trích ly enzyme protease từ ruột cá tra

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
*********





LUẬN VĂN
TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ RUỘT
CÁ TRA
Sinh viên GVHD
Nguyễn Vƣơng Tƣờng Vân Huỳnh Thị Phƣơng Loan
MSSV: 2111677










Cần Thơ 2014

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Vƣơng Tƣờng
Vân với sự hƣớng dẫn của Ts. Huỳnh Thị Phƣơng Loan. Các số liệu và kết quả trình
bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm
theo đây, với đề tài “Trích ly enzyme protease từ ruột cá tra” đã đƣợc hội đồng
chấm luận văn thông qua.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
GV hƣớng dẫn Ngƣời viết




Huỳnh Thị Phƣơng Loan Nguyễn Vƣơng Tƣờng Vân

ii
LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận văn này em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ từ rất nhiều phía. Trƣớc hết,
em xin cám ơn Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & SHƢD, Trƣờng
Đại học Cần Thơ đã tạo môi trƣờng thuận lợi nhất cho em học tập và nghiên cứu
trong thời gian thực hiên luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô trong bộ môn, đặc biệt là cô
Huỳnh Thị Phƣơng Loan đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian thực
hiện luận văn.
Bên cạnh đó, cũng xin các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 37 đã nhiệt
tình đóng góp ý kiến và động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại
phòng thí nghiệm.
Cuối cùng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô Trƣờng Đại
học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại
trƣờng.
Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công.
Em xin chân thành cám ơn!

iii
TÓM TẮT

Nghiên cứu khả năng trích ly enzyme protease từ ruột cá tra nhằm thông qua đó xác
định điều kiện tối ưu của quả quá trình trích ly như: tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi, thời
gian trích ly, pH, nhiệt độ. Đặc biệt, kết hợp khảo sát tác động của 2 yếu tố pH và
nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease, quy hoạch thí nghiệm theo phương pháp giai

thừa với 2 yếu tố, 4 mức can thiệp, thực hiện trên 16 mẫu thí nghiệm.
Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi để quá trình trích ly
tối ưu nhất là tỉ lệ 1/2. Thời gian trích ly tối ưu là 10 phút. Đồng thời, quá trình trích
ly cho hoạt tính enzyme đạt cao nhất khi điều chỉnh pH môi trường trích ly là 9 kết
hợp với điều kiện nhiệt độ 40°C.

iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CÁM ƠN ii
TÓM TẮT iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH vi
DANH SÁCH BẢNG vii
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Nội dung nghiên cứu 1
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 Cá tra 2
2.1.1 Đặc điểm sinh học 2
2.1.2 Sơ lược hệ tiêu hóa của cá tra 3
2.1.2.1 Dạ dày – dịch vị – pepsin 3
2.1.2.2 Ruột – dịch ruột – tripsin và erepsin 3
2.1.2.3 Tụy – dịch tụy 4
2.2 Khái quát chung về enzyme protease 4
2.2.1 Lịch sử nghiên cứu enzyme 4
2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 4
2.2.2.1 Nồng độ enzyme 5
2.2.2.2 Nồng độ cơ chất 6
2.2.2.3 Nhiệt độ 7

2.2.2.4 pH 7
2.2.2.5 Các chất kìm hãm 8
2.2.2.6 Các chất hoạt hóa 9
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease 9
2.2.3.1 Về nguồn gốc thực vật 9
2.2.3.2 Về nguồn gốc vi sinh vật 12
2.2.3.3 Về nguồn gốc động vật 13
2.2.4 Ứng dụng của enzyme trong sản xuất 17
2.2.4.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 17
2.2.4.2 Ứng dụng trong phân tích 18
2.2.4.3 Ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và nông nghiệp 18
2.2.4.4 Ứng dụng trong công nghiệp năng lượng 19
2.3 Các nghiên cứu đã đƣợc thực hiện 19
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1 Thời gian và địa điểm 20
3.2 Vật liệu 20
3.3 Hóa chất 20
3.4 Thiết bị và dụng cụ 20
3.5 Phƣơng pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra 21
3.6 Bố trí thí nghiệm 21
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25
4.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme protease 25
4.3 Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease trích ly 27
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29
5.1 Kết luận 29


v
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30
PHỤ LỤC 1: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH PROTESE ix

PHỤ LỤC 2: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ xii
Thí nghiệm 1 xii
Thí nghiệm 2 xiv
Thí nghiệm 3 xvi

vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Con cá tra 2
Hình 2.2: Lớp biểu mô dạ dày 3
Hình 2.3: Nội tạng cá tra 4
Hình 2.4: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] 6
Hình 2.5: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 6
Hình 2.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 7
Hình 2.7: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ enzyme 7
Hình 2.8: Cơ chế hoạt động của enzyme 8
Hình 2.9: Trái dứa 9
Hình 2.10: Cấu trúc glycan của enzyme bromelin 10
Hình 2.11: Quả đu đủ xanh 11
Hình 2.12: Cấu trúc bậc 2 của papain 11
Hình 2.13: cây sung ngọt (Ficus carica) 12
Hình 2.14: Cấu trúc của pepsin và pepsinogen 13
Hình 2.15: phân tử rennin 15
Hình 2.16: Sự hoạt hóa tripsinogen thành tripsin 16
Hình 2.17: Sự hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotrypsin 17
Hình 2.18: Enzyme chymotripsin B 18

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme protease từ ruột cá Tra 21
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 22
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 23
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 24
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của tỷ lệ ruột/ dung môi đến hoạt tính protease trích ly 25
Hình 4.2: Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến hoạt tính protease 26
Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng tác của nhiệt độ và pH đến hoạt tính
enzyme protease 27
















vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên 2
Bảng 2.2: Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển enzyme 4
Bảng 2.3: Một số tính chất của protease (P) tổng hợp protease 10
Bảng 2.4: Tỷ lệ sử dụng của một số enzyme trên thế giới 17

Bảng 2.5: Thị trƣờng enzyme trong công nghệ thực phẩm 18
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của các nhân tố đến phƣơng trình hồi quy 28























1
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ở đồng bằng sông Cửu Long, chế biến thủy sản là một trong những nghành
đặc biệt phát triển nhờ vào đặc điểm khí hậu và nguồn nƣớc thích hợp cho việc nuôi

trồng nhiều loại thủy sản. Cá tra, cá basa là loại cá dễ nuôi, đƣợc nuôi nhiều trong bè
ven sông hay trong ao, đây là loài cá có giá trị kinh tế cao và đƣợc xuất khẩu đi nhiều
nƣớc trên thế giới. Các dạng sản phẩm chính của cá tra, cá basa nhƣ cá fillet, cá tra,
basa xiên que, chả cá, cá cắt khúc, cá nguyên con… Hiện nay, các nhà máy thủy sản
sản xuất khoảng 4000 tấn nguyên liệu/ ngày, tạo ra hơn 2000 tấn phế phẩm trong đó
gồm nội tạng, mỡ cá, xƣơng cá, máu cá,… đây là nguồn nguyên liệu lý tƣởng cho
việc sản xuất các sản phẩm phụ nhƣng vẫn chƣa đƣợc tận dụng một cách triệt để,
việc thải một lƣợng lớn phế phẩm này ra môi trƣờng đã gây ra những vấn đề ô nhiễm
nghiêm trọng cho môi trƣờng sống của con ngƣời và các loài sinh vật. Vì vậy, nhiều
công trình nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm mục đích giải quyết những vấn đề nan
giải về môi trƣờng và làm tăng giá trị cho con cá tra, cá tra thông qua việc tận dụng
tối đa các bộ phận của con cá.
Mỡ cá tra, cá basa đƣợc tận dụng để sản xuất ra dầu bio-diesel, máu cá có hàm lƣợng
protein khoảng 15% trong đó chủ yếu là albumin, globulin và fibrinogen thì đƣợc sử
dụng để sản xuất bột máu bổ sung vào nguồn thức ăn cho động vật. Xƣơng cá cũng
có thể xay thành bột để làm tức ăn gia súc, làm phân bón, xƣơng cá cũng có thành
phần collagen nên có thể dung để nấu keo…
Nội tạng cá (chiếm tỉ lệ khoảng 12,04% khối lƣợng phế phẩm) có chứa nhiều loại
enzyme, đặc biệt là nguồn enzyme protease dồi dào nhƣng vẫn chƣa đƣợc sử dụng
một cách hợp lí nên gây lãng phí lớn.
Từ những vấn đề trên, đề tài trích ly enzyme protease từ nội tạng cá tra đƣợc thực
hiện nhằm trích ly enzyme từ nội tạng cá để tạo nên chế phẩm enzyme protease
1.2 Nội dung nghiên cứu
- Xác định ảnh hƣởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi và thời gian
trích ly đến hoạt tính của enzyme protease từ nội tạng cá
- Tối ƣu điều kiện trích ly enzyme protease với hoạt tính enzyme cao nhất

2
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Cá tra
2.1.1 Đặc điểm sinh học
Cá tra có tên khoa học là Pangasius hypophthalmus là loài cá thƣờng đƣợc nuôi
nhiều trong ao, bè ở các tỉnh Tây Nam Bộ. Về hình thái sinh lý, cá tra là loại cá da
trơn, thân dài, lƣng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng và có hai râu dài, sống chủ
yếu ở nƣớc ngọt và chịu đƣợc nƣớc lợ nhẹ (độ muối dƣới 10 phần nghìn), chịu đựng
đƣợc nƣớc phèn pH >4.(M.D. Menon and Cheko,1995).
Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể sống đƣợc ở những ao hồ chật hẹp và chịu
đƣợc mật độ nuôi cao. Khi thiếu oxy thì cá có thể hớp không khí trên mặt nƣớc, oxy
sẽ đƣợc đi vào máu qua niêm mạc ruột và khí thừa sẽ theo hậu môn ra ngoài.
Cơ quan tiêu hóa của cá tra gồm miệng, răng hàm, gai mang, dạ dày to hình chữ U,
túi mật lớn, ruột. Thức ăn của cá tra thƣờng là những động vật nhỏ, thực vật, giáp
xác,…
Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên
Loại thức ăn
Tỷ lệ (%)
Nhuyễn thể
35.4
Cá nhỏ
31.8
Côn trùng
18.2
Thực vật dƣơng đẳng
10.7
Thực vật đa bào
1.6
Giáp xác

2.3
Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá tra từ 3 – 4 năm, cá bố mẹ đẻ trứng ở vùng
thƣợng lƣu, cá bột sau khi nở sẽ theo dòng nƣớc về hạ lƣu.


Hình 2.1: Con cá tra
(Nguồn:
Trong một con cá tra có tỷ lệ các phần nhƣ sau: thịt cá chiếm 45 – 48%, đầu xƣơng
chiếm tỷ lệ 33 – 36%, da và vây chiếm tỷ lệ 6 – 8%, nội tạng chiếm tỷ lệ 11 – 13%.


3
2.1.2 Sơ lược hệ tiêu hóa của cá tra
Để duy trì sự sống của cơ thể thì hệ tiêu hóa là rất quan trọng. Thức ăn là nguồn
nguyên liệu cần thiết để cơ thể tồn tại và phát triển , các chất dinh dƣỡng từ thức ăn
đƣợc hấp thụ thông qua hệ tiêu hóa. Do cá sống trong môi trƣờng nƣớc nên tác dụng
làm ƣớt thức ăn của nƣớc bọt là không thiết yếu do vậy khoang miệng của cá nói
chung không có tuyến tiêu hóa, miệng cá có vai trò chủ yếu là bắt giữ mồi.
Thức ăn đƣợc tiêu hóa chủ yếu là nhờ tác dụng của dịch tiêu hóa do các tuyến tiết ra,
đƣợc chứa trong ống tiêu hóa.
2.1.2.1 Dạ dày – dịch vị – pepsin
Trong dạ dày có các tuyến tiết ra dịch vị có tác dụng tiêu hóa đối với protein. Độ pH
trong dạ dày của cá rất thấp. Vd: pH ở dạ dày cá hồi là 3.1 trong khi pH ở ruột non là
6.4. Trong dịch vị có enzyme pepsin, hoạt tính tối ƣu trong điều kiện pH 1.7 – 3.0 và
nhiệt độ là 30 – 50
o
C. Ngoài ra, HCl cũng đƣợc tiết ra, có vai trò quan trọng trong
quá trình tiêu hóa thức ăn và chuyển hóa của pepsinogen.

Hình 2.2: Lớp biểu mô dạ dày

(Nguồn:
Tác dụng của HCl:
- Chuyển hóa pepsinogen thành pepsin hoạt động
- Làm nở các mô liên kết của thức ăn, làm tan các chất keo
- Thủy phân đƣờng đôi nhƣ saccarose…
- Diệt khuẩn: có tác dụng diệt khuẩn đối với một số vi sinh vật nhƣ E.coli, tụ
cầu…
- Đóng mở môn vị
Tác dụng của pepsin:
- Phân giải protein không triệt để thành các chuỗi popypeptide mạch ngắn
2.1.2.2 Ruột – dịch ruột – tripsin và erepsin
Dịch ruột đƣợc tiết ra do các tuyến ruột non, là một chất không màu, có tính chất
kiềm. Tripsin ở đoạn ruột trƣớc nhiều hơn ở đoạn ruột sau, erepsin do tuyến ruột ở
niêm mạc ruột tiết ra và tồn tại trong dịch ruột. Hai nhóm enzyme chính có trong ruột
là:


4

- Nhóm enzyme tiêu hóa protein gồm aminopeptidase và dipeptidase gọi chung
là erepsin, chỉ có thể phân giải protein có phân tử lƣợng nhỏ nhƣ peptone và
proteoza thành amino acid.
- Enzyme enterakinase có tác dụng hoạt hóa tripsinogen thành tripsin. Tripsin là
enzyme hoạt động trong môi trƣờng kiềm tính, có tác dụng thủy phân không
triệt để protein thành các phân tử peptide mạch ngắn (Nguyễn Đức
Lƣợng,2004)

Hình 2.3: Nội tạng cá tra
(Nguồn:
2.1.2.3 Tụy – dịch tụy

Dịch tụy do tụy tạng tiết ra, độ pH = 8. Trong dịch tụy có nhiều enzyme tiêu hóa
- Trypsinogen và chymotripsinogen, peptidase. Tripsinogen khi gặp
enterokinase của ruột sẽ đƣợc hoạt hóa thành tripsin. Chymotripsinogen khi
gặp tripsin sẽ đƣợc hoạt hóa thành chymotripsin.
- Lipase của tụy là một enzyme tiêu hóa mạnh, thủy phân lipid thành glycerin
và acid béo
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Lịch sử nghiên cứu enzyme
Bảng 2.2: Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển enzyme

Năm

Nghiên cứu, phát triển

1833

1874

1876

1897


1900

Payen và Persoz tách đƣợc diatase từ malt

Hansen tách đƣợc rennet từ bao tử cừu

Kiihne đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme

Anh em Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể
chuyển hóa glucose thành cồn và CO
2


Rohm sử dụng protease trong công nghệ thuộc da



5
2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: nồng độ enzyme, nồng
độ cơ chất, nhiệt độ, pH, các ion kim loại…Dƣới đây sẽ xét đến các yếu tố thƣờng
gặp và có tác động nhiều nhất đến vận tốc phản ứng của enzyme.
2.2.2.1 Nồng độ enzyme
Tốc độ phản ứng thƣờng biến đổi theo nồng độ cơ chất [S] và nồng độ enzyme [E].
Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng dần. Khi nồng độ cơ chất lớn, tốc
độ phản ứng ít phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hƣớng phụ thuộc vào
nồng độ enzyme.
Trong điều kiện thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào
[S]. Phƣơng trình vận tốc phản ứng V = K[E] có dạng y=ax. Khi đó, vận tốc phản
ứng sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ enzyme (Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân
Hải,2005).
1913

1917


1920 – 1928

1926


1928

1969



1972


1973

1984

1984 đến nay
Rohm sử dụng enzyme làm chất tẩy rửa

Boidin và Effront nghiên cứu α-amylase của B.subtilis và đƣợc
ứng dụng trong nghành dệt

Will Slitter tinh sạch đƣợc enzyme

Samner kết tinh đƣợc urease và Northrop kết tinh đƣợc protease

Fleming phát hiện ra penicilline

Tanabe co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino

acid. Sử dụng glucose isomerase trong sản xuất dung dịch đƣờng
giàu fructose

Boyer et al đƣa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động
tích cực đến công nghệ enzyme

Tanabe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào.
Winter và Ferch đƣa ra công nghệ sản xuất protein
Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry – lamide và một loạt các
quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme.
Phát hiện ra hàng trăm loại enzyme khác nhau, đã đƣa vào sản
xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và
đời sống.


6

Hình 2.4: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]
(Nguồn:
2.2.2.2 Nồng độ cơ chất
Phƣơng trình Michaelis – Menten cho ta thấy rõ mối quan hệ của nồng độ cơ chất và
vận tốc phản ứng. K
m
đƣợc gọi là hằng số Michaelis – Menten đặc trƣng cho ái lực
của enzyme với cơ chất, K
m
có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng
lớn nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn (Nguyễn Công Hà, Lê
Nguyễn Đoan Duy,2011).

Hình 2.5: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất
(Nguồn:
Phƣơng trình động học Michaelis – Menten cho thấy sự phụ thuộc của hoạt tính
enzyme vào nồng độ cơ chất (hình 2.5), phƣơng trình này liên kết tốc độ phản ứng
(V), nồng độ cơ chất (S) với tốc độ cực đại (V
max
) và hằng số Michaelis (K
m
). Với:
K
m
là hằng số Michaelis đặc trƣng cho ái lực của enzyme với cơ chất và V
max
là tốc
độ tạo thành sản phẩm khi enzyme đƣợc bão hòa cơ chất và hoạt động nhanh tối đa.
(Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)
Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng tăng, khi [S] tăng đến một giá trị nào đó thì vận tốc
đạt cực đại và sẽ không tiếp tục tăng nếu [S] vẫn tăng. Điều này cho thấy khi nồng độ
cơ chất tăng đến một giới hạn nào đó thì cơ chất sẽ ức chế hoạt động của enzyme làm
ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng.
V
max

V
max

2
K
m

Tốc độ
Nồng độ cơ chất
V
max
+ S
K
m
+ S


V =


7
2.2.2.3 Nhiệt độ
Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi
trƣờng, hiện tƣợng này tuân theo quy luật Vant - Hoff. Khi tăng nhiệt độ lên 10
o
C thì
tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần (Nguyễn Minh Thủy,2005).

Hình 2.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme
(Nguồn:
Phản ứng do enzyme xúc tác cũng chịu ảnh hƣởng của định luật này nhƣng chỉ trong
một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein.Khi ta tăng nhiệt độ lên quá cao
thì enzyme sẽ bị biến tính, phần lớn enzyme có nhiệt độ tối thích trong khoảng 30 –
50
o
C. Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm (hình 2.6).

Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc vào nguồn cung
cấp enzyme, cũng có enzyme có nhiệt độ tối thích cao trong khoảng nhiệt độ từ 60 –
70
o
C.
2.2.2.4 pH
Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi
tính chất của trung tâm hoạt động, là nơi liên kết với cơ chất của phân tử enzyme,
dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Mỗi enzyme có một pH
tối thích khác nhau, phần lớn enzyme có pH tối ƣu trong khoảng 4 – 6.
Ảnh hƣởng của pH lên vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có dạng nhƣ hình 2.7


Hình 2.7: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ enzyme
(Nguồn:
Ảnh hƣởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau:
 Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp
pH
Vận tốc phản ứng


8
 Ở hai sƣờn của pH tối thích có thể xảy ra sự phân ly nhóm prosthetic hay
coenzyme.
 Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly cơ chất.
 Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn đến
làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và thay đổi hoạt tính cực
đại.
2.2.2.5 Các chất kìm hãm
Hoạt độ enzyme có thể bị thay đổi dƣới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học

khác nhau. Các chất làm giảm hoạt độ enzyme nhƣng không bị chuyển hóa bởi
enzyme đƣợc gọi là các chất kiềm hãm hoặc các chất ức chế. Các chất này có thể là
những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein.
Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme.
Nhiều chất khác không làm biến tính enzyme nhƣng vẫn kìm hãm hoạt động của
enzyme theo một cơ chế khác. Các chất này có thể kìm hãm hoạt động của enzyme
theo hƣớng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch (Lê Ngọc Tú,2004).
Nếu là kìm hãm thuận nghịch thì phản ứng kết hợp giữa enzyme và chất kìm hãm
nhanh chóng đạt đến cân bằng. Trong trƣờng hợp kìm hãm không thuận nghịch, k
-1

(hình 2.8b) rất bé có thể xem nhƣ bằng không, I kết hợp với E bằng liên kết đồng hóa
trị hoặc liên kết rất chặt khó có thể tách khỏi E, sự phân ly của phức EI là rất chậm.


Hình 2.8: Cơ chế hoạt động của enzyme
a: Mô hình trung tâm hoạt động của Fisher, b: Mô hình của Koshland
(Nguồn:






K
1

K-
1

9
2.2.2.6 Các chất hoạt hóa
Là chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông
thƣờng là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ nhƣ các vitamin tan
trong nƣớc làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydro hoặc những chất có khả năng phá vỡ
một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc là những chất có khả năng phục hồi
những nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme (Lê Ngọc Tú,2004).
Tính chất hoạt hóa của các cation kim loại:
 Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho một kiểu phản ứng nhất định.
 Cation kim loại có tính đặc hiệu tƣơng đối hay tuyệt đối.
 Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion.
 Phụ thuộc nồng độ cation kim loại .
 Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích.
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease
Trong ngành công nghiệp thực phẩm thƣờng sử dụng rất nhiều protease để hỗ trợ quá
trình sản xuất nhằm tăng khả năng sản xuất sản phẩm và hạ giá thành sản phẩm.
Enzyme protease có thể đƣợc thu nhận chủ yếu từ 3 nguồn là thực vật, động vật và vi
sinh vật.
2.2.3.1 Về nguồn gốc thực vật
Bromelin từ cây dứa:
Dứa có tên khoa học là Ananas comusus, thuộc họ Bromeliaceae. Cây dứa là loại cây
đƣợc sử dụng hầu hết các bộ phận nhƣ phần thân và lá thì đƣợc sử dụng làm giấy
hoặc làm phân bón. Quả dứa đƣợc sử dụng làm thực phẩm và có thể sử dụng các phế
phẩm để trích ly enzyme bromelin.

Hình 2.9: Trái dứa
(Nguồn:
Trong quả dứa chín, cacbohydrate chiếm 10 – 18% (trong đó có 60 -67% saccharose,

glucose và fructose chiếm 30 – 40%), protein 2 – 3%, acid hữu cơ 0,1 –
1.6% Bromelin là tên gọi của nhóm enzyme thực vật có chứa sulfhydryl, có khả
năng phân giải protein.
Năm 1957, tiến sĩ Ralph Heinicke nhận thấy trong thân dứa có một lƣợng lớn
bromelin và bắt đầu đƣợc chiết tách nó để đƣa vào sản xuất. Ở mỗi bộ phận khác
nhau trên cây dứa thì bromelin có pH tối ƣu khác nhau và có cấu tạo khác nhau.


10
Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, pH tối ƣu nằm trong khoảng 6 – 8, có
trọng lƣợng phân tử khoảng 33000 Da.
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin kể từ ba tháng trƣớc khi chín, trong
đó hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trƣớc khi chín. Khi trái chín, hoạt tính
bromelin giảm xuống. Thông thƣờng, ngƣời ta có thể thu đƣợc trung bình 3.6 kg
bromelin từ 378 lít dịch quả dứa.

Hình 2.10: Cấu trúc phần glycan của enzyme bromelin
(nguồn:
Bromelin là một protease có bản chất là một sợi glycoprotein, mỗi phân tử có glycan
gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrat carbon này liên kết
hoán vị với sợi polypeptide. Bromelin quả có thành phần amino acid thay đổi trong
khoảng 283 – 161 amino acid.
Bromelin thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầu
carbohydrate là glycine, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanine.
Bromelin là một protease mà trung tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối – S – S – , phân tử có dạng hình cầu.
Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase.
Trong một thử nghiệm hoạt tính phân giải của bromelin, ngƣời ta ghi nhân đƣợc hoạt
tính phân giải casein của bromelin phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của quả dứa (chin,
xanh) nhƣ: bromelin thân của quả vừa chín tới là 7.4 UI/ mg, của bromelin quả xanh

là 4.0 UI/ mg và của bromelin quả chín là 3 UI/ mg.
Papain thu nhận từ đu đủ xanh:
Papain thƣờng đƣợc lấy từ nhựa của quả còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lƣợng từ 0,3
– 1 kg. Nhựa đu đủ phải chứa trong bình thủy tinh sậm màu, tránh tiếp xúc với không
khí để đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa.


11

Hình 2.11: Quả đu đủ xanh
(Nguồn:
Nhựa là hỗn hợp các enzyme protease: papain, chymopapain A (gốc acid amin cuối
là glutamic acid), chymopapain B (gốc acid amin cuối là tyrosine), proteinase III,
proteinase IV, thiolprotease. Trong đó, hàm lƣợng papain chiếm trên 95% tổng hàm
lƣợng protease có trong nhựa đu đủ. Papain là một endoprotease có chứa 16,1% N và
1,2% S.
Theo nghiên cứu của Smith (1960) và Hill (1965), papain là một chuỗi polypeptide
có 185 amino acid, có trọng lƣợng phân tử khoảng 20900 Dalton. Theo kết quả phân
tích bằng tia X, papain đƣợc cấu tạo bởi 212 amino acid không có methionine. Phân
tử lƣợng 23350 Da, phân tử papain là một chuỗi polypeptide với đầu N là isoleucine,
đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo ra 3 cầu liên kết disulfur.

Hình 2.12: Cấu trúc bậc 2 của papain
(Nguồn:
Trung tâm hoạt động của papain gồm có nhóm – SH của cysteine và nitrogen bậc 3
của histidine, nhóm imidazole của histidine cũng liên kết với Asp bởi liên kết hidro.
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và acid amin. Papain có thể thủy
phân hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline, với các glutamic acid có
nhóm carboxyl tự do. Hoạt tính của enzyme papain đƣợc tăng cƣờng khi có sự hiện
diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại nhƣ EDTA. Papain bị kìm hãm

bởi các chất oxy hóa nhƣ: oxi, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide,
thủy ngân chlobenzoate, cystine và các hoạt chất disulfur khác.





12
Ficin từ nhựa của cây thuộc họ sung, vả:
Ficin là một protease đƣợc tìm thấy trong nhựa của cây sung, vả, thuộc họ Moraceae.
Ngày xƣa, con ngƣời đã biết sử dụng nhựa của các cây họ sung để làm đông
sữa trong sản xuất phô mai. Năm 1930, Robbins nhận thấy trong nhựa của các cây họ
sung có một loại enzyme có thể tiêu diệt đƣợc giun tròn Ascaris, ông đặt tên cho nó
là ficin. Trong đó, sung ngọt là loại cây có nhiều nhựa trắng đục, có sản lƣợng cao và
đƣợc trồng phổ biến ở Hoa Kỳ, Tây Ban Nha, Ai Cập…. Nhựa đƣợc thu vào buổi
sáng thì enzyme ficin có hoạt tính cao nhất, sấy khô để dùng trong công nghiệp thực
phẩm.

Hình 2.13: Cây sung ngọt (Ficus carica)
(Nguồn: www.compagniadelgiardinaggi)
Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulhydryl (-
SH). Trình tự các amino acid trong trung tâm phản ứng của ficin.
– Pro – Leu – Arg – Gln – Gly – Glu – Cys – Gly – Ser – Cys – Tryp –
Trọng lƣợng phân từ: 23000 – 27000 Da
Nhiệt độ hoạt động: 30 – 80
o
C, nhiệt độ tối ƣu là 50 – 65
o
C
Điểm đẳng điện: 9 – 10

pH hoạt động của ficin rộng: 4 – 9.5
Ficin có thể thủy phân liên kết của các protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành,
gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả Ascaris sống. ficin cũng có thể thủy
phân các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo.
2.2.3.2 Về nguồn gốc vi sinh vật
Enzyme là một loại protein có tác dụng xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong tế
bào, cơ thể. Ngày nay, vi sinh vật là đối tƣợng đƣợc sử dụng trong sản xuất enzyme
ngày nay. Giống vi sinh vật trong sản xuất enzyme quyết định đến:
- Khả năng sinh tổng hợp enzyme
- Hoạt tính enzyme
- Ảnh hƣởng đến năng suất tổng hợp enzyme
Nhiều VSV có khả năng tổng hợp protease. Dựa vào cơ chất, pH hoạt động có thể
chia protease thành 4 loại: protease acid, protease kim loại, protease thiol, protease
xerin.
Một số tác giả căn cứ vào pH hoạt động lại chia protease thành 3 loại là: protease
trung tính, protease acid, protease kiềm. Các protease thiol, protease xerin có khả
năng phân giải liên kết ester và liên kết amide của amino acid, ngƣợc lại các protease
acid, protease kim loại thƣờng không có hoạt tính esterase.


13
Trong quá trình xúc tác của enzym vùng cấu trúc không gian đặc biệt tham gia trực
tiếp vào phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động". Cấu tạo đặc
biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của
enzyme.
Bảng 2.3: Một số tính chất của protease (P) tổng hợp protease
Nhóm
Nguồn enzyme
Đặc điểm trung tâm hoạt động
pH tối ƣu

P xerin
 Bac. Subtilis
 Asp. Oryzae
 Asp. Flavus
…
Xerin
Kiềm
P thiol
 Streptococcus
 Clostridium
histoly– tycum
- SH
7.5
7.0
P kim loại
 Bac. Subtilus
 Asp. Oryzae
 Atreptomyces
naraensis
…
Kim loại hóa trị 2
Trung tính
P acid
 Asp. Niger
 Asp. Awamori
 Mucor pusilus
…
COOH
acid
2.2.3.3 Về nguồn gốc động vật

a/ Enzyme có trong dạ dày
Pepsin
Hai enzyme chủ yếu trong hệ tiêu hóa của chim và thú là pepsine và rennin. Pepsin là
một enzyme quan trọng của tuyến tiêu hóa của động vật, thuộc nhóm enzyme thủy
phân. Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn thành hình cầu, bao gồm
329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleucin

(Nguyễn Đức Lƣợng.2004).












Hình 2.14: Cấu trúc của pepsin và pepsinogen
(Nguồn:
Pepsin
pepsinogen
Peptide kìm hãm (tƣơng ứng khoảng 41 amino acid)


14

Trong cơ thể sinh vật, pepsin đƣợc tiết ra dƣới dạng là pepsinogen. Khi tiếp xúc với

môi trƣờng acid của dạ dày hay pepsin thì pepsinogen sẽ đƣợc hoạt hóa thành pepsin.
Quá trình hoạt hóa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptide và giải phóng
ra chuỗi peptide kìm hãm, thành phần của chuỗi peptide kìm hãm này bao gồm 41
amino acid của pepsinogen (Koen và cộng sự,1968).
Pepsin hoạt động chủ yếu ở pH 1.7 – 2.2, tham gia quá trình thủy phân protein
thành các polypeptide mạch ngắn. Pepsin tác động lên hầu hết các protein tự nhiên và
có khả năng phân cắt tới 30% liên kết peptide có trong phân tử protein tạo thành chủ
yếu các peptide chứa từ 5 – 8 acid amin.
Sự tự phân giải của pepsin
Pepsin vừa có bản chất là protein vừa là enzyme phân giải protein nên pepsin có khả
năng tự phân hủy. Theo Ingram (1955), trong quá trình pepsin tự tiêu hóa ở nhiệt độ
45
o
C, pH = 4 trong 24 giờ, nhận thấy có 45% tyrosine của phân tử enzyme đƣợc giải
phóng và kết tinh, ngoài ra còn xuất hiện các peptide có phân tử lƣợng nhỏ từ 1000 –
2000 Da. Theo Perlmann (1955), sự tiêu hóa của pepsin tạo ra những sản phẩm có
thể thẩm tích và có hoạt động phân giải protein, chỉ còn lại khoảng 64% hoạt tính
gốc, hoạt tính này đƣợc kiểm tra trên hemoglobin.
Tóm lại, sự tự tiêu của pepsin thƣờng xảy ra trong điều kiện pepsin ở dạng dung dịch,
pH thấp, nhiệt độ thích hợp, tạo ra nhiều thành phần có phân tử lƣợng nhỏ hơn
pepsin.
b/ Enzyme có trong ruột
Tripsin
Tripsin hoạt động trong môi trƣờng kiềm ở ruột nên thuộc loại protease kiềm
tính. Vai trò của tripsin là tiếp tục thủy phân các protein sau khi trãi qua quá trình
tiêu hóa ở dạ dày. Tripsin đƣợc tiết ra ở dạng không hoạt động là tripsinogen, sau đó
đƣợc chuyển thành tripsin dƣới tác động của enzyme ruột enterokinase và bởi chính
tripsin (Nguyễn Hữu Chấn,1983).
Enzyme tripsin đƣợc tụy tiết ra dƣới dạng không hoạt động là tripsinogen, sau đó
tripsinogen đƣợc chuyển hóa thành tripsin dƣới tác dụng của enzyme đƣờng ruột

enterokinase và bởi chính tripsin. Tripsinogen là một chuỗi polypeptide mạch thẳng
gồm 229 amino acid và có trọng lƣợng phân tử khoảng 23048 – 23800 Dalton
(Nguyễn Đức Lƣợng và cộng sự,2004).
Cơ chế hoạt hóa tripsinogen
Có 2 cơ chế để hoạt hóa tripsinogen đó là xúc tác nhờ enzyme đƣờng ruột
enterokinase và tự xúc tác. Quá trình tự xúc tác này chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của
một lƣợng nhỏ enzyme tripsin, nếu hàm lƣợng tripsin lớn thì quá trình tự xúc tác sẽ
bị ức chế.

Tripsinogen Tripsin

Tripsinogen Tripsin
Tripsin
Enterokinase


15

Hình 2.15: Sự hoạt hóa tripsinogen thành tripsin
(Nguồn:
Đặc điểm cấu tạo tripsin
Tripsin là một chuỗi polypeptide trọng lƣợng phân tử khoảng 22680 – 23400 Da. pH
tối ƣu cho hoạt động của tripsin là 8 và pH thích hợp của tripsin là 7.8 – 9.5. Nhiệt độ
thích hợp trong khoảng 30 – 40
o
C. Ở nhiệt độ này và pH 8.5 – 9, tripsin có khả năng
thủy phân mạnh các loại cơ chất nhƣ casein, hemoglobin hay gelatin. Khi đun nóng
dung dịch enzyme đến 90
o
C và pH trong khoảng 6 – 8 thì enzyme bị mất hoạt tính.

Tripsin có trung tâm hoạt động bao gồm các amino acid nhƣ:
- Gly – Asp – Ser – Gly – Pro -
Tripsin là một loại enzyme thủy phân protein không triệt để. Khi sử dụng tripsin thì
chỉ có 1/3 liên kết peptide trong phân tử protein là bị thủy phân, phần còn lại là các
peptide mạch ngắn. Tripsin cắt các liên kết đƣợc tạo ra bởi nhóm carboxyl của lysine
hay arginine với nhóm amine của các amino acid bất kỳ và tripsin không cắt liên kết
giữa lysine và arginine.
Hoạt tính phân cắt cơ chất
Các phân tử protein khi bị cắt bởi tripsin sẽ tạo ra những peptide có trọng lƣợng phân
tử nhỏ và đôi khi cũng tạo ra các amino acid tự do nhƣ tryptophan, tyrosine. Ngoài
hoạt động thủy phân liên kết peptide, tripsin còn có thể thủy phân liên kết ester.
Chymotripsine
Chymotripsin là một protease đƣợc tiết ra từ tụy, là một protease có tính kiềm.
Chymotripsin đƣợc tiết ra dƣới dạng không hoạt động là chymotripsinogen, sau đó
đƣợc chuyển thành chymotripsin nhờ tác dụng của tripsin.
Cơ chế hoạt hóa chymotripsinogen
Quá trình chymotripsinogen đƣợc hoạt hóa thành chymotripsin diễn ra nhƣ sau:
Đầu tiên, tripsin phân cắt liên kết giữa hai amino acid là arginine 15 và isoleucine 16
sẽ tạo thành π – chymotripsin có hoạt tính thủy phân nhƣng không bền. Sau đó,
tripsin tiếp tục cắt đứt liên kết giữa hai amino acid khác là serine 14 và arginine 15 để

Enterokinase
Peptide ức chế


16
tạo ra δ – chymotripsin. Cuối cùng, là tách dipeptide bao gồm threonine 148 và
asparagines 149 sẽ hình thành α – chymotripsin. α – chymotripsincó cấu trúc không
gian đƣợc giữ bằng 5 cầu nối disulfur (hình 2.16).

Hình 2.16: Sự hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotripsin
(Nguồn:
Chymotripsin đƣợc cấu tạo tử 3 sợi polypeptide:
 Sợi A: các amino acid từ 1 – 13
 Sợi B: các amino acid từ 16 – 146
 Sợi C: các amino acid từ 149 – 245
Các sợi này liên kết với nhau bằng cầu nối disulfit. Các sợi polypeptide liên kết với
nhau tạo thành dạng hình cầu. Cấu trúc thứ cấp của enzyme có dạng β.
Chymotripsin có bộ ba amino acid xúc tác phản ứng là – Ser195 – His57 – Asp102 –.
Những amino acid này tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme hỗ trợ cho hoạt
động xúc tác (hình 2.17).
Chymotripsin hoạt động trong điều kiện pH 7 – 9 và pH tối ƣu là 8 – 9, điểm đẳng
điện pI = 5.4, là chuỗi polypeptide có 245 amino acid có trọng lƣợng phân tử 22500
dalton. Chymotripsin xúc tác sự thủy phân liên kết peptide của các phân tử protein và
phân cắt có chọn lọc những liên kết peptide trong chuỗi polypeptide ở vị trí đầu – C
của amino acid có nhân thơm nhƣ triptophan, tyrosine, phenylalanine.
Chymotripsin hoạt động nhƣ một endopeptidase phân cắt mạch polypeptide thành
các peptide mạch ngắn và tác dụng trên những liên kết mà tripsin không phân cắt.
Những liên kết này đƣợc tạo thành bởi nhóm carboxyl của amino acid có nhân thơm
nhƣ tyrosine, tryptophan, phenylalanine với nhóm amin của amino acid khác. Đây là
enzyme có khả năng phân cắt đƣợc cả liên kết peptide và liên kết ester.


17

Hình 2.17: Enzyme chymotripsin B
(Nguồn:
2.2.4 Ứng dụng của enzyme trong sản xuất
Ngày nay, việc sản xuất enzyme đã đƣợc phát triển ở quy mô công nghiệp và
sản phẩm enzyme đã đƣợc ứng dụng phổ biến trong các nghành nghề phục vụ cho

sản xuất. Số lƣợng enzyme đƣợc phát hiện và sử dụng ngày càng nhiều. Việc sử dụng
enzyme thƣơng mại trên thị trƣờng thế giới đƣợc thể hiện qua bảng sau:
Bảng 2.4: Tỷ lệ sử dụng của một số enzyme trên thế giới
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)
Loại enzyme
Tỷ lệ ứng dụng (%)
Enzyme protease
 Trypsin
 Rennet
 Protease acid
 Protease trung tính
 Protease kiềm yếu
 Protease kiềm mạnh dùng trong chất tẩy rửa
59
3
10
3
12
6
25
Carbohydrase
 Pectinase
 Isomenase
 Cellulose
 α-amylase
 β-amylase
28
3
6
1

13
13
Lipase
3
Các enzyme khác sử dụng trong y học và trong phân tích
10

2.2.4.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Đặc biệt, số lƣợng enzyme đƣợc ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là
nhiều nhất. Thƣờng đƣợc sử dụng trong các lĩnh vực sản xuất nƣớc chấm: nƣớc mấm,
tƣơng, chao…Đồng thời enzyme đƣợc bổ sung vào thực phẩm nhằm làm mềm thịt,
tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến. Trong công nghệ sữa các protease nhƣ rennin,
pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.
Enzyme hầu hết có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Ở Việt Nam, việc
sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp chƣa phát triển và vẫn còn phụ thuộc vào
nguồn enzyme từ nƣớc ngoài.