Nghiên cứu phương pháp bán tổng hợp artesunat

BỘ Y TẾ
mưỜKG ĐAI HOC Dươc HÀ NỒI
• • • •
BÙI THỊ MAI SƯƠNG
NGHIỄN
cứu
PHU0NG PHẤP
BÂN TỔNG HỌP ARTESUNAT
■
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999 - 2004)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
- Thời gian thực hiêỊỊ^
PGS.TS. ĐỖ HỮU NGHỊ
BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP DƯỢC
PHÒNG THÍ NGHIỆM GMP
2004 -15/05/2004
£>/
/ íỳ v -f >
Tĩiịr-VIỆNị*
\v t ' . '77"
Hà Nội, 5 - 2004
LỜI CẢM ƠN
Vói lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới:
PGS. TS . ĐỖ HỮU NGHỊ
Thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực
nghiệm khoa học. Dưới sự hướng dẫn của thầy, em đã học hỏi được rất
nhiều điều có ích không chỉ cho việc hoàn thành khoá luận này mà cho cả
công việc trong tương lai của em.
Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo Nguyễn Đình Luyện cùng các
thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện

thuận lợi và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2004
Sinh viên:
Bùi Thị Mai Sương
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ
1
PHẦN 1- TỔNG QUAN 2
1.1- Vài nét về sự phát triển của các thuốc chống sốt rét

2
1.2- Nguồn gốc, tính chất của Artemisinin
4
1.2.1- Nguồn gốc 4
1.2.2- Tính chất của Artemisinin 4
1.3- Đại cương về Artesunat 8
1.3.1- Đặc điểm hoá học và vật lý 8
1.3.2- Tác dụng và cơ chế tác dụng 9
1.3.3- Liên quan cấu trúc và tác dụng 10
1.3.4- Dược động học 10
1.3.5- Lâm sàng 11
1.3.6- Tương tác thuốc 12
1.3.7- Độc tính 12
1.3.8- Chế phẩm và cách dùng artesunat trong điều trị 12
1.3.9- Các phương pháp định lượng artesunat 13
1.4- Bán tổng hợp artesunat 14
PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18
2.1- Nguyên vật liệu,thiết bị và phương pháp thực nghiệm

18
2.1.1- Nguyên liệu
18
2.1.2- Thiết b ị 18
2.1.3- Phương pháp thực nghiệm 19
2.2- Kết quả thực nghiệm và nhận xét 23
2.2.1- Khảo sát ảnh hưởng của một số xúc tác đối với phản ứng
bán tổng hợp Artesunat 23
2.2.2- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác đối với thời gian
phản ứng và chất lượng Artesunat

27
2.2.3- Ảnh hưởng của dung môi đến sự tạo thành artesunat

30
2.2.4- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng ester hóa

34
2.3- Bàn luận 36
2.3.1- Cơ chế phản ứng bán tổng hợp Artsunat và ảnh hưởng
của chất xúc tác
36
2.3.2- Ảnh hưởng của dung môi, tỷ lệ xúc tác, nhiệt độ và
thời gian phản ứng 36
2.3.3- Phổ hồng ngoại 38
PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 39
3.1- Kết luận 39
3.2- Đề xuất 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
DHA Dihydroartemisinin
4-DMAP 4- Dimethylaminopyridin
KST Ký sinh trùng
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IR Phổ hồng ngoại
P. Plasmodium
p Tinh khiết
pA Tinh khiết phân tích
ĐẶT VÂN ĐỂ
Việc đưa Artemisinin và các dẫn xuất vào sử dụng là một tiến bộ lớn
trong điều trị sốt rét. Các công trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam cho
thấy nhóm artemisinin khỏi đầu tác dụng nhanh, diệt ký sinh trùng và cắt cơn
sốt cổ hiệu quả. Nhóm thuốc này đã được WHO khuyến cáo sử dụng trong
điều trị sốt rét, đặc biệt ở những vùng có chủng p. falciparum đã kháng
Chloroquin.
Artesunat là một dẫn xuất của Artemisinin được dùng phổ biến và nhiều
nhất hiện nay trong điều trị sốt rét cả trong nước và trên thế giới.
Artesunat đã được bán tổng hợp và đưa vào sản xuất với quy mô công
nghiệp. Tuy nhiên, quy trình tổng hợp Artesunat sử dụng xúc tác pyridin, 4-
DMAP là những chất đắt tiền và độc hại. Việc nghiên cứu tìm ra chất xúc tác
mới góp phần hạ giá thành Artesunat đồng thời giảm độc hại cho quá trình sản
xuất là rất cần thiết. Natri bicarbonat và natri carbonat là những chất kiềm
yếu, có thể được sử dụng làm xúc tác cho phản ứng ester hóa DHA thành
Artesunat. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu bán tổng
hợp Artesunat” với mục tiêu :
1. Bán tổng hợp artesunat với xúc tác NaHC03và Na2C 03.
2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp
artesunat, từ đó tìm ra các điều kiện phản ứng thích hợp để có hiệu
suất cao.

PHẦN 1 - TỔNG QUAN
1.1- VÀI NÉT VỂ Sự PHÁT TRIỂN CỦA CÁC THUỐC CHỐNG SỐT RÉT
Các vị thuốc chữa sốt rét như cây thanh cao hoa vàng, canh ki na đã
được sử dụng từ lâu đời, nhưng mãi tới đầu thế kỷ XIX, những nghiên cứu về
hoá học các thuốc sốt rét mới thực sự bắt đầu.
Năm 1834, Quinin được người châu Âu phân lập và sử dụng. Đây là
thuốc dùng trị sốt rét sớm nhất dưới dạng hoạt chất tinh khiết. Nó chỉ có tác
dụng với thể phân liệt, ít tác dụng với thể giao bào và khá độc.
Năm 1926, Primaquin được tổng hợp ở Đức. Dẫn xuất nhóm
8- Aminoquinolin này có tác dụng diệt thể giao bào và thể ngủ trong gan,
dùng để điều trị tiệt căn, chống tái phát xa với p. vivax.
Năm 1944, Chloroquin, một dẫn xuất thuộc nhóm 4-Aminoquinolin
được tổng hợp. Đây là thuốc chống sốt rét lý tưởng trong nhiều năm, vì vừa có
tác dụng đối với p.falciparum và p.vivax, vừa có thể dùng dự phòng lại ít độc
hơn các thuốc chống sốt rét khác thời đó.
Năm 1948, nhóm thuốc kháng folic ra đời, trong đó Proguanil và
Chloroguanin có tác dụng tốt và ít độc hơn quinin. Năm 1951,
Pyrimethamin được tổng hợp, nó có cùng cơ chế kháng folic nhưng ít độc
hơn. Hiện nay, các thuốc này ít dùng vì đã bị kháng cao. Năm 1972,
Mefloquin được đem vào sử dụng rộng rãi vì ưu điểm diệt thể phân liệt
mạnh và thải trừ chậm.
Cũng vào năm 1972, Artemisinin được phân lập từ cây thanh cao
hoa vàng ở Trung Quốc. Artemisinin có tác dụng rất mạnh trên KST sốt
rét và tác dụng với cả các chủng kháng đa thuốc. Artemisinin được dùng
làm thuốc chữa sốt rét hoặc làm nguyên liệu bán tổng hợp các dẫn xuất
khác, tạo ra một nhóm thuốc điều trị sốt rét có triển vọng [2].
2
Do artemisinin có nhược điểm ít tan trong dầu và trong nước, tỷ lệ tái
phát cao, nên các nhà khoa học đã nghiên cứu bán tổng hợp các dẫn xuất của
artemisinin để cải thiện các đặc điểm dược lý và dược động học.

Phần lớn các dẫn xuất đó đều là ether hoặc ester của DHA. DHA là một
• V
____
*


c
dẫn suất hình thành khi khử hóa nhóm >C=Q carbonyl của artemisinin thành
nhóm >CH ÕỈĨỒ Các dẫn xuất ether, ẹster có chứa những nhóm thân nước
hoặc thân dầu, nên cải thiện được khả năng hoà tan so với artemisinin. Dẫn
xuất tan trong nước điển hình là natri artesunat (muối natri -DHA- hemi
succinat) và natri artelinat (muối natri - P" DHA- hydroxy- methylbenzoat
ether) với hoạt tính chống sốt rét cao hơn artemisinin 2-5 lần. Các dẫn xuất tan
trong dầu là artemether (P~ DHA- methyl ether) và arteether (ị3- DHA-
ethylether) với tác dụng mạnh hơn artemisinin khoảng 2 lần [21,24]. Ngoài ra,
còn có một số dẫn xuất íluoro alkyl ether có hiệu lực cao, đặc tính điều trị tốt
đang được tiếp tục nghiên cứu về hoá học và sinh học [3].
CH,
R
=0
-OH
-O O Ỉ3
-0Q H ,
-0(C=0)(CH2)2C00Na
-OCH2C6H4COONa
Hoat chất
Artemisinin
Dihydroartemisinin
Artemether
Arteether

Natri artesunat
Natri artelinat
3
2.2- NGUỔN GỐC, TÍNH CHẤT CỦA ARTEMISININ
2.2.1- Nguồn gốc
Artemisinin là hoạt chất có tác dụng chống sốt rét được chiết xuất từ
cây thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L. Asteraceae). Cây được trồng
nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam, ngoài ra còn có ở nhiều nơi khác như Ấn Độ,
châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ Hàm lượng Artemisinin trong lá khô từ 0,01-
1,00% phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý, thời điểm thu hái [6,13]. Hàm lượng
Artemisinin cao nhất trong lá ở phần ngọn vào thời điểm trước khi cây ra
hoa[ll].
1.2.2- Tính chất của Artemisinin.
1.2.2.1- Đặc điểm vật lý [20]
- Cấu trúc hoá học:
- Tên khoa học : (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-decahydro-3,6,9-
trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-l ,2-benzodioxepin-10-on.
- Công thức phân tử : C15H220 5
- Nhiệt độ nóng chảy : 151-153°c
- Năng suất quay cực : [a]D20= +66,3° (C=l,64% trong chloroform)
- Tính chất: Artemisinin có dạng tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu
trắng, không mùi, vị đắng, rất ít tan trong nước, dầu; tan trong ethanol, aceton,
rất dễ tan trong chloroform và ethylacetat.
4
1.2.2.2- Các phản ứng hoá học của artemisinin [9,14,23,24]
Artemisinin là một serquiterpen lacton có cầu nối peroxid nội đặc
trưng. Do cầu peroxid là liên kết dễ bị phân huỷ nên artemisinin bị biến đổi
trong các điều kiện khác nhau thành những hợp chất mà đa số không giữ được
khung cơ bản ban đầu. Trong môi trường trung tính, artemisinin khá bền vững.
Trong môi trường kiềm mạnh hay acid mạnh, artemisinin bị mất hoạt tính do

cầu peroxid bị phá huỷ[14].
> Phản ứng với kiềtn
Artemisinin dễ bị phân huỷ bởi kiềm thành các sản phẩm khác nhau.
NaOH loãng
5
Khi cho Artemisinin (1) tác dụng với kali carbonat trong methanol ở nhiệt
độ phòng sẽ tạo ra ester (2), epoxy lacton (3) và một cetoacid (4). Nếu cho tác
dụng với kiềm trong nước sẽ tạo thành pyran (5). Khi tác dụng với kiềm kéo
dài thu được lacton (6). Trong dung dịch kiềm loãng tạo ra hợp chất (7) còn
gọi là Q292, có cực đại hấp thụ ở 292nm [24]. Phản ứng này được áp dụng
trong phép định lượng bằng quang phổ tử ngoại như đo mật độ quang sau khi
thuỷ phân artemisinin bằng NaOH loãng hoặc làm phản ứng trước hay sau cột
trong định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
> Phản ứng vói acid
Phản ứng của artemisinin với acid sẽ tạo ra một hỗn hợp phức tạp các
sản phẩm thuỷ phân và sắp xếp lại phân tử. Artemisinin tác dụng với acid
trong ethanol tạo thành ba hợp chất (8), (9), (10).
ồ
1 8 9 10
> Phấn ứng khử hoá
Phản ứng khử hoá là một trong những phản ứng có ý nghĩa của
Artemisinin vì nó tạo ra nhiều dẫn xuất quan trọng. Với các điều kiện khử hoá
khác nhau, phân tử Artemisinin bị khử ở các nhóm khác nhau, tạo ra nhiều sản
phẩm khác nhau [25].
Khử hoá bằng tác nhân L1A IH 4 tạo ra hợp chất (11), (12).
6
L i A I H j
H O
H O I III,

CH3
h o h 2c '
11
Khi khử hoá Artemisinin bằng hydro với xúc tác Pd/CaC03 thì nhóm
peroxid bị khử thành oxid, tạo thành deoxyartemisinin (13) không còn hoạt
tính chống sốt rét.
Khử hoá artemisinin bằng NaBH4 trong methanol ở nhiệt độ thấp sẽ tạo
ra DHA (14) mà rất ít ảnh hưởng đến nhóm peroxid. DHA là hợp chất trung
gian quan trọng để tổng hợp ra nhiều dẫn xuất khác.
7
Nếu dùng tác nhân khử là hỗn hợp NaBH4 và boron trifluorid
(BF3Et20), nhóm carbonyl bị khử thành nhóm methylen, tạo ra
deoxoartemisinin (15) có hoạt tính chống sốt rét gấp 8 lần so với artemisinin.
1.3- ĐẠI CƯƠNG VỀ ARTESUNAT
1.3.1- Đặc điểm hoá học và vật lý [22]
- Cấu trúc hoá học :
£Hj
- Tên khoa học: (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-decahydro-3,6,9-
trimethyl - 3,12- epoxy- 12H-pyrano[4,3-j]- 1,2- benzodioxepin-10- ol,
hydrogen succinat
- Công thức phân tử : C19H280 8
- Khối lượng phân tử : 384,42
- Nhiệt độ nóng chảy : 132-135°c
- Năng suất quay cực: [oc]D20= +10° -ỉ- +14° (C = 4%trong chloroform)
I - Tính chất: tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu trắng, không mùi,
không vị, rất khó tan trong nước, tan tốt trong dichloromethan, dễ tan trong
ethanol, aceton, chloroform và dung dịch kiềm. Bền vững trong môi trường
trung tính, trong nước dễ bị thuỷ phân đặc biệt là trong môi trường kiềm.
Dạng muối natri dễ tan trong nước, do vậy dùng natri artesunat để pha
dung dịch tiêm.

1.3.2- Tác dụng và cơ chế tác dụng
1.3.1.2- Tác dụng
Artemisinin có tác dụng trực tiếp và nhanh chóng trên invitro cũng như
invivo đối với các chủng Plasmodium, kể cả các chủng đã kháng lại các thuốc
chống sốt rét khác. Thuốc có tác dụng mạnh trên thể phân liệt của KST sốt rét
ở giai đoạn trong hồng cầu. Thời gian làm sạch KST trong máu khoảng 24 giờ,
nhanh hơn so với các thuốc điều trị sốt rét khác. Thuốc không có tác dụng diệt
thể giao bào, nghĩa là không có tác dụng dự phòng [14,16].
Các thí nghiệm trên invivo với p. Berghei ở chuột nhắt trắng và
p. cynomolgi ở khỉ cho thấy hoạt tính chống sốt rét của natri artesunat cao hơn
artemisinin 5 lần khi dùng đường tiêm tĩnh mạch [7].
Kháng thuốc : Hiện tượng KST kháng artemisinin và các dẫn xuất được
quan sát trên invivo và trên súc vật thí nghiệm. Tuy nhiên, trên thực tế lâm
sàng, đến nay chưa thấy p. falciparum kháng lại artemisinin và dẫn xuất. Sự
giảm tác dụng của thuốc chỉ xảy ra khi cùng một bệnh nhân bị nhiều chủng
KST sốt rét tấn công trong những lần nhiễm bệnh khác nhau [2].
1.3.2.2- Cơ chế tác dụng [16,21]
Có nhiều quan điểm khác nhau khi giải thích cơ chế tác dụng của
Artemisinin và các dẫn xuất của nó. Các nhà nghiên cứu Trung Quốc cho
rằng artemisinin tấn công chủ yếu vào màng tế bào KST làm thay đổi cấu trúc
vi mô của màng tế bào. Theo Gu. và cộng sự, tác dụng diệt KST là do các gốc
9
tự do. Gốc tự do tạo ra do cầu peroxid nội phân tử bị gẫy. sắt trong hem và có
thể cả sắt tự do xúc tác quá trình phá vỡ cầu peroxid tạo ra gốc tự do. Gốc tự
do alkyl hoá các phân tử protein màng tế bào KST làm thay đổi hình thái của
ribosome và lưới nội chất, do đó ngăn cản tổng hợp protein của tế bào KST và
tiêu diệt chúng.
1.3.3- Liên quan cấu trúc và tác dụng [16]
Artemisinin tác dụng với acid hoặc kiềm đều tạo thành các sản phẩm
không có hoạt tính chống sốt rét. Các chất chuyển hoá không có nhóm

peroxid như deoxyartemisinin và các sesquiterpen lacton khác được chiết từ
Artemisinin annua L. Asteraceae đều không có tác dụng. Như vậy, nhóm
peroxid vòng là không thể thiếu cho tác dụng chống sốt rét. Nhưng một mình
nhóm peroxid là chưa đủ bởi chất a-santonin, một peroxid vòng được tổng
hợp bởi Tani và cộng sự lại không có tác dụng này.
Trên cơ sở artemisinin và các dẫn xuất là những chất kiềm yếu, như
những chất amin có khả năng tập trung chọn lọc vào không bào tiêu hoá của
KST sốt rét. Vennerstrom đã điều chế ra một loạt các amin peroxid. Những
hợp chất này cũng có chút hoạt tính trên invitro, nhưng không có hoạt tính
trên invivo. Những nghiên cứu sâu hơn về hệ vòng của phân tử còn đưa ra kết
luận rằng sự nguyên vẹn của cấu trúc lập thể là bắt buộc cho hoạt tính chống
sốt rét.
1.3.4- Dược động học [10,17,18]
> Hấp thu
- Đường uống : artesunat được hấp thu và chuyển hóa thành DHA. Cmax của
artesunat trong máu là 197-397 ng.ml'1, Cmax của DHA là 500-928 ng.ml'1
- Tiêm bắp : thời gian đạt nồng độ đỉnh Cmax của DHA nhanh hơn và Cmax
của DHA cao hơn so với đường uống.
10
> Phân bố
Mức độ liên kết với protein huyết tương phụ thuộc vào đối tượng nghiên
cứu. Ở người, artesunat kết hợp với protein huyết tương khoảng 48%.
Artesunat có thể qua hàng rào rau thai nên tránh dùng cho phụ nữ có thai.
> Chuyển hóa
Theo đường uống, phần lớn artesunat bị chuyển hóa lần đầu qua gan
thành dạng có hoạt tính là DHA, nồng độ artesunat trong máu nhỏ hơn nồng
độ dạng chuyển hóa.
> Thải trừ
- Tốc độ thải trừ tăng dần theo thứ tự : đường uống, đường tiêm bắp, đường
tiêm tĩnh mạch.

- Đường tiêm tĩnh mạch artesunat có t1/2= 2,7 phút, dạng chuyển hóa DHA
có t1/2= 40 phút.
- Đường tiêm bắp : artesunat có t|/2= 29 phút, dạng chuyển hóa DHA có
t1/2= 95 phút.
1.3.5- Lâm sàng [12,21]
Natri artesunat là một chất tan trong nước nên có thể sử dụng để
tiêm tĩnh mạch trong các trường hợp sốt rét ác tính, sốt rét thể não hoặc các
trường hợp thể phức tạp.
So sánh điều trị bằng artesunat liều 600mg (6 ngàyxlOOmg) với điều
trị bằng artemisinin liều 3g (6 ngàyx500mg):
- Thời gian cắt cơn sốt của artesunat (18,9 giờ) nhanh hơn artemisinin (21,8
giờ)
- Thời gian sạch ký sinh trùng trong máu của artesunat (26,4 giờ) nhanh hơn
artemisinin (31 giờ).
- Tỷ lệ tái phát 20% bệnh nhân, thấp hơn so với artemisinin (35%).
11
- Thử nghiệm 17 bệnh nhân sốt rét thể não, 15 bệnh nhân đã được chữa khỏi,
ý thức phục hồi đáng kể sau 12 ± 5 giờ.
1.3.6- Tương tác thuốc [5,19,21]
Tác dụng của artesunat bị giảm khi có mặt chất xúc tác thuỷ phân như
catalase hay các chất khử như acid ascorbic, vitamin E, glutathion dạng
khử Tác dụng tăng lên khi có mặt các chất oxy hoá như miconazol,
doxarubicin
Các thuốc chống sốt rét khác như mefloquin, primaquin, chloroquin khi
phối hợp với artesunat cho tác dụng hiệp đồng tăng cường hay hiệp đồng
cộng. Ngược lại, các thuốc như pyrimethamin, sulfamid lại có tác dụng đối
kháng.
1.3.7- Độc tính [4,7,10]
Nghiên cứu trên động vật thí nghiệm cho thấy độc tính của artesunat
thấp hơn nhiều so với các thuốc chống sốt rét thông thường khảc.

- Độc tính cấp : trên chuột nhắt trắng LD50= 1180mg/kg theo đường uống và
LD50= 775mg/kg theo đường tiêm màng bụng.
- Độc tính bán cấp : cho chuột nhắt trắng uống artesunat liều 4mg/kg trong
5 ngày liền, không thấy tổn thương cấu trúc tế bào mô ở gan và thận.
Năm 1994, viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành thử
nghiệm artesunat trên người. Kết quả cho thấy :
- Trên người khoẻ mạnh : không có sự thay đổi về huyết học, sinh hoá, điện
tim trước và sau khi thử. Tại chỗ tiêm không có phản ứng, không đỏ, không
mẩn ngứa.
- Trên bệnh nhân nhiễm p. falciparum không biến chứng : thuốc có hiệu qủa
điều trị, cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng, không ảnh hưởng
đến chức năng gan, thận, hệ tim mạch.
1.3.8- Chế phẩm và cách dùng artesunat trong điều trị [2,5]
♦♦♦ Artesunat có hai dạng bào chế:
12
- Viên nén 50mg.
- Bột pha tiêm : lọ chứa 60mg acid artesunic ở dạng bột vô trùng, kèm ống
tiêm chứa lml dung dịch NaHC03 5% .
Chỉ định : Điều trị cắt cơn sốt rét do p. vivax, p. malarie kể cả sốt rét
do nhiễm p. falciparum đã kháng các loại thuốc khác.
❖ Liều dùng :
- Dạng uống : điều trị mỗi đợt 12 viên trong 5 ngày.
- Dạng tiêm : hoà tan thuốc vào dung dịch NaHCOs 5% cho thêm dung dịch
Glucose đẳng trương để có nồng độ 10 mg/ml.
Trẻ em < 6 tuổi: lmg/kg/lần. Người lớn : 1,2-1,6 mg/kg/lần.
Tuỳ theo từng bệnh nhân, sau 4, 24, 48 giờ nhắc lại một lần.
1.3.9- Các phương pháp định tính, định lượng artesunat
1.3.9.1- Các phương pháp hoá học
> Phương pháp acid - base :
Phân tử artesunat có một nhóm chức acid tự do nên có thể định lượng

trực tiếp artesunat bằng dung dịch NaOH chỉ thị phenolphtalein. Căn cứ vào
lượng kiềm tiêu thụ để tính ra lượng chất thử cần định lượng. Phương pháp
này khá đơn giản, thưòng dùng để định lượng nguyên liệu artesunat.
1 3.9.2- Các phương pháp quang [15]
> Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại:
Artesunat thuỷ phân trong môi trường kiềm, đun nóng tạo ra sản phẩm
Q289 có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 28 nm, do đó có thể định lượng
artesunat trong nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ của sản phẩm
thuỷ phân này trên máy quang phổ tử ngoại ở bước sóng 289nm.
> Phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến :
Nhóm chức ester của artesunat phản ứng tạo hydroxamat sắt (III) có
màu và đo quang dung dịch thu được ở bước sóng 508 nm.
13
I.3.9.3. Các phương pháp sắc ký [15,25]
> Phương pháp sắc ký lớp mỏng :
Phương pháp sử dụng hệ dung môi khai triển phù hợp để tách hỗn hợp
thành các vết riêng rẽ, rồi hiện màu bằng các thuốc thử đặc hiệu. Sau đó quan
sát màu sắc và so sánh Rf của vết thử với vết đối chiếu.
> Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được ứng dụng ngày càng nhiều để
định lượng artesunat.
Cột được dùng trong HPLC chủ yếu là cột pha đảo. Detector thường
dùng là detector u v đo trực tiếp hay dẫn xuất hoá sau cột để tăng độ nhạy.
Ngoài ra, còn có thể dùng detector điện hoá, detector khúc xạ kế.
1.4- Bán tổng hợp artesunat
Artesunat được bán tổng hợp từ artemisinin qua giai đoạn trung gian là
DHA.
1.4.1- Giai đoạn I : Bán tổng hợp DHA [8,14]
Cho đến nay, phương pháp hiệu quả nhất để khử hoá chọn lọc nhóm -
c=0 lacton của artemisinin thành nhóm -OH bán acetal trong DHA là dùng

tác nhân khử NaBH4 trong methanol ở nhiệt độ thấp.
Trên cơ sở phương pháp này, A.Brossi đã điều chế DHA bằng cách cho
một phần artemisinin vào 50 phần methanol ở 0-5° c, rồi cho dần một phần
chất khử NaBH4 vào. Sau khi tinh chế thu được DHA với hiệu suất 79%. TS.
Đỗ Hữu Nghị thực hiện phản ứng theo nguyên tắc trên nhưng giảm 6 lần
lượng chất khử và dung môi, cải tiến phương pháp tinh chế thu được DHA với
hiệu suất trên 90%.
14
1.4.2- Giai đoạn I I : Bán tổng hợp artesunat [9,14]
Các dẫn xuất ester được tổng hợp theo nguyên tắc cho DHA tác dụng
vói tác nhân acyl hóa tương ứng, có mặt xúc tác thích hợp. Tác nhân acyl hoá
có thể là chlorid acid, anhydrid acid hoặc acid carboxylic. Xúc tác cho phản
ứng acyl hóa thường là các amin bậc ba như pyridin, triethylamin, 4-
dimethylaminopyridin hoặc hỗn hợp các xúc tác này.
14 18
X: -Cl, -OH, acyloxy R: aryl, akyl.
Phương pháp cổ điển sử dụng tác nhân acyl hoá là chlorid acid hoặc
anhydrid acid trong môi trường có xúc tác pyridin chỉ thu được kết quả với
số ít ester. Năm 1982, Li.Y. sử dụng 4-DMAP làm xúc tác cho phản ứng
acyl hoá. Đây được coi là phương pháp cải tiến, hiệu qủa thu được khả quan
nhưng có nhược điểm là phản ứng tạo ra sản phẩm phụ gây khó khăn cho
việc tinh chế.
DHA được ester hoá thành artesunat khi cho tác dụng với anhydrid
succinic, xúc tác là một amin bậc ba: 4-dimetylaminopyridin (4-DMAP). Khi
15
sử dụng acid succinic làm tác nhân acyl hóa thì phải dùng hỗn hợp 4-DMAP
và dicyclohexyl carbodiimid (DCC) [14].
T.s. Đỗ Hữu Nghị đã nghiên cứu quy trình bán tổng hợp artesunat từ
DHA và anhydrid succinic sử dụng xúc tác là hỗn hợp pyridin, 4-DMAP và
đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp [9].

¥
16
Sơ đồ qui trình bán tổng hợp Artesunat từ Dỉhydroartemisinin
Pha nước
Pyridin HCl
Na2S04
CH2C12
DHA
ĩ
Hoà tan
~ T Z
Ester hoá
I
Loại pyridin,4-DMAP
7
Gạn
ET
Pha dung môi HC
— T
Cất thu hồi DMHC
— - T
Kết tinh Artesunat
T
CH2C12
Pyridin + 4-DMAP
Anhydrid succinic
Dung dịch HCl 10%
Na2S04 khan
n-hexan
Nước áo

PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả
2.1- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM.
• 7 • • •
2.1.1- Nguyên liệu.
- Dihydroartemisinin đạt tiêu chuẩn Dược điển Quốc tế (Bộ môn Công
nghiệp Dược,Trường Đại học Dược Hà Nội).
- 4-Dimetylaminopyridin (pA), pyridin (pA), acetonitril (pA).
- Artesunat chuẩn thứ cấp (Bộ môn Công nghiệp Dược).
- Các hoá chất: anhydrid succinic, natri carbonat, natri bicarbonat,
p-dimethylaminobenzaldehyd, acid acetic, acid phosphoric (p)
- Dung môi: aceton, ethanol tuyệt đối, ether ethylic, n-hexan, ethyl acetat,
dichloromethan, methanol (p).
2.1.2- Thiết bị.
- Cân điện tử Satorius (Đức)
- Máy khuấy từ Heidolph MR3001(Đức)
- Thiết bị cất quay Bucchi (Thụy Sĩ)
- Tủ sấy điện
- Máy đo năng suất quay cực Metller (Thụy Sĩ)
- Máy đo độ chảy Metller (Thụy Sĩ)
- Máy quang phổ UV-VIS Carry 100-Varian (Úc-Mỹ)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Class-VP (Nhật)
- Bản mỏng sắc ký silicagel G (Merck)
- Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer, Phòng thí nghiêm trung tâm,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
18
2.1.3- Phương pháp thực nghiệm
2.1.3.1- Phương pháp tổng hợp Artesunat
- Bán tổng hợp artesunat bằng phản ứng ester hoá DHA với anhydrid
succinic, xúc tác NaHC03 và Na2C03.
- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dung môi, nồng độ chất xúc tác, nhiệt

độ, thời gian đến phản ứng bán tổng hợp, từ đó tìm ra các điều kiện phản
ứng thích hợp để có hiệu suất cao, chất lượng artesunat tốt.
- Theo dõi phản ứng ester hoá bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đánh giá
nhanh sự hình thành sản phẩm một cách định tính.
- Tinh chế sản phẩm thu được bằng phương pháp kết tinh phân biệt.
- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và đo quang phổ hấp
thụ tử ngoại để định lượng artesunat trong sản phẩm, từ đó tính hiệu suất
phản ứng.
Sản phẩm artesunat được định tính bằng phổ hồng ngoại, sắc ký lớp
mỏng thử tạp chất liên quan, xác định góc quay cực riêng a D20, nhiệt độ
nóng chảy.
2.1.3.2- Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng silicagel G đã được hoạt hóa ở 120° trong 30 phút
- Dung môi khai triển: n-hexan: ethylacetat (6:4)
- Dung dịch thử: chứa lOmg chế phẩm trong lml ethanol (TT)
- Dung dịch đối chiếu (1): chứa 0,1 mg DHA trong lml ethanol (TT)
- Dung dịch đối chiếu (2): chứa 0,05mg DHA trong lml ethanol (TT)
- Hiện màu : phun thuốc thử ( gồm 0,25 g paradimetyl -
aminobenzaldehyd, 50ml acid acetic, 5ml acid phosphoric đặc và 45ml
nước) rồi sấy bản mỏng ở 110°c trong 4-5 phút. Vết DHA và vết
artesunat có màu xanh tím.
*1* Tiến hành thử tạp chất liên quan :
Chấm riêng biệt lên bản mỏng IOịhI mỗi dung dịch trên. Triển khai bản
mỏng đến khi dung môi đi được khoảng 15cm, lấy bản mỏng ra hiện màu và
quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng ban ngày. Bất kỳ vết phụ nào ngoài vết chính
trên sắc ký đồ của dung dịch thử tương ứng vói vết DHA không được đậm
màu hơn vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), ngoài vết chính và
vết tương ứng với DHA, trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được quá một
vết có màu đậm hơn màu của vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2).
❖ Tiến hành sắc ký theo dõi phản ứng ester hóa:

- Dung dịch thử: hỗn hợp phản ứng
-Dung dịch đối chiếu(l):chứa lmg artesunat chuẩn trong lml ethanol (TT)
- Dung dịch đối chiếu (2): chứa lmg DHA trong lml ethanol (TT)
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 1|J.1 mỗi dung dịch trên. Khai triển dung
môi, hiện màu. Quan sát vết DHA và vết artesunat trên sắc ký đồ.
2.1.3.3- Phương pháp định lượng artesunat trong sản phẩm thu được
♦♦♦ Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [22]
- Pha tĩnh : Cột Supelcosil LC18
- Pha động : acetonitril+ dung dịch đệm phosphat pH3 (50:50).
(pha dung dịch đệm phosphat pH3 : hòa tan l,36g KH2P04 vào lOOOml
nước cất, điều chỉnh pH đến 3,0 bằng acid H3PO4)
- Phát hiện : detector uv, ở bước sóng Ằ,=216nm
- Vòng nhận mẫu : 20jnl
- Tốc độ dòng: 2ml/phút
- Dung dịch mẫu chuẩn artesunat và dung dịch mẫu thử artesunat nồng độ
4mg/ml (pha loãng bằng acetonitril).
20