phân lập và xác định gene độc lực apxiva của vi khuẩn actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh viêm phổi – màng phổitrên heo tại lò mổ thành phố cần thơ

TRNG I HC CN TH
KHOA NÔNG NGHIP VÀ SINH HC NG DNG
 MÔN THÚ Y
BÙI TÂN THIN
PHÂN LP VÀ XÁC NH GENE C LC
APXIVA CA VI KHUN ACTINOBACILLUS
PLEUROPNEUMONIAE GÂY BNH VIÊM
PHI – MÀNG PHI TRÊN HEO TI
LÒ M THÀNH PH CN TH
LUN VN TT NGHIP NGÀNH THÚ Y
n Th, 12 - 2014
TRNG I HC CN TH
KHOA NÔNG NGHIP VÀ SINH HC NG DNG
 MÔN THÚ Y
BÙI TÂN THIN
PHÂN LP VÀ XÁC NH GENE C LC
APXIVA CA VI KHUN ACTINOBACILLUS
PLEUROPNEUMONIAE GÂY BNH VIÊM
PHI – MÀNG PHI TRÊN HEO TI
LÒ M THÀNH PH CN TH
LUN VN TT NGHIP NGÀNH THÚ Y
CÁN B HNG DN
TS. LÝ TH LIÊN KHAI
n Th, 12 - 2014
i
TRNG I HC CN TH
KHOA NÔNG NGHIP VÀ SINH HC NG DNG
 MÔN THÚ Y
 tài: “Phân lp và xác nh gene c lc ApxIVA ca vi khun
Actinobacillus pleuropneumoniae gây bnh viêm phi – màng phi trên heo
i lò m thành ph Cn Th” do sinh viên Bùi Tân Thin thc hin ti phòng

 Sinh Thc n, B môn Thú Y, Khoa Nông Nghip và Sinh Hc ng Dng,
Trng i hc Cn Th, t tháng 1/2014 n tháng 8/2014.
n Th, ngày… tháng… nm 2014 Cn Th, ngày… tháng… nm 2014
Duyt B môn Giáo viên hng dn
TS. Lý Th Liên Khai
n Th, ngày….tháng….nm 2014
Duyt Khoa Nông nghip và Sinh hc ng dng
ii
I CAM OAN
Tôi xin cam oan ây là công trình nghiên cu ca riêng tôi, các s liu, kt qu
c nêu trong lun vn này là trung thc và cha tng c ai công b trong
t k công trình nào khác trc ó.
Sinh viên thc hin
Bùi Tân Thin
iii
I CM T
Thi gian trôi nhanh t khi tôi t chân vào trng i hc Cn Th. Trong sut
thi gian hc tp ây, tôi ã nhn c nhiu s giúp , ng viên chân thành
 cha m, thy cô và bn bè. Ngay gi phút này ây, khi tôi ã hoàn thành xong
lun vn tt nghip ca mình, tôi vô cùng sung sng và mong mun bày t
lòng cm n n nhng ngi giúp  tôi trong sut thi gian qua.
u tiên, con xin kính gi li cm n sâu sc n cha m - ngi ã có công
sinh thành, dy d con nên ngi. Xin cám n cha mã luôn lao ng vt v,
không ngi cc kh, ma nng  lo cho con c y  c v vt cht ln tinh
thn,  con ly ó làm ng lc vt qua nhng lúc khó khn.
Xin chân thành ghi nh công n cô Lý Th Liên Khai là ngi ã ht lòng lo
ng, ch bo, ng viên trong sut quá trình hc tp và thc hin  tài. Quý
thy cô B môn Thú Y và B môn Chn Nuôi ã truyn t cho tôi nhng kin
thc, kinh nghim quý báu, ln nhn thc xã hi trong quá trình hc tp ti
trng .

Chân thành cm n anh Nguyn Lng Trng Giang lp Cao hc khóa 19; mt
ngi anh cng nh mt ngi thy ã giúp , ch bo tôi rt nhiu u trong
sut quá trình hoàn thành  tài này.
m n các bn trong tp th lp Dc Thú Y khóa 36 ã ng hành cùng tôi,
i ngi ã nhit tình giúp  và ng viên  tôi có th hoàn thành tt lun
n này. Tôi cng xin gi li cám n n các anh ch Cao hc khóa 19, 20 các
em sinh viên khóa 38 ã giúp  tôi trong thi gian thc hin lun vn.
Cui cùng tôi xin cám n quý thy cô trong Hi ng ã dành thi gian quý báu
a mình c lun vn ca tôi, nghe tôi báo cáo và a ra nhng li nhn xét
 tôi hoàn thin lun vn ca mình.
Xin mt ln na cám n tt c.
Bùi Tân Thin
iv
DANH MC CH VIT TT
 vit tt Din gii ting Anh Din gii ting Vit
APP Actinobacillus pleuropneumoniae
Vi khun
Actinobacillus
pleuropneumoniae
Apx Apx – Toxins c t Apx
BA Blood agar Thch máu
Bp Base pair p base
CA Chocolate agar Thch socola
CAMP Christie – Atkinson – Munch – Peterson
CPS Capsule Polysaccharide  polysaccharide
ctv ng tác viên
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
LPS Lipopolysacccharide
Màng

lipopolysacccharide
MHA Mueller Hinton Agar Thch Mueller Hinton
NA Nutrient Agar Thch dinh dng
NAD Nicotinamide adenine dinucleotide
O.N.P.G Ortho-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside
OMPs Outer Membrane Proteins Protein màng ngoài
PCR Polymerase Chain Reaction
Phn ng chui
polymerase
RTX Repeats in Toxin
TSA Tryptic Soy Agar Thch Tryptic Soy
v
C LC
Trang duyt i
i cam oan ii
i cm t iii
Danh mc ch vit tt iv
c lc v
Danh sá ch hình v ii
Danh sách bng v ii i
Tóm lc ix
CHNG 1: T VN  1
CHNG 2: C S LÝ LUN 3
2.1 Tình hình nghiên cu vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae gây bnh
viêm phi – màng phi trên heo trong và ngoài nc 3
2.1.1 Tình hình nghiên cu trong nc 3
2.1.2 Tình hình nghiên cu ngoài nc 4
2.2 c m v vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 6
2.2.1 S lc v vi khun APP 6
2.2.2 c tính nuôi cy, phân lp 6

2.2.3 Tính gây bnh 7
2.2.4. Sc  kháng 7
2.2.5. Gene c lc Apx 7
2.3 c m bnh viêm phi – màng phi do vi khun Actinobacillus
pleuropneumoniae gây ra 11
2.3.1 Cách sinh bnh 11
2.3.2 Dch t bnh 11
2.3.3 Tr iu ch ng 12
2.3.4 Bnh tích 13
2.3.5 Chn oán 16
2.3.6 Phòng bnh 17
2.3.7 Kháng sinh u tr 18
CHNG 3: PHNG TIN VÀ PHNG PHÁP THÍ NGHIM 19
3.1 Phng tin thí nghim 19
3.1.1 Thi gian, a m 19
3.1.2 i tng nghiên cu 19
3.2 Phng pháp tin hành thí nghim 20
vi
3.2.1 Phng pháp ly mu 20
3.2.2 Phng pháp nuôi cy, phân lp, nh danh vi khun Actinobacillus
pleuropneumoniae 21
3.2.3 Phng pháp nh danh vi khun A. pleuropneomoniae da vào gene c
 ApxIVA 23
3.2.4 Phng pháp kim tra tính  kháng ca vi khun APP phân lp c i
i mt s loi kháng sinh 27
3.2.5 Các ch tiêu theo dõi 28
3.2.6 Phng pháp x lý s liu 29
CHNG 4: KT QU VÀ THO LUN 30
4.1 Tình hình hot ng ca lò m thành ph Cn Th 30
4.2 Kt qu kho sát bnh hô hp trên heo ti lò m Thành ph Cn Th 33

4.3 Kt qu phân lp, nh danh vi khun Actinobacillus spp. ng phn ng
sinh hóa 35
4.4 Kt qu phân lp c vi khun Actinobacillus spp. theo phng thc chn
nuôi 36
4.5 Kt qu phân lp c vi khun A. pleuropneumoniae da vào xác nh
gene mã hóa c lc apxIVA. 38
4.6 Kt qu kho sát tính  kháng ca vi khun A. pleuropneumoniae phân lp
c i vi mt s loi kháng sinh 42
4.7 Kt qu kho sát tính a kháng vi mt s loi kháng sinh ca vi khun A.
pleuropneumoniae phân lp c 44
CHNG 5: KT LUN VÀ  NGH 46
5.1 Kt lun. 46
5.2  ngh. 46
TÀI LIU THAM KHO 47
PH CHNG 53
vii
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tên hình Trang
2.1 Heo bnh viêm phi - màng phi th quá cp tính 12
2.2 Heo bnh viêm phi - màng phi th cp tính 13
2.3 Phi xut huyt c m khám  heo b nhim A.
pleuropneumoniae th cp tính.
14
2.4 Phi xut huyt và hoi t heo bnh viêm phi - màng phi 14
2.5 Màng phi viêm dính có t huyt  heo bnh viêm phi -
màng phi th mãn tính.
15
2.6 Heo 3 tháng tui b viêm phi - màng phi do nhim
Actinobacillus pleuropneumoniae
15

3.1 Quy trình nuôi cy phân lp vi khun Actinobacillus 22
3.2 Quy trình thc hin phn ng PCR 23
3.3 Quy trình thc hin kháng sinh  27
4.1 S kt cu lò m thành ph Cn Th 30
4.2 Phng tin vn chuyn thân tht 32
4.3 Khu vc git m heo, làm lòng 32
4.4 Heo bnh hô hp - nm th th bng, ho 34
4.5 Phi heo bnh hô hp - xut huyt na bên phi 35
4.6 Kt qu chy n di gene c lc apxIVA ca vi khun APP 39
4.7 Khun lc A. pleuropneumoniae trên môi trng thch
chocolate
40
4.8 Hình thái vi khun APP khi xem di kính hin vi  phóng
i x100
40
4.9 Phi viêm dính sn - rách màng bao phi do nhim vi khun
APP
41
4.10 Phi viêm dính sn do nhim vi khun APP 41
4.11 Kt qu kháng sinh  ca vi khun A. pleuropneumoniae 43
4.12 Sa kháng vi kháng sinh ca vi khun APP phân lp c 45
viii
DANH SÁCH BNG
ng Tên bng Trang
3.1 c tính sinh hóa ca các chng Actinobacillus 23
3.2 Thành phn hn hp ca phn ng PCR 24
3.3 Trình t nucleotide ca cp n mi dùng nh danh vi
khun A. pleuropneomoniae
25
3.4 Chu trình nhit cho phn ng PCR nh danh vi khun A.

pleuropneomoniae
26
3.5 Các chun mc ng kính vòng vô khun 28
4.1 Kt qu kho sát heo bnh hô hp ti lò m thành ph Cn Th 33
4.2 T l mu dng tính vi vi khun Actinobacillus spp. 35
4.3 T l heo nhim vi khun Actinobacillus spp. theo phng
thc chn nuôi
37
4.4 Kt qunh danh vi khun APP da vào gene mã hóa c lc
apxIVA
38
4.5 S kháng ca vi khun APP i vi mt s loi kháng sinh 42
4.6 Kt qua kháng kháng sinh ca vi khun APP phân lp c 44
ix
TÓM LC
Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) là nguyên nhân gây bnh viêm phi -
màng phi trên heo, bnh lan rng khp th gii và là nguyên nhân gây tn tht
kinh t nghiêm trng  nhng tri nuôi heo. Tin hành phân lp vi khun APP t
18 mu bnh phm, c ly  lò m Thành ph Cn Th trong thi gian t
tháng 01/2014 ti tháng 08/2014. Vi khun APP c xác nh da vào gene
c lc apxIVA bng phng pháp PCR và kim tra tính nhy cm ca vi khun
i mt s loi kháng sinh bng phng pháp khuch tán trên thch. S heo
nh hô hp ti lò m thành ph Cn Th là 323 con trên tng s 7.557 con
kho sát, chim t l tng i thp (4,27%). Qua 18 mu bnh phm có bnh
tích c trng ca bnh viêm phi  màng phi ly t 323 heo bnh hô hp, có
12/18 mu dng tính vi Actinobacillus spp. (66,67%). T l dng tính vi
Actinobacillus spp. trên heo ti lò m Thành ph Cn Th không ph thuc vào
phng thc chn nuôi. S hin din ca vi khun APP trên heo ti lò m thành
ph Cn Th tng t nhau  nhng heo có ngun gc t Cn Th, ng Tháp
và Bn Tre. Vi khun APP phân lp c nhy cm cao (100%) vi amoxicillin

và neomycin;  kháng va vi ciprofloxacin, tetracycline và colistin; riêng
florfenicol ã b kháng hoàn toàn (100%). ng thi vi khun APP a kháng
ph bin vi mt s loi kháng sinh kho sát, ít nht vi 2 loi kháng sinh và
nhiu nht vi 4 loi kháng sinh.
1
CHNG 1
T VN 
Chn nuôi heo  nc ta ang ngày mt phát trin áp ng nhu cu thc phm
trong và ngoài nc nhm mang li li nhun cho kinh t quc gia nói chung và
cho ngi chn nuôi nói riêng. Tuy nhiên, chn nuôi heo vn còn tn ti nhiu
n  khó khn nh: dch bnh l mm long móng, dch tai xanh và các bnh
truyn nhim khác, v sinh chm sóc, công tác thú y cha hoàn thin u này
nh hng không kém n hiu qu kinh t ca chn nuôi heo.
Theo Christensen and Mousing (1992), không có heo nào không b bnh ng
hô hp khi git m. Bnh ng hô hp xy ra do rt nhiu nguyên nhân nh vi
khun, chung tri, con ging, thc n, thi tit… Trong ó bnh viêm phi –
màng phi là bnh truyn nhim  heo do vi khun Actinobacillus
pleuropneumoniae (APP) gây ra và làm thit hi ln cho ngành chn nuôi heo,
nh xut hin khp ni trên th gii. Con vt cht do s phi hp ca suy tim và
 sn xut c t ca vi khun APP. Hin tng heo cht t ngt thng xut
hin vi du hiu là máu và bt chy ra t mi, phi b tn thng nng và heo
nh có th tn ti thi gian dài  th mang trùng mãn tính dn n s gim cân
và có th bùng phát khi ngun dinh dng không m bo. n nay, có bn gene
khác nhau ca c t Apx do tt c 15 chng huyt thanh ca vi khun APP sn
xut là: ApxI, ApxII, ApxIII và ApxIV (1 và 2). Riêng gene ApxIVcó mt  tt
 15 chng huyt thanh hc ca vi khun APP và rt hu ích  phát hin tt c
15 chng ca vi khun APP (Sthitmatee et al., 2003).
 Vit Nam, bnh viêm phi viêm màng phi ã có t lâu nhng bnh chc
nghiên cu t nm 1996 n nay ti B môn vi trùng (Vin Thú y) khi phân lp
c vi khun A. pleuropneumoniae t heo bnh  mt s a phng thuc

vùng ng bng sông Hng. Ti ng bng sông Cu Long bnh viêm phi -
màng phi do APP cng ã c nghiên cu, tuy nhiên vn cha c nghiên
u sâu. Riêng ti lò m thành ph Cn Th, vi s lng heo nhp v hàng
ngày tng i ln, heo t nhiu ngun tnh thành khác nhau tp trung v git
, quy trình git m - vn chuyn thân tht không hp v sinh…to u kin
cho vi khun APP vy nhim và gây bnh.
Vì vy vic phòng và u tr bnh nhm ngn chn dch bnh lây lan, hn ch
thit hi v kinh t và góp phn m bo v sinh an toàn thc phm cho ngi
tiêu dùng là ht sc cn thit. Bên cnh ó, các nghiên cu dch t hc v chng
huyt thanh hc ca vi khun APP có th hu ích cho vic s dng thuc và
chng trình tiêm phòng vaccine.
2
Xut phát t thc t trên, c s cho phép ca B Môn Thú Y, Ban ch nhim
Khoa Nông Nghip và Sinh Hc ng Dng (KNN & SHD), Trng i hc
n Th, tin hành kho sát heo  lò m Thành ph Cn Th và ly mu bnh
phm  thc hin  tài: “Phân lp và xác nh gene c lc ApxIVA ca vi
khun Actinobacillus pleuropneumoniae gây bnh viêm phi – màng phi
trên heo ti lò m thành ph Cn Th”
c tiêu ca  tài
Xác nh t l nhim vi khun APP trên heo bnh hô hp ti lò m thành ph Cn
Th.
Xác nh tính  kháng ca vi khun APP vi mt s loi kháng sinh.
3
CHNG 2
 S LÝ LUN
2.1 Tình hình nghiên cu vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae gây
nh viêm phi – màng phi trên heo trong và ngoài nc
2.1.1 Tình hình nghiên cu trong nc
Trong quá trình xác nh nguyên nhân gây bnh ng hô hp trên heo nuôi
i mt s tnh Min Bc, Cù Hu Phú và cng sã phân lp c vi khun

Actinobacillus pleuropneumoniae vi t l 0,19% trong tng s 53 mu phi m
khám và hch lympho; 7,93% trên tng s 542 mu dch ngoáy mi. Tác gi
ng cho bit vi khun APP ít mn cm i kanamycin (45,45%), neomycin
(50%), lincomycin (63,64%) (Cù Hu Phú và ctv., 2005).
ng Xuân Bình và ctv. (2007), ã phân lp c vi khun Actinobacillus
pleuropneumoniae vi t l mu dng tính là 37,83% trong tng s 37 bnh
phm phi heo có triu chng, bnh tích viêm dính màng phi ti hai tnh là Hà
Tây và Thái Nguyên.
Trong nghiên cu “Xác nh vai trò gây bnh viêm phi – màng phi trên heo
a vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và th
nghim vaccine phòng bnh” ca V Ngc Quý ti các tnh thuc ng bng Bc
. ã cho thy kt qu phân lp c vi khun Actinobacillus
pleuropneumoniae i t l 3,49%  Thái Bình, 7,78%  Hi Phòng, và 8,33%
Hà Tây (V Ngc Quý, 2008).
Nguyn Th Thu Hng và ctv. (2009), ã tin hành thc hin hai phn ng
multiplex PCR  xác nh s hin din ca các gene ngoi c t (Apx) có trong
các chng vi khun APP gây bnh viêm phi – màng phi  heo phân lp ti
min Bc Vit Nam. Phn ng multiplex PCR 1: dùng  xác nh các gene
apxICA, apxIICA và apxIIICA. Phn ng multiplex PCR 2: dùng  xác nh các
gene apxIBD và apxIIIBD. Kt qu cho thy: có 4/5 chng (thuc serotype 5) có
cha gene Apx tng t nh chng i chng  serotype tng ng; 12/13
chng (thuc serotype 2) u có s sai khác trong vic sn sinh c t Apx.
Qua tin hành thu thp 169 mu phi heo có bnh tích  các lò m ti tnh Tin
Giang và 15 mu bnh phm phi heo ti tri ca nhà máy thc n chn nuôi
Bình Minh. Ngô Phú Cng (2010), ã phân lp c vi khun A.
pleuropneumoniae trên các phi có bnh tích ti lò m tp trung chim t l
1,47%. t qu thc hin kháng sinh  cho thy 5 loi kháng sinh u có t l
4
n cm cao (81,25 – 97,92%) tr colistin, norfloxacin có  nhy cm vi vi
khun APP cao nht (97,92%) và colistin có  nhy cm thp nht (58,33%).

Võ Phong V Anh Tun và Athipoo Nuntaprasert (2011), ã nghiên cu khuch
i gene ApxIV  phát hin các vi khun APP phân lp t heo v béo  Thái
Lan. Kt quc chia thành ba nhóm. Nhóm 1 ã phát hin 9 chng huyt
thanh bao gm: serotype 1, 3, 4, 6, 9, 11, 12, 13, 14  3 tnh; nhóm 2 ch phát
hin c bn chng huyt thanh (4, 6, 9, 11)  1 tnh; nhóm 3 ã tìm thy c
12 chng huyt thanh (1, 2, 3, 5a, 5b, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15)  2 tnh.
Qua 30 mu bnh phm t các  dch PRRS ti mt sa phng ca tnh Hng
Yên, ã phân lp c t l cao các chng vi khun th phát, c bit là A.
pleuropneumoniae (63,3%), E. coli (53,3%) và P. multocida (36,6%). Các chng
A. pleuropneumoniae phân lp mn cm cao vi các loi kháng sinh nh
florfenicol (89,47%), amoxicillin (84,21%), erythromycin (78,95%),
kistasamycin (73,68%) và kháng mnh i streptomycin (100%), enrofloxacin
(94,74%), colistin (94,74%), gentamicin (89,47%) (Tiêu Quang An và Nguyn
u Nam, 2011).
Lê Vn Dng và ctv. (2012), ã phân lp c vi khun A. pleuropneumoniae
 245 mu bnh phm phi và cung hng ca heo mc PRRS ti tnh Bc
Giang vi t l tng i cao (19,59%), trong ó cao nht  heo sau cai sa t
1,5 n 3 tháng tui (26,67%) và thp nht là  heo con s sinh n 1,5 tháng
tui (10,34%).
Xét nghim 90 mu bnh phm t heo mc PRRS ti tnh Bc Giang, Nguyn
Quc Huy và ctv., (2013) cho thy t l heo b PRRS phân lp c vi khun
APP là 17,78%, trong ó t l heo nhim APP cao nht phân lp c chng vi
khun này là  heo 1,5 – 3 tháng tui (28%). Các chng vi khun phân lp c
u mn cm mnh vi florphenicol, ceftiofur, amoxicillin và kháng li
neomycin, crythromycin, lincomycin, colistin.
2.1.2 Tình hình nghiên cu ngoài nc
Sidibé et al. (1993), ã tin hành kim tra s hin din ca vi khun APP trên
u dch xoang mi và hch hnh nhân ly t 442 heo khe. Kt qu cho thy có
 dng tính vi APP trên 24 mu dch xoang mi, 90 mu hch hnh nhân và
11 mu trên c hai mu dch xoang mi và hch hnh nhân.

Gram cùng cng s ã thu thp mu hch hnh nhân ca 101 heo trên 9 àn khác
nhau  kim tra vi khun gây bnh ng hô hp. Kt qu cho thy có 23% là vi
khun APP; khi s dng k thut PCR xác nh APP thì có 65% dng tính.
(Gram et al., 1996).
5
Gene apxIVA là t yu tc lc RTX ca vi khun APP c trng ca loài.
Phn ng PCR dùng n mi c trng ca gene apxIVA thì không khuch i
DNA t 17 loài vi khun khác có quan h gn vi vi khun APP. ng thi pn
ng PCR cng cho kt qu âm tính vi DNA ca mt vài loài Actinobacillus
spp., nhng loài có kiu hình và cho phn ng huyt thanh hc ging vi APP.
 th là khi dùng k thut PCR thì phát hin c vi khun APP hin din 
16/17 mu phi có bnh tích hoi t, trong khi ó s dng phng pháp nuôi cy
ch phát hin c APP  13/17 mu phi hoi t (Schaller et al., 2001).
Fittipaldi et al. (2003), ã  dng 8 phn ng PCR ánh giá kh nng phát
hin APP trong hch hnh nhân ca heo. Tác gi thc hin phn ng PCR t mu
DNA ly trích trc tip t mu hch hnh nhân (PCR trc tip) và mu DNA ly
trích t vi khun c nuôi cy t mu hch hnh nhân (PCR sau nuôi cy). Hu
t các phn ng PCR u cho kt qu dng tính vi APP, tuy nhiên mt vài
phn ng cho kt qu dng tính gi vi mt s loài không phi là APP.
Sthitmatee cùng cng s ã dùng k thut PCR  xác nh serotype ca vi
khun APP da vào nhng n mi c thit kc trng cho nhng gene
apxI, apxII, apxIII và apxIVA. Bng k thut PCR, 10 trong s 13 chng APP
tham kho ã c phân bit. Mi serotype ca APP cho thy c c trng
a mi serotype. Vì vy, k thut PCR là mt công c nhanh chóng và có ích 
xác nh serotype ca vi khun APP (Sthitmatee et al., 2003).
Trong ko sát s lu hành ca các vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae,
Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus
suis trên 50 àn heo  Ontario ca MacInnes et al., (2008). Tác gi nghiên cu
trên hch hnh nhân và dch xoang mi ca heo  la tui t sau cai sa. Kt qu
cho thy s hin din ca các vi khun nh sau: Streptococcus suis có  1 àn,

Haemophilus parasuis có du hiu nhim trong 2 àn, Pasteurella multocida
chng mang c t có mt  1 àn, 78% àn gia súc chn oán dng tính vi vi
khun APP, ch có 3 trong 50 àn là chn oán âm tính vi APP và A. suis.
Marois et al. (2008), ã kho sát v s lây lan ca vi khun gây bnh hô hp trên
heo  lò m, nghiên cu c thc hin nh sau: nhng heo c thí nghim 
lò m phi c kim tra và cho thy sch bnh vi các vi khun Mycoplasma
hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida,
Streptococcus suis. Kt qu kim tra u dch xoang mi, hch hnh nhân và
phi ly t heo sau khi git m bng phng pháp PCR cho thy có s dng
tính vi các vi khun này, u này chng minh rng lò m là ni cha các mm
nh gây bnh ng hô hp.
6
Loera-Muro et al.(2013), ã dùng k thut PCR  các nh gene c lc ca vi
khun APP  14 nông tri vi 212 mu dch xoang mi ti Mexico. Kt qu có
19,8% mu dng tính vi vi khun APP (79% nông tri có s hin din ca vi
khun APP).
2.2 c m v vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)
2.2.1 S lc v vi khun APP
Vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae thuc h Pasteurellae, thuc ging
Actinobacillus, trc ây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay
Haemophilus pleuropneumoniaeã c xác nh là nguyên nhân chính gây nên
nh viêm phi - màng phi truyn nhim trên heo. Vi khun không di ng,
không sinh nha bào, có kh nng hình thành giáp mô, tuy nhiên mt s chng
không có giáp mô cng ã c quan sát thy.
Vi khun APP t lâu ã c nhiu nghiên cu xác nh là nguyên nhân chính
gây bnh viêm phi – viêm màng phi  heo và c chia thành 2 biotype chính
a trên nhu cu s dng yu t V (NAD) cho quá trình sinh trng ca vi
khun. Biotype 1 cn có NAD, còn biotype 2 thì không òi hi NAD trong quá
trình nuôi cy, song vn cn có các pyridine nucleotid c hiu hoc các cht tin
thân ca pyridine nucleotid cho quá trình tng hp NAD. Vi khun APP có 15

serotype có c lc khác nhau (Gottschalk et al., 2006).
2.2.2 c tính nuôi cy, phân lp
Moller and Kilian (1990) cho bit A. pleuropneumoniae là mt loi vi khun khó
phân lp trên các môi trng thông thng và thng ph thuc vào yu t V.
Do vy, khi nuôi cy A. pleuropneumoniae cn các môi trng giàu dinh dng.
Trên môi trng thch máu thông thng vi khun không phát trin mà ch có
th mc trên thch máu ã c b sung NAD hoc có cy kèm vi khun
Staphylococcus aureus. Sau 24 gi nuôi cy, vi khun phát trin thành khun lc
c xung quanh ng cy Staphylococcus aureus hình thành mt vùng dung
huyt  là hin tng CAMP.Khun lc APP là nhng khun lc hi trong, dng
 tinh, có kích thc là 1 mm, gây dung huyt  trên môi trng thch máu
(Jacobsen and Nielsen, 1995).
Vi khun APP không di ng, không kháng acid, ym khí tùy tin, khi phát trin
thng nhy. Lên men ng glucose, xylose, mannitol, mannose và không lên
men ng arabinose, lactose, raffinose, sorbitol. Dng tính vi phn ng
urease, oxidase, O.N.P.G., CAMP. Âm tính vi phn ng sinh indole, không phát
trin trên môi trng thch MacConkey (Cù Hu Phú và ctv., 2005; ng
Xuân Bình và ctv., 2007).
7
2.2.3 Tính gây bnh
A. pleuropneumoniae là tác nhân gây bnh viêm phi viêm màng phi, vi khun
lây lan nhanh và có th làm tng t l heo cht trong àn. Vì bnh lây lan nhanh
chóng trong àn nên vic phát hin sm s hin din ca vi khun là bin pháp
t nht  kim soát và u tr bnh trong àn (Lo et al., 1998).
A. pleuropneumoniae ký sinh  các ng vt bình thng, có th gây cm nhim
 hi. Vì vy, bnh do vi khun này thng có tính l t, nhng nh các yu t
tác ng ngoi lai ng lot mà có th phát sinh có tính tp oàn. Hn na, bnh
này còn có th cm nhim theo chiu dc (t m sang con),  thai hoc gia súc
non thng gây t vong. Yu t gây bnh c bit là dung huyt t, c t t
bào và ni c t.

Nhng heo khe mnh thng cha vi khun APP ng hô hp trên, c bit
là  trong xoang mi và hch hnh nhân (Sidibe et al., 1993). Nhng nghiên cu
n ây cho thy APP có th tn ti trong hch hnh nhân dn n tình trng
mang trùng (Chiers et al., 1999).
2.2.4. Sc  kháng
Vi khun A. pleuropneumoniae có sc  kháng yu, không th sng lâu  môi
trng bên ngoài, b cht nhanh bi s khô hn. Trong niêm dch hoc môi
trng có nhiu cht hu c, vi khun có th tn ti trong vài ngày. Tuy nhiên,
trong nc sch  4
0
C vi khun có th tn ti trong 30 ngày. Các cht sát trùng
thông thng có th dit vi khun nhanh chóng (H Th Vit Thu và ctv., 2012).
2.2.5. Gene c lc Apx
Nhiu nghiên cu ã cho thy c lc  các serotype khác nhau ca vi khun A.
pleuropneumoniae phn ln c quyt nh bi các ngoi c t mà chúng sn
sinh ra (Frey et al., 1993). Polysaccharide v, lipopolysaccharide, protein màng,
protein thu nhn st, yu t bám dính, ngoi c t và mt vài loi enzyme có
liên quan cng óng vai trò quan trng i vi c lc ca vi khun A.
pleuropneumoniae (Gottschalk and Taylor, 2006).
Ngoi c t (Exotoxin): là yu t quan trng nht gây nên nhng bnh tích trên
phi c trng ca vi khun APP bi làm h hi chc nng thc bào ca ci
thc bào (macrophage) và t bào bch cu trung tính (neutrophil) (Tô H và ctv.,
2014). Nhiu nghiên cu cho thy mc c lc khác nhau ca các serotype
a vi khun APP phn ln có liên quan n ngoi c t (Apx) sn sinh t vi
khun và óng vai trò chính trong quá trình gây bnh cho heo (Frey, 1995). Các
c t này c xp vào nhóm RTX-toxin và t tên là c t Apx, bao gm
ApxI, ApxII, ApxIII (Frey et al., 1993) và ApxIVA (Schaller et al., 1999).
8
i serotype ca APP to ra ít nht hai hoc mt kt hp ca ba trong s bn
ngoi c t nói trên. Mi ngoi c t ApxI, ApxII, ApxIII c to ra bi mt

 serotype, tuy nhiên ApxIV c to ra bi tt c 15 serotype. Hn na, c t
ApxIV c to ra trong u kin in vivo nhng không to ra trong u kin in
vitro. Gene apxIV không c tìm thy trong nhng loài vi khun khác thuc h
Pasteurellaceae, và vì vy gene apxIVc coi là marker chn oán chuyên bit
cho loài APP. Trong khi gene apxI, apxII, apxIII thì c tìm thy trong mt s
loài khác ca h Pasteurellaceae (Tô H và ctv., 2014).
c t Apx c mã hóa bi operon apx, gm 4 gene c sp xp theo th t là
apxCABD, trong ó C là gene hot hóa, A là gene quy nh cu trúc c t, B và
D là hai gene mã hóa cho các protein kt hp vi màng liên quan n s tit c
 qua c hai màng (Frey et al., 1993). Tính c ca mi loi c t có th thay
i và ph thuc vào các serotype khác nhau ca vi khun.
+ ApxI (A. pleuropneumoniae – RTX – toxin I): ban u c mô t nh là
heamolysin I (HlyI), c tinh ch t serotype 1 chng 4074, là mt protein hot
ng có phân t khi là 105kDa (Frey et al., 1993). ApxI có c lc cao, gây tan
huyt và có hot tính gây c t bào mnh hng i thc bào ph nang và bch
u trung tính, vì vy còn c gi là cytolysin I (ClyI) (Frey et al., 1993). ApxI
c tit ra bi A. pleuropneumoniae serotype 1, 5a, 5b, 9, 10 và 11 thuc
biotype 1 (Kamp et al., 1994) và serotype 14 thuc biotype 2 (Rayamajhi et al.,
2005). Operon mã hóa cho ApxI c xác nh là gene apxI và gm 4 gene c
p xp theo th t là apxIC, apxIA, apxIB, apxID (Jansen et al., 1993). Các
chng sn sinh ra ApxI thng có c lc cao, u này cho thy c t có liên
quan n c lc ca A. pleuropneumoniae (Kamp et al., 1991; Frey, 1995).
+ ApxII: ban u c mô t là c t haemolysin II (HlyII) gây tan huyt yu và
gây c t bào  mc  trung bình. ApxII có trng lng phân t là 105 kDa,
phân lp t serotype 2 tham kho t chng S1536 (Frey et al., 1993). Tt c các
serotype ca APP u tit ApxII, tr serotype 10 và 14 (Rayamajhi et al., 2005).
Bên cnh vic gây tan huyt, ApxII còn c bit là có hot tính gây c t bào
nh hng i thc bào ph nang và bch cu trung tính, vì vy còn c gi là
cytolysin II (ClyII) (Kamp et al., 1991; Frey et al., 1993). Operon mã hóa ApxII
ch cha các gene apxIICA và thiu các gene bài tit tng ng. S tit ApxII

ph thuc vào gene apxIIBD và gene này c tìm thy  tt c các serotype ca
A. pleupneumoniae, tr serotype 3 (Frey, 1995).
+ ApxIII: là mt protein có trng lng phân t 120 kDa, còn có tên khác là
cytolysin III (ClyIII), pleurotoxin (Ptx), hoc c t i thc bào (Mat –
macrophage toxin). ApxIII là c t không làm tan huyt, nhng li là c t
9
dung gii t bào mnh (Kamp et al., 1991). Phân bit c vi ApxI và ApxII do
không gây dung huyt. ApxIII ging 50% vi ApxI và HlyI ca E. coli (Jansen et
al., 1993). Protein c t ApxIII c tit ra bi serotype 2, 4, 6, 8 và 15 ca A.
pleuropneumoniae (Rayamajhi et al., 2005). Trong tt c nhng serotype này
m có gene hot hóa apxIIIC, gene quy nh cu trúc c t apxIIIA, và hai
gene B và D là hai gene mã hóa cho các protein kt hp vi màng liên quan n
 tit c t qua c hai màng.
+ ApxIV (ApxIVA): là c t RTX th 4 ca APP c phát hin và c 
xut t tên là ApxIVA. Gene ApxIVA c phát hin thy  tt c các serotype
a APP và u ó chng t nó có tính cht c trng cho loài. Vai trò ca c
 ApxIVA vi vt ch nh th nào trong quá trình gây bnh cha c nghiên
u k, song ã có mt s công trình nghiên cu chng minh s tn ti ca
ApxIVA trong c th sng và c to ra t gene c t ca vi khun A.
pleuropneumoniae (Schaller et al., 1999).
Không có serotype nào ca A. pleuropneumoniae có kh nng sn sinh c ba loi
c t Apx, ch yu là có kh nng to ra hai loi c t. Các serotype 1, 5, 9, 11
và 13 sn sinh ra ApxI và ApxII; serotype 2, 3, 4, 6, 8 và 15 sn sinh ra ApxII và
ApxIII. Mt s lng nh serotype ch sn sinh mt loi c t Apx nh serotype
10 sn sinh ApxI, serotype 6, 7 và serotype 12 sn sinh ApxII (Kamp et al.,
1991). c lc ca các serotype thay i t mc  mnh n yu. S thay i
này tùy thuc vào loi c t mà mi serotype tit ra.
Lipopolysaccharride (LPS): là thành phn chính ca lp màng ngoài t bào vi
khun A. pleupneumoniae, có liên quan nhiu ti quá trình gây c và có kh
ng gây tn thng i vi mô. Nhng tn thng do LPS tinh ch không gây

xut huyt, không gây hoi t khác vi tn thng c trng ca bnh viêm phi
– màng phi. Song LPS chc chn kt hp vi c t Apx làm tng c lc và
ng tính mãnh lit cho c t Apx.
LPS có vai trò quan trng trong s bám dính ca vi khun lên t bào biu mô và
p nhy khí qun ca heo. Bám dính là hot ng ban u giúp cho s xâm nhp
a vi khun và có th là c tính gây bnh, là nguyên nhân gây ra bnh.
Belanger et al. (1990), cho thy có ti 83% các serotype vi LPS mn (smooth
LPS) bám dính phn ln vành khí qun, trong khi 80% các serotype vi LPS bán
n (semi-smooth LPS) bám dính yu. u này cho thy LPS có th là mt nhân
 quan trng i vi s tn ti ca vi khun A. pleuropneumoniae ng hô
p trên ca heo.
Nhng nghiên cu gn ây ch ra rng phn LPS ca A. pleuropneumoniae có vai
trò trong s phát trin tn thng hay gây cht heo khi b nhim vi khun này.
10
Tuy nhiên c ch gây bnh khác có th tham gia trong quá trình sinh bnh khi s
n thng vn phát trin sau khi heo b phi nhim vi vi khun sng, có hiu
giá huyt thanh cao vi lipit A và phn carbohydrate ca phân t LPS.
Polysaccharide v vi khun (Capsule polysaccharide – CPS): vi khun A.
pleuropneumoniae c bao bc bên ngoài bi mt lp v có bn cht là các
polysaccharide. Lp v polysaccharide này tích n âm và c cu to bi các
n v Oligosaccharide, các polymer ca acid teichoic gn kt vi nhau bi các
u ni phosphate diester, hoc các pylomer Olygosaccharide gn kt vi nhau
i các cu ni phosphate .Polysaccharide v vi khun là mt trong nhng thành
phn quyt nh c lc ca vi khun và cng là mt nhân t quyt nh tính c
hiu serotype ca vi khun (Ward and Inzana, 1997). Polysaccharide v vi khun
là yu t xác nh c trng ca hin tng phát ánh ng sc trên b mt khun
c trong môi trng nuôi cy. Lp v ca APP có  dày t 80 – 230 nm tùy
thuc vào các serotype khác nhau. Các chng APP c lc cao có lp v dày,
trong khi mt s chng không c có lp v mng hoc d dàng b phá v.
Các serotype có lp v dày có c lc mnh hn so vi các serotype có lp v

ng (Jensen and Bertram, 1986). u này cho thy lp v vi khun có th là
t trong nhng yu tnh hng n c lc ca các serotype khác nhau. Lp
 ca APP có c tính chng li thc bào và c coi là lá chn ch yu ca vi
khun chng li h thng bo v ca vt ch. Nhng chng APP có v bình
thng có kh nng kháng li vi hin tng tiêu dit vi khun qua trung gian b
th ca huyt thanh heo khi có kháng thc hiu. Ngc li, vi các chng APP
t bin thiu ht v thì b tiêu dit bi huyt thanh bình thng.
Các protein màng ngoài (Outer membrance proteins – OMPs): protein màng
ngoài ca A. pleuropneumoniae có th thay i tùy theo hàm lng NAD cung
p trong môi trng nuôi cy. Vi khun APP n sinh mt vài loi protein màng
ngoài và các protein này c cho là có vai trò trong áp ng min dch. Hn
a, các kháng th kháng OMPs ca APP c chng minh tác ng nh mt
cht opsonin quan trng chng i thc bào và bch cu n nhân. APP có kh
ng tng hp hai protein mi khi c nuôi trong môi trng thiu st và có các
kháng th chng li chúng. Hin tng xut hin các polypeptide này ch có c
 trong c th sng. Các nhà nghiên cu ã quan sát thy có mt s th th
transferrin c hiu  heo và kh nng phát trin ca APP vi transferrin vn
chuyn st.
Các protein thu nhn st: kh nng cnh tranh và hp th st c xem là mt
trong nhng yu tc lc quan trng ca A. pleuropneumonia giúp vi khun tn
i trong c th vt ch. Nhiu công trình nghiên cu cho thy vi khun APP có
11
th s dng transferrin ca vt ch (Gerlach et al., 1992) và hemoglobin
(Archambault et al., 1999), cng nh s dng siderophore khác nhau ca nhiu
vi sinh vt khác nhau (Diarra et al., 1996) làm ngun cung cp st cho sinh
trng. Các nghiên cu cng ã xác nh chc chn có s tn ti ca các th th
trên b mt màng t bào APP c bit cho các ngun thu nhn st. Nghiên cu
a Jacques (2004), cho bit vi khun APP có protein gn kt hemoglobin và các
th th st hydroxamate. Chính protein gn transferring ã giúp cho APP c
cung cp y  st trong mt thi gian ngn sau quá trình xâm nhp gây nhim

trùng.
2.3 c m bnh viêm phi – màng phi do vi khun Actinobacillus
pleuropneumoniae gây ra
2.3.1 Cách sinh bnh
Sau khi xâm nhp vào c th, vi khun bám vào t bào biu mô  hch hnh nhân
sau ó di chuyn n các b phn di ca c quan hô hp và gây ra tn thng
ch yu  phi. Khi vi khun nhân lên s lng ln, chúng phóng thích phân t
lipopolysaccharides (LPS) t màng ngoài vi khun và c t gây viêm. Bch cu
trung tính c huy ng n và b phá hy bi c t, dn n phóng thích
lyzozyme làm nhng tn thng  c quan hô hp thêm trm trng. C th heo
tit ra cytokine có tác dng c ch tun hoàn  tnh mch  ngn chn c t
phát tán ra khp c th, gây ra nhi máu cc b phi. Heo cht nhanh có th
trong khong 4-12 gi sau khi nhim. LPS và c t gây c t bào không ch
giúp vi khun phá hy t bào ca ký ch mà còn giúp tránh b tiêu dit do làm
suy yu hin tng thc bào và hot ng ca b th (H Th Vit Thu và
Nguyn c Hin, 2012).
2.3.2 Dch t bnh
nh xy ra khp ni trên th gii, ti Vit Nam trong nhng nm gn ây A.
pleuropneumoniae ã c phân lp và c ánh giá là mt bnh hô hp khá
quan trng  tt c các tri heo siêu nc quy mô ln. Bnh c báo cáo  nhiu
c nh M, Canada, Mexico, Úc, Phn Lan, c, Thy n, Pháp,
Argentina, Hà Lan, an Mch…  Vit Nam, bnh cng c ghi nhn và gây
n tht khá ln, c bit là trong nhng trng hp có nhim mycoplasma hoc
virus PPRS (H Th Vit Thu và Nguyn c Hin, 2012).
APP là vi khun c trú ng hô hp trên ca heo. Trong nhng trng hp
nhim trùng quá cp tính và cp tính, không ch thy vi khun  phi và máu mà
còn  cht tit ng mi. Các trng hp sng sót sau nhim khun cp tính tr
thành heo mang trùng, tác nhân gây bnh thng thy  nhng vùng hoi t
phi, amidan và mi.Thi gian  bnh có th khác nhau, ngi ta thy rng heo
12

tip xúc vi s lng ln vi khun có th dn b cht sau vài gi hoc vài ngày.
 nhim trùng  mc  thp có th dn ti th bnh n trên lâm sàng.
 lan truyn bnh gia các àn thng xy ra qua vic a ng vt mi vào
àn. S vn chuyn và trn àn làm tng s lng heo mc bnh viêm phi –
màng phi.Các yu t khác nh mt àn quá ông, u kin khí hu thay i
t ngt nht là khi có s thay i nhit ,  m không khí cao và thông
thoáng kém làm s phát trin và lan truyn bnh nhanh có nh hng ln n s
ng heo mc bnh và cht. Do ó không ngc nhiên khi thy t l các t bùng
phát cao nht  heo ang ln và heo chun bc git tht, ch yu vào các mùa
có thi tit xu. Các àn có s lng ln, trn àn nhiu thng có nguy c mc
nh cao hn các àn nh, nuôi riêng l.
2.3.3 Triu chng
Theo Gottschalk and Taylor (2006), triu chng lâm sàng ca bnh ph thuc
vào tui, sc  kháng, mc  cm nhim, u kin môi trng và c lc ca
vi khun. Tin trin lâm sàng bnh có th là: th quá cp tính, th cp tính, hoc
th mãn tính.
+ Th quá cp tính: heo mc bnh st 41,5
0
C, mt mi, bn, nôn ma và tiêu
chy, tim p nhanh. Do suy hô hp và tun hoàn nên da  vùng mi, chân và
toàn b phn sau c th tr nên tím xanh.  thi k cui heo th khó d di, th
ch yu bng ming, con vt  t th ngi, nhit  tng cao. Ngay trc khi
cht, có chy nhiu dch bt ln máu  ming và mi, nhp tim tng; phn da 
i, tai, chân và sau cùng toàn b c th tr nên tím tái (Nicolet, 1992), heo mc
nh thng cht sau 24 - 36 gi. Thnh thong con vt cht t ngt mà không
có nhng du hiu lâm sàng.
Hình 2.1: Heo bnh viêm phi – màng phi th quá cp tính
( />13
+ Th cp tính: : thân nhit heo tng (st t 40,5 – 41
o

C), i li khó khn, mt
i, da , con vt tr nên  r và n ít hay bn. Nhng triu chng hô hp d
i nh khó th, ho và thnh thong th bng ming. Do suy hô hp và suy tim
n n t máu  nhng b phn xa nht ca c th nh mõm, chót tai và các
chân. Con vt bnh  th cp tính có th cht hoc hi phc. Nu heo vt qua 4
ngày u thì nó có th sng sót. Tuy nhiên, bnh  các heo này s chuyn thành
ng mãn tính.
Hình 2.2: Heo bnh viêm phi - màng phi th cp tính
( />+ Th mãn tính: phát hin sau khi du hiu cp tính bin mt, con vt st nh
hoc không st, ho tng cn thay i theo tin trin ca bnh. Con vt có biu
hin n ít và tng trng gim. Trong nhiu trng hp, du hiu duy nht khi m
khám bnh tích là nhng tn thng dính  màng phi – phi. Các bnh ng
hô hp khác hoc stress có th là yu t mng cho bnh viêm phi – màng
phi (MacInnes and Rosendal, 1988). Nhng con vt bnh mãn tính mang trùng
có th lây truyn bnh dù không có biu hin lâm sàng.
2.3.4 Bnh tích
 th cp tính: phi có màu hng sm n  mn, có bt máu  khí qun,
ch máu trong xoang ngc, viêm dính si huyt vào thành ngc, hoành cách mô
và màng ngoài tim.
 th mãn tính: vic xác nh heo nhim APP khó khn. Nhng tn thng 
phi do APP s bin i sau vài tun và khó phân bit vi nhng tn thng do
nhng bnh ng hô hp khác. Nhng tn thng này ri rác trên phi t
n vàng và có si huyt. Chính nhng m này là ni trú n ca APP trong
nhiu tháng làm cho con vt có kh nng truyn lây bnh trong àn.
14
Hình 2.3: Phi xut huyt c m khám  heo b nhim A.
pleuropneumoniae th cp tính.
( />Hình 2.4: Phi xut huyt và hoi t heo bnh viêm phi - màng phi
( />