KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.25 MB, 108 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI
́
CÂY MÔ SẸO TẠO DICH HUYỀN PHÙ CÂY
̣
Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN
HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003-2007
Sinh viên thực hiện: HỒNG THỊ THU

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
**************************

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI
́
CÂY MÔ SẸO TẠO DICH HUYỀN PHÙ CÂY
̣

Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN
HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. BÙI VĂN LỆ

HỒNG THỊ THU

́
TS. PHAN PHƢƠC HIỀN
ThS. QCH NGƠ DIỄM PHƢƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này đƣợc hoàn thành với s ự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các
thầ y cô, các anh chị và các bạn. Em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành đế n :
PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , ngƣời đã tâ ̣n tình hƣớng dẫn và ta ̣o mo ̣i điề u kiê ̣n để
em thƣ̣c hiê ̣n khóa luâ ̣n này .
Thạc sĩ Quách Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ dạy và
ln động viên em trong những hồn cảnh khó khăn nhất. Đề tài này đƣợc hoàn
thành với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của chị. Cảm ơn chị vì tất cả.
Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣớc Hiền, những chỉ dạy và giúp đỡ của thầy đã
giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Thạc sĩ Kiều Phƣơng Nam , ngƣời luôn gợi ý và cho em những lời khuyên bổ

ích.
Em cảm ơn anh Điề n , anh Hoàng, anh Cƣờng và các anh chi ̣phòng sắ c ký ,
Viê ̣n Công nghê ̣ Sin h ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trƣờng , ĐH Nông Lâm TP . HCM.
Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian chúng em
thƣ̣c tâ ̣p.
Cảm ơn anh Bình cùng tồn thể các bạn sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa
học Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đô ̣ng viên tôi nhƣ̃ng lúc gă ̣p khó
khăn trong đề tài .
Cảm ơn lớp CNSH 29 thân yêu và các ba ̣n thân đã cùng tôi chia sẻ tấ t cả
nhƣ̃ng nỗi buồ n vui suố t bố n năm đa ̣i ho ̣c.
Và trên hết , con cảm ơn bố m ẹ, chị gái và em trai yêu quý đã luôn chăm lo ,
ủng hộ, tin tƣởng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỡ dựa vững chắc nhất trong
c ̣c sớ ng.
Tháng 9/2007
Hồng Thị Thu

iii

TÓM TẮT
Đề tài nghiên cƣ́u “Khảo sát khả năng ƣng du ̣ng kỹ thuâ ̣t nuôi cấ y mô
́
sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhâ ̣n hơ ̣p chấ t
anthraquinone” đƣơ ̣c tiế n hành ta ̣i trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đa ̣i ho ̣c Quố c gia thành phố Hồ Chí Minh và

phịng sắ c ký , Viê ̣n Công

nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trƣờng , Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí
Minh tƣ̀ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007.

Kế t quả thu đƣơ ̣c:
- Mô se ̣o tƣ̀ mẫu lớp mỏng tế bào cây D. burmanni Vahl đƣơ ̣c hinh thành
̀
trên môi trƣờng khoáng cơ bản Gamborg’s B5 bổ sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2
mg/l), đƣờng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điề u kiê ̣n ủ tố i .
- Các kỹ thuật sắc ký cột , sắ c ký bản mỏng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng nhằ m cơ lâ ̣p và ly
trích hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơ ̣p chấ t này đ ƣợc sử
dụng nhƣ chất tham chiếu để định lƣợng anthraquinone trong các thành phần khác
nhau của cây Drosera burmanni Vahl.
- Kế t quả đinh lƣơ ̣ng anthraquinone bằ ng kỹ thuâ ̣t HPLC cho thấ y
̣

: hàm

lƣơ ̣ng anthraquinone trong rễ là 3,03% so với tro ̣ng lƣơ ̣ng khô, nhiề u hơn trong thân
lá (2,78%); ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8% trong khi ở cây có sắ c tố đỏ là 0,78%;
trong sinh khố i huyề n phù tế bào là

0,02% ( so với tro ̣ng lƣơ ̣ng tƣơi ), trong khi

không thấ y có sƣ̣ hiê ̣n diê ̣n của anthraquinone trong dich môi trƣờng.
̣

iv

SUMMARY
The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in
Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out
at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography

room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology,
University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007.

Results:
-

Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using
Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l),
2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to
5,8 before autoclaving.

-

Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to
purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was
used as authentic sample for HPLC technique.

-

Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone,
larger than 2,78% in leaves.

-

Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW,
compared with 2,78% DW in green-leaf trees.

-

Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of

anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been
found in spent medium.

Ho Chi Minh city, September, 2007.
Hoang Thi Thu

v

MỤC LỤC
CHƢƠNG
TRANG
Trang tƣ̣a ..................................................................................................................... .i
Lời cảm ơn ................................................................................................................. iii
Tóm tắt ..................................................................................................................... iv
Summary ..................................................................................................................... v
Mục lu ̣c ..................................................................................................................... vi
Danh sách các chƣ̃ viế t tắ t .......................................................................................... ix
Danh sách các hinh ..................................................................................................... x
̀
Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii
Danh sách các bảng .................................................................................................. xiii
Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1.
Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2.
Mục tiêu .......................................................................................................... 2
1.3.
Yêu cầu ............................................................................................................ 2
1.4.

Ý nghĩa đề tài .................................................................................................. 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1.
Tổng quan về Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3
2.1.1. Vị trí phân loại................................................................................................ 3
2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3
2.1.3. Mơ tả hình thái ............................................................................................... 4
2.1.4. Đặc tính sinh học ............................................................................................ 6
2.1.5. Đặc điểm sinh thái .......................................................................................... 7
2.1.6. Thành phần hóa học ....................................................................................... 8
2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống .............................................................................. 11
2.1.8. Tầm quan trọng ............................................................................................ 12
2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái ...................................................................................... 12
2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật ................................................. 12
2.1.8.3. Gía trị dƣợc tính ........................................................................................... 12
2.1.8.4. Ứng dụng trong cơng nghiệp........................................................................ 14
2.1.8.5. Gía trị kinh tế................................................................................................ 15
2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc............................................................ 16
2.2.
Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận
hợp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17
2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp ......................................................................... 17
2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo ........................................................................................... 18
2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo ......................................................................................... 18
2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo .................................................................... 19
2.2.3. Nuôi cấy dịch huyền phù.............................................................................. 19
2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào......................................................................... 19
2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù ............................................................................ 19

vi

2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào ............................... 20
2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay ......................................... 20
2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất
các hợp chất thứ cấp .................................................................................................. 22
2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi
cấy huyền phù ........................................................................................................... 22
2.2.4.1. Tối ƣu hóa điều kiện ni cấy ..................................................................... 22
2.2.4.2. Chọn lọc dịng tế bào có khả năng sản xuất cao ......................................... 22
2.2.4.3. Bổ sung tiền chất ......................................................................................... 22
2.2.4.4. Cố định tế bào ............................................................................................. 23
2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hóa mô ............................................................................ 23
2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23
2.3.
Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn .................................................... 24
2.3.1. Phƣơng pháp ly trích – thu nhận hợp chất .................................................. 24
2.3.1.1. Sắc ký cột .................................................................................................... 24
2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26
2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế ........................................................................... 27
2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp ..... 28
Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31
Thời gian và địa điểm thực hiện................................................................................ 31
3.1.
Nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù ......................................................... 31
3.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 31
3.1.2. Phƣơng pháp................................................................................................ 33
3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và
nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 33
3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho

việc kích ứng tạo mơ sẹo ........................................................................................... 34
3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp
với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mơ sẹo ............................................................. 35
3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự
tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 36
3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự
hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 37
3.2.
Ly trich và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38
́
3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 38
3.2.2. Phƣơng pháp................................................................................................ 39
3.3.
Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu
nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC .............. 40
3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 40
3.3.2. Phƣơng pháp ............................................................................................... 40
3.3.2.1. Xác định điều kiện, thơng số kỹ tḥt thích hợp......................................... 40
3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41

vii

3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong
định lƣợng hợp chất anthraquinone........................................................................... 41
3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong
các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 43
3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong
các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ............................................... 44
3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu

dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45
3.4.
Xử lý thống kê ............................................................................................. 45
Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46
4.1.
Nuôi cấy mơ sẹo tạo dịch hùn phù ........................................................... 46
4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và
nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 46
4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho
việc kích ứng tạo mơ sẹo ........................................................................................... 48
4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp
với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 49
4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự
tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 54
4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự
hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 56
4.2.
Ly trich và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58
́
4.3.
Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy
in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC ............................. 59
4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59
4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định
lƣơ ̣ng hợp chất anthraquinone ................................................................................... 61
4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong
các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 62
4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong
các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu khơng có sắc tố đỏ ...................................................... 64
4.3.5. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu

dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66
Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68
5.1.
Kết luận ....................................................................................................... 68
5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù .......................................................... 68
5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC ......... 68
5.2.
Đề nghị ........................................................................................................ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70
PHỤ LỤC

viii

́
́
́
́
DANH SACH CAC CHƢ̃ VIÊT TĂT
2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
BAP : 6-benzylaminopurine
CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên)
ctv

: cộng tác viên

HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắ c ký lỏng ao áp )
IAA

: 3-indolyl-acetic acid

IBA

: 3-indolebutyric acid

MS

: Murashige & Skoog, 1962

NAA : naphthalene acetic acid
PVP : poly vinyl pyrrolidone
TCL : Thin Cell Layer (Lớ p mỏng tế bào )
TLC : Thin Layer Chromatography (Sắ c ký bản mỏng)

ix

́
DANH SACH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1. Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới .................. 4
Hình 2.2. Hình thái của Drosera burmanni Vahl .................................................... 4
Hình 2.3. Lá D. burmanni ........................................................................................ 5
Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngồi tự nhiên. ........................................................... 7
Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10
Hình 2.6. Mơ ̣t sớ loa ̣i Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới ......................... 15
Hình 2.7. Hệ thống ni cấy gián đoạn qui mơ nhỏ trên các máy lắc ................... 21
Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mơ phịng thí nghiệm ........................................... 21
Hình 2.9. Sắ c ký cơ ̣t ............................................................................................... 24
Hình 2.10. Mô hinh sắ c ký nhanh cô ̣t khô ............................................................. 26

̀
Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng ................................................................................... 27
Hình 2.12. Sơ đồ hoa ̣t đô ̣ng các bô ̣ phâ ̣n của máy HPLC ...................................... 29
Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl ni cấy in vitro ................................................ 31
Hình 4.1. Mơ se ̣o đƣơ ̣c hình thành tƣ̀ mẫu lớp mỏng cây D.burmanni trên
môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với
nờ ng đơ ̣ thay đở i ..................................................................................................... 52
Hình 4.2. Mô se ̣o đƣơ ̣c hinh thành tƣ̀ mẫu lớp mỏng lóng thân cây
̀
D. burmanni trên môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D
với nồ ng đơ ̣ thay đở i ............................................................................................... 53
Hình 4.3.A. Mơ sẹo ni trong mơi trƣờng lỏng lắc.............................................. 55
Hình 4.3.B. Cụm tế bào quan dƣới kính hiển vi 40X. ........................................... 55
Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dƣới kính hiển vi 40X ..............................................55
Hình 4.4. Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của
mô se ̣o cây D. burmanni ........................................................................................ 57
Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm ................... 60
Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ................... 60

x

Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm ................... 60
Hình 4.8. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm ................... 60
Hình 4.9. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở ở 70 ppm ................ 60
Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo
quy trình A. ............................................................................................................ 61
Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo
quy trình B.............................................................................................................. 61
Hình 4.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl ........................... 63

Hình 4.13. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl.................... 63
Hình 4.14. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl có sắc tố đỏ. .......... 65
Hình 4.15. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl không
có sắc tố đỏ. ............................................................................................................ 65
Hình 4.16. Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch mơi trƣờng sau khi lọc
sinh khối tế bào ...................................................................................................... 66
Hình 4.17. Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù. ................... 66

xi

̉
̀
̀
́
́
DANH SACH CAC SƠ ĐƠ VÀ BIÊU ĐƠ
TRANG
̀
SƠ ĐƠ
Sơ đờ 2.1. Con đƣờng tổ ng hơ ̣p các hơ ̣p chấ t thƣ́ cấ p ở thƣ̣c vâ ̣t ........................ 18
Sơ đờ 3.1. Quy trình ly trích và cơ lập hợp chất anthraquinone .......................... 39
Sơ đồ 3.2. Quy trình xƣ̉ lý mẫu ............................................................................ 42
Sơ đồ 3.3. Quy trinh xƣ̉ lý dich huyề n phù .......................................................... 45
̣
̀
Sơ đồ 3.4. Quy trình ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone (kế t quả) ........... 58
̀
BIỂU ĐƠ
Biể u đờ 4.1. Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác

nhau sau 14 ngày nuôi cấy ................................................................................... 46
Biể u đồ 4.2. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày ni cấy .... 54
ĐỜ THỊ
Đồ thị 4.1. Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone
tham chiếu và giá trị diện tích peak ..................................................................... 59

xii

́
DANH SACH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và
7-methyljuglone ..................................................................................................... 8
Bảng 2.2. Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera ................... 9
Bảng 2.3. Dƣợc tính và một số hoạt tính ứng dụng khác của
dịch chiết Drosera ............................................................................................... .13
Bảng 3.1. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng
và nồng độ đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớp mỏng ....................................... 33
Bảng 3.2. Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone
thích hợp cho việc kích ứng tạo mơ sẹo ............................................................... 34
Bảng 3.3. Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D
khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ..................................... 35
Bảng 3.4. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy
lên sự tăng sinh khối mô sẹo ................................................................................ 36
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng
lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mơ sẹo ................................................................... 37
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong
các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................... 43
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu

cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ ................................................................ 44
Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy ................... 46
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thành phần khoáng lên sự phát triển của
mẫu cấy lớp mỏng ................................................................................................ 47
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy
lớp mỏng ............................................................................................................. 48
Bảng 4.4. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trƣờng sử dụng kết hợp 2
loại hormone khác nhau ....................................................................................... 48

xiii

Bảng 4.5. Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21
ngày nuôi cấy ....................................................................................................... 49
Bảng 4.6. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày
nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau ......................................................... 54
Bảng 4.7. Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo .... 56
Bảng 4.8. Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak ............. 59
Bảng 4.9. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác
nhau của cây in vitro ............................................................................................ 62
Bảng 4.10. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu có và
không có sắ c tố đỏ ................................................................................................ 64
Bảng 4.11. Kế t quả đinh lƣơ ̣ng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù ....... 66
̣

xiv

1

Chƣơng 1
̉
MƠ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngay từ buổi sơ khai, con ngƣời đã biết sử dụng thực vật không chỉ làm
nguồn thực phẩm mà cịn cho nhiều mục đích khác, đặc biệt là trong y học. Ngƣời
ta sử dụng một số loại thực vật tƣơi để đắp lên vết thƣơng hoặc thực vật khô để sắc
thuốc trị bệnh. Cách đây hơn một thế kỷ, dựa vào y học cổ truyền các nhà khoa học
đã phát triển các quy trình cho phép tạo ra nhiều loại thuốc từ các hợp chất thứ cấp
chiết xuất từ cây trồng. Với tiến bộ khoa học, các phân tử hoá học trong cây đã
đƣợc tổng hợp nhân tạo để sản xuất dƣợc phẩm. Tuy nhiên việc tổng hợp nhân tạo
còn gặp nhiều khó khăn do con đƣờng tổng hợp các chất này vẫn chƣa đƣợc làm
sáng tỏ.
Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỷ XX đến nay, các nhà khoa học đã
công bố hàng loạt các cơng trình nghiên cứu về ni cấy tế bào đơn của nhiều loài
thực vật nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp. Nhƣ vậy việc áp dụng các kỹ thuật công
nghệ sinh học dựa trên các phƣơng pháp nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro
không những góp phần vào việc sản xuất và thu nhận mà còn giúp ta đảm bảo đƣợc
một cách chủ động số lƣợng các hợp chất có giá trị trị liệu.
Ở Việt Nam, ngƣời ta đã thu thập đƣợc 3 loài Drosera trong đó Drosera
burmanni Vahl gần đây đã đƣợc nghiên cứu về việc thu nhận hợp chất quinone từ
nuôi cấy in vitro, khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất này cũng nhƣ nhân giống
thành công bằng tạo chồi trực tiếp.

2

Do đó để hƣớng tới tự động hóa việc thu nhận và chủ động tăng sinh lƣợng
chất quinone đã đƣợc nghiên cứu thành công, đề tài:
“KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO

TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN
HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ”
đã ra đời.
1.2. Mục tiêu
 Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cây Drosera burmanni Vahl.
 Khảo sát khả năng tạo dịch huyền phù tế bào cây Drosera burmanni Vahl.
 Khảo sát hàm lƣợng hợp chất quinone thu đƣợc từ nuôi cấy dịch huyền phù.
1.3. Yêu cầu
 Tạo đƣợc mô sẹo và khởi đầu tạo dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl.
 Phân tích định tính và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng anthraquinone trong từng
thành phần khác nhau và trong dịch huyền phù cây D. burmanni bằng máy
HPLC.
1.4. Ý nghĩa của đề tài:
 Ý nghĩa khoa học: đây là một bƣớc tiến quan trọng và cần thiết trong qui
trình ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào D. burmanni Vahl để thu nhận hợp
chất quinone.

Ý

nghĩa thực tiễn: cung cấp quy trình tạo mơ sẹo, dịch hùn phù D.

burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone

3

Chƣơng 2
̉
TÔNG QUAN TÀ I LIỆU
2.

2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl
2.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [14]:
Giới:

Plantae (Thực vật).

Ngành:

Magnoliophyta (Ngọc lan).

Lớp:

Magnoliopsida (Ngọc lan).

Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng).
Bộ:

Nepenthales.

Họ:

Droseraceae.

Giống:

Drosera.

Loài:

Drosera burmanni Vahl.

Tên tiếng Anh: burmese sundew.
Tên thông thƣờng: cây bắt ruồi, cỏ trói gà, bèo đất, trƣờng lệ burman.
2.1.2. Phân bố
Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở đông bắc nƣớc Úc, Ấn Độ, Trung
Quốc, Nhật, Sri Lanka và Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Myanmar, Thái Lan,Việt
Nam . . .(Hình 2.1) [33], [34].
Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở Thái Nguyên, Thanh
Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu tỉnh Bà
Rịa Vũng Tàu [1] và ở khu du lịch sinh thái Bắc Bình, Bình Thuận.

4

h

Ghi chú
Khu

vực

phân

bố

của

Drosera burmanni Vahl
Khu vực không có sự hiện

diện của Drosera burmanni
Vahl
Hình 2.1: Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới [30].
2.1.3. Mơ tả hình thái
Drosera burmanni Vahl là loài cây cỏ, cao 5 - 30 cm, có nhiều màu sắc khác
nhau: xanh lá, xanh đậm, xanh có ánh vàng với lơng tuyến màu đỏ hay tồn cây
màu đỏ [6], [15], [33], [35].

A

B

C

D

E

F

Hình 2.2: Hình thái của Drosera burmanni Vahl [33], [35].
 Thân (Hình 2.2 A, B, C)
Thân không phân nhánh, rất ngắn, có khi chỉ cao 1 cm khi tăng trƣởng trong
bóng râm, khơng hình thành thân củ dƣới đất. Thân mang nhiều phát hoa [31].

5

 Lá (Hình 2.3)
Lá hình m̃ng, xếp thành hình hoa thị quanh thân, phiến lá dài khoảng 1,2

cm, rộng khoảng 0,4 cm, mặt lá phủ đầy lông tuyến.
Lá có tua cuốn với những giọt keo ở đầu gọi là dịch nhầy, cơn trùng dính vào
và bị bẫy trong dịch này. Sau đó chất này sẽ tiêu hóa côn trùng mắc bẫy. Tua cuốn
trên lá uốn cong về phía con mồi bằng tính hƣớng tiếp xúc của nó. Drosera
burmanii Vahl là một trong những loài có chuyển động tua cuốn nhanh nhất [37].
A

B

D

C

Hình 2.3: Lá D. burmanni [42].
A: Lá; B: Các tua cuốn.
C, D: Cấu trúc một tua cuốn.
Tua cuốn là lông tiết đƣợc tạo bởi một cuống dài, nhỏ, có cấu trúc đa bào và
đầu mút tua cuốn đƣợc tạo bởi 2 lớp tế bào tuyến. Chất keo dính đƣợc tiết ra từ các
tuyến xuyên qua lớp biểu bì gián đoạn.
 Rễ
Hệ thống rễ tƣơng đối đơn giản: rễ chùm nhƣng chỉ có một vài nhánh. Chúng
đƣợc gọi là rễ giả vì chỉ có cơ quan hút nƣớc, cung cấp nƣớc cho cây.
 Hoa (Hình 2.2 D, E)
Cây ra hoa tháng 3 - 4. Hoa đều, lƣỡng tính, nhỏ, có nhiều màu sắc từ tím
nhạt tới vàng nhạt, màu đỏ, hồng và trắng. Hoa nằm trên một cuống chung dài, mọc

6

thẳng góc từ chồi nách hay chồi đỉnh gọi là phát hoa. Phát hoa cao 5 - 6 cm, mỗi

phát hoa có từ 5 đến 25 hoa, họp thành chùm hình bị cạp. Hoa đối xứng trịn, lá đài
5, cánh hoa 5, tiểu nhụy 5, nỗn sào một buồng, đính phơi trắc mơ, bầu 5 lá nỗn
hàn liền nhau bởi mép bên [9], [14].
Hoa nở nhiều thời điểm khác nhau, tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển
của cây. Hoa thƣờng nở vào buổi sáng. Mỗi ngày nở một bông bắt đầu từ nụ thấp
nhất (nụ đƣợc hình thành sớm nhất). Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng. Nếu sự
thụ phấn không diễn ra, hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh.
 Hạt (Hình 2.2 F)
Hạt thu đƣợc sau một tuần từ khi hoa nở. Hạt nằm trong nang hạt. Nang hạt
tròn, gồm 5 mảnh, chứa nhiều hạt. Nang hạt còn non có màu xanh, nang hạt chín có
màu đen. Hạt màu đen, đƣờng kính 0,1 mm.
2.1.4. Đặc tính sinh học
 Hình thức sinh sản
Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vơ tính. Sinh sản vơ tính bằng
cách nảy chồi con từ chồi bên hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hạt.
 Phƣơng thức bắt mồi
Hình thức: Sử dụng dịch nhầy để bắt dính con mồi (flypaper traps).
Cơ chế: Các lông tuyến bao phủ khắp bề mặt lá có vai trị nhƣ một cái bẫy
nhỏ. Các keo dính tiết ra từ lơng tuyến nhìn nhƣ những giọt sƣơng và khơng bị khơ
đi trong ánh mặt trời (vì vậy mà lồi cây này cịn đƣợc gọi là “sundew”). Giọt keo
dính này tác động nhƣ những giấy bắt mồi (flypaper). Các giọt keo thƣờng không
độc và có hƣơng thơm, nhờ vậy nó thu hút con mồi đậu xuống bề mặt lá và bắt dính
chúng. Khi đó những lơng tuyến nhạy cảm với protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con
mồi lại và đẩy nó vào giữa lá. Tuyến tiết trên bề mặt lá lúc này sẽ ngừng tiết keo
dính mà tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi. Lá sẽ hấp thu chất dinh
dƣỡng mà cây không thể lấy từ môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng [25], [34], [35].

7

2.1.5. Đặc điểm sinh thái

Hình 2.4: D. burmanni Vahl ngồi tự nhiên [3], [40].
 Đất đai
Cây có thể sống đƣợc ở hầu hết các điều kiện: đất đầm lầy, sỏi, cát, đất acid
[37].
Đất trồng Drosera: hỡn hợp ¾ đất mùn + ¼ cát, cát sạch hoặc cát trộn bột
than gỡ.
 Độ ẩm
Độ ẩm từ trung bình đến cao (50 - 80%). Độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giọt
keo dính đầu lông tiết.
 Nhiệt độ
Cây sống đƣợc ở nhiệt độ 5 - 35OC, nhiệt độ thích hợp nhất 18 - 25OC. Dƣới
5 OC cây ngừng phát triển.
 Ánh sáng
Cây thích hợp với ánh sáng trực tiếp, tối thiểu từ 6 - 8 giờ chiếu sáng một
ngày. Khi cây sống ở nơi có cƣờng độ ánh sáng cao thì tồn bộ cây sẽ chuyển sang
màu đỏ. Nếu cây không nhận đủ ánh sáng thì tua cuốn sẽ có màu xanh.

8

2.1.6. Thành phần hóa học
Nhiều hợp chất naphthoquinone và các flavonoid đã đƣợc cô lập, xác định
cấu trúc và định lƣợng trong cây Drosera ngoài thiên nhiên cũng nhƣ in vitro.
 Naphthoquinone
Các loại Drosera thƣờng sản sinh 2 loại naphthoquinone chính là plumbagin
và 7-methyljuglone (Bảng 2.1) [21]. Ngồi ra cịn có các naphthoquinone vi lƣợng
khác nhƣ droserone, hydroxydroserone và nhiều naphthoquinone glucoside (Bảng
2.2) mà khơng thể tìm thấy trong các loài cây khác [29].

Bảng 2.1: Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [21]
Plumbagin 7

Methyljuglone

D. andersoniana

D. adelae

D. auriculata

D. aliciae

D. binata

D. aliciae x capensis

D. bulbosa

D. anglica

D. capensis

D. auriculata

D. capillaris

D. burkeana

D. cistiflora

D. burmanii

D. dichotoma

D. capensis

D. erythrorhiza

D. cistiflora

D. intermedia

D. cuneifolia

D. longifolia

D. dielsiana

D. lunata

D. filiformis

D. macrophylla

D. hamiltonii

D. madagascariensis

D. hilaris

D. microphylla

D. indica

D. modesta

D. intermedia

D. natalensis

D. longifolia

D. peltata

D. longifolia x rotundifolia

9

D. platypoda

D. madagascariensis

D. prolifera

D. ramentacea

D. pygmaea

D. regia

D. regia

D. rotundifolia

D. rotundifolia

D. spathulata

D. slackii

D. stolonifera, spp. Stolonifera

D. stolonifera, spp. Rupicola

D. tracii

D. venusta

D. trinervia

D. villosa

D. villosa

Bảng 2.2: Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera [21]
Naphthoquinone

Lồi

Kiểu ni cấy

Droserone

D. whittakeri

In vivo

D. rotundifolia

In vivo

D. whittakeri

In vivo

D. rotundifolia

In vivo

Biramentaceonea

D. ramentaceae

In vivo

Droserone-5-glucoside

D. rotundifolia

In vivo

Rossoliside

D. rotundifolia

In vivo

Hydroxydroserone

In vitro
D.spatulata

In vitro

Hydroxydroserone-5-glucoside

D.rotundifolia

In vivo

2-Methylnaphtazarin-5-O-

D.rotundifolia

In vitro

glucosideb

D.spatulata

In vitro

a: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi hữu cơ.
b: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiế t với dung môi methanol.

10

Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách
chiết từ các loài Drosera [21].

R2

R1

R2

R3

R4

R5

[1]

CH3

H

H

H

OH

7-Methyljuglone

[2]

H

H

CH3 H

OH

Plumbagin

[3]

H

H

CH3 OH OH

Droserone

[4]

OH

H

CH3 OH OH

Hydroxydroserone

[5]

H

H

CH3 OH OGlc Droserone-5-glucoside

[6]

OH

H

CH3 OH OGlc Hydroxydroserone-5-gluside

R6

R7

[7]

CH3

H

[8]

H

O

CH3 2-Methyl-hydrojuglone-4-glucoside

R1

R3

R4
R5

O

OH

Rossoliside

R6

R7

OH

OGlc

 Flavonoid
Drosera chứa phổ rất rộng các flavonoid, flavonoid glucoside nhƣ quercetin,
isoquercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin và gossypitrin [20].

Quercetin

Myricetin

Kaempferol

Hyperin

Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside [29].

11

2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống
 Nhân giống tự nhiên [3]
Nhân giống bằng cách gieo hạt
Thời gian gieo hạt tốt nhất là cuối mùa đông. Hạt đƣợc gieo trên hỗn hợp đất
trồng thích hợp. Tốt nhất nên giữ hạt trong điều kiện mát và ẩm khoảng 6 tuần. Sau
đó cho hạt vào chậu đất có bọc túi nhựa và để trong điều kiện sáng. Đến khi hạt nảy
mầm thì bỏ túi nhựa ra và trồng các cây con vào chậu lớn.

Nhân giống bằng cách cắt rễ
Cây bắt ruồi có thể đƣợc nhân giống từ các rễ dày. Lấy những rễ khỏe từ cây
mẹ, cắt thành đoạn dài 5 cm và đặt nằm ngang trên hỗn hợp đất dày 6 cm, phủ
chúng với l lớp đất dày 1 cm. Bọc những chậu đất này lại và đặt trong điều kiện
sáng. Khi cây mới bắt đầu mọc lên thì khơng bọc nữa. Nhân giống bằng phƣơng
pháp cắt rễ tốt nhất vào đầu mùa tăng trƣởng của cây.
Nhân giống bằng cách cắt lá
Thời gian nhân giống tốt nhất là vào đầu mùa tăng trƣởng của cây. Lá đƣợc
cắt ở cuống lá rồi đặt lên trên hỗn hợp đất và cát sao cho lông tuyến hƣớng lên. Giữ
cuống lá ngập trong đất nhƣng không phủ lên các lông tuyến. Bọc chậu đất lại và
giữ trong điều kiện sáng. Sự phát triển của cây xảy ra trong vài tuần.
Nhân giống bằng cây mầm
Vào mùa thu, cây sẽ sản sinh ra những cây bé xíu (cây mầm). Thu thập
những cây mầm này và trồng thành những cây mới. Một cách để thu thập cây mầm
là giữ những chậu chứa cây trút ngƣợc xuống 1 tờ giấy và dùng tăm gạt cây mầm ra
khỏi cây mẹ. Gieo chúng trên hỗn hợp đất. Cây sẽ mọc rễ và phát triển thành cây
trƣởng thành.
 Nhân giống in vitro
Hầu hết những nghiên cứu trên thế giới về nuôi cấy mô Drosera đều cho
thấy nhiều loài Drosera có tiềm năng nhân giống rất cao khi đƣợc nuôi cấy trong
điều kiện in vitro thích hợp. Cho đến nay, rất nhiều lồi Drosera đã đƣợc nuôi cấy

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về