Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của mật gấu

w
BỘYTẾ
TRUỒNG ĐẠI HỌC DUỢC HÀ NỘI
HOÀNG HỒNG ANH
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG
CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA MẬT GÂU
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 1999-2004)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
: TS. Nguyễn Văn Đồng
: Bộ môn Hoá sinh
Thời gian thực hiện : Tháng 2-5/2004
HÀ NỘI, THÁNG 5-2004
nn2. tz
MỜ&@cẢMƠ<ìl
Hoàn thành khoá luận này, trước hết em xin bày tỏ lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Vãn Đồng, người thầy đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ em từ những bước đầu nghiên cứu cho tới khi kết thúc khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên bộ
môn Hoá sinh, bộ môn Dược lý, khoa trữ máu bệnh viện Việt Đức đã tạo mọi
điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá luận.
Trong quá trình nghiên cứu, em còn nhận được sự góp ỷ chân tình, sự
động viên và cổ vũ của GS.TS Nguyễn Xuân Thắng, trưởng bộ môn Hoá
Sinh, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đố.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ của ban giám hiệu, của các thầy cô ở
các bộ môn, thư viện và các phòng ban trong trường đại học Dược Hà Nội
Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2004
Hoàng Hồng Anh
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
[a]D20 Độ quay cực đo ở 20°c, với tia D của Natri.
CDCA Chenodesoxycholic acid.

HMWK High molecular weigh kininogen (kininogen phân tử lượng cao)
PAI-1, PAI-2 Plasminogen activateđ inhibitor-1,2 (yếu tố ức chế hoạt
hoá plasminogen 1,2)
PIVKA Protein induced by vitamin K antagonists
QTĐM Quá trình đông máu
SK Streptokinase
T°c Nhiệt độ nóng chảy
TC3 Tiểu cầu 3
t-PA Tissue plasminogen activator (yếu tố hoạt hoá
plasminogen tổ chức)
UDCA Ursodesoxycholic acid
ƯK Urokinase
VLDL Lipoprotein tỷ trọng rất thấp
Yt Yếu tố
A% % thay đổi so với chứng
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề 1
Phần 1: Tổng quan 2
1.1. Đại cương về mật gấu 2
1.1.1. Đặc điểm và thành phần hoá học

2
1.1.2. Cách lấy và chế biến mật gấu 3
1.1.3. Thử mật gấu 4
1.1.4. Công dụng và cách dùng 5
1.2. Đại cương về chống đông máu và tiêu íibrin 6
1.2.1. Quá trình đông máu 6
1.2.2. Quá trình tiêu íibrin 10
1.2.3. Rối loạn quá trình đông máu và tiêu íibrin

11
1.2.4. Một số thuốc chống đông máu và tiêu íibrin
.
17
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 17
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

17
2.1.1. Nguyên vật liệu 17
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 18
2.2. Kết quả nghiên cứu và nhận xét 22
2.2.1. Tác dụng của mật gấu tới thời gian phục hồi Calci

22
2.2.2. Tác dụng của mật gấu tói thời gian tiêu íibrin 25
2.2.3. Khảo sát tác dụng chống đông máu và tiêu íibrin của mật gấu và
một số mật khác
27
2.2.4. Ảnh hưởng của mật gấu đến thời gian đông máu toàn phần

31
2.3. Nhận xét tổng quát và bàn luận
33
Phần 3: Kết luận và đề xuất 35
Tài liệu tham khảo 36
ĐẶT VẤN ĐỀ
Mật gấu, còn gọi là hùng đởm, tên khoa học là Fel Ursi là vị thuốc quý
đứng đầu trong các loại mật động vật, có vị đắng, ngọt mát, mùi thơm dịu,
tính hàn, không độc, quy vào ba kinh can, tâm, vị. Giá tiị chữa bệnh của mật
gấu đã được biết đến cách đây khoảng hơn 1000 năm ở phương đông. Nhiều

nước Châu Á đã tiêu thụ một số lượng lớn mật gấu từ Ân Độ, Trung Quốc để
làm thuốc. Riêng Nhật Bản đã nhập khoảng 8000 túi mật gấu hàng năm. Ở
Việt Nam, mật gấu cũng được sử dụng làm thuốc từ xa xưa. Tuy nhiên chỉ vài
năm trô lại đây việc sử dụng mật gấu mới trở nên phổ biến. Theo kinh nghiệm
dân gian, mật gấu được dùng để chữa viêm tấy, đau nhức, tụ máu, bầm tím do
ngã hay chấn thương, hoàng đản, mụn nhọt, lở loét Mật gấu có thể hoà vào
nước ấm để uống hoặc pha trong cồn để xoa bóp, có thể dùng riêng hoặc phối
hợp với các vị thuốc khác [15].
Hiện nay, mật gấu được sử dụng rộng rãi có khi lạm dụng để chữa viêm
loét dạ dày, mật và tụy hoạt động kém, sỏi mật, viêm khớp, viêm xoang, đái
đường Tuy nhiên việc sử dụng mật gấu vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian
hoặc theo lời đồn đại mà chưa có sự kiểm chứng. Các tài liệu nghiên cứu về
tác dụng của mật gấu chưa nhiều và còn sơ sài.
Từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện khóa luận "Nghiên cứu tác
dụng chống đông máu của mật gấu" góp phần làm sáng tò cống năng hoạt
huyết, khứ ứ của mật gấu. Để thực hiện mục đích đó khoá luận đã đi sâu
nghiên cứu những nội dung và mục tiêu cụ thể sau:
> Khảo sát ảnh hưởng của mật gấu và một số mật khác tới quá trình đông
máu bằng chỉ số thời gian Howell.
> Khảo sát ảnh hưởng của mật gấu và một số mật khác tới quá trình tiêu
íibrin bằng nghiệm pháp Milstone.
> Khảo sát ảnh hưởng của mật gấu tới thời gian đông máu toàn phần trên
máu thỏ theo phương pháp Milian
1
PHẦN 1
TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ MẬT GẤU
1.1.1. Đặc điểm và thành phần hoá học
1.1.1.1. Đặc điểm [15] [10]
Gấu là loài thú lớn, thân dài có thể đến l,5m; đầu to, mõm dài, tai tròn,

đuôi ngắn, chân có móng to, sắc. Bộ lông đen, rậm và dài, đặc biệt ở ngực có
một khoang (yếm) trắng to, hình chữ V ở gấu ngựa và hình chữ u ở gấu chó.
Có hai loài gấu ở Việt Nam là Gấu ngựa ( Ursus thibetanus G. Cuvier
hoặc Selenarctos thibetanus G. Cuvier) và Gấu chó ( Ursus malayanus Raffles
hoặc Helarctos malayanus Raffles ). Gấu ngựa lớn nhất trong các loài gấu, có
thể nặng đến 150-200kg.
Mật gấu còn nguyên thường là những túi được ép bẹp, có cuống dài. Khi
ép bẹp chiều rộng có thể tới 5-6cm, chiều dài 14-15cm, chiều dày l-2mm, một
mép phẳng, một mép cong trông giống lưỡi dao. Khi cắt túi mật sẽ thấy ở
trong có chất đen nhánh, giữa đám đen có những hạt lổn nhổn màu vàng óng
ánh như hổ phách. Nếm sẽ thấy vị đắng, sau ngọt dính lưỡi. Ngậm lâu sẽ tan
hết trong miệng. Đốt không cháy.
Mật gấu được dùng ở các nước Triều Tiên, Trung Quốc và Việt Nam.
Dược điển Triều Tiên quy định tiêu chuẩn mật gấu như sau: độ ẩm phải dưới
15%, độ tro dưới 7%, tro không tan trong acid chlohydric dưứi 4%.
1.1.1.2. Thành phần hoá học.
Thành phần chủ yếu của mật gấu gồm: acid cholic, và các dẫn chất của
acid cholic: acid chenodesoxycholic (CDCA), acid ursodesoxycholic
(UDCA), cholesterol, sắc tố mật như bilirubin [10].
2
Trong đó UDCA là acid đặc biệt chỉ có trong mật gấu (vào khoảng hơn
20%), bởi vậy mà có chữ “urso” (từ chữ urse=gấu). UDCA có nhiệt độ nóng
chảy 200-204°C, năng suất quay cực +59,0 —» +62,0° (dung dịch 40mg/ml
trong ethanol) nhờ những đặc điểm này có thể dựa vào phương pháp sắc ký
để nhận biết nó, phân biệt với mật của những con vật khác. Cũng trên cơ sở
này mà trong nhân dân lưu truyền các cách thử để nhận biết mật gấu thật và
mật gấu giả [3] [10].
HO'
'OOH
OH

Acid cholic
Acid chenodesoxycholic
Acid ursodesoxycholic
1.1.2. Cách lấy và chế biến mật gấu [10]
Bất cứ mùa nào cũng có thể lấy mật. Có thể ba tháng, sáu tháng hoặc một
năm lấy một lần. Theo kinh nghiệm vào mùa đông mật gấu nhiều hơn, vào
mùa xuân ít hơn nhưng phẩm chất mật lại tốt hơn.
Trước kia muốn lấy mật người ta phải giết gấu, nay có thể lấy dịch mật
bằng cách chọc hút trực tiếp từ túi mật sau khi gây mê gấu và siêu âm túi mật.
Túi mật lấy được phải phơi khô trong mát, sau đó gói kín để vào hộp, để
ở nơi mát. Nếu để ở nơi ẩm có nhiệt độ cao mật gấu sẽ chảy nước.
Dịch mật tưoi hút vào dụng cụ khô, sạch nút kín để ở 0°c. Hoặc pha ngay
vào rượu hoặc cồn.
3
1.1.3. Thử mật gấu
1.1.3.1. Theo kinh nghiệm dân gian [10]
+ Khi nếm lúc đầu thấy có vị đắng, sau ngọt mát và dính lưỡi, ngậm lâu
sẽ thấy tan hết trong miệng. Mật những con vật khác đắng mà không mát,
không dính lưỡi, không bóng, không giòn, mùi tanh khó ngửi. ^
+ Thả vài hạt mật gấu vào bát nước, hạt mật quay tròn rồi chìm xuống
đáy và cho một sợi màu vàng không lan toả ra.
+ Lấy vài hạt mật gấu đốt trên ngọn lửa đèn cồn, hạt mật sủi bọt mà
không cháy.
1.1.3.2. Thử bằng phản ứng hoá học [10]
+ Hoà tan 0,5g mật gấu vào dung dịch Kali hydroxid 5%. Đun sôi, sau
khi hoà tan acid hoá bằng acid chlohydric, rồi lắc với ether ethylic 3 lần, mỗi
lần lOml. Hợp các dung dịch ether lại, dùng nước rửa sạch, bốc hơi hết ether.
Ta sẽ có hỗn hợp CDCA và UDCA. Hoà tan cặn này trong lOml dung dịch
amoniac 12%, rồi thêm lOml dung dịch 10% bari chlorua. Lọc lấy kết tủa, ta
sẽ có muối bari của các acid trên. Thêm lOml dung dịch 10% Natri carbonat

đun nóng để loại bỏ bari. Rồi acid hoá bằng acid chlohydric. Lắc với ether
ethylic 3 lần, mỗi lần lOml ether. Hợp các dung dịch ether lại cất thu hồi
ether. Hòa tan cặn trong ethyl acetat. Để yên cho kết tinh, sau đó lọc lấy tinh
thể CDCA không kết tinh. Để khô, đo độ chảy phải thấy 202°c là độ chảy của
UDCA.
+ Cân thật chính xác 0,5g mật gấu rồi tiến hành như trên, cân ƯDCA
chiết xuất được. Phải được 0,10g tức là trong mật gấu phải có tới trên 20%
UDCA.
4
1.1.33. Phản ứng màu [10]
a. Phản ứng Pettenkofer: Lấy một ít hạt nhỏ tinh thể UDCA hoà tan
trong lml nước cất và một ít saccarose rồi thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc sẽ
thấy xuất hiện màu đỏ rất đẹp.
b. Phản ứng Liberman-Surchard: Hoà tan một hạt tinh thể UDCA
trong 0,5ml chloroform; thêm 0,5ml anhydrid acetic và một giọt acid sulfuric
đặc. Bắt đầu có màu đỏ hồng sau chuyển sang xanh lam và xanh lục.
1.1.4. Công dụng và cách dùng [2]
1.1.4.1. Tính vị: vị đắng, tính hàn
1.1.4.2. Quy kinh: tâm, can, vị
1.1.4.3. Công nàng chủ trị:
- Thanh nhiệt giải độc, dùng cho bệnh do hoả độc dẫn đến mụn nhọt,
sang lở sưng đau, đặc biệt đau do bệnh tri, có thể hoà trong nước nóng rồi bôi.
- Thanh nhiệt giáng hoả, dùng trong bệnh sốt cao dẫn đến co giật, hoặc
bệnh kinh giản, hồi hộp sợ hãi co quắp. Phối hợp với câu đằng, bình vôi .sắc
lấy nước hoà vói mật gấu để uống.
- Thanh can hoả, tan màng mộng ở mắt, dùng khi can hoả mắt sưng đau,
mắt có màng mộng, mật gấu hoà với nước lấy dịch trong nhỏ vào mắt. Trường
hợp viêm gan, hôn mê gan, sắc với nước nhân trần rồi hoà với mật gấu mà
uống.
- Hoạt huyết giảm đau, dùng cho trường hợp sưng tấy ứ huyết đau đớn

do chấn thương, mật gấu hoà vào rượu, xoa và bóp nơi sang chấn.
- Ngoài ra dùng chữa đau dạ dày, khó tiêu
1.1.4.4. Liều dùng
+ Uống: 0,5 - 2g/ngày
+ Nhỏ mắt: mật gấu một lượng bằng hạt gạo mài vói nước đun sôi để
nguội lấy dịch trong nhỏ vào mắt.
5
+ Xoa bóp : dùng dung dịch mật gấu 5g/100ml rượu 35°.
1.1.4.5. Kiêng kỵ
+ Những người đau do hoả uất, trạng thái thực nhiệt không dùng.
+ Không nên dùng liều cao kéo dài, dễ ảnh hưỏng đến trạng thái thần kinh.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỂ CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ TIÊU FIBRIN
1.2.1. Quá trình đông máu [5]
Quá trình đông máu và chống đông máu là hai quá trình phức tạp mà
cả hai cùng xảy ra song song và tiến triển với hai mục đích khác nhau: đông
máu nhằm mục đích cầm máu khi chảy máu và chống đông máu nhằm mục
đích ngăn cản đông máu lan tràn, tiêu cục máu để lưu thông khi mạch đã phục
hồi.
Về phương diện hoá sinh, có thể gọi quá trình đông máu là hệ thống
nhiều phản ứng hoá học để biến íibrinogen (hoà tan trong huyết tương) thành
ílbrin (có dạng sợi không hoà tan). Các íibrin liên kết thành lưới sợi huyết ôm
lấy các huyết cầu tạo thành cục máu đông. Cục máu đông nút vào chỗ mạch bị
tổn thương để chống chảy máu (cùng với các yếu tố co mạch và co sợi huyết).
Khi mạch đã phục hồi thì cục máu đông tiêu đi. Hiện tượng tiêu cục máu
đông là quá trình tiêu íibrin thành những sản phẩm hoà tan dưới tác dụng của
plasmin. Sự hình thành plasmin cũng là một chuỗi các phản ứng phức tạp. Khi
hai hệ thống đông máu và chống đông máu mất thăng bằng thì gây rối loạn
đông máu quá nhanh gây tắc mạch hoặc đông máu quá chậm gây chảy máu.
1.2.1.1. Các yếu tố đông máu [5]
Theo quan điểm hiện đại, quá trình đông máu có sự tham gia của các

yếu tố đông máu (của huyết tương, tiểu cầu và của tổ chức). Hầu hết các yếu
tố đông máu có bản chất là protein (trừ yếu tố rv là Ca**) có vai trò như những
enzym. Bình thường các yếu tố đông máu có trong huyết tương, tiểu cầu và tổ
chức tồn tại ở dạng không hoạt động khi xuất hiện một yếu tố bất thường (chất
ngoại lai, tổn thương mạch ) chúng được hoạt hoá một cách trình tự theo
kiểu bậc thang để cuối cùng tạo thành cục máu đông.
6
Tính chất các yếu tố đông máu
Ký hiêu yếu tố
(Yt)
Tên khác
Nồng
độ trong
huyết
tương
(mg/dí)
Con
đường
đông
máu
(E,I,C)
Nhóm hoá sinh
(1)
(2) (3)
(4)
(5)
Quá trình đông máu
I
Fibrinogen
200-400

c
n
Prothrombin 10 c
Phu thuôc Vta
K
m
Thromboplastin tổ chức
0
E
IV
lon Calci
9-10
EXC
V
Proaccelerin 1
c
VI
vn
Proconvertin
0,05 E
Phu thuôc Vta
K
vm
Yt chống chảy máu A,
đồng Yt tiểu cầu 1
0,01 I
IX
Yt chống chảy máu B,
đồng Yt tiểu cầu 2, Yt
Christmas

0,3 I Phu thuôc Vta
K
X
Yt Stuart-Prower 1 c Phu thuôc Vta
K '
XI
Thromboplastin huyết
tương, Yt chống chảy
máu c
0,5 I Yt tiếp xúc
x n
Yt Hageman
3
I
Yt tiếp xúc
xm
Yt làm vững bền fibrin
1-2 c
Prekallikrein Yt Retcher 5 I Yt tiếp xúc
HMWK
Yt hoạt động nhờ tiếp
xúc
6 I Yt tiếp xúc
Chống đông máu và tiêu Fibrin
Antithrombin
m
Kháng thrombin III
18-30
I
Phu thuôc Vta

K ‘
Protein c
0,4
I,c
Phu thuôc Vta
K '
Protein s
2,3
I,c
Phu thuôc Vta
K
Plasminogen
20-40
c
7
Chú thích : E: con đường đông máu ngoài mạch
I: con đường đông máu trong lòng mạch
C: con đường đông máu chung cả trong và ngoài mạch
Vta: Vitamin
Tên các yếu tố đông máu được ký hiệu bằng chữ số La Mã theo bản danh
pháp quốc tế năm 1954, yếu tố VI hiện không được công nhận nữa, hai yếu tố
mới là Prekallikrein và Kininogen có trọng lượng cao mdi được công nhận
nhưng chưa có số La Mã.
8 yếu tố n, VII, IX, X, XI, XII, XIII, Prekallikrein là những zymogen
nghĩa là những protein có hoạt tính men. 3 yếu tố V, v in và kininogen có
trọng lượng phân tử cao là những đồng yếu tố có tác dụng làm tăng tốc độ
phản ứng , yếu tố I (íibrinogen) là cơ chất
1.2.1.2. Cơ chế đông máu [5] (Hình 1.1)
Theo Howell quá trình đông máu chia thành 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn I: Là quá trình hình thành thromboplastin chất xúc tác cho

quá trình biến đổi prothrombin thành thrombin. Giai đoạn này kéo dài khoảng
5 phút, máu vẫn ở thể lỏng. Trong giai đoạn này các yếu tố xn, XI, IX, X
được hoạt hoá theo phản ứng dây chuyền.
+ Giai đoạn II: Là giai đoạn chuyển prothrombin thành thrombin dưới
tác dụng của yếu tố Xa, Va, IV. Thời gian Quick kéo dài khi thiếu một trong
những yếu tố trên.
+ Giai đoạn ni: Là giai đoạn tạo íibrin từ íibrinogen dưới tác dụng của
thrombin, Ca++, yếu tố xnia.
Phản ứng đầu tiên là íibrinogen mất đi một hay nhiều peptid để tạo thành
fibrin hoạt hoá (íibrin đơn phân) chất này trùng hợp ngay tức khắc nhưng
thuận nghịch thành fibrin đa phân (dạng hoà tan) có phân tử lượng lớn hơn rất
nhiều so với íibrinogen ban đầu. Dưới tác dụng của yếu tố XIII hoạt hoá,
fibrin đa phân
ở dạng sợi đan với nhau thành lưới ôm lấy các huyết cầu tạo
thành cục máu đông.
8
Tiếp xúc
bềmăt __
xn— =^-oxna
(Hageman
factor)
XI—
Hình 1.1: Cơ chế của quá trình đông máu và tiêu íibrin
Cơ chế đông máu
Hệ thống nội mạch
HMWKininogen,Prekallikrein
Hệ thống ngoài mạci
£>XIa
I
cầ2

c>IXa + vm + phospholipid
+2 (Antihaemophilic factor)
Cá — g£

:
ị
Thromboplastin môa— Tổn thương mô
(íactor ní)+
vn (ProconvertinXD
->Xa <”
Antithrombinin
inhibits
Cá2
G>
V
Ngưng kết tiểu cầu
V+Phospholipid
f (yếu tố TC3)
(DProthrombin
Thrombin
(íactorll)
— * — t-'*’
©
(íactorlla)
(S>
]
Tiểu cầu
©
XIII
Cá2

— > Chuyển dạng
Fibrinogen
V te
Fibrin
.

_r>.

> Hoạt hoá
(íactorl)
v

"
x>
0
(íactorla)
Fibrin
bền vĩ
(Ị) Coumarin và dẫn chất (3) Heparin - ức chế sự tạo thànhvà hoạt động của Thrombin (3) Heparin liều thỂ
lực của các chất ức chế các yếu tố X,IV,XI,XII và của plasmi@ Ancrod - ngăn cản Abrinogen thành fibrin không bền Q> Thuốc ức chế k
@ Thuốc thrombolytic - Streptokinase (7) Thuốc thrombolytic - Urokinase (8) Chất kích thích
(9) Chất chống tiêuíibrin :aci<Ếamino caproic, tranexamic
1.2.13. Các chất ức chế đông máu [11]
- Nhóm 1: các chất ức chế của serin protease hay serpin antithrombinlll
(AT ni), đồng yếu tố thứ 2 của heparin (HCII), a l antitrypsin.
- Nhóm 2: hộ thống protein C: gồm 2 protein huyết tương phụ thuộc
vitamin K, Protein c, Protein s và một protein màng thrombomodulin.
1.2.2. Quá trình tiêu fĩbrỉn [5]
Tiêu íibrin là một quá trình diễn ra trong nhiều cơ chế bệnh sinh khác
nhau. Plasmin là men chủ yếu của nhiều cơ chất như íibrin, các thành phần

khác nhau của hệ lưới ngoại bào, một số tiền hormon và tiền tố cytokin, đồng
thời đóng vai trò quan trọng trong các hiện tượng tan cục máu, sửa chữa và tái
tạo mô sinh ung thư, viêm chức năng thực bào, sự làm tổ của phôi
Người ta phân biệt plasminogen thành plasmin bỏi các chất kích hoạt
- Plasminogen
- Sự thoái giáng cơ chất bởi plasmin
1.2.2.1. Các yếu tố tham gia trong hệ thống tiêu ýibrín
- Plasminogen: được tổng hợp ở gan, có trong nhiều tổ chức khác nhau,
là protein đơn chuỗi có 791 acid amin, không bền với nhiệt và pH trung tính.
- Plasmỉn: gồm 2 chuỗi protein nối với nhau bằng cầu nối disulíua, hoạt
động ở pH trung tính phân huỷ cả íibrin, íibrinogen, yếu tố V, vm, xnia
Có nhiều cách hoạt hoá plasminogen thành plasmin nhờ íibrinokinase
trong mô và huyết tương, yếu tố hoạt hoá plasminogen của mô (t-PA:tissue
plasminogen activator), urokinase có trong nước tiểu, streptokinase và
staphylokinase phân lập từ vi khuẩn.
1.2.2.2. Các giai đoạn quá trình tiêu ýĩbrin
Giai đoạn 1: hoạt hoá plasminogen thành plasmin. Tất cả các chất hoạt
hoá đều theo cơ chế cắt liên kết giữa arginin và valin trong phân tử
plasminogen tạo ra 2 chuỗi A và B liên kết nhau bằng cầu nối disulĩua.
10
Giai đoạn 2: Tiêu íibrin, plasmin làm tiêu huỷ íibrin không hoà tan tạo
ra các sản phẩm thoái hoá có trọng lượng phân tử thấp, hoà tan. Plasmin còn
phân huỷ cả íibrinogen (sản phẩm thoái giáng của íibrin và íibrinogen quay
lại ức chế quá trình hình thành íibrin).
1.2.2.3. Các chất điều hoà quá trình tiêu ýỉbrin [11]
- Các chất ức chế sự hoạt hoấ plasminogen 1,2 (PAI-l,PAI-2:
plasminogen activated inhibitor 1,2)
- Các chất kháng plasmin: a 2- antiplasmin, chất ức chế Cl,
glycoprotein giàu histidin, 8-amino caproic acid (EACA), 1-antitrypsin,
antithrombin III

- Các hormon: TSH (kích thượng thận tố) ức chế sự tiêu íibrin.
1.2.3. Rối loạn quá trình đông máu và tiêu fibrin [6]
Quá trình đông máu và quá trình chống đông máu là hai quá trình song
song trong máu, ở trạng thái cân bằng. Khi trạng thái cân bằng bị phá vỡ, gây
nên hiện tượng máu không đông hoặc chậm đông và hiện tượng máu nhanh đông
(quá đông). Nguyên nhân của sự mất cân bằng này rất phức tạp. Cổ thể do mạch
máu, do tiểu cầu, do các yếu tố đông máu và do các yếu tố tiêu íibiin.
1.23.1. Rối loạn sự tạo thành Thromboplastin
Có nhiều yếu tố tham gia sự tạo thành Thromboplastin trong giai đoạn
đầu của quá trình đông máu. Khi thiếu một yếu tố nào đó, thường gây kéo dài
thời gian đông máu, đặc biệt thời gian Howell và ngược lại.
Yếu tố Thromboplastic tiểu cầu ( yếu tố tiểu cầu 3 (TC3) )
Thiếu yếu tố này trong trường hợp giảm tiểu cầu, hoặc trạng thái rối loạn
tiểu cầu. Chẩn đoán dựa vào các xét nghiệm:
> Số lượng tiểu cầu: giảm.
> Thcd gian Quick: bình thường
11
> Thời gian co cục máu: tăng (bình thường 1 -3 giờ)
Ngược lại yếu tố này tăng khi tiểu cầu bị kết dính và phân huỷ. Bình
thường tế bào nội mạc thành mạch có Enzym Prostacyclinsynthetase xúc tác
sự tạo thành prostacyclin (P.G.X) từ prostaglandin ở trong tiểu cầu, làm cho
tiểu cầu kết vón lại ở nội mạc thành mạch. Khi tiểu cầu bị kết vón thì phóng
thích yếu tố làm thúc đẩy quá trình đông máu. Ngoài ra còn có một số yếu tố
khác như : Colagen, ADP, thrombin, kháng nguyên, kháng thể, điện tích âm
đều kích thích tiểu cầu phóng thích yếu tố TC3. Cho nên các thuốc chống kết
vón tiểu cầu được sử dụng để dự phòng biến chứng huyết khối nghẽn mạch và
sự hình thành các mảng vữa xơ động mạch.
Thiếu các yếu tố chống ưa chảy máu
- Thiếu các yếu tố chống ưa chảy máu A (yếu tố vm ) gây nên bệnh
ưa chảy máu A ìà một bệnh di truyền mà nữ là ngưòi mang gen bệnh và nam

là người mắc bệnh. Đây là thể lâm sàng hay gặp nhất.
- Thiếu các yếu tố chống ưa chảy máu B (yếu tố IX). Trên lâm sàng
thể này ít gặp hơn. Bệnh nhân đầu tiên được phát hiện thiếu yếu tố này là
Christmas (1953).
- Thiếu hụt yếu tố c (yếu tố XI) rất ít gặp.
1.2.3.2. Rối loạn sự tạo thành Thrombin
Rối loạn này do các yếu tố n, V, v n gây nên.
- Prothrombin (yếu tố n): thiếu prothrombin thường gặp trong các
trường hợp: thiếu vitaminK mà do hấp thu kém trong viêm loét dạ dày, tắc
mật, ỉa chảy, hoặc do ruột tổng hợp kém (vi khuẩn ruột bị diệt khi dùng nhiều
kháng sinh bằng đường uống). Thiếu prothrombin còn gặp trong thiểu năng
gan hoặc dùng thuốc kháng vitamin K, hoặc do di truyền.
- Thiếu hụt yếu tố V thường gặp trong thiểu năng gan nặng hoặc do di
truyền.
- Thiếu yếu tố v n trong thiểu năng gan dù rất nhẹ, trong hầu hết các
trường hợp thiếu hụt yếu tố II, đặc biệt trong trường hợp thiếu vitamin K.
- Thiếu hụt yếu tố trong trường hợp bẩm sinh.
Sự thiếu hụt 4 yếu tố II,V, VII, X đều có biểu hiện xuất huyết giống
nhau, thctì gian quick kéo dài. Các thuốc ảnh hưởng tới giai đoạn này điển
hình nhất là thuốc kháng vitamin K.
1.2.3.3. Rối loạn sự tạo thành fìbrin
Rối loạn sự tạo thành fibrin thường do 2 yếu tố: fibrinogen và yếu tố
XIII. Thrombin số lượng nhiều hay ít phụ thuộc vào lượng prothrombin.
Nhưng vai trò xúc tác của thrombin với tỉ lệ rất cao (một lượng thrombin xúc
tác cho 105 lượng íibrinogen) cho nên lượng fibrin tạo thành không lệ thuộc
vào số lượng thrombin mà phụ thuộc vào 1 chất kháng - thrombinlll và các
chất đồng tác dụng với nó như Heparin.
Yếu tố fibrinogen:
Thiếu íĩbrinogen máu đông cục không được tốt nhưng thời gian đông
máu vẫn bình thường. Trên lâm sàng máu vẫn đông được khi íibrinogen tụt

xuống lg/1 hoặc 0,5g/l (bình thường là 3g/l). Những trường hợp chảy máu là
do fibrinogen quá ít hoặc không có íibrinogen, thiểu năng gan nặng, thiếu
íibrinogen lúc sinh đẻ hoặc phẫu thuật phổi, tử cung. Ngược lại, íibrinogen
tăng trong viêm khớp cấp hay mãn tính, hoặc trong chấn thương các tổ chức.
Khi có thai, íibrinogen máu cũng tăng.
1.23.4. Rối loạn hệ thống tiêu ýỉbrin
Hệ thống tiêu íibrin được điều hoà bằng sự cân bằng các chất hoạt hoá
và các chất ức chế. Khi cân bằng này bị phá vỡ đều gây nên tai biến.
Nếu chất hoạt hoá tăng sẽ làm cho cơ thể tạo ra quá nhiều plasmin, dẫn
tới cục íibrin bị tiêu nhanh, làm chảy máu lại khi vết thương chưa lành. Mặt
khác các sản phẩm tiêu íibrin lại ức chế quá trình đông máu làm cho chảy
13
máu càng trầm trọng có thể gây tử vong. Trong lâm sàng hay gặp ở các trường
hợp sốc phản vệ, phẫu thuật vùng ngực, sau đẻ khó, thai chết lưu, tắc nước ối.
Nguyên nhân do tế bào các tổ chức: phổi, tử cung, tuyến tiền liệt, tuyến giáp
khi bị huỷ hoại giải phóng rất nhiều íibrinokinase tăng hoạt hoá plasminogen
thành plasmin. Hiện tượng này có thể gặp khi dùng quá liều streptokinase,
urokinase. Lập tức phải ngừng thuốc hay dùng thuốc ức chế sự hoạt hoá
plasminogen (acid 8- aminocaproic)
Ngược lại, khi thiếu các chất hoạt hoá hay tăng các chất ức chế thì gây
hiện tượng chậm tiêu cục íibrin, làm cho máu ở các tổ chức xung quanh vết
thương chậm được lưu thông, sự phục hồi tổ chức chậm hơn. Trong các trường
hợp huyết khối nghẽn mạch cũng có thời gian tiêu íibrin kéo dài. Những
trường hợp này đều phải dùng các chất hoạt hoá plasminogen.
1.2.4. Một số thuốc chống đông máu và tiêu ílbrin [4] [11]
I.2.4.1. Thuốc chống đông máu
+ Thuốc ức chế sự tổng hợp các yếu tố đông máu ồ gan (Yếu tố
II,VII,IX,X): Các kháng vitamin K (dẫn chất 4-hydroxycoumarol, dẫn chất
in d a n -l,3 -d io n ) các chất này cạnh tranh với vitamin K gây ức chế quá trình
chuyển PIVKA (Protein induced by vitamin K antagonists) thành các yếu tố

II,VII, IX, X có hoạt tính. Loại này chỉ có tác dụng in vivo. Các thuốc chính:
dicoumarol, tromesan, warfarỉn, marcoumar, sintrom, phenidion
+ Thuốc ức chế tác dụng của các yếu tố đông máu: Heparin là một
mucopolysaccharid ức chế sự tạo thành và tác dụng của thrombin. Loại này có
tác dụng cả in vivo và in vitro. Heparin tạo phức với gốc lysin của
antithrombin HI thúc đẩy phản úng tạo thành antithrombin-thrombin cuối
cùng thrombin không còn khả năng chuyển íibrinogen thành ílbrin. Phức hợp
này còn ức chế các yếu tố IX, X, XI, XII. Heparin còn có tác dụng chống kết
vón tiểu cầu, ức chế kallikrein. Ngoài ra Heparin hoạt hoá lipoprotein-lipase,
14
làm tăng chuyển hoá chylomicron và Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL),
nên có tác dụng làm giảm triglycerid và VLDL.
+ Thuốc chống kết dính tiểu cầu: Aspirin: ức chế enzym Prostaglandin
cyclo oxygenase của màng tiểu cầu ngăn cản tổng hợp thromboxan A2, là
chất gây giãn mạch và làm kết dính tiểu cầu mạnh. Ngoài ra aspirin còn ức
chế phospho diesterase làm tăng nồng độ AMP vòng, ức chế giải phóng ADP
nội tại, là chất kích thích tiểu cầu phóng thích yếu tố TC3.
1.2.4.2. Thuốc làm tiêu ýỉbrin [4]
Là những thuốc có tác dụng hoạt hoá plasminogen thành plasmin do đó
nhanh chóng hoà tan cục máu đông.
Các thuốc gây tan đông hiện tại chia thành hai nhóm: nhóm thuốc có tác
dụng chọn lọc lên íibrin và nhóm thuốc có tác dụng không chọn lọc lên íibrin.
+ Các thuốc tác dụng không chọn lọc lên Ịibrin: là những thuốc có tác
dụng hoạt hoá plasminogen, cho dù chất này gắn với iĩbrin bên trong cục đông
hoặc tự do trong tuần hoàn, đồng thời gây ra một tình trạng đông toàn thể.
• Urokinase (UK): là một protease phân lập từ nước tiểu người hoặc từ
nuôi cấy tế bào phôi thận người. UK hoạt hoá trực tiếp plasminogen thành
plasmin có sự phối hợp chặt chẽ với yếu tố hoạt hoá plasminogen tổ chức t-
PA. Thời gian bán huỷ của UK ngắn 10-15 phút.
• Streptokinase (SK): phân lập từ môi trường nuôi cấy liên cầu khuẩn p

tan máu nhóm c. SK hoạt hoá plasminogen bằng cách liên kết với
plasminogen với tỷ lệ 1:1 hoặc liên kết với plasmin. SK còn có tác dụng làm
giảm íibrinogen và có tính kháng nguyên. Thời gian bán huỷ của SK là 20’.
+ Các thuốc có tác dụng chọn lọc lên ýĩbrin: là những thuốc có tác dụng
hoạt hoá plasminogen gắn íibrin nằm trong cục đông đơn thuần, các thuốc này
không tạo ra một tình trạng tan đông toàn thể. Gồm các thuốc hoạt hoá
15
plasminogen ở mô (t-PA) như: Alteplase, Duteplase hay Saruplase
(Prouokinase) và Reteplase (r-PA).
1.2.4.3. Một số thuốc đông dược có tác dụng chống đông máu [2]
Theo y học cổ truyền, thuốc hoạt huyết là thuốc có tác dụng lưu thông
huyết mạch, thường dùng trong các trường hợp huyết ứ do sang chấn viêm tắc gây
đau đớn, huyết ứ do kinh bế, sau đẻ, sưng tấy, đau nhức Thuốc được chia thành
2 loại:
+ Thuốc hoạt huyết: có tác dụng hành huyết ở mức độ nhẹ như đương
quy, xuyên khung, đan sâm .loại này dùng đối với các bệnh do huyết mạch
lưu thông kém gây sưng đau.
+ Thuốc phá huyết: Tác dụng hành huyết mạnh hơn như: đào nhân,
hồng hoa, nga truật, tô mộc dùng với các bệnh huyết ứ đọng gây đau đớn
mãnh liệt.
Mật gấu: cũng được dùng trong những trường hợp tụ máu, sưng
đau và cũng như đa số các thuốc đông dược cơ chế tác dụng của mật gấu
chưa rõ.
16
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1.1. Nguyên vật liệu
Dịch mật gấu tươi: được lấy từ gấu ngựa bằng phương pháp chọc hút
trực tiếp sau khi gây mê gấu và siêu âm túi mật, đựng trong lọ sạch nút kín

bảo quản ở 0°c. Pha thành nồng độ 1/40 bằng dung dịch NaCl 0,9% trước
khi dùng.
Dịch mật: lợn, chó, cá trắm, gà, ngan: được lấy từ các động vật trên
khi giết thịt, đựng trong lọ sạch, nút kín, bảo quản ở 0°c. Khi dùng pha thành
các nồng độ cần thiết trong dung dịch NaQ 0,9%.
Huyết tương người: Máu người bình thường (người hiến máu tại bệnh
viện Việt Đức) được chống đông bằng dung dịch Natri citrat 3,8% theo tỷ lệ
lthể tích citrat: 9 thể tích máu, để lắng hoặc ly tâm chậm 500 vòng/phút trong
5 phút lấy huyết tương giàu tiểu cầu hoặc ly tâm 3500 vòng/phút trong 20 phút
để lấy huyết tương nghèo tiểu cầu, dùng ngay.
Máu toàn phần thỏ: lấy từ tĩnh mạch tai thỏ đực, khoẻ mạnh, trọng
lượng từ l,5-2,3kg (vào buổi sáng trước khi ăn) mua tại Viện vệ sinh dịch tễ
Trung Ương
Hoá chất, thuốc thử:
> Dung dịch NaQ 0,9%
> Dung dịch CaCl2 0,1M; 0,025M
> Dung dịch Acid acetic 1%; 0,016%
> Dung dịch đệm Borat pH 7,6
Máy móc, thiết bị:
17
> Máy điều nhiệt Qiíton (Nickel Electro- Anh)
> Máy ly tâm EBA 21 (Hettich Zentrifligen- Đức)
> Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiêm
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.I. Thử tác dụng chống đông máu và tiêu ýibrin của mật gấu
Tác dụng chống đông máu của mật gấu được thực hiện bằng phương
pháp in vitro trên huyết tương ngưòi với hai xét nghiệm:
a. Xác định thời gian Howell theo kỹ thuật Howell
+ Nguyên tắc: Thời gian Howell (còn gọi là thời gian phục hồi Calci)
phản ánh quá trình đông máu nội sinh của huyết tương là thời gian hình thành

sợi íibrin của huyết tương khi thêm ion Ca** [11]
+ Dụng cụ thuốc thử:
> Mật gấu pha thành dung dịch có nồng độ 1/40 trong NaCl 0,9%
> Huyết tương giàu tiểu cầu
> Dung dịch Cad2 0,025M pha ngay trước khi dùng từ dung dịch
Cad20,lM.
> Máy điều nhiệt, máy ly tâm, đồng hồ bấm giây, ống nghiệm, pipet
+ Tiến hành
— Mẫu
Thuốc thử ~ ——
Mẫu chứng Mẫu thử
Huyết tương giàu tiểu cầu (ml)
0,2 0,2
Dung dịch Naơ 0,9% (ml)
0,05
Dung dịch mật 1/40 (ml)
0,05
Lắc trộn đều, ủ 37°C/2 phút
Dung dịch CaCl2 0,025M (ml)
0,2 0,2
Khởi động đồng hồ bấm giây. Lắc trộn đều ghi thời điểm đông
18
b. Xác định thời gian tiêu ýĩbrin theo kỹ thuật Milstone
+ Nguyên tắc: thời gian tiêu íibrin là thctì gian từ khi íĩbrin hình thành
đến khi tan hết trong môi trường không có chất ức chế plasminogen. Việc tủa
Euglobulin bằng cách pha loãng và acid hoá huyết tương đã loại trừ được các
chất ức chế tiêu íibrin ở phần dịch trong làm cho hiện tượng tiêu íibrin trở nên
nhanh hơn. Hoà tan tủa bằng đệm Borat, sau đó thực hiện quá trình tạo íibrin
bằng cách bổ sung ion Calci [11].
+ Dụng cụ thuốc thử:

> Mật gấu pha thành dung dịch có nồng độ 1/40 trong dung dịch
N ad 0,9%
> Huyết tương nghèo tiểu cầu
> Dung dịch acid acetic 0,016% pha ngay trước khi dùng từ dung
dịch acid acetic 1%
> Dung dịch CaCl2 0,025M pha ngay trước khi dùng từ dung dịch
Cad2 0,1M
> Đệm Borat pH=7,6
> Máy điều nhiệt, máy ly tâm, đồng hồ bấm giây, pipet, đũa thuỷ
tinh, giấy lọc, ống nghiệm
+ Tiến hành
~

Mẫu
Thuốc thử "

-
—_____
Mẫu chứng
Mẫu thử Điều kiện
Huyết tương nghèo tiểu cầu (ml)
0,4 0,4
4°c
Dung dịch acid acetic 0,016% (ml)
7,6 7,6 4°c
Nút kín, trộn đều, để 0°c /10 phút, ly tâm 3500vòng/phút ưong 10 phút đổ dịch trong lấy
tủa lau khô miệng ống . Thêm vào tủa
Dung dịch đệm Borat pH =7,6 (ml)
0,4 0,4
Dung dịch NaCl 0,9% (ml) 0,1

37°c
Dung dịch Mật gấu 1/40 (ml) 0,1
37°c
Trộn đều, ủ 37°c trong 2 phút để cân bằng nhiệt
Dung dịch Caơ2 0,025M (ml)
0,4
0,4
37°c
Ghi thòi điểm cục đông hình thành
Ghi thời điểm cục đông tan hoàn toàn
19
2.1.2.2. Khảo sát tác dụng chống đông máu và tiêu Fibrín của mật gấu và
các mật: chó, lợn, gà, ngan, cá trắm.
Thử nghiệm được tiến hành in vitro trên huyết tương người bình thường
vái hai xét nghiệm:
> Chỉ số thời gian Howell theo kỹ thuật Howell [2.2.2.la]
> Chỉ số thời gian tiêu Fibrin theo kỹ thuật Milstone [2.2.2. lb]
2.1.2.3. Ảnh hưởng của mật gấu tới thời gian đông máu toàn phần (Phương
pháp MiUan)
Thử nghiệm được tiến hành in vitro trên máu toàn phần thỏ.
+ Nguyên lý: Xác định thời gian đông của máu toàn phần căn cứ vào sự
xuất hiện những sợi íibrin trong giọt máu đặt trên phiến kính [11].
+ Dụng cụ:
> Kim chủng
> Phiến kính
> Đồng hồ bấm giây
> Bông, cồn
+ Tiến hành:
Mẫu chứng Mẫu thử
Dung dịch NaCl 0,9% (ml)

0,005
Dung dịch mật gấu 1/40 trong NaQ 0,9% (ml)
0,005
Máu toàn phần thỏ
1 giọt 1 giọt
Ghi thời điểm máu đông
20
2.1.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Theo phương pháp thống kê có dùng thông số.
a. Biểu thị trị số trung bình
x±ơ
Trong đó: X là giá trị trung bình
1 £
X = — jr X . n: Số lương phép thử
n ì=i '
Xji giá trị phép thử i
ơ là độ lệch chuẩn
ì
íỊx-xĩ
j= Ị
_________
ĩ7-1
b. Cách tính độ tin cậy t ị trị sốStudent) theo Ưrbrach
+ Tính t để so sánh 2 giá trị trung bình ( áp dụng cho các chỉ số: thời
gian phục hồi Calci, thời gian tiêu íibrin, thòi gian đông máu toàn phần ).
1-ỹ, - ^ Ự - 5^ -
( _
____________
'______________1V »1 + »2
______________

lẺ (^1. - y + ẳ
A — —^

V « J + « 2 - 2
c. Đối chiếu với bảng t-Student rồi phân tích kết quả
> Nếu t lớn hơn giá trị tương ứng với p = 0,05 thì độ tin cậy đạt trên 95%
> Nếu t lớn hơn giá trị tương ứng với p = 0,01 thì độ tin cậy đạt trên 99%
> Nếu t lớn hơn giá tiị tương ứng với p = 0,001 thì độ tin cậy đạt trên 99,9%
21