khảo sát khả năng thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra ( đầu cá) bằng enzyme bromelain

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẨN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ BÍCH PHƢƠNG


KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN
TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA ( ĐẦU CÁ) BẰNG
ENZYME BROMELAIN

Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


Cần Thơ, 2014


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẨN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THƢC PHẨM

Tên đề tài
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN
TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA ( ĐẦU CÁ) BẰNG
ENZYME BROMELAIN

Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện
Ths PHAN NGUYỄN TRANG NGUYỄN THỊ BÍCH PHƢƠNG
Ts NGUYỄN CÔNG HÀ MSSV:2111631
Lớp: CB1108A1
Cần Thơ, 2014
CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Luận văn tốt nghiệp Đại học với đề tài “ Khảo sát khả năng thủy phân protein từ
phụ phẩm cá tra bằng enzyme bromelain” do sinh viên Nguyễn Thị Bích Phương
thực hiện dưới sự hướng dẫn của Ts Thầy Nguyễn Công Hà và Ths Phan Nguyễn
Trang.

Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện


Ts Nguyễn Công Hà Ths Phan Nguyễn Trang


Cần Thơ, ngày….tháng…năm 2014
Chủ tịch hội đồng

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân. Các thông tin
về số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và
chưa từng được công bố trong bất kì luận văn nào trước đây.






















LỜI CẢM TẠ


Em xin chân thành gửi lời cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Công Hà –
Phó Trưởng Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng
Dụng - Trường Đại học Cần Thơ, cùng cô Phan Nguyễn Trang – cán bộ giảng dạy –
Trường Đại học Cần Thơ, đã nhiệt tình hướng dẫn cho em hoàn thành tốt luận văn
này.Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy, người đã tận tình
truyền thụ những kiến thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong
suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô và anh chị quản lý phòng thí nghiệm - Bộ
môn Công nghệ Thực Phẩm và Bộ môn Khoa học Đất đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ
cho em thực hiện nghiên cứu trong điều kiện tốt nhất.
Xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Xuất Nhập Khẩu Thủy Sản Caseamex-
Cần Thơ, đã hỗ trợ nguồn nguyên liệu cho em trong suốt thời gian nghiên cứu.
Em xin cảm ơn cô cố vấn Dương Thị Phượng Liên và tập thể các bạn K37 chuyên
ngành Công nghệ Thực Phẩm đã động viên và giúp đỡ em trong suốt khóa học vừa
qua.
Cần Thơ, ngày 2 tháng 12 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Bích Phƣơng








TÓM LƢỢC
Đề tài “Khảo sát khả năng thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra bằng enzyme

bromelain” Sử dụng enzyme bromealin thương mại chiết xuất từ thân khóm (EC
3.4.22.32) trong thủy phân phụ phẩm cá tra- phế liệu của ngành chế biến thủy sản.
Quá trình thủy phân được thực hiện ở pH 6,5, nhiệt độ 55
0
Cđiều kiện thủy phân tối
ưu của enzyme bromealin trên cơ chất thịt cá. Nhằm tìm ra giá trị nồng độ cơ chất,
nồng độ enzyme và thời gian thủy phân cho hiệu suất tối ưu. Qua quá trình khảo sát
cho thấy hàm lượng protein trung bình trong thịt cá thu được là 17,363g/100g
nguyên liệu, đây là nguồn nguyên liệu có thành phần dinh dưỡng cao. Kết quả thủy
phân xác định cặp tỉ lệ 1,5mg E/ 1,042g protein cho hiệu suất tương đối cao và ổn
định, sau 120 phút hiệu suất thủy phân đạt được 22,75% (tính theo lượng tyrosin
sinh ra).

















MỤC LỤC

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG i
LỜI CAM ĐOAN ii
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM LƢỢC iv
MỤC LỤC v
DANH SÁCH HÌNH vii
DANH SÁCH BẢNG viii
CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 TỔNG QUAN 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1
CHƢƠNG 2 LƢỢT KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 NGUYÊN LIỆU 2
2.1.1 Tổng quan về cá tra 2
2.1.2 Tổng quan về phụ phẩm cá tra 4
2.1.3 Biện pháp tận dụng phụ phẩm cá tra ở Việt Nam 4
2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME 5
2.2.1 Khái quát về Enzyme 5
2.2.2 Động học Enzyme 6
2.3 ENZYME BROMELAIN 9
2.3.1 Sơ lượt về enzyme bromelain 9
2.3.2 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme bromelain 9
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác 10
2.3.4 Cơ chế xúc tác của bromelain 11
2.4 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 12
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 13
3.1.1 Thời gian, địa điểm 13
3.1.2Dụng cụ, thiết bị 13
3.1.3 Hóa chất 13

3.1.4 Nguyên liệu 13
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.2.1 Quy trình chuẩn bị nguyên liệu 14
3.2.2 Phương pháp phân tích 14
3.2.3 Xử lí số liệu 15
3.3 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ 15
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 19
4.1 Thành phần hóa học trong nguyên liệu 19
4.2 Thông số động học của enzyme bromelain 19
4.3 Tỉ lệ nồng độ E/S 20
4.4 Thời gian thủy phân tối ƣu 21
4.5 Mức độ thủy phân của enzyme 23
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25
5.1 KẾT LUẬN 25
5.2 ĐỀ NGHỊ 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 27
PHỤ LỤC A ix
PHỤ LỤC B x
PHỤ LỤC C xvii









DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cá tra nguyên con 2
Hình 2.2 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 8
Hình 2.3 Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain 10
Hình 2.4 Phản ứng xúc tác thủy phân protein của enzyme bromelain 12
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chuẩn bị nguyên liệu 14
Hình 3.2 Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm 1 16
Hình 3.3 Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm 2 17
Hình 3.3 Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm 3 18
Hình 4.1 Đồ thị thể hiện giá trị V
max
, K
m
của enzyme bromelain 19
Hình 4.2 Đồ thị thể hiện hiệu suất thủy phân enzyme bromelain theo hàm
lượng tyrosin 21
Hình 4.3 Đồ thị thể hiên hiệu suất thủy phân của enzyme bromelain theo
Hàm lượng đạm amin 22
Hình 4.4 Mức độ thủy phân của các enzyme trên cơ chất phụ phẩm
cá tra 23

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của thịt cá tra fillet 3
Bẳng 2.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100g thịt cá 4
Bảng 4.1 Hàm lượng các thành phần hóa học trong nguyên liệu 19
Bảng 4.2 Vận tốc phản ứng cực đại và hằng số tốc độ phản ứng của enzyme
bromelain 20
Bảng 4.3 Hàm lượng đạm amin và tyrosin sinh ra sau thủy phân 20




CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. TỔNG QUAN
Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường bờ biển dài, nên rất thuận lợi
phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản.Trong đó,ngành nuôi cá tra,
basa của Việt Nam phát triển mạnh trong những năm qua do nhu cầu lớn từ các thị
trường xuất khẩu.Với điều kiện thiên nhiên thuận lợi và chế độ nuôi dễ dàng, cũng
như giá trị xuất khẩu cao, nên xuất khẩu cá tra, basa chiếm tỷ trọng chủ yếu trong
xuất khẩu cá da trơn. Sản lượng cá tra nguyên liệu 2012 đạt 1190 tấn, cung cấp trên
87% sản lượng cá tra chế biến của cả nước.
Tuy nhiên, sự phát triển của ngành thủy sản vẫn còn có những vấn đề bắt cặp, đó là
lượng phụ phẩm sau phi lê bao gồm: thịt vụn, đầu, xương, vây,… tăng tỷ lệ thuận
với lượng cá fillet xuất khẩu.Trung bình sản xuất 1kg thành phẩm cá fillet đông
lạnh cần khoảng 2,6 kg cá nguyên liệu. Như vậy, lượng phụ phẩm từ công nghiệp
chế biến cá tra fillet đông lạnh khoảng 450.000- 480.000 tấn phụ phẩm/năm (ông
Trần Hữu Thích giám đốc công ty STECG, 2006).Nguồn phụ phẩm hiện nay rất
lớn, nếu không có biện pháp xử lý triệt để nguồn phụ phẩm này sẽ gây ô nhiễm môi

trường trầm trọng. Trước tình hình trên, việc nghiên cứu các sản phẩm từ phụ phẩm
cá tra sau fillet là rất cần thiết.
Hiện nay phương pháp xử lý nguồn phụ phẩm này bằng các biện pháp sinh học
đang rất được quan tâm, đặc biệt sử dụng enzyme thủy phân để thu hồi protein do
tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng và giá trị dinh dưỡng cao (Min- Tian
Gao et al., 2005). Việc sử dụng enzyme Bromelainđể xử lý phế liệu của ngành công
nghiệp cá, đồng thời tạo ra sản phẩm giá trị, là vấn đề có nhiều tiềm năng và ưu thế.
Nên đề tài “Khảo sát khả năng thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra bằng
enzyme bromelain” cần được thực hiện.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Khảo sát các điều kiện về nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất và thời gian tối ưu cho
quá trình thủy phân của enzyme bromelain lên cơ chất là phụ phẩm cá tra.




CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NGUYÊN LIỆU
2.1.1 Tổng quan về cá tra
 Phân loại khoa học
Tên tiếng anh: Sutchi catfish
Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus
Cá tra là một trong 11 loài thuộc họ Pangasiidae, thuộc chi Pangasius.Tài liệu gần
đây nhất xếp cá Tra nằm trong giống cá Tra dầu (Pangasianodon), bộ cá nheo
Siluriformes).

Hình2.1 Cá tra nguyên con
(Nguồn: )
 Nguồn gốc và phân bố
Cá tra có nguồn gốc từ vùng Thượng Lào và di cư về Campuchia, vào mùa sinh sản
cá tra bơi ngược vào Biển Hồ để bắt cặp và sinh sản. Trứng trôi về hạ lưu sông Tiền
và sông Hậu Việt Nam sinh sôi.
Cá tra phân bố ở khu vực sông MeKong, có mặt ở cả bốn nước Lào, Việt Nam,
Campuchia và Thái Lan. Ở Thái Lan còn gặp cá tra ở lưu vực sông MeKong và
Chao Phraya. Ở nước ta, những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá
bột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy
trong ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên ở địa phận Việt Nam, do tập tính di cư ngược
dòng sông MeKong để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên.
Năm 1970, cá tra bắt đầu được nuôi bằng bè tre tại Châu Đốc, sau đó được thay
bằng các hầm dọc theo sông Tiền và sông Hậu vào năm 1985. Đến năm 1996, cá tra
được xuất khẩu qua Mỹ và trở thành một trong những mặt hàng xuất khẩu chính của
Việt Nam cho đến nay.
(Nguồn:http:// www.anvifish.com)
 Hình thái, sinh lý
Cá tra là cá da trơn không vảy, thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng,
đôi râu dài. Cá tra sống chủ yếu ở nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ
(nồng độ muối từ 7- 10), có thể chịu được nước phèn với pH>5, không sống được ở
nhiệt độ thấp dưới 15
0
C, nhưng chịu nóng tới 39
0
C.Cá tra có số lượng hồng cầu
nhiều hơn các loài cá khác. Có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng
khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan.

(Nguồn: http//khoahocchonhanong.com.vn)
 Thành phần hóa học và giá trị dinh dƣỡng của cá tra
Cũng giống như các nguồn nguyên liệu khác như thịt của gia súc, gia cầm, thịt nạc
cá cũng có thành phần hóa học tương tự. Thịt của các loài cá là nguồn thực phẩm
giàu dinh dưỡng, đặc biệt là protein và các acid béo chưa bão hòa.
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của thịt cá tra fillet
Thành phần

Thịt cá tra fillet (%)


Protein

Lipit

Carbohydrat

Nước



16,85

3.34

6.5

75 80

(Nguồn: )

Cá tra là một trong những loài cá có giá trị xuất khẩu cao. Cá tra của Việt Nam
được nhiều thị trường ưa chuộng vì màu sắc cơ thịt trắng, có vị thơm ngon so với
các loài cá da trơn khác. Thành phần dinh dưỡng trong 100g cơ thịt cá bao gồm:




Bảng 2.2 Thành phần dinh dƣỡng trong 100g thịt cá
Tổng năng
lượng cung
cấp (calori)
Chất đạm (g)
Chất béo (g)
Chất béo
chưa bão hòa
(DHA, EPA)
(g)
Cholesterol
(%)
Natri (mg)
124.52
23.42
2.42
1.78
0.025
70.6
(Nguồn: )
2.1.2 Giới thiệu về phụ phẩm cá tra
Phụ phẩm cá tra được định nghĩa là những thứ phẩm không có giá trị thương
mại (như: thịt vụn sau fillet cá, xương, đầu, mỡ, da, máu,…) nhưng có thể tái chế

sau khi được xử lí (Phạm Thị Hồng Nga, 2008).
Khi nói đến phế liệu cá, mọi người đều cho rằng đó là nội tạng và sản phẩm
thải. Nhưng thật ra không phải như vậy, phế liệu cá là tất cả các nguyên liệu thô
(không thể hoặc có thể ăn được) được sản sinh ra trong suốt quy trình sản xuất sản
phẩm chính và có thể tận dụng được.
Ở Mỹ, phế liệu cá có thể chia thành 4 nguồn:
 Phần phế liệu mà con người có thể tiêu hóa được (như thịt vụn còn sót lại sau khi
fille cá…)
 Sản phẩm thải là các sản phẩm không thể dùng làm thức ăn gia súc hay sản phẩm
giá trị gia tăng, nhưng có thể phối trộn, cháy hay phân hủy được (xương…)
 Phần bỏ ra là các sản phẩm thường thấy trong quá trình xử lí sơ bộ (như vây,
đuôi,…)
 Nội tạng của cá (như ruột, gan)
Tính chất của nguyên liệu thô phụ thuộc vào thành phần hóa học và hoạt tính của
enzyme. Phế liệu cá bị phân hủy bởi vi sinh vật, các phản ứng enzyme và oxy hóa
rất nhanh nếu như bảo quản và giữ gìn không tốt.
Chỉ số quan trọng để xác định chất lượng của phế liệu là pH, nhiệt độ và đặc biệt là
hoạt tính của các enzyme.
2.1.3 Biện pháp tận dụng phụ phẩm cá tra ở Việt Nam.
Theo điều tra của Viện Nghiên cứu Hải sản, trong chế biến thủy sản đông lạnh, cứ
sản xuất được 1 tấn cá tra fille sẽ thải ra môi trường 1,8 tấn phế thải.
Vì vậy, tận dụng phế liệu cá tra để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng là điều cần
thiết, nhằm giải quyết vấn đề phế thải của ngành thủy sản, đáp ứng thị hiếu của
người tiêu dùng, mang lại giá trị cao cho nhà sản xuất.
Cá tra sau khi phi lê xuất khẩu thì phần còn lại gồm có da cá, mỡ cá, đầu, xương,
nội tạng… hiện nay chúng đã và đang được nghiên cứu tận dụng gần như toàn bộ.
 Da cá được nghiên cứu chế biến gelatin để sử dụng trong ngành công nghiệp
dược và mỹ phẩm
 Mỡ cá chiếm từ 15-20% trọng lượng ban đầu được các cơ sở chế biến nấu thành
mỡ nước cung cấp cho thị trường. Sau đó, được nghiên cứu sản xuất thành 2 loại

dầu: loại nhẹ có thể trích ly DHA (omega 3) sử dụng trong công nghệ dược phẩm,
thực phẩm; loại nặng sản xuất dầu biodiesel sử dụng cho động cơ.
 Đầu, xương sống, ruột,…chế biến thành thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi
sau khi đã nấu lấy mỡ.
 Bong bóng cá bán cho những đại lý chuyên thu mua sấy khô cung cấp cho các
nhà hàng nấu súp. Bao tử cá làm sạch bán cho các quán ăn đặc sản.
 Phế liệu cá Tra còn được chế biến thành sản phẩm bổ sung đạm động vật, gọi là
bột cá. Là một sản phẩm làm từ cá nguyên con, xương và phụ phẩm từ cá sau chế
biến.
2.2 GIỚI THIÊU VỀ ENZYME
2.2.1 Khái quát về enzyme
Enzyme là những chất xúc tác sinh học và là các phân tử protein trong tự
nhiên.Bản chất của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học, là một loại
protein được sinh vật sống tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học
(Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011).
Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Có khả năng xúc tác
đặc hiệu các phản ứng hóa học theo chiều hướng nhất định. Khả năng xúc tác của
enzyme là do cấu trúc protein đặc biệt của nó. Một phản ứng hóa học cụ thể được
xúc tác tại một phần nhỏ trên bề mặt của một loại enzyme, tại đó được gọi là trung
tâm hoạt động của enzyme.
Enzyme được cấu tạo từ các L- α- acid amin kết hợp với nhau qua liên kết
peptide. Khi nghiên cứu chi tiết về enzyme cho thấy enzyme có thể là protein hoặc
proteit (cấu từ enzyme liên kết với cấu tử phi protein tạo thành proteit). Trên cơ sở
đó thường phân enzyme thành 2 nhóm:
 Nhóm enzyme một cấu tử như pepsin, amylase…trong phân tử chỉ
chứa cấu tử protein. Do vậy trung tâm hoạt động của của nó là sự phối hợp giữa các
nhóm chức tự do của acid amin. Các nhóm chức thường gặp của acid amin trong
trung tâm hoạt động của enzyme là: nhóm –SH (sunfihydryl) của Cuys, nhóm –OH
(hydroxyl) của Ser, nhóm –COOH (carboxyl) của Asp hay Glu. Những enzyme này
thường xúc tác cho phản ứng thủy phân.

 Nhóm enzyme hai cấu tử: ngoài thành phần protein còn có thành phần
phi protein. Phần protein được gọi là “feron” hay “apoenzyme”. Phần không phải là
protein được gọi là nhóm ngoại “agon”, nếu nhóm ngoại tách ra khỏi phần
“apoenzyme” có thể tồn tại độc lập, trong các trường hợp này các “agon” sẽ được
gọi là “coenzyme”. Trung tâm hoạt động ngoài các nhóm chức của acid amin, người
ta còn gặp các nhóm chức của phần coenzyme thường chứa các vitamin hay các ion
kim loại.
Enzyme có thể thu nhận từ các cơ thể sống khác nhau: động vật, thực vật, vi
sinh vật (như pepsin trong dạ dày, trypsin trong tụy tràng, rennin trong ngăn thứ tư
của dạ dày bê, bromelain trong khóm, papain trong đu đủ, amylase trong thóc
mầm…). Tuy nhiên, nguồn enzyme quan trọng hiện nay hầu hết được lấy từ vi sinh
vật.
2.2.2 Động học enzyme
Sơ đồ phản ứng enzyme hai giai đoạn theo cơ chế Michalis- Menten có thể viết như
sau:
E + S ES E + P
Trong đó:
k
1
: hằng số vận tốc phản ứng phức hợp ES.
k
2
: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại chất ban đầu và enzyme.
k
3
: hằng số vận tốc phản ứng phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P.
Vận tốc phản ứng tỉ lệ với nồng độ phức hợp ES, nồng độ phức hợp càng lớn, vận
tốc phản ứng càng lớn.
Từ phương trình (1) ta có thể thiết lập các phương trình vận tốc như sau:
 Vận tốc phản ứng tạo thành phức hợp ES là:

k
1
ES= k
1
(E
0
 - ES)S (2)
Với E
0
: nồng độ enzyme ban đầu.
ES: nồng độ phức trung gian enzyme- cơ chất
E: nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt đến cân bằng
Do đó: E=E
0
- ES
Nồng độ cơ chất ban đầu cũng được xem là nồng độ cơ chất lúc phản ứng đạt đến
cân bằng, vì nồng độ cơ chất trong phản ứng luôn lớn hơn nhiều lần nồng độ
enzyme, do đó có thể bỏ qua lượng S trong phức chất ES; khi nghiên cứu động
k
3
k
1

k
2
(1)
học phản ứng enzyme thường xác định vận tốc ban đầu, lượng cơ chất bị chuyển
hóa chưa đáng kể so với nồng độ ban đầu của nó.
 Vận tốc phân ly phức hợp ES là tổng vận tốc của hai phản ứng:
 Phản ứng phân ly phức hợp ES để tạo E và S (ngược lại với phản ứng kết

hợp)
 Phản ứng biến đổi phức hợp ES thành sản phẩm phản ứng P và giải phóng
enzyme về dạng ban đầu E.
Do đó, vận tốc phân ly phức hợp ES bằng:
k
2
[ES] + k
3
[ES] = (k
1
+k
2
)[ES] (3)
Khi phản ứng đạt tới trạng thái cân bằng, vận tốc tạo thành ES bằng vận tốc phân ly
ES:
k
1
([E
0
] – [ES])[S]= (k
1
+ k
2
)[ES] (4)
Nếu đặt:
1
3
2
k
k

kK
m


(K
m
gọi là hằng số Michalis Menten)
Từ (4) ta suy ra:
][
][
][][
0
SK
S
EES
m


(5)
Qua đây cho thấy, khi ES càng lớn thì vận tốc phản ứng càng lớn.Khi nồng độ cơ
chất đủ lớn, thì tất cả các phân tử enzyme có trong phản ứng đều tham gia tạo phức
ES, vận tốc phản ứng sẽ đạt cực đại (V
max
). Từ đó có thể thiết lập tỉ lệ sau:
][
][
0max
E
ES
V

V

(6)
Từ (5) ta có:
][
][
0
E
ES
=
][
][
SK
S
m



Thay vào phương trình (6), có:
max
V
V
=
][
][
SK
S
m

=>

][
][
max
SK
S
VV
m


(7)
Phương trình (7) được gọi là phương trình Michaelis- Menten.
K
m
gọi là hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzyme. K
m
đặc trưng cho ái lực
enzyme với cơ chất, K
m
có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng
lớn, nghĩa là vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn. (Nguyễn Thị Thu Thủy,
2006).

Hình 2.2 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất
Theo thuyết Mischaelis Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra qua ba
giai đoạn:
 Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm của
enzyme bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo thành phức hệ enzyme- cơ chất
(ES). Phức hệ này thường không bền. Phản ứng tạo ra phưc hệ enzyme- cơ chất
thường xảy ra rất nhanh và cần rất ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết
tham gia gồm: liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kị nước lực
Vander- Waals và lieenk kết do dịch chuyển điện tử.
 Giai đoạn hai: Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình
không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá
vỡ và tạo ra sản phẩm.
 Giai đoạn ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm qua quá trình phản ứng
tạo thành và tách ra khỏi enzyme. Enzyme tách ra và trở về trạng thái ban đầu,
chuẩn bị kết hợp với phân tử cơ chất khác. Quá trình phản ứng hoàn thành.




2.3 ENZYME BROMELAIN
2.3.1 Sơ lƣợc về enzyme bromelain
Enzyme bromelain lần đầu tiên được biết đến vào khoảng thế kỉ XIX.Năm 1892,
nhà khoa học Chittenden là người đầu tiên đã tìm thấy sự hiện diện của một loại
enzyme có khả năng thủy phân protein trong dịch của cây và trái dứa, Ananas
Comosus (pineapple). Ông đã gọi nó là “bromeline”. Sau này, thuật ngữ “bromelin”
hay “bromelain” đã được dùng để gọi chung các enzyme thủy phân protein
(protease), được tìm thấy từ những cây giống dứa thuộc cùng họ Bromeliaceae.
Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân
tử để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là peptide (R.Christian et

al.,2001).
Bromelain hiện diện trong tất cả các phần của cây dứa (thân, chồi, quả). Tuy nhiên,
chúng chiếm trên 50% protein trong quả dứa. Do đó enzyme bromelain còn được
gọi là “enzyme dứa”. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác
nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.Hoạt động tốt ở pH 6-8 (Nguyễn Đức Lượng,
2004).Nó có trọng lượng phân tử 23.000Da(H.R.Maurer, 2001).Phạm vi nhiệt độ
hoạt động 40- 65
0
C, điều kiện hoạt động tốt là 55
0
C.
Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được dùng làm nguyên liệu chính để sản
xuất ra enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt
là sau mùa thu hoach trái.
Enzyme Bromelain thân (EC 3.4.22.32)
- Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain.
- Tên khoa học và y học: sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease.
- Tên thương mại: Bromanase (Kramer- Novis), bromelain 2400 Maximum
Strength ( vitalize Corp).
2.3.2 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme Bromelain
a. Cấu tạo
Enzyme bromelain là một protease- thiol.Trong trung tâm hoạt động của
bromelain có chứa cysteine,đây là một acid amin có nhóm hóa học hoạt động mạnh
là –SH (sulfuhydryl) thủy phân protein, và hai sợi polypeptide liên kết với nhau
bằng cầu nối -S – S Phân tử bromelain có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức
tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra trong bromelain còn
có sự hiện diện của ion Zn
2+
đóng vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
Bromelain thân là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 monose, 2

glucosamin, 1 xylose và 1 fructose.Các nghiên cứu nghi nhận, Bromelain thân và
quả dứa có thành phần acid amin thay đổi khác nhau.Bromelain thân có khoảng
321- 144 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 283- 161 acid
amin.Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và
ở đầu carbonyl là glycine.
Cấu trúc bậc một của bromelain theo Murachi và Bussain:




Hình 2.3 Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
b. Hoạt tính
Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidease, amylase và esterase.
Bromelain xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ
chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA _
Benzolyl-L-Arginine amide, BAEE _Benzolyl-L-Arginine Ethyl Esther, BAEM _
Benzolyl-L-Arginine Methyl Esther… ( Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng
càng dài sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ
enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.
Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số
các enzyme bị mất hoạt tính trến 70
o
C (Lê Ngọc Tú, 2004).
Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45- 60
o
C.Nhiệt

độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử,
làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí không
gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất.Nhiệt
độ quá cao hoặc quá thấp sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính
của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999).
Ở dịch chiết quả (pH 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60
o
C thì bromelain vẫn còn hoạt
tính nhưng bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 5
o
C, pH 4-10 thì enzyme
giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24 giờ. Ở 55
o
C, pH 6.1 thì enzyme bị mất 50%
hoạt tính trong vòng 20 phút ( Nguyễn Đức Lượng, 2004).

 Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của
enzyme.Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định
gọi là pH tối thích.
Bromelain có biên độ pH hoạt động khá rộng, từ pH 3- 10. Vùng pH tối thích cho
enzyme bromelain không ổn định, mà phụ thuộc vào bản chất và nồng độ cơ chất,
độ tinh sạch enzyme, nhiệt độ và bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của các
chất hoạt hóa cũng như thời gian phản ứng. Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của
enzyme bromelain lại là pH 5-8. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
 Ảnh hưởng bởi cơ chất
Tùy theo cơ chất xúc tác mà enzyme bromelain thể hiện hoạt tính khác nhau. Nếu
cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4
lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này tương đương
nhau.Đối với cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của bromelain yếu hơn

papain.(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
 Ảnh hưởng của kim loại và một số chất khác
Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại trung tâm hoạt động, do đó
chúng cũng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme.
Vì bromelain thuộc nhóm protease cysteine, trung tâm hoạt động có nhóm –SH là
chất hoạt hóa cho bromelain. Ví dụ: KCN, thioglycolic acid, cysteine, sulfit,
cianit,…
Bromelain bị ức chế bởi những ion hợp chất ái lực mạnh hơn nhóm –SH, các tác
nhân oxy hóa, halogen hóa, ankyl hóa ( như: iodoacetate, bromoacetate, H
2
O
2
,
methyl bromur…),…
Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn, có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử
bromelain. Khi không có chất hoạt hóa, bromelain chỉ phát huy được 60- 70% hoạt
tính tối đa trên casein và enzyme có hoạt tính tối đa khi chỉ có sự hiện diện 0.005M
cysteine. (Nguyễn Thanh Điền, 2006).
2.3.4 Cơ chế xúc tác của Bromelain
Trong hoạt động thủy phân của bromelain, các nhóm –SH của cysteine, nhóm
imidazole của histidine và nhóm disulfur, đều giữ một vai trò nhất định. Nhóm –SH
tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carbocyl của cơ chất (nơi các
liên kết peptide bị cắt). Nhóm imidazole là chất trung gian nhận gốc acid và chuyển
cho nhóm anion của chất nhận khác.
Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.Đầu tiên,
bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid
amin.Proetein kết hợp với nhóm –SH của enzyme làm cho protein bị ester hóa rồi
nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, aicd amin và peptide. Ở giai
đoạn đầu, Zn
2+

rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của trung tâm hoạt
động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối
trí bổ sung với các nhóm chức khác của phân tử protein như amin, carbocyl,…)
enzyme-SH + Zn
2+
=> enzyme-S-Zn + H
+
. Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động
đã bị ester hóa bởi cơ chất, nhưng cấu trúc không gian được bảo vệ nhất định.
Bromelain là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng
thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid.





Hình 2.4: Phản ứng xúc tác thủy phân protein của enzyme bromelain
(Lê Kim Thanh, 2007)
2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, nồng độ
enzyme và thời gian lên hoạt tính xúc tác thủy phân của enzyme bromelain trên cơ
chất thịt cá.
Phần thí nghiệm bao gồm các nội dung sau:
 Khảo sát nguyên liệu ban đầu, xác định các thành phần: protein tổng, Nitơ tổng
số, béo và ẩm.
 Xác định các thông số động học V
max
(vận tốc phản ứng cực đại), K
m
(hằng số

tốc độ phản ứng) của enzyme bromelain trên cơ chất thịt cá.
 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme lên hoạt tính xúc tác
của enzyme bromelain trên cơ chất là thịt cá tra. Sau đó xác định thời gian
thủyphân tối ưu của enzyme bằng cách tính hiệu suất thủy phân theo hàm lượng
tyrosin, hàm lượng đạm amin sinh ra bằng phương pháp quang phổ (áp dụng
phương pháp Anson, phương pháp OPA).


CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1.1 Thời gian, địa điểm
- Thời gian: từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại PTN Công nghệ thực phẩm của Bộ
môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần
Thơ.
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị
- Tủ lạnh, tủ đông.
- Cân phân tích (OHAUS, Nhật).
- Tủ sấy (Lab Companion).
- Máy xay thịt cá.
- Hệ thống Kjeldahl, hệ thống Soxhlet.
- Máy Vortex.
- Máy đo pH (pH meter TOA HM-12P, Nhật).
- Máy đo quang phổ (Multiskan Spectrum).
- Bể điều nhiệt (C20 CP LAUDA).
- Một số dụng cụ khác ở phòng thí nghiệm.
3.1.3 Hóa chất
- Dung dịch NaOH 30%.
- Chất xúc tác (K

2
SO
4
:CuSO
4
:Se).
- H
2
SO
4
đậm đặc, H
2
SO
4
0,1N, H
3
BO
3
2%, Ether dầu hỏa 30- 60.
- Dung dịch đệm phosphate (Na
2
HPO
4
- KH
2
PO
4
0,1M), HCl 0,2N, NaOH
0,5N.
- Acid tricloacetic (TCA).

- Thuốc thử folin- ciocalceux.
- Sodium dodecyl sulphate (SDS).
- Borax (disodium tetraborate), (Trung Quốc).
- Ortho- phthaldialdehyde (OPA), (Trung Quốc).
- Dithiothreitol (DTT), (Trung Quốc).
- Serine (Merck). Ethanol (cồn tuyệt đối).
3.1.4 Nguyên liệu
- Phụ phẩm cá tra được vận chuyển từ nhà máy Caseamex, tại khu Công
nghiệp Trà Nóc, Cần Thơ.
- Enzyme thủy phân: Bromelain (từ thân khóm E.C.3.4.22.32). Sản xuất tại
Đức, nhập khẩu từ công ty TNHH Merck VN.

3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Quy trình chuẩn bị nguyên liệu












Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chuẩn bị nguyên liệu ban đầu
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích
 Xác định ẩm độ của phụ phẩm cá tra nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến
khối lượng không đổi

 Xác định hàm lượng đạm tổng số trong thịt cá tra nguyên liệu bằng phương
pháp Kjeldahl.
 Xác định hàm lượng béo trong thịt cá nguyên liệu bằng phương pháp
Soxleht.
 Khảo sát thông số động học của enzyme bromelain trên cơ chất thịt cá
nguyên liệu dựa vào hàm lượng tyrosin sinh ra theo phương pháp Anson.
 Xác định hàm lượng đạm amin sinh ra sau thủy phân theo phương pháp
OPA.
 Xác định hàm lượng tyrosin tổng bằng cách thủy phân hoàn toàn protein
bằng phương pháp hóa học.
3.2.3 Xử lý số liệu
Thí nghiệm được khảo sát với 3 lần lặp lại trên cùng một nguyên liệu. Kết quả được
xư lý bằng phần mềm ứng dụng MS. Excel 2010. Tính toán thống kê, phân tích
phương sai, kiểm định LSD bằng phần mềm Stagraphic 16.1.18. Xác định các thông
số động học V
max
, K
m
bằng phần mềm SAS 9.1.3 portable.exe.

3.3 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định thông số động học enzyme bromelain (V
max
, K
m
)
trên cơ chất phụ phẩm cá tra (đầu cá)
 Mục đích: Xác định độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme bromelain trên cơ
chất thịt nạc cá.
 Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố.
Cố đinh nhiệt độ, pH tối ưu: pH=6,5, T= 55
0
C
Cố định nồng độ enzyme bromelain (1,5mg), thời gian thủy phân 30 phút
Nhân tố A: khối lượng cơ chất (gam)
A
1
: 0,1g A
2
: 0,2g A
3
: 0,5g
A
4
: 0,8g A
5
: 1g A
6
: 1,5g
A
7
: 2g A
8
: 2,5g A
9
: 3g
A
10
: 3,5g A

11
: 4g A
12
: 4,5g
A
13
: 5g A
14
: 5,5g A
15
:6g
A
16
: 6,5g A
17
: 7g A
18
:7,5g
Tổng số nghiệm thức: 18x 1=18 nghiệm thức
Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Tổng số mẫu thí nghiệm:18x1x3=54 (mẫu)
 Cách tiến hành
Cân nguyên liệu thịt đầu cá và enzyme cho vào bình tam giác, bổ sung thêm dịch
đệm phosphate. Ủ ở 55
0
C trong 30 phút, hút enzyme vào dịch cơ chất, tiếp tục thủy
phân trong 30 phút. Sau đó đem lọc để tiến hành phương pháp đo quang phổ.