phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa tại một số tỉnh ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIP V SINH HỌC NG DNG
o0o






NGUYỄN THỊ ANH THƯ



PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU
GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL
TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG




LUẬN VĂN TỐT NGHIP ĐẠI HỌC
NGNH NÔNG NGHIP SẠCH





Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIP V SINH HỌC NG DNG
o0o



NGUYỄN THỊ ANH THƯ

PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU
GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL
TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG


LUẬN VĂN TỐT NGHIP ĐẠI HỌC
NGNH NÔNG NGHIP SẠCH
MSSV: 3103370


Người hướng dẫn khoa học:
TS. DƯƠNG MINH VIỄN

Cần Thơ, 2014
i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân và thầy
hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai

công bố trong bất cứ luận văn nào trước đây.
Người hướng dẫn Tác giả luận văn


TS. Dương Minh Viễn Nguyễn Thị Anh Thư



















ii

LÝ LỊCH KHOA HỌC
I. LÝ LỊCH SƠ BỘ
Họ và tên: Nguyễn Thị Anh Thư Giới tính: Nữ
Ngày, tháng, năm sinh: 11/03/1992 Nơi sinh: Sóc Trăng

Quê quán: Kế Sách, Sóc Trăng Dân tộc: Kinh
Địa chỉ liên lạc: xã Nhơn Mỹ, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng
Di động: 0907741288
E-mail:
II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
Năm 1999-2003, học tại trường tiểu học Nhơn Mỹ, xã Nhơn Mỹ, huyện Kế Sách,
tỉnh Sóc Trăng.
Năm 2004-2007, học tại trường THCS Nhơn Mỹ, xã Nhơn Mỹ, huyện Kế Sách,
tỉnh Sóc Trăng.
Năm 2008-2010, học tại trường THPT Kế Sách, thị trấn Kế Sách, huyện Kế Sách,
tỉnh Sóc Trăng.
Năm 2011-2014, học tại trường Đại Học Cần Thơ, đường 3/2, phường Xuân
Khánh, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
Cần Thơ, ngày….tháng…. năm 2014
Ký tên


Nguyễn Thị Anh Thư






iii

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin gửi lời tri ơn sâu sắc đến gia đình những người đã không ngại khó khăn,
gian khổ tiếp sức, lo lắng và động viên cho tôi có ngày hôm nay.
Để có kết quả này, tôi xin gửi lời ghi ơn sâu sắc đến thầy Dương Minh Viễn đã

tận tâm hướng dẫn và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức cũng như những kinh nghiệm
quý báu giúp tôi hoàn thành được luận văn.
Chân thành biết ơn cô Nguyễn Đỗ Châu Giang là cố vấn của lớp Nông Nghiệp
Sạch khóa 36 đã định hướng, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
khóa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Bộ Môn Khoa Học Đất và quý
Thầy, Cô của Khoa Nông nghiệp & SHƯD, đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt cho tôi
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt khóa học.
Tôi xin gửi lời biết ơn đến anh Trương Quốc Tất đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong
quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các anh, chị và các bạn trong PTN Sinh học Đất - Bộ Môn Khoa
học Đất đã tận tình giúp đỡ, động viên và hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin thân gửi lời chúc sức khỏe, thành đạt nhất đến các bạn lớp Nông Nghiệp
Sạch khóa 36, những người đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập. Chúc các bạn gặp nhiều may mắn và thành công trong cuộc sống.



Nguyễn Thị Anh Thư





iv

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1.1 Công thức hóa học của Chlorpyrifos ethyl 6
Hình 1.2 Một số chế phẩm chứa Chlorpyrifos ethyl được sử dụng phổ biến 7

Hình 1.3 Động thái của thuốc BVTV dư tồn trong đất (nguồn Ross, 1989) 9
Hình 1.4 Các sản phẩm chuyển hóa của Chlorpyrifos ethyl 10
Hình 2.1 Một số địa điểm thu mẫu 16
Hình 2.2 Thu mẫu đất 18
Hình 3.1 Thống kê diện tích và số hộ sử dụng thuốc trừ sâu có chứa hoạt chất
Chlorpyrifos ethyl 23
Hình 3.2 So sánh giữa liều lượng khuyến cáo với liều lượng sử dụng Chlorpyrifos
ethyl thực tế của nông dân 25
Hình 3.3 Khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của hệ vi khuẩn trong môi trường
dung dịch MM sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn) 27
Hình 3.4 Khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của 8 dòng vi khuẩn trong môi trường
dung dịch MM sau 30 ngày nuôi cấy (n=4 và độ lệch chuẩn) 28
Hình 3.5 Hình dạng tế bào vi khuẩn của hai dòng vi khuẩn PH C3.1 và PH C4.3 được
quan sát trên kính hiển (quan sát ở E100) 29
Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm Box-PCR của hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3
30
v

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Nguồn gốc của tám dòng vi khuẩn phân lập được 20
Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát tốc độ phân hủy Chlorpyrifos
ethyl……………………………………………………………………………… 21
Bảng 3. 1 Một số đặc tính lý hóa của các mẫu đất sử dụng trong thí nghiệm 26
Bảng 3.2 Hình dạng khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn vi khuẩn PH C3.1 và PH C4.3
29
vi

TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ gốc
bp
Base pair
BVTV
Bảo Vệ Thực Vật
CTAB
Cetyltrimethylammonium bromide
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
DEC
Desethyl chlorpyrifos
DNA
Deoxyribonucleic acid
ERIC
Enterobacterial repetitive intergenic consensus
HPLC
High Pressure Liquid Chromatography
IRU
Intergenic repeat units
LC
50

Lethal Concentration 50
LD
50

Lethal Dose 50
MM
Minemal mineral medium
OPCs

Organophosphorus compounds
PU
Palindromes units
REP
TCP
Repetitive extra-genic palindromes
3,5,6 - trichloro - 2 - pyridinol
WHO
World Health Organization

vii

Nguyễn Thị Anh Thư, 2014. “PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ
SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁC
LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG”. Luận văn tốt
nghiệp đại học ngành Nông Nghiệp Sạch, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường Đại
học Cần Thơ.
Cán bộ hướng dẫn khoa học: Ts. Dương Minh Viễn
TÓM LƯỢC
Đề tài “Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ
Chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long”
được thực hiện với mục tiêu: (1) Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên
mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu
Giang;(2)Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl
trên mô hình chuyên canh lúa thuộc hai nhóm đất là đất phù sa và đất phèn. Phương
thức điều tra tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl là phỏng vấn trực tiếp nông dân.
Tổng cộng 13 mẫu đất trong đó: 4 mẫu ở Cai Lậy - Tiền Giang, 4 mẫu ở Bình Tân -
Vĩnh Long và 5 mẫu ở Phụng Hiệp - Hậu Giang được sử dụng để phân lập dòng vi
khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl.
Kết quả điều tra tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl cho thấy, các hoạt chất

được nông dân sử dụng để phòng trừ sâu hại rất đa dạng về chủng loại, số lượng và
loại hoạt chất thay đổi theo vị trí địa lý của từng vùng. Hoạt chất Chlorpyrifos ethyl
chỉ được sử dụng tại hai địa điểm là Cai Lậy - Tiền Giang, Phụng Hiệp - Hậu Giang
và liều lượng được nông dân sử dụng cao gấp khoảng 2 đến 8 lần so với liều lượng
khuyến cáo.
Kết quả thí nghiệm phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong môi trường khoáng tối
thiểu loãng bởi 13 hệ vi sinh vật cho thấy, 2/13 hệ vi sinh vật và 2/8 dòng vi khuẩn đã
phân lập ở Phụng Hiệp - Hậu Giang thể hiện sự phân hủy Chlorpyrifos ethyl. Hai
dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3 có thể phân hủy được 13,96% và 49,72%
Chlorpyrifos ethyl ở nồng độ 20 ppm sau 30 ngày nuôi cấy. Kết quả chạy Box-PCR từ
DNA cho thấy, hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3 khác nhau về mặt di truyền.
viii

MC LC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM TẠ iii
DANH SÁCH HÌNH iv
DANH SÁCH BẢNG v
TỪ VIẾT TẮT vi
TÓM LƯỢC vii
MC LC viii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. LƯỢC KHẢO TÀI LIU 2
1.1 Tổng quan về thuốc trừ sâu 2
1.1.1 Phân loại thuốc trừ sâu 2
1.1.2 Tính chất và độc tính của các nhóm thuốc trừ sâu 2
1.1.2.1 Thuốc trừ sâu chlor hữu cơ 2
1.1.2.2 Thuốc trừ sâu lân hữu cơ 3
1.1.2.3 Thuốc trừ sâu Carbamate 3

1.1.2.4 Thuốc trừ sâu Pyrethroid (gốc cúc tổng hợp) 4
1.2 Tình hình sản xuất lúa và sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL
nói riêng 4
1.3 Tác động của thuốc trừ sâu đến hệ sinh thái đất 5
1.4 Tổng quan về hoạt chất Chlorpyrifos ethyl 6
1.4.1 Đặc tính của Chlorpyrifos ethyl 6
1.4.2 Tác hại của Chlorpyrifos ethyl 7
1.4.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong môi trường 8
1.4.3.1 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong không khí 9
1.4.3.2 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong nước 9
ix

1.4.3.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong đất 10
1.5 Một số kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl
11
1.6 Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn . 12
1.6.1 Box-PCR 12
1.6.2 Điện di gel agarose 12
1.7 Phân tích thuốc Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp 13
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG TIN V PHƯƠNG PHÁP 15
2.1 Phương tiện 15
2.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 15
2.1.1.1 Thời gian 15
2.1.1.2 Địa điểm 15
2.1.1.3 Đối tượng thí nghiệm 15
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 15
2.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 16
2.2.4 Môi trường nuôi cấy 17
2.2 Phương pháp 17
2.2.1 Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại

Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang 17
2.2.2 Phân lập hệ vi khuẩn và một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy
Chlorpyrifos ethyl 17
2.2.2.1 Làm giàu mật số hệ vi khuẩn có tiềm năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl 18
2.2.2.2 Phân lập dòng vi khuẩn có tiềm năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl 19
2.2.3 Đánh giá khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của các dòng vi khuẩn trong môi
trường khoáng tối thiểu 19
2.2.4 Phương pháp phân tích Chlorpyrifos ethyl trong môi trường khoáng tối thiểu 21
2.2.5 Khảo sát sự khác biệt về mặt di truyền của hai dòng vi khuẩn phân hủy
Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sinh học phân tử Box-PCR 21
x

2.2.6 Phương pháp mô tả đặc điểm, hình thái và tế bào của vi khuẩn phân lập 22
2.2.6.1 Test gram 22
2.2.6.2 Test oxydase 22
2.2.6.3 Hình thái khuẩn lạc 22
2.2.7 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1 Tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy -
Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang 23
3.2 Đặc tính lý, hóa học của đất của các mẫu đất thí nghiệm 25
3.3 Kết quả phân lập các hệ vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong môi trường
dung dịch từ đất chuyên canh lúa 26
3.4 Đánh giá khả năng phân hủy của các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl
trong môi trường dung dịch của các dòng vi khuẩn đã phân lập được 27
3.5 Khảo sát sự đa dạng của các vi khuẩn phân lập được 30
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ 31
4.1 Kết luận 31
4.2 Đề nghị 31
TÀI LIU THAM KHẢO 32

1

MỞ ĐẦU
Ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) lúa là cây trồng chính trong hệ thống
canh tác, diện tích trồng lúa năm 2011 trên 4 triệu ha (hơn 50% tổng diện tích cả
nước). ĐBSCL được xem là vựa lúa cung cấp trên 50% sản lượng gạo quốc gia và
cũng là nơi cung cấp 90% sản lượng gạo xuất khẩu (Trung tâm tin học và Thống kê,
2012). Canh tác lúa ở ĐBSCL có vai trò quan trọng trong đảm bảo an ninh lương thực
và xuất khẩu nông sản của quốc gia. Để đạt được những thành công đó một phần do
ĐBSCL có điều kiện khí hậu thuận lợi và đất đai màu mỡ, các hoạt động thâm canh
tăng vụ, nâng cao kỹ thuật canh tác, nông dân còn sử dụng một lượng lớn thuốc bảo vệ
thực vật (BVTV) và phân bón trong sản xuất nông nghiệp. Việc lạm dụng thuốc
BVTV cùng với điều kiện khí hậu nóng ẩm đã làm phát sinh nhiều loài sâu bệnh mới
khó phòng trị và có khả năng kháng thuốc cao, hậu quả là thuốc BVTV ngày càng tăng
về mặt số lượng và đa dạng hơn về chủng loại. Bên cạnh vai trò phòng trừ sâu, bệnh và
cỏ dại, sử dụng thuốc BVTV không đúng liều lượng và không tuân theo các quy tắc an
toàn khi sử dụng thuốc không chỉ làm mất năng suất cây trồng mà còn ảnh hưởng đến
môi trường từ đó làm giảm quần thể sinh vật thủy sinh, làm giảm rất lớn mật số giun
đất cũng như các vi sinh vật trong đất, ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản và do vậy sẽ
ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Trong đó, Chlorpyrifos ethyl là thuốc trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ, được sử
dụng khá rộng rãi, chiếm khoảng 11% trong tổng số các thuốc trừ sâu được sử dụng
(EPA, 2004 được dẫn bởi Yang et al., 2006). Chlorpyrifos ethyl là loại thuốc có tính
độc thần kinh ở mức cao, gây hại cho người và nhiều loài động vật có lợi. Việc sử
dụng Chlorpyrifos ethyl quá mức và kéo dài có thể làm tồn trữ một lượng lớn thuốc ở
trong đất và nước. Để giảm thiểu ô nhiễm Chlorpyrifos ethyl trong nước thì việc làm
giảm ô nhiễm Chlorpyrifos ethyl trong đất là vô cùng quan trọng. Nhiều nghiên cứu
gần đây đã cho thấy Chlorpyrifos ethyl có thể bị phân hủy bởi các dòng vi khuẩn đã

được phân lập như Enterobacter chủng B14 (Singh et al., 2004), Alcaligenes faecalis
DSP3 (Yang et al., 2006). Do đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu
gốc lân hữu cơ Chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa tại một số tỉnh ở Đồng bằng
sông Cửu Long” được thực hiện với mục tiêu:
− Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại
Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang.
− Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl trên đất
canh tác lúa tại một số tỉnh ở ĐBSCL.
2

CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIU
1.1 Tổng quan về thuốc trừ sâu
1.1.1 Phân loại thuốc trừ sâu
Thuốc trừ sâu gồm các chất hay hỗn hợp các chất có nguồn gốc hoá học (vô cơ,
hữu cơ), thảo mộc, sinh học (các loài sinh vật và sản phẩm do chúng sản sinh ra).
Chúng được dùng để diệt trừ hoặc ngăn ngừa tác hại của côn trùng đến cây trồng, cây
rừng, nông lâm sản, gia súc và con người. Các loại thuốc trừ sâu có thể có tác động vị
độc, tiếp xúc, xông hơi, nội hấp, thấm sâu, hấp dẫn, xua đuổi và điều hoà sinh trưởng
Ngoài ra một số thuốc trừ sâu còn có hiệu lực trừ nhện hại cây trồng (Nguyễn Trần
Oánh, 2007).
Có nhiều cách phân loại thuốc trừ sâu, tùy theo nguồn gốc hoặc mục đích sử
dụng, có thể có những phân loại khác nhau về thuốc trừ sâu:
− Theo nguồn gốc hóa học:
 Thuốc trừ sâu vô cơ.
 Thuốc trừ sâu hữu cơ, bao gồm: Các hợp chất Chlor hữu cơ; các hợp chất
Phosphate hữu cơ; các hợp chất Carbamate; các hợp chất Pyrethroid.
 Thuốc trừ sâu thảo mộc.
 Thuốc trừ sâu vi sinh.
− Theo con đường tác động: Thuốc trừ sâu tiếp xúc; thuốc trừ sâu vị độc; thuốc

trừ sâu xông hơi; thuốc trừ sâu nội hấp (lưu dẫn); thuốc trừ sâu thấm sâu.
− Theo cơ chế tác động: Thuốc trừ sâu ức chế men Cholinesterase; thuốc trừ sâu
điều khiển sinh trưởng côn trùng.
1.1.2 Tính chất và độc tính của các nhóm thuốc trừ sâu
1.1.2.1 Thuốc trừ sâu chlor hữu cơ
Thuốc trừ sâu Chlor hữu cơ tác động đến sâu hại bằng con đường tiếp xúc và vị
độc, một số có tác dụng thấm sâu và xông hơi. Các thuốc Chlor hữu cơ tác động đến
côn trùng chậm, phổ tác động rộng, một số còn diệt được cả nhện hại cây (Dicofol).
Các thuốc Chlor hữu cơ là những chất độc tế bào thần kinh, chúng làm tê liệt dẫn
truyền xung động điện trên sợi trục thần kinh (axon) ngoại biên thông qua phản ứng
liên kết với màng sợi trục và hình thành phức chất với màng sợi trục. Ngoài ra, hợp
chất Chlor hữu cơ còn ức chế hoạt động của men ATPase và một số men khác nhưng
không ức chế men Cholinesterase (ChE). Các hợp chất trong nhóm có độ độc trung
3

bình đến rất độc đối với cá và động vật máu nóng. An toàn đối với cây, thậm chí còn
kích thích cây sinh trưởng. Nhược điểm lớn nhất của các hợp chất trong nhóm này là
có tính hoá học bền, nên tồn lâu trong môi trường, gây ô nhiễm môi trường (Nguyễn
Trần Oánh, 2007).
1.1.2.2 Thuốc trừ sâu lân hữu cơ
Thuốc trừ sâu lân hữu cơ (OP) là nhóm thuốc trừ sâu lớn, ra đời sau nhóm Chlor
hữu cơ. Chúng là dẫn xuất của các ester trung tính hay amid của acid photphoric (có
chứa gốc P-O) hay thiophosphoryl (P-S). Các thuốc trừ sâu lân hữu cơ có phổ tác động
rộng (ngoài tác dụng trừ sâu, nhiều thuốc trong nhóm còn có khả năng trừ nhện và
tuyến trùng). Các thuốc OP có tính hoá học kém bền vững, nên có thời gian hữu hiệu
ngắn, không tích luỹ trong môi trường. Tác động nhanh và mạnh đến côn trùng bằng
con đường tiếp xúc và vị độc, một số thuốc trong nhóm còn có tác dụng xông hơi hay
nội hấp. Việc sử dụng các thuốc OP không hợp lý dễ gây hậu quả xấu với môi sinh.
Ngoài ra, các thuốc trong nhóm còn gây độc với động vật máu nóng (hầu hết thuộc
nhóm độc II, một số ở nhóm độc Ib); rất độc đối với cá và ong mật; dễ gây hại đến các

loài thiên địch. Chúng tác động đến côn trùng bằng cách kìm hãm men ChE bằng cách
phosphoryl hoá các vị trí hoạt động của men nên không thể làm nhiệm vụ phân giải
acetylcholine (acetylcholine làm nhiệm vụ dẫn truyền xung động thần kinh qua khe
xinap ở đầu mút tế bào thần kinh). Chất này được tích luỹ lại với lượng lớn, gây kích
thích thần kinh quá mức làm cho dây thần kinh tổn thương và đứt đoạn. Trường hợp,
nếu lượng thuốc OP quá ít, không đủ kìm hãm quá trình phosphoryl hoá, men ChE lại
được giải phóng, tiếp tục phân giải acetylcholine. Nhờ đó, côn trùng nếu đã bị trúng
độc lại có thể được phục hồi (Nguyền Trần Oánh, 2007).
1.1.2.3 Thuốc trừ sâu Carbamate
Thuốc trừ sâu Carbamate tác động đến sâu hại bằng con đường tiếp xúc và vị
độc. Một số còn có tác động xông hơi, thấm sâu và nội hấp. Các thuốc Carbamate
thường không có tính độc vạn năng như thuốc lân hữu cơ. Về cơ chế tác động của
thuốc trừ sâu Carbamate tương tự như các thuốc trừ sâu OP. Các thuốc Carbamate kìm
hãm men ChE bằng cách carbaryl hoá các vị trí hoạt động của toàn men. Quá trình
carbaryl hoá cũng là quá trình thuận nghịch. Nhưng sự liên kết giữa các thuốc
Carbamate với men ChE thường không bền, nên có trường hợp sâu hại hồi phục được.
Các thuốc Carbamate an toàn với cây, ít độc đối với cá hơn các thuốc OP; không tồn
lưu quá lâu trên nông sản và môi trường sống. Độ độc của thuốc đối với động vật máu
nóng rất khác nhau, tùy thuộc vào loại thuốc (Nguyễn Trần Oánh, 2007).
4

1.1.2.4 Thuốc trừ sâu Pyrethroid (gốc cúc tổng hợp)
Thuốc trừ sâu Pyrethroid tác động đến sinh vật bằng con đường tiếp xúc và vị
độc, ngoài ra còn có tác động xua đuổi côn trùng. Các thuốc trong nhóm có phổ tác
động rộng, trừ nhiều loài sâu hại miệng nhai và chích hút, nhất là các loài sâu thuộc bộ
cánh vảy, cánh cứng, cánh nửa cứng hại cây ăn quả, cây thực phẩm, lúa và ngũ cốc,
cây công nghiệp, Một số được phun vào đất để trừ sâu hại trong đất, ngoài ra thuốc
còn được dùng trừ sâu hại kho lương thực, côn trùng gây hại sức khỏe cho người như
ruồi, muỗi, gián, côn trùng và ký sinh ngoài da hại gia súc. Nhiều loại thuốc trong
nhóm có thể trừ được nhện. Các thuốc Pyrethroid không tác động đến các hệ men sống

của cơ thể sinh vật, mà tác động trực tiếp đến hệ thần kinh của côn trùng và động vật
máu nóng. Ở côn trùng, thuốc Pyrethroid tác động đến hệ thần kinh trung ương và
ngoại vi ở liều rất thấp. Thuốc gây rối loạn sự dẫn truyền xung động của kênh natri
dọc sợi trục của tế bào thần kinh côn trùng. Tác động đến sự truyền xung động của tế
bào sợi trục thần kinh, ngăn cản và kìm hãm sự truyền xung động trong tế bào thần
kinh. Còn ở động vật máu nóng, thuốc Pyrethroid tác động đến các trung tâm hô hấp ở
tuỷ sống và hệ thần kinh kiểm soát chức năng của tim. Triệu chứng ngộ độc thuốc trừ
sâu Pyrethroid ở côn trùng và động vật máu nóng rất giống nhau, trước tiên là kích
động, rùng mình, rối loạn tiếp sau là bại liệt và chết (Nguyễn Trần Oánh, 2007).
1.2 Tình hình sản xuất lúa và sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam nói chung và
ĐBSCL nói riêng
Ở Việt Nam, cây lúa được xem là cây lương thực hàng đầu trong hoạt động sản
xuất nông nghiệp, nó luôn giữ vai trò quan trọng trong nhu cầu đời sống của con người
và sự phát triển kinh tế chung của đất nước. Với diện tích đất canh tác hiện nay khoảng
9,44 triệu ha, nông dân chiếm 70% dân số cả nước, Việt Nam trở thành một trong
những nước có thế mạnh trong xuất khẩu nông sản. Theo thống kê của ngành nông
nghiệp, khối lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam năm 2011 đạt khoảng 7,5 triệu tấn với
kim ngạch hơn 3,7 tỷ USD. Miền Nam có diện tích trồng lúa khoảng 5,14 triệu ha,
trong đó, vùng ĐBSCL có diện tích trồng lúa năm 2011 trên 4 triệu ha (hơn 50% tổng
diện tích cả nước). ĐBSCL được xem là vựa lúa cung cấp trên 50% sản lượng gạo
quốc gia và cũng là nơi cung cấp 90% sản lượng gạo xuất khẩu (Trung tâm tin học và
Thống kê, 2012). Những năm gần đây, diện tích đất canh tác lúa ở nước ta bị thu hẹp
từ 7,67 triệu ha năm 2000 giảm xuống còn 7 triệu ha trong năm 2012 (Đoàn Mạch
Trường, 2012). Vì thế, nhiều mô hình phải thay đổi cơ cấu giống cây trồng, tiến hành
thâm canh tăng vụ, cùng với sự thay đổi bất thường của khí hậu. Đặc biệt ở ĐBSCL có
5

điều kiện khí hậu nóng ẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại cỏ dại, sâu bệnh
diễn biến phức tạp hơn. Trong những năm gần đây ĐBSCL sử dụng khoảng 2 triệu tấn
phân hóa học và gần 500.000 tấn thuốc BVTV hằng năm (Phạm Đình Đôn, 2009),

trong đó lượng thuốc BVTV dùng cho lúa chiếm 80,3%, các cây trồng khác chỉ chiếm
từ 5-11% (Lê Văn Khoa, 2010). An Giang là một trong những tỉnh có trữ lượng lúa
lớn nhất ở ĐBSCL (cung cấp 16,63% sản lượng lúa cho vùng ĐBSCL và 8,64% sản
lượng lúa cả nước) theo thống kê của Sở Nông nghiệp & PTNT An Giang hàng năm
có khoảng 183.000 tấn phân hóa học các loại và khoảng trên 1.000 tấn thuốc BVTV đổ
xuống đồng ruộng (Sở NN & PTNT An Giang, 2009).
Theo thống kê của chương trình bảo vệ môi trường quốc gia, ít nhất 20.000 nông
dân chết mỗi năm, chủ yếu ở các nước đang phát triển, do ngộ độc thuốc BVTV trong
đó có các loại thuốc BVTV nhóm Carbamate và Phosphate hữu cơ (WHO, 1990; Kishi
et al., 1995; Pimental et al., 1992; Rosenstock et al., 1991). Theo báo cáo của tổ chức
của WHO, vào năm 2002 từng có 7.170 trường hợp nhiễm độc thuốc trừ sâu được ghi
nhận tại Việt Nam. Năm 1995, ĐBSCL có 13.000 người nhiễm độc, trong đó có 354
người chết (Lê Huy Bá, 2008). Một số tỉnh ở ĐBSCL như tỉnh Bến Tre từ 1986-1993
có 1.102 người bị nhiễm độc, trong đó có 208 người chết; ở tỉnh Tiền Giang có 3.167
người bị nhiễm độc và 333 người chết (Phạm Thành Nhơn, 2005).
1.3 Tác động của thuốc trừ sâu đến hệ sinh thái đất
Mặc dù thuốc BVTV nói chung và thuốc trừ sâu nói riêng được dùng để bảo vệ
cây trồng nhưng chúng có thể ảnh hưởng đến các sinh vật không mong muốn và gây ô
nhiễm môi trường đất thông qua thay đổi sự cân bằng của các quá trình sinh học trong
đất dù trong một thời gian ngắn hay dài (Smith et al., 2000). Những loại thuốc này ảnh
hưởng đến các vi sinh vật bằng cách giảm số lượng, sự đa dạng và thay đổi cấu trúc
cộng đồng vi sinh vật. Ngoài ra, thuốc trừ sâu còn ảnh hưởng đến hoạt động sinh hóa
của vi sinh vật như nitrat hóa, ammonium hóa, phân hủy các chất hữu cơ và cố định
đạm (Agnihotri et al., 1981).
Thuốc trừ sâu trong đất và nước có thể bị suy thoái bởi các con đường sinh học
và phi sinh học. Trong quá trình phân hủy sinh học, vi sinh vật đất đóng vai trò vô
cùng quan trọng vì chúng có thể sử dụng hoặc phân hủy các loại thuốc trừ sâu trong
hoạt động của chúng. Kết quả của các tiến trình đó làm phân hủy hoặc chuyển hóa các
loại thuốc này (Shahida et al., 2004). Khi thuốc trừ sâu mới tiếp xúc với đất, các loài
vi sinh vật đất có sự tự đáp ứng. Những vi sinh vật không có khả năng tận dụng thuốc

trừ sâu làm nguồn thức ăn sẽ bị thuốc tác động, nên bị hạn chế số lượng hay ngừng
hẳn không phát triển nữa. Ngược lại, những loài vi sinh vật có khả năng này sẽ phát
6

triển thuận lợi và tăng số lượng nhanh chóng. Số lượng và hoạt động của vi sinh vật
chiếm một tỷ lệ cao trong các tầng đất mặt, đặc biệt là trong các đất có hàm lượng hữu
cơ cao. Thông thường, tỷ lệ hữu cơ giảm dần theo độ sâu trong đất, nơi có điều kiện
như độ ẩm, nhiệt độ và không khí ít thuận lợi cho hoạt động của vi sinh vật (Kerle et
al., 2007; Anonymous, 2009). Ngoại lệ của quy luật này là một số vùng trầm tích bão
hòa có tốc độ dòng chảy cao thì số lượng và hoạt động của vi sinh vật giống như trên
tầng mặt.
Sự phân hủy sinh học thuốc trừ sâu nói chung và thuốc trừ sâu lân hữu cơ nói
riêng là vấn đề rất đáng quan tâm bởi vì độc tính cao đối với động vật hữu nhũ của một
vài loại hoạt chất, hơn nữa chúng lại được sử dụng rất phổ biến. Các loài vi sinh vật
đất có khả năng phân hủy các thuốc trừ sâu thành các chất hóa học và sử dụng các
thành phần này để tổng hợp các hợp cần thiết cho chúng, kết quả là làm giảm đi tính
bền vững của các loại thuốc này (Shahida et al., 2004).
1.4 Tổng quan về hoạt chất Chlorpyrifos ethyl
1.4.1 Đặc tính của Chlorpyrifos ethyl
Chlorpyrifos ethyl còn có tên thương mại là Lorsban, Dursban, Dorsan, Pyrinex,
Brodan, Tên hóa học là O,O-dietyl-O-3,5,6-trichloro-2-pyridylphotphorothioat.
Công thức hóa học: C
9
H
11
Cl
3
NO
3
PS. Phân tử lượng: 350,62 g/mol. Công thức hóa

học:

Hình 1.1 Công thức hóa học của Chlorpyrifos ethyl
Chlorpyrifos ethyl có dạng tinh thể không màu, tan rất ít trong nước, tan tốt trong
benzene, acetone, xylen. Độ tan trong benzene 7.900 g/kg, acetone 6.500 g/kg,
clorofom 6.300 g/kg, cacbondisunfua 5.900 g/kg, dietyl ete 5.100 g/kg , methanol 450
g/kg. Độ thủy phân của Chlorpyrifos ethyl tăng lên khi pH tăng. DT
50
của thuốc trong
nước (pH = 8,25) là 1,5 ngày. Thuộc nhóm độc II, LD
50
peros (xâm nhập qua miệng
vào đường ruột): 135-163 mg/kg, dermal (xâm nhập qua da): 2.000 mg/kg; ADI
(lượng chất độc không gây hại cơ thể người được chấp nhận): 0,01 mg/kg; MRL (mức
dư lượng tối đa): cam, chanh 0,3 mg/kg, hoa quả khác 0,2 mg/kg, rau 0,05 mg/kg; PHI
7

(thời gian cách ly): 14-21 ngày, thuốc độc với cá và ong mật. Trong đất, Chlorpyrifos
ethyl phân giải chậm, DT
50
khoảng 60-120 ngày, sản phẩm chuyển hóa 3,5,6-trichloro-
2-pyridinol (TCP) tiếp tục phân giải thành hợp chất Chlor hữu cơ và khí CO
2
(Trần
Quang Hùng, 1999).
Chlorpyrifos ethyl có tác dụng tiếp xúc vị độc và xông hơi. Thuốc trừ được nhiều
loài sâu miệng nhai và chích hút hại lúa, rau, màu, cây công nghiệp, cây ăn quả, hoa và
cây cảnh, trừ côn trùng y tế và thú y. Chlorpyrifos ethyl được gia công thành các dạng
sữa (20-48%), bột thấm nước (25%). Chlorpyrifos ethyl còn được chế biến hỗn hợp
(hoặc dùng hỗn hợp) với Cypermethrin, Dimethoat, Diflubenzuron

Hình 1.2 Một số chế phẩm có chứa Chlorpyrifos ethyl được sử dụng phổ biến
1.4.2 Tác hại của Chlorpyrifos ethyl
Chlorpyrifos ethyl là một dạng của thuốc lân hữu cơ phổ rộng, có tính chất gây
độc thần kinh ở mức cao. Độc tính của các hợp chất lân hữu cơ là vấn đề đối với sức
khỏe trên toàn thế giới với khoảng 3 triệu ca ngộ độc và 200.000 ca tử vong mỗi năm
(Karalliedde & Senanayake, 1999; Sogorb et al., 2004 được dẫn bởi Yang et al.,
2006). Chúng được xem như chất độc thần kinh do tác động ức chế sự tạo thành
enzyme Acetylcholinesterase (AchE) làm cho sự truyền tín hiệu thần kinh ở sinh vật bị
ngăn chặn đáng kể (Cho et al., 2002 được dẫn bởi Yang et al., 2006).
Chlorpyrifos ethyl được sử dụng thương mại hóa vào năm 1965 để khống chế các
loại côn trùng gây hại trên lúa, rau màu, bông và đồng cỏ. Việc sử dụng Chlorpyrifos
ethyl phổ biến đã gây ô nhiễm không khí, tầng nước mặt, sông, hồ và không khí. Các
triệu chứng nhiễm độc cấp tính bao gồm nhức đầu, buồn nôn, nhức mỏi cơ, một số
trường hợp có thể dẫn đến tử vong. Các khuyết tật bẩm sinh ở người cũng được xem là
có liên quan tới sự tiếp xúc với các sản phẩm chứa Chlorpyrifos ethyl. Các nghiên cứu
cũng cho thấy thuốc BVTV nhóm Carbamate và Phosphate hữu cơ có thể làm thai
8

chết, thay đổi hormone, ảnh hưởng đến DNA, thai dị dạng, tinh trùng, buồng trứng và
trứng phát triển không bình thường (Zahm et al., 1997). Chlorpyrifos ethyl cũng rất
độc đối với các loài động vật máu nóng khác, LD
50

qua miệng đối với chuột 135-163
mg/kg, chuột lang 504 mg/kg và thỏ 1.000-2.000 mg/kg. LD
50
qua da thỏ 5.000
mg/kg; chuột > 2.000 mg/kg. Chlorpyrifos độc đối với nhiều loại động vật chân đốt có
lợi như ong, bọ rùa và ong bắp cày, các loài bọ cánh cứng. Chim cũng dễ bị ảnh hưởng
bởi Chlorpyrifos từ việc giảm khối lượng chim non đến bị dị tật và tử vong, LD
50
qua
miệng đối với vịt trời 490 mg/kg, gà 32-405 mg/kg. Chlorpyrifos ethyl giết chết các
loài cá ở nồng độ thấp khoảng vài phần nghìn tỷ (ppt), cá hồi 0,007-0,051 mg/L, LC
50

(96 giờ) đối với tôm Triều Tiên Palaemon Macrodactylus 0,05 µg/L. Đối với cây
trồng, có thể chậm hình thành hạt, dị dạng trái và phân chia tế bào bất thường khi tiếp
xúc kéo dài với Chlorpyrifos ethyl (Cox, 1995 được dẫn bởi Ranjan và Malik, 2008).
Chlorpyrifos ethyl còn thay đổi thành phần của cộng đồng sinh vật phù du ở nồng độ
100 ppb (Tagatz et al., 1982).
Trong cơ thể động vật có vú, thuốc nhanh chóng chuyển hóa thành 3,5,6-
trichloro-2-pyridinol (TCP) rồi thải ra ngoài qua nước tiểu. Trong cây cối, thuốc không
có tác dụng nội hấp và cũng không xâm nhập qua mô rễ. Dư lượng tìm thấy trong mô
cây là chất chuyển hóa 3,5,6-triclo-pyridin-2-ol ở dạng liên kết. Trong đất, vi sinh vật
phân hủy thành 3,5,6-trichloro-pyridinol (TCP) tiếp tục phân giải thành hợp chất chlor
hữu cơ và khí CO
2
(Trần Quang Hùng, 1999). Những ảnh hưởng của Chlorpyrifos
ethyl lên các đặc điểm của vi sinh vật đất là không đáng kể. Sự phân hủy Chlorpyrifos
ethyl tăng theo nhiệt độ đất (Singh et al., 2002).
Ở Việt Nam, Chlorpyrifos ethyl vẫn là loại hoạt chất được sử dụng phổ biến.
Chlorpyrifos ethyl có thể được sử dụng dưới dạng đơn chất (các loại thuốc như: God

550EC, Vitashield 18EC, Mapy 48EC, Chlorban 20EC, Sanpyriphos 20EC…) hoặc
kết hợp với các hoạt chất khác như Cypermethrin (các thuốc như: Soddy 430EC,
Supertac 250EC, Subside 505EC,…), với Imidacloprid (các thuốc như: Losmine
250EC, Pro-per 250EC,…) có hiệu quả tốt với các loại sâu cuốn lá, sâu đục thân, rệp
sáp, rầy nâu,… trên lúa, cà phê, thuốc lá, chè, rau màu, cây ăn quả,… Ngoài ra
Chlorpyrifos ethyl còn được sử dụng làm thuốc diệt mối (các thuốc như: Dursban
40EC, Lenfos 50EC, MAP Sedan 48EC,…).
1.4.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong môi trường
Thuốc BVTV có thể bị phân hủy bằng các con đường hóa học và con đường sinh
học. Phân hủy hóa học xảy ra thông qua các phản ứng như sự quang phân, sự thủy
9

phân, sự oxy hóa và sự khử. Phân hủy sinh học khi có sự tham gia của các vi sinh vật
đất trong quá trình phân hủy (Andreu và Picó, 2004).









Hình 1.3 Động thái của thuốc BVTV dư tồn trong đất (nguồn Ross, 1989)
Khi hoạt chất Chlorpyrifos ethyl vào trong đất sẽ chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố
lý, hóa và sinh trong môi trường. Những yếu tố này có thể kết hợp làm ảnh hưởng đến
tính bền của thuốc, bao gồm sự phân hủy hóa học và sinh học, hay làm ảnh hưởng đến
tính di động của thuốc, bao gồm sự hấp phụ trên tầng mặt, sự hấp thụ từ thực vật, bay
hơi, xói mòn do gió, rửa trôi và thấm lậu (Galani et al., 2010). Tiêu chuẩn tốt nhất để
mô tả số phận của thuốc trừ sâu là chu kỳ bán rã của nó (Linde, 1994).

1.4.3.1 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong không khí
Chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl trong không khí là 72 giờ (Lyman et al.,
1990). Theo một nghiên cứu khác của Hayward et al. (2010) chu kỳ bán rã của
Chlorpyrifos ethyl là 14 giờ. Mặc khác, theo Howard (1991) chu kỳ bán rã của
Chlorpyrifos ethyl 6,34 giờ. Sự phân hủy của Chlorpyrifos ethyl trong không khí khi
không được chiếu sáng tạo ra sản phẩm duy nhất là TCP, ngược lại trong điều kiện
chiếu xạ có hai sản phẩm phụ khác được hình thành (Fontaine và Teeter, 1987).
1.4.3.2 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong nước
Chlorpyrifos ethyl có chu kỳ bán rã là 14 ngày trong môi trường nước (McEwen
và Stephenson, 1979). Theo Howard (1991) chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl trong
môi trường dung dịch có pH trung tính (pH = 7,0) ở 25
o
C là 35-78 ngày. Chu kỳ bán
rã của Chlorpyrifos ethyl trong môi trường acid từ 1-2 tháng, các sản phẩm chuyển hóa
chính tạo thành TCP và desethyl chlorpyrifos (DEC). Sự thủy phân xảy ra nhanh hơn
trong môi trường kiềm tạo thành TCP. Sự thủy phân trong dung dịch được xúc tác bởi
Rửa trôi
bề mặt
Thuốc hấp phụ
trong đất
Bay
hơi
Phân hủy
quang hóa
Thực vật
hấp thu
Trực di
Phân hủy
sinh học
Chuyển hóa

hóa học
10

các ion đồng (II) và sự tác động của vi sinh vật cũng góp phần làm tăng độ phân hủy.
Các sản phẩm chuyển hóa trung gian thủy phân nhanh hơn so với Chlorpyrifos ethyl.
1.4.3.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong đất
Theo Tomlin (2000), chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl trong đất là 94 ngày.
Các nghiên cứu khác cũng cho thấy, trong điều kiện phòng thí nghiệm chu kỳ bán rã
trong đất là 14-84 ngày trên đất đã nhiễm Chlorpyrifos ethyl (Chapman và Harris,
1980; Pike và Getzin, 1981). Sự phân hủy sinh học chiếm ưu thế trong một số loại đất.
Trong đất hiếu khí, chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl dao động từ 11-141 ngày
trong bảy loại đất. Các loại đất này có thành phần sa cấu khác nhau và pH biến động từ
5,4-7,4. Trong đất yếm khí, chu kỳ bán rã là 15 ngày trong mùn và 58 ngày trong đất
sét (US EPA, 1989). Sự phân hủy chậm lại rõ rệt ở nồng độ cao hơn (1.000 mg/kg),
chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl kéo dài từ 4-12 tháng và có thể hơn 4 năm trong
đất cát, phù hợp với độ tan trong nước thấp của Chlorpyrifos ethyl (Racke et al.,
1996). Sự quang phân trong đất góp phần không đáng kể đến động thái của
Chlorpyrifos ethyl trong môi trường (Havens et al., 1992).
Nhiều nghiên cứu cho rằng sự tích tụ TCP - sản phẩm chính trong quá trình
chuyển hóa của Chlorpyrifos ethyl có tác động như chất kháng khuẩn đã làm cản trở
hoạt động của các loại vi sinh vật phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong đất (Singh et al.,
2003). Sự phân hủy của TCP tạo trichloromethoxypyridine (TMP) và CO
2
. Sự phân
hủy của TMP xảy ra trong đất tạo thành CO
2
và TCP và chu kỳ bán rã được ghi nhận
từ 1-2 tháng.

Hình 1.4 Các sản phẩm chuyển hóa của Chlorpyrifos ethyl

11

1.5 Một số kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos
ethyl
Đối với một số hoạt chất lân hữu cơ như Parathion, các nghiên cứu thực nghiệm
đã chứng minh có thể dễ dàng để phân lập các vi sinh vật phân hủy hoạt chất này, hai
dòng vi khuẩn là Flavobacterium sp. chủng ATCC 27551 và Pseudomonas diminuta
chủng Gm, đã được phân lập từ trong đất tương ứng ở Philippine và Mỹ (Singh et al.,
2002). Trong khi đó với nghiên cứu của Rani và Latitha Kumari đã tìm thấy một dòng
thuộc Pseudomonas putida có thể thủy phân Methyl parathion - một hoạt chất khác
của lân hữu cơ (Rani et al., 2008).
Chlorpyrifos ethyl đặc trưng bởi liên kết P-O-C giống như các thuốc BVTV lân
hữu cơ khác như Diazinon, Fenitrothion, Methyl parathion và Parathion. Song không
giống với trường hợp của các hợp chất lân hữu cơ khác, có rất ít kết quả nghiên cứu về
sự tăng cường phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong thời gian Chlorpyrifos ethyl được sử
dụng từ năm 1965.
Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để phân lập vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos từ
đất nông nghiệp đã không thành công (Mallick et al., 1999; Racke et al., 1990). Một
số nghiên cứu được xem như bước đầu trong sự phân hủy Chlorpyrifos ethyl đã cho
thấy Chlorpyrifos ethyl có thể bị phân hủy theo dạng đồng biến dưỡng trong môi
trường lỏng bởi Flavobacterium sp. và Pseudomonas diminuta tương ứng trên những
cánh đồng có sử dụng Diazinon và trên đất được làm giàu với Parathion (Yang et al.,
2006). Tuy nhiên, những vi sinh vật này không sử dụng Chlorpyrifos ethyl như là
nguồn carbon chính. Mọi cố gắng trong việc phân lập vi sinh vật phân hủy
Chlorpyrifos ethyl từ đất nhiễm Chlorpyrifos ethyl đều không thành công cho đến năm
2003 Singh và cộng tác viên đã phân lập được 6 dòng vi khuẩn từ đất ở Úc cho thấy có
sự tăng cường phân hủy Chlorpyrifos ethyl. Singh (2004) cũng đã phân lập được vi
khuẩn Enterobacter chủng B-14 có khả năng tăng cường phân huỷ sinh học
Chlorpyrifos ethyl. Tương tự, trong năm 2006 Yang và ctv đã phân lập được vi khuẩn
Alcaligenes faecalis DSP3 có khả năng phân huỷ cả Chlorpyrifos ethyl và TCP. Một

nghiên cứu khác của Ghanem và ctv năm 2007 cũng phân lập được dòng Klebsiella và
công trình năm 2009 của Anwar và ctv. phân lập được vi khuẩn Bacillus pumilus dòng
C2A1 cũng có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl và TCP, dòng này phân hủy này
đến 90% TCP ở nồng độ 300 ppm chỉ sau 8 ngày nuôi cấy. Ngoài ra, dòng vi khuẩn
Paracoccus-TRP phân lập từ bùn có khả năng phân hủy sinh học Chlorpyrifos ethyl và
TCP, bên cạnh đó dòng vi khuẩn này cũng có khả năng phân hủy Pyridine, Methyl
parathion và Carbonfuran khi bổ sung các thuốc này như là nguồn carbon duy nhất
nhờ các enzymes ngoại bào được tiết ra (Gangming Xu et al., 2008). Kết quả của các
12

nghiên cứu trên cho thấy tìm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Paracoccus sp. trong
việc xử lý ô nhiễm nông dược là rất lớn.
Mặc dù sự phân hủy vi sinh Chlorpyrifos ethyl đã được nghiên cứu nhưng vẫn
còn rất ít thông tin về gene và các enzyme liên quan đến sự phân hủy này. Gần đây, có
nhiều gene/hệ enzyme có liên quan đến sự phân hủy các hoạt chất lân hữu cơ đã được
xác định. Một gene có tên “gene phân hủy hoạt chất lân hữu cơ” (Organophosphate
degrading gene - opd) đã được tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật khác nhau ở các vùng
địa lý khác nhau (Yang et al., 2006). Enzyme thủy phân hoạt chất lân hữu cơ
(Organophosphate hydrolase - OPH) được mã hóa bởi gene opd phù hợp với nhiều loại
chất nền và có đặc tính thủy phân mạnh. Tuy nhiên khi Chlorpyrifos ethyl bị thủy phân
bởi OPH thì gần như chậm hơn đến 1.200 lần với loại hoạt chất thích hợp hơn là
Paraoxon.
1.6 Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong phân tích cấu trúc hệ vi
khuẩn
1.6.1 Box-PCR
Trong bộ gene của vi sinh vật sơ hạch có các đoạn DNA ngắn với trình tự
nucleotide giống nhau. Chúng có thể có cấu trúc hình vòng do các nucleotide trong các
đoạn này có thể tự liên kết bổ sung hoặc palindromes units (PU) hoặc repetitive extra-
genic palindromes (REP), hoặc không có cấu trúc vòng như intergenic repeat units
(IRU) hoặc ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus). Các nghiên cứu

gần đây đã phát hiện một đoạn DNA cũng hiện diện rãi rác trong bộ gene của vi khuẩn
Gram dương được gọi là BOX. Các nhân tố BOX cũng có cấu trúc vòng, là các đoạn
DNA có trình tự lặp lại bao gồm 3 thành phần boxA, boxB, boxC với số lượng
nucleotide lần lượt là 59, 45 và 50. Mặc dù kích thước, số lượng và cấu trúc của các
nhân tố BOX tương tự như REP và ERIC nhưng trình tự DNA của chúng rất khác
nhau. Kết quả nghiên cứu về lai DNA (DNA hydridization) và PCR cho thấy các trình
tự oligonucleotide của boxA được bảo tồn ở nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Vì vậy,
trình tự oligonucleotide của boxA có thể được sử dụng để thiết kế các đoạn mồi giúp
xác định sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn ở mức độ phân tử (Koeuth et al., 2008).
1.6.2 Điện di gel agarose
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử.
Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta sử dụng phương pháp điện di để
tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản
phẩm PCR.
13

Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường
dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5-20 kb. Gel được đổ
trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các
nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên
là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid
và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Trong thao tác, ethidium
bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điện di, gel được chiếu sáng bằng tia tử
ngoại, nucleic acid sẽ hiện dưới dạng những vạch màu đỏ cam (Hồ Huỳnh Thùy
Dương, 2002).
1.7 Phân tích Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) là kỹ thuật tách và
phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp.
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và
cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong

đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới
dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã
được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày
càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định
lượng lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc
trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược
phẩm, môi trường…
Quá trình tách trong kỹ thuật tách HPLC là tổ hợp của nhiều quá trình hóa học và
lý học. Đó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động,
là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích
(pha động) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tới cuối cột tách.
Trong quá trình đó, chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha
động luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định, hay gradient. Trong những
điều kiện sắc ký nhất định, chất tan luôn luôn phân bố trong hai pha theo những cân
bằng động học. Chẳng hạn, mẫu phân tích được bơm vào cột sắc ký và được pha tĩnh
giữ lại, thời gian mẫu bị giữ lại trong pha tĩnh gọi là thời gian lưu. Sau đó, quá trình
sắc ký các chất trong mẫu phân tích sẽ diễn ra khi dung môi rửa giải của pha động
bơm qua cột sắc ký. Trong quá trình sắc ký, các chất trong mẫu phân tích dịch chuyển
qua lại giữa pha tĩnh và pha động nhiều lần từ đầu đến cuối cột sắc ký, quá trình này
diễn ra cho đến khi chất cuối cùng trong mẫu phân tích được rửa giải xong. Nếu ghi lại