khảo sát sự đa dạng di truyền của vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (pangasianondon hypophthalmus) ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN





DƯƠNG THANH QUY




KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus)
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2014


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN





DƯƠNG THANH QUY




KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus)
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Cán bộ hướng dẫn
PGs. Ts. Từ Thanh Dung



2014

1

KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella
ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypopthalmus) Ở ĐỒNG
BẰNG SÔNG CỬU LONG
Dương Thanh Quy
1
và Từ Thanh Dung
2
(1) Lớp nuôi trồng thủy sản k37, khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ
(2) Bộ môn Bệnh học thủy sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ
Email:
ABTRAST
This study was carried out to assess phylogenetic diversity of Edwarsiella ictaluri
isolates collected from striped catfish intensively farmed in the Mekong Delta,
Vietnam. A total of 14 bacterial isolates were isolated and identified from diseased
catfish by using PCR technique based on the upstream region of fimbrial gene
cluster. The results determined that they were E. ictaluri positive with specific DNA
band for the upstream region of fimbrial gene appeared at 470 bp. Ten isolates were
chosen to sequence, the nucleotide blast result showed that these strains had high
homology/identity (96-100%) compared with reference strains of Edwardsiella
ictaluri on Genbank (NCBI). These strains were used for analyzing phylogenetic

diversity. The result indicated that Tien Giang and Tra Vinh strains had close
relationship and had hight similarity other in Can Tho, An Giang, Vinh Long, and
Dong Thap provinces. However, the study found that there are no genetic
differences between Edwardsiella ictaluri strains in two differently ecological areas
of brackish and fresh water in the Mekong Delta.
Title: Analysis of phylogenetic diversity of Edwarsiella ictaluri from striped catfish
(Pangasianodon hypopthalmus) farmed in the Mekong Delta.
Keywords: catfish, Edwarsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus,
phylogenetic diversity, Mekong Delta.
TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là nhằm khảo sát sự đa dạng di truyền của các chủng
vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên các tra nuôi ở Đồng bằng
sông Cửu Long. Tổng số 14 chủng vi khuẩn được phân lập và định danh bằng Kỹ
thuật PCR dựa trên vùng “upstream” của gen bám dính. Kết quả cho thấy các chủng
vi khuẩn phân lập đều cho phản ứng dương tính khi các DNA đều xuất hiện vạch
470 bp. Mười chủng vi khuẩn phân lập đại diện cho 6 tỉnh An Giang, Đồng Tháp,
Cần Thơ, Vĩnh Long, Tiền Giang, Trà Vinh được chọn giải trình tự vùng “upstream”
của gen bám dính, kết quả cho mức tương đồng cao (96-99%) với các chủng trên
ngân hàng GenBank (NCBI). Phân tích sự đa dạng di truyền của 10 chủng vi khuẩn
được giải trình tự, kết quả cho thấy các chủng phân lập có đặc điểm di truyền giống
nhau, các chủng từ Tiền Giang, Trà Vinh tuy có vị trí giáp biển nhưng kết quả cho
thấy không có sự khác biệt di truyền nhiều với các chủng ở Cần Thơ, An Giang,
Vĩnh Long, Đồng Tháp. Kết quả của đề tài còn là tiền đề nghiên cứu ứng dụng vắc-
xin phòng ngừa bệnh do loài vi khuẩn gây bệnh này gây ra.
I. GIỚITHIỆU
Ngành công nghiệp cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đã và đang phát triển
trong nhiều năm qua và trở thành mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn của Việt Nam nói
chung và Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng. Tuy nhiên, trong những
năm qua, mật độ thâm canh hóa không ngừng tăng dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi

2

trường, tạo điều kiện cho dịch bệnh phát triển và gây thiệt hại nghiêm trọng cho
người nuôi. Trong đó bệnh gây thiệt hại lớn nhất cho nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL là
bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) gây ra (Crumlish et
al., 2002). Ngoài ra, vi khuẩn gây bệnh này còn được xác nhận ở Mỹ (Hawke et al.,
1986), Thái Lan (Kasornchndra et al., 1987), Indonesia (Yuasa et al., 2003) và Thổ
Nhĩ Kì (Keskin et al., 2004).
Vi khuẩn E. ictaluri có thể coi là tác nhân đặc thù gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn
nuôi công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới. Vi khuẩn E. ictaluri là vi khuẩn Gram
âm, hình que, không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, phản ứng Oxidase âm tính,
Catalase dương tính (Plum, 1999; CrumLish et al., 2002; Từ Thanh Dung và ctv,
2004). Bệnh do vi khuẩn này gây ra đã và đang gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá
tra ở ĐBSCL. Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh là biện pháp chữa bệnh phổ biến, gây
ra hiện tượng kháng thuốc vi khuẩn này và vi khuẩn môi trường xung quanh (Từ
Thanh Dung, 2010), tình trạng sử dụng kháng sinh tràn lan, không kiểm soát ngày
càng làm cho tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp và gây khó khăn cho ngành
xuất khẩu cá tra. Năm 20l0, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam và ctv,
hầu hết vi khuẩn E. ictaluri kháng với streptomycin, chloramphenocol (95%),
florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycycline (67,5%) và 97,5% chủng vi khuẩn
biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng từ 3 loại kháng sinh). Hơn nữa, theo kết quả
kháng sinh đồ của Phạm Thanh Hương (2010), cho thấy vi khuẩn E. ictaluri cũng
kháng với các loại kháng sinh streptomycin (84,1%), enrofloxacin (74,5%); kháng
hoàn toàn với flumequin, trimethoprim + sunfamethoxazol; nghiên cứu cũng phát
hiện có 96% chủng vi khuẩn E.ictalluri biểu hiện sự đa kháng.
Trước tình hình đó, để giảm thiệt hại của bệnh do vi khuẩn này gây ra thì việc sử
dụng vắc-xin để phòng ngừa bệnh là điều cần thiết. Để thực hiện được điều đó, trước
hết cần phải khảo sát sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn gây bệnh nguy
hiểm này. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn
E. ictaluri. Nghiên cứu của Sakai et al (2009), áp dụng biện pháp khuếch đại chiều

dài đoạn gen đa hình của các chủng vi khuẩn E. ictaluri (Amplified- Fragment
Length Polymorphism, AFLP), kết quả cho thấy, có sự khác biệt di truyền chủng vi
khuẩn phân lập từ Mỹ so với các chủng phân lập từ Nhật Bản và Indonesia, các vi
khuẩn E. ictaluri phân lập cùng một thủy vực tại Indonesia cũng có sự khác biệt về
di truyền do khác nhau về thời gian phân lập, các chủng phân lập ở Mỹ cũng có sự
khác biệt di truyền do khác biệt về sinh thái thủy vực. Ở ĐBSCL có các tỉnh nuôi
thâm canh cá tra nằm trong vùng sinh thái nước ngọt, lợ. Vấn đề đặt ra là vùng sinh
thái nước ngọt và lợ nuôi cá tra ở ĐBSCL có ảnh hưởng tới tính đa dạng di truyền
của vi khuẩn E. ictaluri hay không? Và vi khuẩn gây bệnh trên cá tra ở các tỉnh khác
nhau có khác nhau hay không? Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Khảo sát sự đa
dạng di truyền của vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra nuôi
(Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện
với mục tiêu: phân lập, định danh và khảo sát sự đa dạng di truyền một số chủng vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi thâm canh ở một
số tỉnh ĐBSCL.

3

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri theo phương pháp truyền thống
Đề tài đã thu 25 mẫu cá tra bệnh được thu ở một số ao có dấu hiệu bệnh gan thận mủ
ở một số tỉnh ở ĐBSCL như Vĩnh Long, Đồng Tháp, An Giang, Tiền Giang, Trà
Vinh, Cần Thơ trong năm 2014 và vi khuẩn E. ictaluri được phân lập từ các ao khác
nhau dựa theo tài liệu của Frerich and Millar (1993). Tách ròng trên trên môi trường
Trypton soy agar (TSA) và ủ ở 28
o
C trong 48h. Sau đó tiến hành trữ vi khuẩn trong
môi trường Brain heart in broth (BHIB) có bổ sung 20% glycerol bảo quản ở -80
o
C

cho đến khi sử dụng. Các đặc điểm hình thái và sinh hóa cơ bản của vi khuẩn được
kiểm tra như màu sắc khuẩn lạc, tính di động, nhuộm Gram, phản ứng
Oxidase/Catalase và phản ứng O/F theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và
Feltham, 1993) và tài liệu hướng dẫn của Buller (2004).
2.2 Tiến hành phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) xác định E. ictaluri
Ly trích DNA
Các chủng vi khuẩn sau khi được nuôi tăng sinh trong môi trường BHIB được ly
trích DNA dựa theo tài liệu của Moore et al (2004). Các bước thực hiện gồm: hút 2
ml dung dịch nuôi cấy cho vào tube 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút,
loại bỏ phần dung dịch phía trên. Cho vào tube 300 µl Lysis buffer (Tris [pH 8.0] 1
M, EDTA [pH 8.0], NaCl 5 M, SDS 10%, H
2
O), cho viên bi sắt vào tube và lắc đều
bằng máy lắc, hút thêm 700 µl Lysis bufer cho vào tube, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10
phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, lấy 700 µl dung dịch phía trên chuyển
sang tube mới. Cho 700 µl Ethanol 95% vào dung dịch, ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ
phần dung dịch phía trên (chỉ lấy kết tủa). Rửa kết tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly
tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ phần dung dịch phía trên, sấy khô trong chân
không trong 10 phút. Hòa tan kết tủa trong 100 µl TE 0,1X (Tris pH8 1 M, EDTA
0,5 M, H
2
0). Trữ mẫu ở -20
o
C trong quá trình sử dụng.
Tiến hành phản ứng PCR
Sau khi ly trích, tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA nằm trong
vùng “upstream” của gen bám dính có kích thước 470 bp, phản ứng PCR được thực
hiện dựa theo qui trình của Sakai et al., (2009(b)) với cặp mồi có trình tự:
Edi_F: 5’-
CAGATGAGCGGATTTCACAG-3’ ;Edi_R5’-GCGCAATTAACATAGAGCC-3’.

Thành phần của phản ứng PCR gồm 2,5 µl dung dịch đệm Buffer 1X (Tris HCl 100
mM và KCl 500 mM), 2 µl MgCl
2
1,5 mM, 4 µl dNTPs (deoxyribonucleotide
triphosphate) 200 µM, 1 µl primer (EdiF) 0,4 µM, 1 µl Primer (EdiR) 0,4 µM, 0,25
µl Taq DNA polymerase 2,5 UI, 2 µl 20 ng DNA, thêm nước cho đến 25 µl. Chu
trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện theo Sakai et al (2009(b)) bao gồm:
Biến tính ban đầu trong 3 phút ở 94
o
C, sau đó thực hiện khuếch đại 30 chu kì gồm
các giai đoạn biến tính ở 94
o
C trong 30 giây, gắn mồi 65
o
C trong 30 giây, kéo dài ở
72
o
C trong 1 phút, và giai đoạn kéo dài ổn đinh sản phẩm được thực hiện trong 5
phút ở 72
o
C.
Điện di sản phẩm PCR và giải trình tự
Sản phẩm PCR sau phản ứng được trộn với 2-3 µl dung dịch Loading Buffer trước
khi chạy điện di bằng gel agarose 1,5%. Sau đó, chọn 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri
đại diện cho 6 tỉnh được gởi sang công ty Macrogen, Hàn Quốc để giải trình tự.
(website: (các chủng được đánh dấu (*) ở Bảng 1)).

4

2.3 Phân tích đa dạng di truyền

Kết quả của các mẫu sau giải trình tự được xếp hàng (alignment) bằng phần mềm
ClustalW (DNA Data Bank of Japan; http: Clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html). Cây
phả hệ (Phylogenetic tree) được xây dựng bằng phần mềm Mega 6 (Tamura et
al.,2013) bằng thuật toán Neighbor-joining với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại.
III. KẾT QUẢ
3.1 Phân lập vi khuẩn
Đề tài đã thu được 25 mẫu cá tra từ 6 ao có dấu hiệu bệnh gan thận mủ với các dấu
hiệu bên ngoài như xuất huyết, mắt hơi lồi, xuất hiện nhiều đốm trắng đục có kích
cỡ 1-3 mm trên gan, thận và tỳ tạng và đã phân lập được 14 chủng vi khuẩn. Nguồn
gốc của các chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 1.
Bảng 1. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh gan thận mủ ở
ĐBSCL
Stt

Đ
ịa ph
ương

S
ố mẫu

thu thập
Các ch
ủng phân lập

Th
ời gian

1

C
ần Th
ơ

4

17ED4
*

2014

2

V
ĩnh Long

4

42ED4
*

2014

3

An Giang

4

20ED4

*
, 21ED4
*
, 29ED4

2014

4

Đ
ồng Tháp

5

11ED4
*
, 12ED4
*
, 31ED4, 3
4ED4

2014

5

Ti
ền Giang

4

13ED4
*
, 15ED4

2014

6

Trà Vinh

4

2ED4
*
, 3ED4
*
, 51ED4
*

2014


T
ổng cộng:

2
5

14

Ghi chú: kí hiệu đầu tiên là số thứ tự chủng phân lập, kí hiệu tiếp theo là tên vi khuẩn và năm phân
lập, kí hiệu tiếp theo tên viết tắt của tỉnh; * là các chủng được chọn giải trình tự khảo sát sự đa dạng
di truyền.
3.2 Kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn E. ictaluri được phân trên môi trường TSA trong 48h và ủ ở 28
o
C trong tủ
ấm. Kết quả cho thấy khuẩn lạc có màu trắng đục, nhỏ, không nhân và rìa có dạng
không đồng nhất (Hình 1A). Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn trên kính
hiển vi với vật kính 100X cho thấy, vi khuẩn có khả năng di động. Kết quả nhuộm
Gram cho thấy tất, cả các chủng vi khuẩn đều không bắt màu tím xanh của thuốc
nhuộm Crystal Violet mà bắt màu đỏ của Fushin. Qua đó cho thấy các chủngvi
khuẩn phân lập được đều là Gram âm (Hình 1B).











5

Hình 1.Kết quả phân lập vi khuẩn E. ictaluri trên môi trường TSA trong 48h và
nhuộm Gram vi khuẩn
A: Hình thái khuẩn lạc trên môi trường TSA
B: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn E. ictaluri được chụp dưới kính hiển vi 100X
Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường TSA trong 48h được thử
nghiệm để kiểm tra sự hiện diện của enzym catalase và cytochrome oxidase. Khi thử
nghiệm catalase (H
2
O
2,
3%) tất cả các chủng vi khuẩn đều cho hiện tượng sủi bọt
khí, điều này chứng tỏ vi khuẩn có hệ enzyme catalase để phân giải H
2
O
2
thành nước
và oxi hay nói cách khác là các chủng vi khuẩn dương tính với Catalase. Khi thử
nghiệm Oxidase bằng cách cho vi khuẩn tiếp xúc với giấy lọc có tẩm thuốc thử
Tetramethyl- p- phenylendiamin dihydrochlorid, các chủng vi khuẩn cho kết quả âm
tính vì không làm đổi màu giấy lọc từ trắng sang tím. Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn
phân lập cũng được kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men đường glucose (O-F test).
1 ống được phủ 0,5-1 ml parafin tạo điều kiện yếm khi để kiểm tra khả năng lên men

(F), ống còn lại tạo điều kiện hiếu khí để kiểm tra khả năng oxi hóa (O), kết quả cho
thấy tất cả các chủng vi khuẩn đều làm đổi màu 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F
từ màu xanh sang màu vàng.
3.3 Kết quả xác định vi khuẩn E. ictaluri dựa vào vùng “upstream” của gen
bám dính bằng PCR
Vi khuẩn phân lập được định danh bằng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng “upstream”
của gen bám dính với cặp mồi đặc hiệu Edi_F và Edi_R. Kết quả sau phản ứng PCR
của 14 chủng vi khuẩn phân lập đều xuất hiện band ADN 470 bp (Hình 2). Kết quả
này cho thấy 14 chủng vi khuẩn phân lập được định danh bằng kỹ thuật PCR đều là
vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ.
A

B


6


Hình 2. Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR dựa trên vùng “upstream”của gen bám
dính của vi khuẩn E. ictaluri (Chú giải : 1_17ED4(CT); 2_21ED4(AG);
3_20ED4(AG); 4_51ED4(TV); 5_3ED4(TV); 6_2ED4(TV).
Kết quả giải trình tự của 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập nhận được từ công
ty Macrogen, Hàn Quốc. Sử dụng chương trình BLASTN để so sánh mức độ đồng
hình của trình tự các chủng vi khuẩn phân lập với trình tự của các chủng vi khuẩn
trên ngân hàng gen trên trang NCBI BLAST. Kết quả thu được cho thấy 100% các
chủng vi khuẩn phân lập đều thuộc loài Edwardsiella ictaluri. Trình tự “upstream”
của gen bám dính của các chủng vi khuẩn phân lập có tỉ lệ tương đồng cao với với
trình tự vùng “upstream” của gen bám dính của các chủng trên ngân hàng dữ liệu
NCBI là 96-99%. (Bảng 2).

Hình 3. Kết quả so sánh tính tương đồng của chủng 13ED4 so với vi khuẩn E.
ictaluri trên ngân hàng dữ liệu NCBI
500bp
1

2 3 4 5 6 L
470bp

7

Hình 4. Kết quả so sánh tính tương đồng của chủng 42ED4 so với vi khuẩn E.
ictaluri trên ngân hàng dữ liệu NCBI
Kết quả giải trình các chủng vi khuẩn phân lập được so sánh với trình tự các chủng
trên ngân hang gen (Bảng 2), kết quả cho thấy trình tự nucleotide vùng upstream
gen bám dính của 10 chủng phân lập có mức tương đồng khá cao (96-99%) với trình
tự nucleotide vùng upstream gen bám dính các chủng trên ngân hàng dữ liệu
(NCBI). Trình tự các chủng phân lập 2ED4(TV), 13ED4(TG), 12ED4(DT) có mức
tương đồng thấp nhất 96%, các chủng phân lập còn lại có mức tương đồng 99% với
các dòng trên ngân hàng dữ liệu.
Bảng 2. Kết quả xác định tính tương đồng trình tự “upstream” của gen bám dính của
10 chủng vi khuẩn so với các chủng trên ngân hàng GenBank
S
ố
TT
Ch
ủng

vi khuẩn
phân lập
S

ố
nucleotide
Vi khu
ẩn t
ương đ
ồng tr
ên ngân

hàng dữ liệu
S
ố truy cập

T
ỉ lệ
tương
đồng
1

17ED4(CT)

444

Edwardsiella ictaluri

strain JF0278

AB469966.1

99%

2

21ED4(AG)

446

Edwardsiella ictaluri

strain PH0744

AB469964.1

99%

3

20ED4(AG)

445

Edwardsiella ictaluri

strain FPC1093

AB469962.1

99%

4

51ED4((TV)

473

Edwardsiella ictaluri

strain JCM1680

AB469968.1

99%

5

3ED4(TV)

449

Edwardsiella ictaluri

strain JF0278

AB469966.1

98%

6

2ED4(TV)

458

Edwardsiella ictaluri

strain PH07
44

AB469964.1

96%

7

42ED4(VL)

50
2

Edwardsiella ictaluri

strain FPC1093

AB469962.1

99%

8

13ED4(TG)

51
8

Edwardsiella ictaluri

strain JCM1680

AB469968.1

96%

9

12ED4(DT)

472

Edwardsiella ictaluri

strain JF0278

AB469966.1

96%

10

11ED4(DT)

446

Edwardsiella
ictaluri

strain JF0207

AB469965.1

99%

3.4 Kết quả phân tích đa dạng di truyền
Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm Mega 6 thể hiện mối quan hệ giữa 10
chủng vi khuẩn phân lập đại diện cho 6 tỉnh giải trình tự và 8 chủng trên ngân hàng
dữ liệu NCBI (Hình 3). Cây phả hệ chia thành 2 nhánh (cluster) lớn: nhánh lớn A
gồm 1 chủng12ED4(DT) và nhánh lớn B có 9 chủng phân bố ở 6 tỉnh. Nhánh B lớn
chia thành nhánh nhỏ B
1
gồm 2ED4(TV) và B
2
gồm 8 chủng còn lại, nhánh B
2
chia
thành 2 nhánh nhỏ là B
21
gồm 1 chủng 13ED4(TG) và nhánh B
22
gồm 7 chủng phân
bố ở 5 tỉnh.

8

Nhánh B
22
chia thành 2 nhánh nhỏ là B
221
gồm 1 chủng là 3ED4(TV) và B
222
gồm 6
chủng còn lại phân bố ở 5 tỉnh. Trong nhánh B
222
, chủng 51ED4(TV) và
42ED4(VL) lần lượt tạo thành 2 nhóm riêng với 4 chủng còn lại gồm 11ED4(DT),
17ED4(CT), 20ED4(AG), 21ED4(AG) và 4 chủng này có mối quan hệ gần nhất với
các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Các chủng phân lập có mức tương đồng
thấp (96%) với các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI 13ED4(TG), 2ED4(TV),
12ED(DT) có mối quan hệ xa với các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI so với các
chủng còn lại có mức tương đồng (98-99%) thể hiện trên cây phả hệ.
Chủng 12ED4(DT) tuy được phân lập từ tỉnh nước ngọt quanh năm nhưng lại có
quan hệ gần với các chủng phân lập từ các tỉnh có những tháng nước lợ như Trà
Vinh, Tiền Giang và có quan hệ xa với các chủng phân lập từ Vĩnh Long, Cần Thơ,
An Giang và Đồng Tháp (11ED4(DT)).


Hình 5. Mối quan hệ tiến hóa (cây phả hệ) của các chủngvi khuẩn
E. ictaluri được phân lập tại 6 tỉnh ĐBSCL và các chủng được so sánh trên ngân
hàng gen (B
i
). (Phương pháp Neighbor- joining, số lần giản đồ thiết lập: 1000 lần)

B
2
B
21
A
B
1
B
222
B
B
221
B
22
B
i

9

Bảng 3. Mức tương đồng giữa các chủng vi khuẩn phân lập (%)
Kí hi
ệu

STT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

CT17ED4

1

AG21ED4

2

97,9











AG20ED4

3

98,4

98,4

TV51ED4

4

98,4

98,4

98,9









TV3ED4

5

98,9

97,9

98,4

99,5








TV2ED4

6

98,9

96,8

97,3

97,3

97,9

VL42ED4

7

97,9

96,8

97,3

97,3

96,8

97,9






TG13ED4

8

9

8,4

96,8

97,3

98,4

98,4

98,4

97,9





DT12ED4

9

98,4

96,8

97,3

98,4

98,4

98,4

97,9

99,5




DT11ED4

10

97,3

97,9

97,9

98,9

98,4

96,8

96,2

97,3

97,3



IV.THẢO LUẬN
Kết quả phân lập vi khuẩn cho thấy các đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập
giống với mô tả của Plum, 1999; CrumLish et al., 2002; Từ Thanh Dung và ctv,
2004, vi khuẩn E. ictaluri Gram âm, hình que, có khả năng di động yếu, Catalase
dương tính và Oxidase âm tính, có khả năng lên men glucose, không sinh H
2
S và
indole âm tính. Theo kết quả phân lập cá tra bệnh được phân lập tại ĐBSCL của
Crumlish et al., (2002) cho thấy các chỉ tiêu đều âm tính ngoại trừ khả năng thủy
phân lysine và khả năng lên men glucose là dương tính. Như vậy kết quả của đề tài
này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Crumlish et al., (2002) và Plumb, 1999;
Crumlish et al., 2002; Từ Thanh Dung và ctv, 2004.
Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện vi khuẩn E. ictaluri đã được nhiều nghiên cứu
tiến hành trên nhiều gen khác nhau như vùng gen 16S rRNA (Đặng Thị Hoàng Oanh
và Đặng Thụy Mai Thy, 2009), gen eip18 với kích thước 480 bp (Trần Thị Thanh
Huyền và ctv, 2011). Do đó, việc phát hiện vi khuẩn này bằng kỹ thuật PCR rất
nhanh chóng và đặc hiệu, ứng dụng kỹ thuật này cho phép người nuôi chuẩn đoán và
phát hiện kịp thời cá tra bị nhiễm bệnh. Trong nghiên cứu này, đề tài đã định danh
14 chủng vi khuẩn phân bằng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng “upstream” của gen
bám dính bằng cặp mồi đặc hiệu Edi_F và Edi_R theo phương pháp của Sakai et al
(2009), kết quả của đề tài này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Sakai et al
(2009) với sản phẩm PCR có kích thước là 470 bp.
Theo nhiều nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền thì việc dựa vào gen 16S rRNA
được xem là một công cụ thích hợp cho việc xác định lịch sử tiến hóa và các mối
quan hệ phát sinh loài (Weisburg et al., 1991). Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc

Được và ctv (2013) dựa trên việc khuếch đại vùng gen 16S rRNA có kích thước
1200 bp cho thấy có sự khác biệt di truyền của 65 dòng vi khuẩn acid lactic từ các
vùng sinh thái nước ngọt, mặn, lợ ở ĐBSCL. Điều này khẳng định, các vùng sinh
thái khác nhau có ảnh hưởng tới quan hệ các dòng vi khuẩn acid lactic. Ngoài ra,
dựa trên việc vùng gen 16S rDNA, kết quả nghiên cứu Nguyễn Thị Pha và Nguyễn
Hữu Hiệp (2012) cho thấy sự khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn có khả năng
cố định đạm tại các huyện có vùng đất phù sa và các huyện có vùng đất nhiễm phèn
của tỉnh Đồng Tháp.

10

Trong nghiên cứu này, vi khuẩn E. ictaluri được khảo sát sự đa dạng di truyền dựa
trên vùng “upstream” của gen bám dính. Nghiên cứu của Sakai et al. (2009) cũng
dựa trên trình tự vùng gen “upstream” của gen bám dính để đánh giá sự đa dạng
dạng di truyền của các chủng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh có thời gian phân lập
khác nhau khác nhau, kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa các chủng vi
khuẩn E. ictaluri. Nghiên cứu đa dạng di truyền gần đây của Bartie et al., (2012)
dựa trên kỹ thuật phân tích macrorestriction của 59 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân
lập từ Mỹ, Việt Nam và Indonesia cho thấy có sự khác biệt di truyền giữa các chủng
vi khuẩn này với các chủng vi khuẩn phân lập từ Mỹ xếp vào một cụm trên cây phả
hệ, trong khi các chủng vi khuẩn phân lập từ Việt Nam và Indonesia chia thành một
cụm lớn và một cụm nhỏ, các chủng phân lập từ Indonesia được xếp vào cùng nhóm
với Việt Nam. Các dòng phân lập từ Việt Nam và Indonesia có mức tương đồng cao
64%, các dòng phân lập từ Mỹ có mức tương đồng thấp hơn so với 2 nhóm này.
Điều này chứng tỏ có sự khác biệt về di truyền theo vị trí và khoảng cách địa lý.
Kết quả của nghiên cứu này, mười chủng phân lập được chọn giải trình tự trong
nghiên cứu này có sự khác biệt di truyền không cao do các tỉnh nuôi ĐBSCL có vị
trí địa lý và đặc điểm tự nhiên khá giống nhau. Hơn nữa, nguồn giống mà các hộ
nuôi chọn mua từ các cơ sở ngoài tỉnh nên cá giống có thể mang mầm bệnh phân bố
từ tỉnh này sang tỉnh khác. Vùng sinh thái tỉnh Tiền Giang và Trà Vinh có vị trí tiếp

biển và có những tháng nước lợ nên các chủng phân lập có mối quan hệ gần gũi và
có sự khác biệt với các chủng được phân lập từ các vùng nước ngọt quanh năm như
Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, chứng tỏ vùng sinh thái ảnh hưởng di
truyền của loài vi khuẩn này. Chủng 12ED4 được phân lập từ Đồng Tháp có mối
quan hệ gần gũi với các chủng phân lập từ Trà Vinh, Tiền Giang và khác biệt nhiều
nhất với các dòng phân phân lập từ các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng
Tháp, có thể do sự biến đổi di truyền và góp phần vào sự đa dạng di truyền của vi
khuẩn E. ictaluri ở ĐBSCL.
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1 Kết luận
Để tài đã phân lập và định danh được 14 chủng vi khuẩn E. ictaluri. Các chủng có
mức tương đồng khá cao và có mức độ tương đồng cao với các chủng trên ngân
hàng gen (96-99%).
Kết quả khảo sát sự đa dạng di truyền cho thấy không có sự khác biệt nhiều về giữa
các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra bệnh gan thận mủ ở một số tỉnh
của ĐBSCL.
4.2 Đề xuất
Cần nghiên cứu sự đa dạng di truyền của vi khuẩn E. ictaluri dựa trên vùng 16S
rRNA khảo sát sự đa dạng vi khuẩn này hiện diện trên vùng nuôi cá tra khác nhau
hoặc trên nhiều loại cá khác để tìm hiểu thêm sự đa dạng và phong phú của vi khuần
này.
Cần nghiên cứu ứng dụng các giải pháp phòng và trị bệnh vi khuẩn khác như vắc-
xin để giảm rủi ro do bệnh do vi khuẩn gây ra.

11

LỜI CẢM TẠ
Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Quách Văn Cao Thi, chị Huỳnh Thị Diễm Trang,
anh Nguyễn Bảo Trung và các bạn trong tập thể lớp Nuôi trồng Thủy Sản K37 đã
tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Barrow, G.I., and R.K.A. Feltham., 1993. Cowan and Steel’s manual for
Identification of Medical bacteria. Cambridge University Press.
Bartie, K. L., Austin, F. W., Diab. A., Dickson, C., Dung, T. T., Giacomini.
M., and Crumlish, M., 2012. Intraspecific diversity of Edwardsiella
ictaluri isolates from diseased freshwater catfish, Pangasianodon
hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam.
Journal of Fish Diseases (2012), 35. 671-682.
Buller, B.N., 2004. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animal-A Practical
Identification Manual. CABI Publishing. 353 pp.
Crumlish, M., Dung, T. T., Turnbull., J. F, Ngoc, N. T. N., and Ferguson (2002).
Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish,
Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta,
Vietnam. Journal of Fish Diseasees 2002, 25, 733-736.
Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy (2009). Nghiên cứu công trình PCR
chuẩn đoán vi khuẩn Edwarsiella ictaluri trên thận cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus). Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 289-
292.
Dung, T.T., 2010. Edwardsiella ictaluri in Pangasianodon catfish: antimicrobial
resistance and the early interactions with its host. Department of Pathology,
Bacteriology and Avian Diseases Faculty of Veterinary Medicine, Ghent
University, Belgium. 136.
Frerichs, G. N., and S. D. Millar., 1993. Manual for the isolation and identification
of fish bacterial pathogent. Istitute of Aquaculture, University of Stirling,
Scotland. 60pp.
Hawke J.P., 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel
catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36:150–1512.
Kasornchndra, J., W.A. Rogers and J.A. Plumb., 1987. Edwardsiella ictaluri from
walking catfish, Clarias batrachus L., in Thailand. Journal of Fish disease:
10: 137-138.

Keskin., Secer., O. S., Izgur, M., Turkyilmaz. S., and R. S. Mkakosya., 2004.
Edwardsiella ictaluri infection in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss).
Turk J Vet Anim Sci, 28: 649-653.
Moore .E., Arnscheidt .A., Kruger .A., Strompl C., Mau. M., (2004). Simplified
protocols for the preparation of genomic DNA from bacterial cultures.
Molecular Microbial Ecology Manual, Second Edition 101: 3-18.
Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Hữu Hiệp, 2012. Khảo sát vùng gen 16S rDNA của một
số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm ở đất vùng rễ cây lúa ở tỉnh Đồng
Tháp. Tạp chí khoa học 2012 :23a, 184- 192

12

Nguyễn Thiện Nam, Phạm Thanh Hương, Trần Duy Phương, Từ Thanh Dung, 2010.
Nghiên cứu sự đa kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh
trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí Khoa học, Đại học Cần
Thơ. 2010: 14b, 200-210.
Phạm Thanh Hương, 2010. Nghiên cứu sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydophila gây bệnh trên cá tra
(Pangasianodon hypopthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt
nghiệp Cao học, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ.
Plumb, J. A., (1999). Health maintenance and principal microbial diseases of
cultured fishes. Iowa state Press, U.S. A
Sakai, T., Yuasa, K., Sano, M., & Iida. T, (2009): Identification of Edwardsiella
ictaluri and E. tarda by Species pecific Polymerase Chain Reaction
Targetedtothe Upstream Region of the Fimbrial Gene, Journal of Aquatic
Animal Health, 21:2(b), 124-132.
Sakai, T., Yuasa, K., Ozaki, A., Sano, M., Okuda, R., Nakai, T., and Iida, T.,
(2009). Genotyping of Edwardsiella ictaluri isolates in Japan using
amplified-fragment length polymorphism analysis. Agency, 422-1(a)
Nakatsuhamaura, Minami-ise, Mie 516-0193, Japan.

Trần Ngọc Được và ctv, 2013. Khảo sát tính đa dạng sinh học vi khuẩn acid lactic
phân lập tử cơm mẻ ở ba vùng sinh thái của Đông bằng Sông Cửu Long. Tạp
chí khoa học, Đại học Cần Thơ. Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công
nghệ sinh học 25(2013), 58-66.
Trần Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Trung, Trương Nam Hải, 2011. Phát hiện vi
khuẩn Edwarsiella Ictaluri gây bệnh trên cá tra Việt Nam bằng Kỹ thuật
PCR. Tạp chí Công nghệ sinh học 9(1), 61-65.
Từ Thanh Dung, Crumlish, M., Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và
Đặng Thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn trắng gan trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ.
2004,137–142.
Weisburg, W. G., Barns. S. M., Pelletier D. A., and Lane D. J., Bacteriol J., 1991.
16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic study. 73: 697.
Yuasa, K., Kholidin E.B., Panigoro N., and Haiti. K., 2003. First isolation of
Edwardsiella ictaluri from cultured striped catfish Pangasius hypophthalmus
in Indonesia. Fish Pathology, 38, 181-183.