giải keratin tóc, có thể do sự đa dạng về cấu hình của cơ chất này so với keratin
lông vũ.
Hai dòng vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis có khả
năng phân hủy tóc, móng và lông gia súc đã được phân lập bởi Savitha et al. (2010).
Enzyme của chúng có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thịt, đồng thời enzyme được
sản xuất từ các dòng vi khuẩn này cũng được sử dụng để xử lý các loại rác thải chứa
keratin.
Ba dòng vi khuẩn B. megaterium SN1, B. thuringenesis SN2, B. pumilis SN3
phân lập từ bãi đất chôn lông gia cầm có khả năng phân giải lông gà và lông bồ câu
sau 5 ngày nuôi cấy (Agrahari et al., 2010).
2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đã được phân
lập từ đất và lông vũ tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông gia
cầm. Nguyễn Đình Quyến (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất 7 dòng xạ khuẩn
và 15 dòng Bacillus có hoạt tính phân giải casein rõ rệt. Trong đó 5 dòng xạ khuẩn và
2 dòng Bacillus có khả năng phân hủy lông gà mạnh.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn
Bacillus, Chryseobacterium, từ một số vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam.
Điều kiện thích hợp cho các chủng vi khuẩn này là ở 30°C đến 40°C và có khả năng
phân hủy lông vũ đạt từ 75% đến 90% sau một tuần nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn đã
được phân loại định danh bằng các nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh kit API
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến

Viện NC&PT Công nghệ sinh học
12
50CHB, API 20NE và trình tự gen mã hóa 16S rRNA. Kết quả định danh của bốn
dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông vũ mạnh nhất cho thấy các dòng này lần
lượt tương đồng với vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus megaterium,
Chryseobacterium spp.
Nguyễn Thu Hiền et al. (2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, cũng đã
phân lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân giải lông vũ.
Bùi Thị Minh Diệu và Đinh Thị Bé Hiền (2011) đã tiến hành phân lập được từ
đất và nước 19 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc. Trong đó, dòng vi
khuẩn K13, dòng O3 và dòng K8 cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các
dòng còn lại với tỷ lệ phân giải lông gia súc lần lượt là 63,38%, 60,9% và 58,33%.
Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền (2012) cũng thực hiên một nghiên
cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis dòng Kr2 có khả năng phân giải lông gà, pH tối
ưu cho sự phát triển và sinh enzyme keratinase tối ưu của dòng này là 7 – 8, nhiệt độ
35C, nồng độ lông là 20 g/L.
Phạm Minh Triết (2013) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 18 dòng vi
khuẩn có khả năng phân giải keratin. Trong đó có dòng vi khuẩn Bacillus megaterium
cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân hủy lông
lên đến 40,48%.


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ sinh học
13
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm - Thời gian
- Thời gian thực hiện: từ tháng 04/2014 đến 10/2014.

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Vật liệu thí nghiệm
a. Giống vi khuẩn
Dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V
1
được Phạm Minh Triết phân lập từ đề tài
luận văn “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân hủy keratin chịu nhiệt ở tỉnh Đồng
Tháp” (2013)
b. lông gia súc, gia cầm làm cơ chất
Các mẫu lông gia cầm, gia súc thu tại một số cơ sở giết mổ và chăn nuôi gà, vịt
tại Cần Thơ.
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 1. Thành phần hóa chất môi trường bột lông lỏng
Hóa chất
Nồng độ (g/l)
MgSO
4
.7H
2
O
0,1
KH
2
PO
4

0,4
K
2

HPO
4

0,3
NaCl
0,5
Bột lông (lông heo/lông gà)
10
(*Nguồn: Daniel et al., 2009)