Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ aspergillus niger bằng phương pháp lên men rắn

LỜI CAM ĐOAN
Xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Lê Thị Nhanh với sự hướng
dẫn của Ts. Trần Thanh Trúc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Một số
yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng họp protease từ Aspergillus niger bằng
phương pháp lên men rắn” đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Người viết
Trần Thanh Trúc
Người hướng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
Lê Thị
LỜI CẢM ƠN
Em cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi được thực hiện luận văn tốt nghiệp dưới
sự hướng dẫn của Trần Thanh Trúc.
Lời cảm ơn đầu tiên, em xin được gởi đến Cô Trần Thanh Trúc đã giành nhiều thời
gian và công sức để tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn
thành luận văn tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mười, Thầy luôn đóng góp
cho em rất nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian hướng dẫn, cùng em tìm
hướng giải quyết cho những vấn đề mới phát sinh để có kết quả thu nhận tốt nhất.
Trong suốt quá trình làm luận văn, em cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt
tình cũng như sự ủng hộ, động viên to lớn của Chị Lê Thị Bảo Ngọc và các anh chị
trong phòng thí nghiệm D006, các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm K36.
Xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm
- khoa Nông Nghiệp và Sinh Học ứng Dụng, trường Đại học cần Thơ, đã tận tình giảng
dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trinh
học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin được gởi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sự khuyến
khích, ủng hộ đã dành cho em trong suốt chặng đường để hoàn thành được luận văn
này.

XŨ1 chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Nhanh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -2-
TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát một số yểu tổ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ
Aspergillus niger bằng phương pháp lên men rắn ” được thực hiện với mục tiêu
nghiên cứu khảo sát một số điều kiện lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
protease ưa acid trên môi trường ran (SSF) với dòngA.niger đặc hiệu.
Kết quả nghiên cứu đã xác định được điều kiện lên men rằn sinh tổng hợp protease
từ dòng A. niger S5 dựa irên việc khảo sát một sổ yểu tố như cơ chẩt lên men phù
hợp, tác động của độ ẩm, pH, nhiệt độ và thời gian ủ đến hiệu quả thu nhận protease.
Kết quả cho thấy bột đậu nành là cơ chất cho hiệu quả lên men tổng hợp protease tốt
nhất. Quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất khi sử dụng dung dịch đệm citrate -
phosphate có pH 5 để điều chỉnh độ ẩm môi trường ban đầu, đồng thời môi trường
lên men bổ sung dinh dưỡng và khoáng chất gồm yeast extract (0,5%), K
2
HP0
4
(0,4%), NaCl (0,1%), MgS0
4
(0,05%), thời gian ủ thích hợp là 72 giờ ở nhiệt độ 31
°c. Ước tính hoạt tỉnh pro tease đạt được ở điều kiện lên men tốt nhất là 0,126
±0,012 u/g cơ chất.
Từ khóa: Asversillus nieer. bột đậu nành, hoạt tính cao, lên men
ran SSF, protease acid.
MỤC LỤC
soOos

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -3-
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sình học ứng dụng - V-
DANH SÁCH HÌNH
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -5-
DANH SÁCH BẢNG
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
A. niger Aspergillus niger
CFU Colony Forming Unit (mật số bào tử hình thành)
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
EGTA Ethylene Glycol Tetra Acetic acid
KCN Khu Công Nghiệp
PMSF Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
rpm revolutions per minute
SSF Solid State Fermentation
TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn
TTHĐ Trung Tâm Hoạt Động
u
Đơn vị hoạt tính enzyme
u/g Units per weight (gram) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 g cơ chất)
U/mL Units per volume (mL) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 mL cơ chất)
v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lượng)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -7-
CHƯƠNG 1 MỞ ĐÀU
1.1 TỔNG QUAN VÈ ĐỀ TÀI

Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong thực tiễn và được
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y tế, nghiên cứu khoa
học Trong công nghiệp thực phẩm, protease đã có những đóng góp rất to lớn trong
việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người. Protease được sử dụng trong các quá
trình đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản
xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm Protease chiếm khoảng
60% thị trường enzyme công nghiệp (Rao et al., 1998). Trong đó, protease được thu
nhận từ vi sinh vật chiếm khoảng 40% sản lượng enzyme được bán trên toàn thế giới
(Godfrey và West, 1996). Protease được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như
động vật (gan, dạ dày ), thực vật (đu đủ, khóm ) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm ).
Trong đó, protease có nguồn gốc vi sinh vật có vai trò to lớn trong các ngành sản xuất
công nghiệp. Hiện nay trên thế giới công nghệ thu nhận protease tò vi sinh vật hiện
đang nhận được sự quan tâm rất lớn.
Nấm mốc được sử dụng như nguồn sinh tổng hợp protease phổ biến hiện nay và được
xem như nguồn thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công
nghiệp. Nguồn sinh tổng hợp protease từ nấm mốc ổn định, không phụ thuộc theo
mùa và vi sinh vật sinh trưởng nhanh trên môi trường đơn giản, rẻ tiền (Nguyễn Thị
Thảo và Quyền Đình Thi, 2004). Ngoài ra, enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn
enzyme được thu nhận từ động vật và thực vật do chúng có hoạt tính thủy phân cao
hơn và sản lượng lớn hơn. Khoảng 2% vi sinh vật trên thế giới đã được xác định có
khả sinh tổng hợp các loại enzyme khác nhau (Padmavathi, 2013).
Aspergillus niger (A. niger) là dòng nấm sợi phân bố rất rộng rãi trên nhiều loại cơ
chất tự nhiên và trong các sản phẩm nông công nghiệp (Pansear et al., 2010), được
biết đến với khả năng sinh tổng họp protease (Paranthaman et al., 2009). Tuy nhiên,
không phải tất cả nấm mốc đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả những
dòng cùng một giống cũng không có khả năng sinh tổng họp enzyme với hoạt tính
tương đồng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ngoài ra, để sản xuất enzyme từ vi sinh vật,
quá trình lên men rắn (SSF) thường được thực hiện. Đây là phương pháp được sử
dụng rộng rãi để sản xuất protease. Quá trình này sử dụng các cơ chất rẻ tiền thường
là các phụ phẩm nông nghiệp với các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men nhằm đạt

giá trị thu hồi protease cao nhất (Qazi et al., 2008).
Các ngành công nghiệp nói chung và công nghiệp thực phẩm nói riêng đang trên đà
phát triển. Điều này hứa hẹn cho một nhu cầu to lớn về protease. Mặt khác, các phụ
phế phẩm dồi dào của nước ta có thể sử dụng như nguồn cơ chất cho quá trình sản
xuất protease ưa acid từ A. niger. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất
lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD -8-
Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang được nghiên cứu
trong nhiều năm qua. Tuy nhiên, những kết quả đạt được trong lĩnh vực này vẫn chưa
đáp ứng được việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này
trong đời sống.
Việc nghiên cứu cải thiện và nâng cao hoạt tính protease được thu nhận từ vi sinh vật,
thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình tổng họp enzyme này là vấn đề
cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Chính vì vậy, nghiên cứu về khả năng sinh
tổng họp protease cần được tiến hành một cách cụ thể thông qua các bước khảo sát
các điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng họp protease từ dòng nấm mốc trên.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài này là tìm ra điều kiện lên men thích hợp cho
quá trình sinh tổng họp protease ưa acid trên môi trường rắn (SSF) với dòng A.niger
đặc hiệu.
Từ mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài đưa ra các nội dung nghiên cứu sau:
1) Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến quá trình lên men rắn sinh tổng họp protease.
2) Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng thu nhận protease có
hoạt tính cao từ Aspergillus niger.
3) Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình sinh tổng họp protease.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình tổng họp
protease ở các nhiệt độ khác nhau.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD -9-

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE
2.1.1 Tồng quan
Protease (hay còn gọi là proteinase hoặc peptidase) nằm trong lớp các enzyme thủy phân
hydrolase, ỉà nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)
n
của chuỗi polypeptide trong phân tử protease đến sản phẩm cuối cùng là các acỉd amin.
Hình 2.1: cấu trúc không gian protease
Nguồn: hoahocngaynay.com
Thông thường protease được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptỉdase
(Rao et al, 1998).
Protease
Endopeptidase
p
Serine protase
Cystein proteases
Exopeptìdase
Aminopeptidase
Metallo
protease Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease
Nguồn:
> Exopeptidase: tách liên kết peptide ở gần cuối của chuỗi polypeptide. Dựa theo vị trí
hoạt động của các enzyme này, exopeptidase được phân loại tương ứng thành
aminpeptidase và carboxypeptidase.
• Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự do của chuỗi polypeptide
để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
• Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu c tự do của chuỗi polypeptide
để giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
> Endopeptidase: cắt các liên kết peptide ở vùng bên trong của chuỗi polypeptide. Tùy
theo động học cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm: serine protease,

protease aspartic, protease cystein và metalloprotease.
• Serine protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serin trong trung tâm hoạt
động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serin
protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
• Protease aspartic: Hầu hết các protease aspartic thuộc nhóm pepsin (các enzyme tiêu
hóa: pepsin, chymosin, cathepsin, renin) có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
• Protease cystein: chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động, thường hoạt động ở pH
trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
• Metallo proteinase: thường tím thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc
cao hon. Metallo proteinase hoạt động ở pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác
dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease còn được phân loại theo khoảng pH hoạt động, và được chia thành:
+ Protease acid: pH 2 - 4 +
Protease trung tính: pH 7 - 8 +
Protease kiềm: pH 9 - 11 (Ahmed
et al., 2011).
2.1.2 Tính chất của protease ưa acid
Protease ưa acid (EC 3.4.23) còn được gọi là aspartic acid protease. Đây là một
endopeptidase với khối lượng phân tò dao động trong khoảng từ 30 - 45kDa. Enzyme
này có khả năng hòa tan trong nước và hoạt động tối ưu ở độ pH thấp (Vishwanatha et
al., 2009). Điểm đẳng điện của protease ưa acid nằm trong khoảng pH 3,0 - 4,5. Trung
tâm hoạt động của enzyme này có chứa chuỗi trình tự các acid amin Asp-Xaa-Gly, trong
đó Xaa có thể là Ser hoặc Thr. Các protease ưa acid bị ức chế bởi pepstatin (Fitzgerald
et al., 1990).
Ngoài ra, các hợp chất diazoketone như diazoacetyl-dl-norleucine methyl ester (DAN)
và l,2-epoxy-3 (p-nitrophenoxy) propan (EPNP) ừong sự hiện diện của các ion đồng
cũng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme này (Rao et al., 1998).
Protease ưa acid thường được tiết ra bởi nấm (Tremacoldi et al, 2004). Một số protease

ưa acid tiết ra từ các dòng Aspergillus gọi aspergillopepsin (Percin et al., 2009) và có
hoạt động tối đa ở pH 3 - 4 (Rao et al., 1998)
2.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease
Trong trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc
trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung
về TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau
(Nguyễn Đức Lượng, 2004):
- TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và một số trường hợp còn có cả
cofacto kim loại. Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21°A, có thể phân
biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với gốc aa
trong phân tử cơ chất. Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ
của các tinh thể protease acid của Rhizopus chinenis và Endothia parasỉlica đã cho thấy
phân tò các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20°A. Khe
hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 vầAsp-215 xếp đối diện nhau trong
khe ấy.
- Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu
trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphite.
2.1.4 Ctf chế phản ứng của enzyme protease
Những enzyme peptidase đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông
qua hai bước chính (Barrett, 1994):
• Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị với nguyên tử cacbon trong nhóm
cacboxyl của phân tò cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhỏm imidazole từ histidine. Kết quả
phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng
cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thảnh một acyl-
enzyme, vòng imidazole và một amine (phản ứng khử) (Fastrez and Fersht, 1973).
• Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H
2
0 theo chiều
ngược lại của bước một để tái sinh lại enzyme.
2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến động học protease

Giống như các enzyme khác, các nghiên cứu đối với protease cũng khẳng định, biến đổi
động học của enzyme này chịu ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ enzyme, nồng độ
cơ chất, pH, nhiệt độ cũng như tác động của các chất hoạt hóa và kìm hãm (Ly Nguyên,
2004; Duvetter, 2007; Arotupin et al., 2008).
2J.5J Anh hưởng của nồng độ cơ chất
Các nghiên cứu đối với protease cho thấy, phản ứng của protease thuộc trường hợp đơn
giản nhất - chỉ có một cơ chất, theo phương trình 1.1:
E+SỊ
k
' >ES »E+P
*- (1.1)
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, P: sản phẩm; ki, kLi là hằng số tốc độ phản ứng tạo
thành phức chất £S và phân ly phức chất ES thành E và s, k
2
là hằng sé tốc độ phản ứng
tạo thành E và p (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Với sự biến đổi động học phản ứng theo phương trình một cơ chất, hằng số Micheaỉỉs -
Menten cũng được ứng dụng để thể hiện tốc độ củâ phản ứng và đặc trưng cho protease.
Ở giai đoạn đầu phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và nồng độ cơ chất
thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng
độ cơ chất tiếp tục tăng, đường biễu diễn uốn cong và với nồng độ cơ chất cao thì vận
tốc không còn gia tăng nữa và đường biễu diễn tiệm cận với giá trị Vmax-
Hình 2.4: Phuưng trinh Michealis - Menten
K
m
là hằng số Michealis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc Vi vận tốc

Hằng số K
m
tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme cũng như phương pháp xác định hoạt tính.

So với giá trị K
m
tìm được từ protease nguồn gốc thực vật, hằng số K
m
của protease từ
nấm mốc đều có giá trị cao hơn. Nói cách khác, ái lực của protease từ nấm mốc đối với
cơ chất thấp hơn hay độ nhạy của protease từ nấm mốc kém hơn protease từ thực vật
(Duvetter, 2007).
2.1.5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của pro tease
Hoạt tính của protease phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường. pH môi trường ảnh hưởng
đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó, phức chất
enzyme - cơ chất và độ bền của enzyme. (Đậu Thị Kim Dung, 2006).
Mỗi enzyme hoạt động trong một dãy pH khác nhau, pH tối ưu của đa số enzyme vào
khoảng giá trị trung tính (6 - 8). Tuy nhiên, đối với protease từ nấm mốc thì pH hoạt
động tối ưu dao động trong khoảng 4,5 + 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007).
2.1.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động pro tease
Giống như các phản ứng của enzyme khác, tốc độ của phản ứng phân giải peptit do
protease sẽ gia tăng cùng với sự gia tăng nhiệt độ đến một mức tối ưu, sau đó hoạt tính
của protease giảm. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease dao động trong khoảng từ
30 -ỉ- 40°c, phụ thuộc vào nguồn enzyme. Mặc dù vậy, trong điều kiện thay đổi áp suất,
nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cũng thay đổi (Verlent et al.,2004; Castro et
al., 2006; Sila et al., 2007).
2.1.5.4 Ảnh hưởng của cation kim loại đến hoạt động của pro tease
Các cation kim loại thường được sử dụng với vai trò chất hoạt hóa đối với hoạt động
của enzyme (Marangoni, 2003). Hoạt động của protease gia tăng cùng với sự tăng nồng
độ cation kim loại và đạt đến giá trị tối ưu, ở trên điểm này hiệu quả hoạt động của
enzyme thường giảm. Ở nồng độ cao, cation kim loại ức chế hoạt động của enzym. Điều
này được hiểu dựa trên nhóm carboxyl bị khóa bởi cation kim loại, phản ứng enzyme
không xảy ra và đây là nguyên nhân ức chế khi có nồng độ cation kim loại cao (Nari et
al., 1991). Theo Leiting và Wicker (1997) ở cùng mức độ ion hóa, các cation hóa trị II

kích hoạt protease khác nhau. Đối với protease được ly trích từ việc lên men chủng
Acinetobacter sp. NQ6, K
+
, Na
+
, Mg
2+
là những ion hoạt hóa mạnh, có khả năng làm
tăng hoạt tính protease, còn ion Ca
2+
có ảnh hưởng không đáng kể. Ion Zn
2+
chỉ ức chế
protease ở nồng độ cao 10-20 mM. Các ion kim loại khác Cu
2+
, Co
2+
, Pb
2+
và Hg
2+
ức
chế protease ngay ở nồng độ thấp 2 mM và ức chế hoàn toàn ở nồng độ cao đối với Pb
2+
và Hg
2+
Chất tạo gọng kìm EDTA kìm hãm protease hoàn toàn ở mọi nồng độ (Quyền
Đình Thi, 2007).
2.1.5.5Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độngprotease
Một yếu tố thường ảnh hưởng đến sự ổn định protein là sự phân giải bởi chính

protease có mặt trong môi trường. Biện pháp an toàn nhất để giảm bớt sự phân giải
protease là làm việc nhanh trong môi trường lạnh hoặc sử dụng các chất kìm hãm
protease. Chất kìm hãm hoạt động protease được sử dụng tùy thuộc vào từng loại
protease. Một số chất ức chế thông dụng được trình bày ở bảng 2.1.
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thuộc công nghiệp thực phẩm,
công nghiệp nhẹ, dược phẩm, nông nghiệp, nghiên cứu khoa học Yêu cầu trên toàn
thế giới về enzyme này gia tăng ngày càng nhanh chóng (Vishwanatha et al., 2009).
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân
một phần protein trong thịt, làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Tẩm
hỗn họp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt), tiêm dung dịch enzyme vào thịt
(tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ) (Nguyễn Thị Tuyết Mai,
2006).
Trong chế biến thủy sản, enzyme protease được sử dụng nhằm rút ngắn thời gian làm
và cải thiện hương vị của nước mắm (Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2006).
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm
đông tụ sữa của chúng. Và ứng dụng này đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công
nghiệp sữa trong quá trình sản xuất pho mát (Neelakantan et al., 1999). Protease từ
một số vi sinh vật như : A. candidus, p. roquerti, B. mesentericus, được dùng ừong
sản xuất phomat (Trần Xuân Ngạch, 2007). Trong sản xuất bánh
mì, bánh quy, protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ
xốp, nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền
của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của Aspergillus Oryzae dùng để thủy phân
protease trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn (Lê Xuân Phương, 2001).
Bảng 2.1: Các chất ức chế protease thông dụng
Chất ức chế protease Loại protease Nồng độ sự dụng
PMSF Serine protease 0,1-lmM
Aprotinin Serine protease 5 (j,g/mL
Benzamidin Serine protease 1 mM
Pepstatin A Acid protease 1 ng/mL

Leupeptin Thiol protease 1 |j,g/mL
EDTA & EGTA Protease kim loại 0,1-lmM
Nguồn: Phan Thị Bích Trâm (2011)
2.1.6 Tầm quan trọng của việc sử dụng protease trong thực tiễn
Protease ưa acid còn có ứng dụng trong sản xuất vật liệu gia vị, thủy phân protein, giúp
làm tăng nồng độ của các acid amin trong quá trình lên men của nước tương (Rao etal.,
1998).
Bên cạnh đó, protease ưa acid cũng là một yếu tố rất hữu ích trong ngành công nghiệp
da và lông thú ( />2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Aspergillus nỉger
2.2.1 Giói thiệu chung
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên các
cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng địa lý khác
nhau trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất
enzyme (điển hình như a - amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong
công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid
citric, acid gluconic, .(Pansear et al., 2010).
Nấm mốc là vi sinh vật có thay đổi đáng kể trong lịch sử phân loại. Các nghiên cứu khởi
đầu đã phân chia nấm thuộc ngành Thallophyta thuộc giới phụ Cryptogamae, giới
Plantae (thực vật). Các khảo sát về đặc tính cấu trúc dưới kính hiển vi tiếp theo đã
chứng minh nấm không thuộc thực vật lẫn động vật (Sumbali, 2005). Samson và van
Reenen-Hoekstra (1988) đã phân chia nấm thật thành 4 lớp: Phycomycetes,
Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes. Hệ thống phân loại này đã tồn tại
một thời gian dài và A. niger được phân loại thuộc giới nấm (Fungi), ngành phụ nấm bất
toàn Deuteromycotina, lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae, chi
Aspergillus và loài Aspergillus niger (Samson và van Reenen- Hoekstra, 1988).
Tuy nhiên, vói sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70 của thế
kỷ XX, bắt đàu tò nghiên cứu phân chia nhỏm của Whittaker (1969, trích dẫn bởi
Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi Sumbali, 2005) đã
đề nghị khỏa phân loại mới cho giới nấm nói chung và A. niger nói riêng thuộc:
Ngành: Amastigomycota

Ngành phụ: Ascomycotina
Lóp: Ascomycetes
Lóp phụ: Plectomycetidae Bộ: Eurotiales
Họ: Eurotiaceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus niger
Nguồn: Sumbali, (2005)
Với đặc điểm chính trong họ Eurotiaceae là bào tử đính ở dạng thể bình (Cao Ngọc Điệp
và Nguyễn Văn Thành, 2010).
2.2.2 Đặc điểm hệ sọỉ của nấm Aspergillus nỉger
Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:
- Khuẩn ty dinh dưỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thước nhỏ, màu trắng.
Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trường nuôi cấy để hút
dưỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng.
- Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty
dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt. Khuẩn ty sinh sản hướng vào không khí để lấy oxy, có
khả năng tạo bào tử khi già.
Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành các
hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình thành các
bào tò đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen.
(Nguồn: Klich, 2002; Samson et al., 2007)
2.2.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản
Aspergillus niger là loại nấm không có giai đoạn sinh sản hữu tính, A. niger sinh sản vô
tính chủ yếu bằng bào tử đính (Gams, 1985) (hình 2.3).
Hình 2.3: Hình thái Aspergillus sp.
(a) khối bào tử đỉnh, (b) bào tử đỉnh, (c) tể bào gốc, (đ) cuống thể bình và thể
bình Nguồn: Onion et al, (198ỉ)
Cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào tử dính phát triển từ một tế
bào có đường kỉnh lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là tế bào
gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dài với phần đỉnh phồng

to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề mặt túi là các
cuống thể bình màu nâu, dài 10 - 15 ịj.m, là nơi sinh ra các thể bình. Thể bình có một
tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình
thành chuỗi hưáng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non
nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già). Bào tử đính hình cầu, thường dẹt,
đường kính 4-5 ịim, nhưng thường nhỏ hơn (Onions et al., 1981). Loài A. niger được
phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử dính màu đen.
2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG VÀ CÁC ĐIÈU KIỆN LÊN MEN ĐÉN
QUÁ TRÌNH SINH TỒNG HỢP PROTEASE
2.3.1 Vai trò của co' chất trong quá trình sinh tồng hợp protease
Các loại nắm mốc ừong tự nhiên có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống. Với mồi
nguồn cơ chất nhất định, chúng sẽ sinh tổng hợp enzyme tương thích, đặc hiệu vởỉ cơ
chất đó nhằm chuyển cơ chất từ dạng phức tạp khó hấp thu thành dạng cơ chất đơn giản
dễ hấp thu (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nói cách khác, muốn thu nhận enzyme nào thì
phải có sự hiện diện của cơ chất đặc hiệu với enzyme đó trong môi trường nuôi cấy
(Rombouts và Pilnik, 1981). Tác động của cơ chất đặc hiệu đạt hiệu quả cao khi ở một
nồng độ nhất định. Nếu vượt quá nồng độ tối đa cho phép thì khả năng sinh tồng hợp sẽ
giảm (Rombơuts và Pilnik, 1981).
Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết đỉnh khả năng sinh tổng hợp
protease cũng như các enzyme khác từ vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có
đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng họp
enzyme (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010; bảng 1.2).
Bảng 2.2: Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào
2.3.1.1 Ảnh hưởng của thành phần đa lượng
Trong các yếu tố ảnh hưởng của thành phần môi trường, nguồn carbon là thảnh phần
đầu tiên, đóng vai trò đặc biệt trong sự phát triển của vi sinh vật. Trong quá trình sinh
tổng hợp protease, nguồn carbon có độ methoxyl hóa cao và đơn phân tò như acid
pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác thường được sử dụng. Các
thành phần này không chỉ đóng vai trò đơn thuần là nguồn carbon cho sự phát triển của
vi sinh vật, mà còn là một cơ chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp

nấm mốc Aspergillus sp.
Nguyên tô Nguôn gôc Chức năng
Thức ăn đa lượng
Carbon
Hợp chât hữu cơ hoặc
CO2
Xây dựng thành phân vật chât cơ bản
của tế bào
Oxygen
H
2
0, hợp chất hữu cơ,
C0
2
, Nước
Xây dựng nên vật chât và nước trong tê
bào, O2 là chất nhận điện tử trong hô
hấp hiếu khí
Nitrogen NH
3
NO3', hợp chât Xây dựng nên acid amin, nucleotide của
hữu cơ, CO2, N2 acid nucleic và coenzyme
Hydrogen H
2
0, hợp chất hữu cơ,
h
2
Xây dựng nên các hợp chât hữu cơ.
Tham gia các quá trình sinh năng
lượng như các proton

Phospho Phosphate vô cơ
Xây dựng nên các acic
nucleic,
nucleotide, phospholipid, acid teichoic
Thức ăn vi lượng
SO4
2
H2S, SO2, hợp Xây dựng nên cystein, methionine,
Lưu huỳnh
chất hữu cơ chứa lưu
huỳnh
glutathione và nhiều coenzyme
Kali Muối kali Xây dựng nên các cation vô cơ của tê
bào và là đồng nhân tố của các enzyme
Dạng các cation vô cơ của tê bào và là
Magie Muối magie
đồng nhân tố cho nhiều phản ứng
enzyme
Calcium Muối Calcium Cation vô cơ là đông nhân tô cho nhiêu
enzyme và là cấu phần của nội bào tử
Câu phân của cytochrome và các protein
Săt Muôi săt
khác cũng là đông nhân tô cho một sô
phản ứng enzyme
Nguồn: Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành (2010)
protease. Nguồn nitrogen cũng có vai trò như chất cảm ứng, ảnh hưởng không nhỏ đến
quá trình sinh tổng họp protease. Nitrogen tham gia vào quá trình tạo protein, acid
nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Tuy nhiên, khi nồng
độ nitrogen tăng cao sẽ là chất kìm hãm cho sự sinh tổng hợp enzyme. Tỷ lệ giữa carbon
và nitrogen trong môi trường, hay tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon

và nitrogen có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối của vi sinh vật và sự tạo
thành enzyme (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991). Môi trường có đủ lượng carbon và
nitrogen cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không
được bù đắp bằng sự dư thừa của cấu tử kia (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
Ngoài ra, do acid amin là những cấu tử họp thành phân tử enzyme, acid amin có ảnh
hưởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng như quá trình sinh tổng họp enzyme. Acid
amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitrogen và là nguồn năng lượng
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng
Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và tổng họp enzyme
của vi sinh vật. Phospho cần để tổng hợp các họp phần quan trọng của sinh chất và
nhiều coenzyme, đồng thòi để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy hóa sinh học.
Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác. Cation
Mg
2+
có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme tuy nhiên MgS0
4
sẽ có ảnh hưởng xấu
đến sự tổng họp enzyme bởi nấm sợi. Trong khi đó, lưu huỳnh - có mặt trong các acid
amin quan trọng như methionine, cysteine, có vai trò tích cực trong việc kích thích sự
hình thành enzyme. Ngoài ra, calcium, mangan, corban, cũng ảnh hưởng đến sự tổng
họp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Nhìn chung, thành phàn khoáng được sử dụng trong nuối cấy protease khá ổn định, chủ
yếu thành phần là: yeast extract (0,5%), K2HPO4 (0,4%), NaCl (0,1%), MgS0
4
(0,05%)
(Man et al., 2011).
Mặc dù thành phàn cơ chất lên men có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc, tăng
khả năng tổng hợp enzyme nhưng các điều kiện lên men điển hình như nhiệt độ, thời

gian, độ ẩm hay pH ban đầu của môi trường ủ là những yếu tố có sự chi phối rất lớn đến
quá trình phát triển và hình thành enzyme .
2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nuôi cấy và khả năng sinh enzyme
của vi sinh vật. ở nhiệt độ thấp, sản lượng protease thu được không cao (Damare et al.,
2006). Tuy nhiên ở nhiệt độ cao, quá trình trao đổi chất và phát triển của vi sinh vật bị
hạn chế (Haq et al., 2006). Đồng thời, enzyme protease bị biến tính và mất hoạt tính xúc
tác do sự kéo dài và phá vỡ của các liên kết hydro trong cấu trúc của enzyme (Conn et
al., 1987). Nhiệt độ tối ưu của các loài Aspergilus khác nhau thì khác nhau và nằm trong
khoảng 30°C-40°C (Coral et al. 2002; Charles et al., 2008; Negi và Baneijee 2010).
2.3.3 Độ ẩm môi trường
Thành phần nước chiếm từ 70 -ỉ- 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật, tất cả quá trình
phân hủy thức ăn và các phản ứng chuyển hóa các chất trong tế bào đều diễn ra với sự
có mặt của nước. Độ ẩm cao ảnh hưởng đến độ thoáng khí, ngược lại độ ẩm thấp quá sẽ
kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng tạo enzyme (Lê
Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010).
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối ưu của môi trường là 58 -ỉ- 60% và sự duy
trì độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi đóng vai trò quan trọng. Độ ẩm
tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hon 50% làm kìm hãm sự sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như giảm hiệu quả hình thành enzyme (Pandey
et al., 2000). Khi nuôi cấy trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi
trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60% để tránh sự nhiễm khuẩn, vi sinh
vật lạ (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.4 Điều kiện pH ban đầu của môi trường
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm
ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích sau lên men thường ít thay đổi trong suốt thời gian
nuôi cấy. Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường ủ có ảnh hưởng không nhỏ đến
sự phát triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme. Giá trị pH tối ưu của enzyme có
nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 5,5 (Trần Xuân Ngạch,
2007). Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc điểm từng enzyme, loại cơ chất và nguồn nấm

mốc, giá trị pH tối ưu cho hoạt động của vi sinh vật lên men, tạo ra enzyme là khác
nhau. Thêm vào đó, trong quá trình sinh tổng hợp enzyme, pH thường giảm nhẹ vào
thời gian đàu do sự phân hủy các chất, điển hình như sự chuyển hóa các protein thành
các acid amin mang tính acid, sau đó pH thường tăng dần do quá trình trao đổi chất tạo
ra các chất mang tính kiềm như ammonium, Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc
vào nguồn vi sinh vật và sản phẩm tạo thành (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010).
Theo O'Donnell et al., (2001) Aspergillus niger có khả năng giảm pH xuống sau hai
ngày lên men.
2.3.5 Ảnh hưởng của thời gian ủ
Thời gian lên men ảnh hưởng đáng kể đến việc sinh tổng hợp enzyme cũng như hoạt
tính của enzyme. Vi sinh vật cần thời gian để phát triển và sản sinh enzyme. Tuy nhiên,
khi thời gian ủ quá dài, môi trường cạn dần chất dinh dưỡng, vi sinh vật phát triển kém
và do đó hoạt tính enzyme sẽ giảm. Khảo sát thực nghiệm là phương pháp phổ biến để
xác định được thời gian nuôi thích họp giúp thu được enzyme có hoạt tính cao và hiệu
suất thu hồi lớn (Radha, 2012). Việc tạo bào tò là hiện tượng không mong muốn vì
thường làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với A. niger, quá trình sinh tổng họp enzyme
nhiều nhất thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
2.3.6 Ảnh hưởng của phương thức lên men đến quá trình tổng họp protease
Trong việc sản xuất protease từ vi sinh vật, cả hai kỹ thuật: lên men chìm (SmF) và lên
men bề mặt (SSF) đều có thể được sử dụng (Pandey et al., 2001; Mukhtar và Haq,
2008). Tuy nhiên, quá trình lên men trạng thái rắn là một phương pháp thích hợp để sản
xuất protease ưa acid từ nấm (Tremacoldi et al., 2004). Các nghiên cứu trước đã cho
thấy enzyme thu được từ phương pháp SSF có hoạt tính cao hơn so với phương pháp
SmF khi nuôi cấy trên cùng loại vi sinh vật và cơ chất lên men (Viniegra-Gonzalez et al,
2003). Tuy nhiên, lý do vi sinh vật sản xuất ra enzyme trên môi trường ran SSF có hoạt
tính cao hơn trường họp sử dụng môi trường lỏng SmF vẫn chưa được giải thích cụ thể.
Nhìn chung, sự khác biệt quan trọng giữa quá trình lên men SmF và SSF là độ ẩm môi
trường. Do độ hoạt động của nước trong môi trường lên men SmF rất cao nên mức độ
nhiễm vi sinh vật không mong muốn gia tăng (Patil et al., 2006). Hesseltine (1977) đã

chỉ ra một số thuận lợi và bất lợi của SSF so với SmF.
2.3.6.1 Thuận ỉợi
- Môi trường nuôi cấy đơn giản;
- Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường rắn hoặc bổ sung thêm một
số chất dinh dưỡng;
- Sản phẩm thu nhận có nồng độ cao, dễ dàng tinh sạch;
- Sử dụng kết họp các cơ chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật, bào tử hoặc tế bào;
- Độ ẩm thấp và mật số nấm mốc lớn nên hạn chế được sự lây nhiễm của nhiều loại vi
sinh vật khác;
- Lượng tạp chất sinh ra thấp hơn trong SmF;
- Enzyme ít nhạy cảm với các chất ức chế dị hóa hoặc cảm ứng;
- Trong điều kiện thiết bị đơn giản, không có thiết bị phản ứng sinh học, việc lên men SSF
là phương thức hiệu quả, dễ thực hiện, có tính khả thi cao.
23.6.2 Bất lợi
- Các vi sinh yật nuôi cấy bởi phương pháp SSF bị hạn chế bởi rào cản về độ ẩm của môi
trường;
- Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, oxy tự do, CO2 là một vấn đề khó khăn do
thiếu thiết bị kiểm tra sản xuất (pectinases, amylase, protease ưa acid,
amyloglucosidases, ) ở quy mô công nghiệp (Lonsane và Ghildyal, 1992).
Ngoài ra, Mitchell và Lonsane (1992) cũng đã nêu ra ưu điểm của SSF là: phương pháp
đơn giản, chi phí sản xuất thấp hơn, sản lượng enzyme cao và nước thải đầu ra thấp. Do
vậy phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi để sản xuất protease. Trong quá trình
lên men SSF các phụ phẩm nông-công nghiệp thường được coi là các chất nền tốt nhất
(Pandey et al., 1999).
2.4MỘT SỐ NGHIÊN cứu CÓ LIÊN QUAN
Haq et al. (2004) đã khẳng định được bột đậu nành là sản phẩm nông nghiệp tốt nhất có
khả năng sử dụng như cơ chất chính cho việc sản xuất protease từ Pénicillium
griseoroseum. Ngoài ra, cám gạo và bột hướng dương cũng được sử dụng làm cơ chất
lên men cho dòng nấm Rhizopus oligosporous trong quá trình sản xuất protease (Ikasari
và Mitchell, 1994; Haq et al., 2003). Chakraborty et al. (2000) cũng đã nghiên cứu sản

xuất của protease từ A. nỉger với cám lúa mì được sử dụng như một chất nền.
Protease ưa acid được sản xuất bởi một số loài Aspergillus bao gồm A. oryzae (Narahara
et al., 1982), A. nỉger và A. sojae (Chakraborty et al., 2000; Yang và Hsing, 1998). Tuy
nhiên dòng nấm sợi A. niger (Heneri et al., 1988) và A. flavus cũng sản xuất protease
kiềm (Malathi và Chakraborty, 1991).
Paranthaman et al. (2009) tiến hành nghiên cứu so sánh việc sử dụng các cơ chất khác
nhau (từ các giống khác nhau) của gạo tấm (PONNI, IR-20, CR-1009, ADT- 36 và
ADT-66) để sản xuất protease đối với A. niger. Sau quá trình SSF, PONNI cho hoạt tính
protease cao nhất với 67,7 u/g và ADT-66 sản xuất protease với hoạt tính thấp nhất là
44,7 u/g. Các điều kiện tối ưu để sản xuất protease là: ủ ở 35°c, 96 giờ và pH 7,0.
Aspergillus niger được phân lập từ đất bùn thu thập từ Lahore đã được chứng minh có
khả năng sinh protease thông qua quá tình SSF. Quá trình tổng hợp enzyme đạt hiệu quả
tốt nhất khi điều chỉnh thành phần môi trường lên men là cám lúa mì và đậu tương như
nguồn cung cấp carbon và nitrogen ở tỷ lệ tương ứng là 8:2 trong 48 giờ ủ ở nhiệt độ
30°c và pH 3,0 (Qazi et al., 2008).
Radha (2012) đưa ra thông tin về các điều kiện tối ưu hóa trong quá trình sinh protease
ưa acid của Aspergillus SPS trên cơ chất lúa mì Rawa. Các giá trị tối ưu của các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình sinh proease acid đã được tìm thấy với độ ẩm 60% (v/w), nhiệt
độ ủ 32 ± 2°c, thời gian ủ 5 ngày và pH 5,0. Bên cạnh đó, việc ứng dụng phương pháp
bề mặt đáp ứng trong tối ưu hóa quá trình lên men sinh tổng họp protease từ A. oryzae
cũng được áp dụng (Deepak et al, 2008 ; Gerritse et al,
2007).
Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về tổng hợp protease từ vi sinh vật cũng đã được công
bố. Đỗ Thị Bích Thủy (2012) đã tìm ra một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thu
nhận chế phẩm protease ngoại bào của dòng Bacillus amyloliquefaciens Ni, phân lập từ
nem chua Huế, như thảnh phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và thời gian
lên men đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon bổ
sung vào môi trường cơ bản (MTCB), có chứa 1% peptone, 0,3% cao thịt và 0,5%
NaCl, làm cho quá trình thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của B.
amyloliquefaciens NI tốt nhất; hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy đạt được

0,758 HP/mL, lớn hơn so với mẫu đối chứng (0,613 HP/mL) 1,2 lần. Trong tất cả các
nguồn nitrogen bổ sung vào MTCB, chỉ có casein làm cho hoạt độ protease (0,758
HP/mL) cao hơn mẫu đối chứng (0,511 HP/mL). Các thí nghiệm có bổ sung kết họp các
nguồn nitrogen và carbon vào môi trường nuôi cấy, hoạt độ protease không tăng so với
khi khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ nguồn tinh bột. Trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của hàm
lượng tinh bột (0,25-^1,75%) đến khả năng sinh tổng hợp protease của dòng này, hoạt
độ quan sát đạt được giá trị cao nhất (0,760 HP/mL) ở hàm lượng tinh bột 0,75%. Đồng
thời, hoạt độ protease đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường thích họp với pH ban
đầu bằng 8 và nhiệt độ 35°c. Thời gian thu nhận enzyme thích hợp nhất khi nuôi cấy
dòng này trong các điều kiện trên là 32 giờ với hoạt độ đạt được là 0,777 HP/mL.
Trước đó, Quyền Đình Thi et al. (2007) cũng đã nghiên cứu tối ưu một số điều kiện nuôi
cay Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng họp protease. Ket quả khảo sát cho thấy, hoạt tính
protease đạt tối đa khi dòng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 được nuôi cấy trong
môi trường LB ở pH 7,0 bổ sung 20% (v/w) nước biển ở nhiệt độ 30°c và thời gian ủ 48
giờ.
Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực tuyển chọn dòng vi sinh vật
phù hợp cho hoạt động của enzyme đặc hiệu (protease) đến việc tối ưu hóa quá trình
sinh tổng họp enzyme này, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:
- Hoạt tính của protease thu nhận phụ thuộc vào dòng vi sinh vật đặc hiệu - chịu sự chi
phối của điều kiện môi trường sinh trưởng. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu protease chỉ
thường được thực hiện trên đối tượng vi khuẩn (Bacillus sp.), trong khi việc sử dụng
dòng nấm sợi, điển hình là A.niger trong nuôi cấy protease được áp dụng rất rộng rãi
trên thế giới. Các ngân hàng giống vi sinh vật ở Việt Nam cũng không có giống đặc hiệu
riêng cho protease.
- Các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, sinh tổng hợp protease phụ thuộc vào từng
dòng vi sinh vật khảo sát - cần phải được xác định cụ thể theo thực nghiệm.
Chính vì vậy, việc thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình tổng hợp enzyme
protease của dòng Aspergillus niger bản địa được thực hiện.
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.1PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM