ảnh hưởng của bổ sung các chủng vi khuẩn bacillus sp. khác nhau trong nuôi tôm thẻ chân trắng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







HUỲNH PHONG ĐẠI






ẢNH HƯỞNG CỦA BỔ SUNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS sp. KHÁC NHAU TRONG NUÔI TÔM THẺ
CHÂN TRẮNG







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2013



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






HUỲNH PHONG ĐẠI






ẢNH HƯỞNG CỦA BỔ SUNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS sp. KHÁC NHAU TRONG NUÔI TÔM THẺ

CHÂN TRẮNG





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN






2013


i
LỜI CẢM TẠ



Cảm ơn các quý Thầy Cô và các anh chị trong Thư viện khoa thủy sản, Trung

tâm học liệu, phòng thí nghiệm phân tích chất lượng nước, Bộ môn Thủy sinh
học ứng dụng – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện
thuận lợi cho trong thời gian làm luận văn.
Xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã dành
thời gian tận tình hướng dẫn, động viên, cung cấp nhiều kiến thức quý báo và
tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn Nguyễn Tấn Cường đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Tôi vô cùng biết ơn gia đình và những người thân của tôi đã chia sẻ, động viên
và dành những gì tốt đẹp nhất cho tôi có được thành công như ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện
Huỳnh Phong Đại

ii
TÓM TẮT

Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và chất thải của tôm đã
được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn và
nghiệm thức đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Mục đích nhằm theo dõi và
đánh giá chất lượng nước, vật chất hữu cơ trong ao có bổ sung vi khuẩn
Bacillus. Các chỉ tiêu chất lượng nước như nhiệt độ, pH, DO, COD, TSS,
TAN và tổng độ kiềm. Mẫu được thu trước khi bổ sung vi khuẩn, thu định kì 5
ngày/lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm (60 ngày). Phương pháp thu và phân
tích mẫu dựa theo phương pháp chuẩn (APHA, 2005), đang được áp dụng tại
phòng phân tích chất lượng nước, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ.
Kết quả sau 12 đợt thu mẫu cho thấy các yếu tố như nhiệt độ, pH, tổng độ
kiềm ít biến động và nằm trong khoảng cho phép. Các yếu tố khác như DO,
COD, TSS, TAN có sự biến động giữa các nghiệm thức và có xu hướng tăng

về cuối thí nghiệm. Tuy nhiên vẫn ở mức thích hợp cho tôm nuôi. Mật độ tổng
vi khuẩn và Vibrio ở nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn luôn thấp hơn nghiệm
thức không bổ sung vi khuẩn. Tỉ lệ sống của tôm nuôi thí nghiệm đạt cao ở
nghiệm thức B2 (70.0±5.3%) và nghiệm thức B41 (86.7±3.1%), khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng (65.3±3.1%).
Từ khóa: chất lượng nước, chế phẩm vi sinh, tổng vi khuẩn, Vibrio,
Bacillus, tôm thẻ chân trắng.

iii
MỤC LỤC
MỤC LỤC iii
CHƯƠNG 1 v
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2Mục tiêu của đề tài: 2
1.3 Nội dung của đề tài: 2
1.4 Thời gian thực hiện đề tài: 2
CHƯƠNG 2 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình nghiên cứu các dòng vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong nuôi trồng thủy
sản 3
2.2 Khái quát về vi khuẩn Bacillus và tôm thẻ chân trắng 4
2.2.1 Vi khuẩn Bacillus 4
2.2.1.1 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản 4
2.2.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản 4
2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản 7
2.3.1 Sơ lược về probiotic 7
3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản 8
2.4 Sự siến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi thuỷ sản. 9
2.4.1 Nhiệt độ 9

2.4.2 pH 9
2.4.3 TSS 9
2.4.4 Oxy hòa tan (DO – Dissolved Oxygen) 10
2.4.5 Tiêu hao oxy hóa học (COD – Chemical Oxygen Demand) 10
2.4.6 Ammonia tổng cộng (TAN - Total Ammonia Nitrogen) 10
2.4.7 Độ kiềm tổng cộng 11
CHƯƠNG 3 12
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1 Vật liệu nghiên cứu 12
3.1.1 Thiết bị và dụng cụ 12
3.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi 12
3.1.3 Nguồn vi khuẩn, tôm thẻ chân trắng, bể composite và nguồn nước. 12
3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

iv
3.2.1 Bố trí thí nghiệm 13
3.2.2 Phương pháp pha loãng mẫu 13
3.2.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn 14
3.2.4 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước 14
3.2.5 Phương pháp xác định mật độ tổng vi khuẩn Bacillus 14
3.2.6 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm 13
3.2.7 Tính tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm. 15
3.3 Phương pháp thu và phân tích các chỉ tiêu 15
3.4 Phương pháp tính toán và xử lí số liệu 16
CHƯƠNG 4 17
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
4.1. Biến động một số chỉ tiêu môi trường nước 17
4.1.1. Nhiệt độ 17
4.1.2. pH 17
4.1.3. Tổng độ kiềm 18

4.1.4. Tổng vật chất lơ lửng (TSS) 19
4.1.5. Sự biến động Oxy hòa tan (DO) 20
4.1.6 Tiêu hao oxy hóa học (COD) 20
4.1.7. Tổng đạm amon (TAN) 21
4.2. Biến động một số vi khuẩn trong nước 22
4.2.1. Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus 22
4.2.2. Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio 23
4.2.3. Biến động mật độ tổng vi khuẩn 24
4.3. Tốc độ tăng trưởng về chiều dài và trọng lượng của tôm 25
4.3.1. Trọng lượng 25
4.3.2. Tỉ lệ sống tôm nuôi 26
4.4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 27
4.4.1.Kết luận 27
4.4.2 Đề xuất 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

v
DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Phương pháp thu và phân tích các chỉ tiêu 16
Hình 4.1 Sự biến động nhiệt độ trong ngày của các nghiệm thức 17
Hình 4.2 Sự biến động pH trong ngày của các nghiệm thức 18
Hình 4.3 Sự biến động của độ kiềm tổng cộng trong thời gian thu mẫu 19
Hình 4.4 Sự biến động của tổng vật chất lơ lửng trong thời gian thu mẫu 20
Hình 4.5 Sự biến động của oxy hòa tan trong thời gian thu mẫu 20
Hình 4.6 Sự biến động của COD trong thời gian thu mẫu 21
Hình 4.7 Sự biến động của TAN trong thời gian thu mẫu 22
Hình 4.8 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong nước 23
Hình 4.9 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước 24
Hình 4.10 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước 25

Hình 4.11 Tốc độ tăng trọng lượng của tôm 26
Hình 4.12 Tốc độ tăng chiều dài của tôm 26
Hình 4.13 Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng trong thí nghiệm 27

vi
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

NT1: Đối chứng (không có bổ sung vi khuẩn)
NT2: B2 (bổ sung Bacillus chủng B2)
NT3: B41 (bổ sung Bacillus chủng B41)
TCBS: Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar
NA: Nutrient Agar

1
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu
Trong gần hai thập kỉ qua nuôi trồng thủy sản đã phát triển mạnh mẽ theo
hướng thâm canh hóa. Năng suất và sản lượng thủy sản không ngừng gia tăng,
đến trên 52 triệu tấn (2008), tăng trên 4 lần so với thập kỉ 80 (FAO, 2010).
Hậu quả của thâm canh hóa làm dịch bệnh lan rộng và gây tổn thất lớn đến
nghề nuôi tôm. Sự lạm dụng kháng sinh dẫn đến sự hình thành các vi khuẩn
kháng thuốc và tăng mức độ ô nhiễm môi trường. Ngoài ra, dư lượng kháng
sinh tích tụ trong các sản phẩm cũng ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu
dùng.
Trong những năm gần đây, chế phẩm vi sinh đang được sử dụng rộng khắp
trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên hiệu quả vẫn chưa được đánh giá đầy đủ
nhất là hiệu quả kinh tế (Vũ Ngọc Út, 2011). Ngoài ra các chế phẩm vi sinh có
mặt trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc nội địa với chất lượng không ổn

định và giá thành cao làm ảnh hưởng đến lợi nhuận của người nuôi. Vì vậy,
cần nghiên cứu và lựa chọn các dòng vi khuẩn hữu ích là rất cần thiết trong
nuôi trồng thủy sản, hạn chế sự ô nhiễm của môi trường, thúc đẩy và tăng
cường sự bền vững của nghề nuôi.
Trong những năm gần đây, việc ứng dụng vi sinh trong nuôi tôm thâm canh và
bán thâm canh đang phát triển mạnh và rất cần thiết trong nghề nuôi tôm
thương phẩm hiện nay. Với mục đích tạo môi trường tốt cho tôm sinh trưởng
và phát triển, giảm bệnh tật, hạn chế sử dụng một số hóa chất và thuốc kháng
sinh trong nuôi tôm. Ngoài ra, còn làm giảm các độc tố trong ao xuống mức
thấp nhất (chủ yếu NH
3
và H
2
S), cải thiện màu nước, ổn định pH, cân bằng hệ
sinh thái trong ao, phân hủy tối đa các chất hữu cơ trong ao và làm giảm độ
nhớt của nước, phòng tảo nở hoa và hấp thu nguồn tảo chết trong ao …
Với tầm quan trọng ngày càng được nâng cao thì việc đảm bảo chất lượng con
giống và tăng sản lượng nuôi là vấn đề cấp thiết. Đặc biệt, vấn đề về môi
trường nuôi tôm đang gặp nhiều khó khăn do môi trường ngày càng bị ô
nhiễm. Vi sinh vật hữu ích đóng vai trò quan trọng trong xu thế hiện nay,
chúng cải thiện môi trường nước, phân hủy chất hữu cơ, chuyển hóa các khí
độc như NH
3
, NO
2
… sang các dạng không độc khác (Vũ Thế Trụ, 2011).
Ngoài ra khi bổ sung vi sinh vật hữu ích, nhất là giống Bacillus vào ao nuôi
các chỉ tiêu thủy lí, hóa, sinh được cải thiện rõ rệt. Vi khuẩn Bacillus sp là một
trong các nhóm vi khuẩn nhiều nhất trong chế phẩm vi sinh, nó có vai trò quan

2
trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng
sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và enzyme (Ferarri et al., 1993).
Để đánh giá hiệu quả xử lí môi trường cũng như tác động lên chất lượng tôm
thẻ nuôi của các dòng vi khuẩn Bacillus được phân lập trong ao nuôi tôm sú
thâm canh, một nghiên cứu được thực hiện trong bể nuôi tại khoa Thủy Sản
nhằm “Xác định sự ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus sp lên tôm thẻ
chân trắng”.
1.2Mục tiêu của đề tài:
Đánh giá khả năng cải thiện môi trường và kháng Vibrio của các chủng vi
khuẩn Bacillus sp. trong bể nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).
1.3 Nội dung của đề tài:
Xác định ảnh hưởng của ba dòng vi khuẩn Bacillus sp lên khả năng cải thiện
môi trường dựa trên các chỉ tiêu chất lượng nước và so sánh với bể không bổ
sung Bacillus sp.
Xác định sự biến động của tổng vi khuẩn, tổng Vibrio và vi khuẩn Bacillus sp.
trong bể nuôi tôm thẻ trên môi trường Nutrient Agar (NA) và Thiosulphate
Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS).
Xác định tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng khi được bổ
sung vi khuẩn vào môi trường sống.
1.4 Thời gian thực hiện đề tài:
Từ tháng 09/2013 đến tháng 12/2013 tại Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng,
Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ.

3
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu các dòng vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong nuôi
trồng thủy sản
Khuất Hữu Thanh (2009), Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm,
Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ
sinh học hoàn thiện chế phẩm Bio-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm
trong nuôi tôm sú thâm canh từ năm 2008 đến 2010. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
và ctv. (2010), nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vi sinh vật hữu ích nhằm nâng
cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú. Các sản phẩm này đã được thử
nghiệm các trại giống tôm sú ở Ninh Thuận. Tại Khoa Thủy Sản, trường Đại
Học Cần Thơ, các tác giả Phạm Thị Tuyết Ngân và Nguyễn Hữu Hiệp (2010)
đã phân lập và chọn lọc được 9 chủng vi khuẩn Bacillus từ ao nuôi tôm sú
thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng. Trong đó một số chủng đã được thử nghiệm và
đánh giá hiệu quả xử lí nước đạt kết quả cao trong phòng thí nghiệm (Phạm
Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú , 2010).
Nghiên cứu của Graslund et al. (2003) cho thấy 86% người nuôi tôm Thái Lan
sử dụng vi sinh vật hữu ích để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao nuôi.

Moriarty et al. (2005) đã tổng kết vài kết quả nghiên cứu ứng dụng Bacillus
trong nuôi tôm đã đạt hiệu quả tốt. Ví dụ: ở Indonesia và Philipphines, năng
suất ao nuôi tôm luôn cao và ổn định cho tất cả các ao sử dụng Bacillus đúng
kĩ thuật trong khi đó các ao không sử dụng Bacillus gặp thất bại do tôm bệnh
(Moriarty, 1998 và 1999). Trong năm 2004, trong 3 ao nuôi tôm ở Teknomin,
Andra Pradesh, Ấn Độ, có sử dụng chế phẩm vi sinh trộn vào thức ăn sau 115
ngày nuôi tôm sú đạt 34g với tỉ lệ 25% , trong đó ở ao đối chứng chỉ đạt 25g.
Balcazar et al. (2007) tìm thấy Bacillus subtilis UTM 126, là dòng vi khuẩn
hữu ích có ảnh hưởng tốt trên tôm nuôi do khống chế được V.
parahaemolyticus. Trong các trại giống và ao nuôi tôm thịt, Ziaei-Nejed et
al.,(2006) cũng kết luận rằng hệ số chuyển hóa thức ăn, tốc độ tăng trưởng
tuyệt đối và năng suất nuôi trong ao có sử dụng hỗn hợp chế phẩm vi sinh gồm
5 loài Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. polymyxa, B. laterosporus và
B. corculans) cao hơn đối chứng. Gulliana et al.,(2004) cũng cho biết Bacillus
P64, phân lập từ gan tụy của tôm tự nhiên thu từ ao ở Manglarato, Ecuador, có
tác dụng ngăn ngừa được bệnh ở tôm.


4
2.2 Khái quát về vi khuẩn Bacillus và tôm thẻ chân trắng
2.2.1 Vi khuẩn Bacillus
2.2.1.1 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản
Giống Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham
gia tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại
enzyme ngoại bào. Bacillus được tìm thấy gần 500 loài, là vi khuẩn hình que,
gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, tất cả đều hình
thành nội bào tử. Do sự đa dạng sinh thái và loài nên các hoạt chất của chúng
cũng rất phong phú. Triển vọng ứng dụng Bacillus trong nhiều lĩnh vực đời
sống, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Khả năng sinh các
enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của

vi sinh vật gây bệnh (Vibrio) giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng là
đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này.(Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010)
2.2.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản
Cải thiện sức khỏe
Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa
Cung cấp dinh dưỡng trực tiếp: một số nghiên cứu trên các đối tượng nuôi
thủy sản như: luân trùng, Artemia, nhuyễn thể, ấu trùng giáp xác, cá… cho
thấy Bacillus đã trực tiếp cung cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi đặc biệt là
acid béo và vitamin. Một nghiên cứu khác trên cá hồi chấm hồng Bắc cực
(Salvelinus alpinus L) kết quả cũng cho thấy vi khuẩn có thể đã có vai trò
quan trọng trong quá trình dinh dưỡng của cá. Nghiên cứu tương tự trên tôm
thẻ trưởng thành (Penaeus chinensis) cho thấy hệ vi sinh vật đã cung cấp
nguồn dinh dưỡng và là nguồn thức ăn trực tiếp cho tôm. Vì vậy, ứng dụng vi
khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản thường cho kết quả cao về tỉ lệ sống,
tăng trưởng và hiệu quả kinh tế.
Hỗ trợ tiêu hóa: vài loài vi khuẩn đã được nghiên cứu trên động vật hai mảnh
vỏ cho thấy vi khuẩn còn góp phần hỗ trợ tiêu hóa do chúng sản sinh các
enzyme như proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn.
(Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010)
Tăng cường các phản ứng miễn dịch
Vi khuẩn có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Một nghiên cứu
sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow trout), kết
quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng
hoạt động thực bào của bạch cầu. Nghiên cứu khác của Rengpipat et al. (2000)

5
trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi
ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã tiết ra các chất làm tăng đáp ứng cả
miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcaszar (2003) chứng
minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V.

harveyi và virus đốm trắng. Nghiên cứu của Hadi Zokaei et al. (2009) trộn B.
subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ
sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B. subtilis cũng tăng nhanh
trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm. (Phạm Thị Tuyết Ngân,
2010)
Cải thiện môi trường
Phân hủy các chất thải:
Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như carbonhydrate, chất béo và đạm
thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất hữu
cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm. Bacillus có tác dụng làm giảm COD,
H
2
S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi. Do nhóm vi khuẩn Bacillus là vi
khuẩn vi khuẩn gram (+) thường phân hủy vật chất hữu cơ thành CO
2
tốt hơn
nhóm gram (-). Urê và axit uric có trong thành phần chất thải của động vật
nuôi thủy sản. Quá trình amôn hóa urê trải qua 2 giai đoạn, urê sẽ bị thủy phân
tạo thành muối carbonate amôn. Ở giai đoạn 2, carbonate amôn chuyển hóa
thành NH
3
, CO và H
2
O. Axit uric bị các vi sinh vật phân giải thành urê và acid
tactronic. Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH
3
. Bacillus tham gia
trong quá trình amôn hóa protein là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ
chứa nitơ, giải phóng NH
3

. Ban đầu protein bị phân cắt thành pepton,
polypeptid oligopeptid, dipeptid và acid amin. Một phần axit amin sẽ được tế
bào Bacillus hấp thu làm chất dinh dưỡng, phần khác sẽ thông qua quá trình
khử amin tạo thành NH
3
và nhiều sản phẩm trung gian khác tùy theo điều
kiện. Sản phẩm cuối cùng chủ yếu của quá trình vô cơ hóa hiếu khí protein là
ammonia, carbonic, các muối của acid sulfuric và acid phosphoric.
Giảm chất độc NH
3
, H
2
S:
Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bên
cạnh NH
3
và CO
2
còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như acid hữu
cơ, rượu, H
2
S và những dẫn suất của nó như mecaptan, các chất độc như
diamin và tomain, indon và scaton. Đây là lý do người nuôi luôn phải duy trì
hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao luôn cao để đảm bảo quá
trình phân hủy hữu cơ xảy ra hoàn toàn. Ứng dụng Bacillus trong trường hợp
này làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ tránh đáy ao, làm giảm các chất dư

6
thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy ao. (Phạm Thị Tuyết
Ngân, 2010).

Ức chế tác nhân gây bệnh
Tiết ra kháng sinh
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn có thể tiết vào môi trường chất
có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh
khác. Mục đích gián tiếp là cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong
môi trường. Nghiên cứu của Stein et al. (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh
chất kháng sinh của B. subtilis đã được ghi nhận hơn 50 năm qua. Hiện nay tác
giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn B. subtilis có khả năng tiết ra hơn 20
chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau. Bao gồm: subtilin, ericin, mersacidin,
sublancin Hầu hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ
hay ra môi trường nước làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn cơ hội gây ức
chế các vi sinh vật gây bệnh. Các chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn
lẻ hoặc kết hợp nhau.
Cạnh tranh dinh dưỡng
Sự cạnh tranh chủ yếu xảy ra ở nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cạnh tranh cơ chất
hữu cơ, là nguồn carbon và năng lượng. Những nghiên cứu liên quan đến lĩnh
vực này chưa nhiều. Rico-Mora et al. (1998), đã đưa một dòng vi khuẩn có
khả năng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ. Cấy vi khuẩn này vào bể
nuôi tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus, kết quả Vibrio không phát triển.
Điều này chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh tranh lấn át Vibrio trong điều
kiện nghèo hữu cơ. Verschuere et al. (1999) đã chọn lọc vài dòng vi khuẩn có
ảnh hưởng tốt đến tỉ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia để làm thí
nghiệm. Những vi khuẩn này được đưa vào môi trường nuôi Artemia sau khi
nước nuôi đã được lọc sạch. Kết quả cho thấy chất kìm hãm được tiết ra môi
trường có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh V. proteolytics CW8T2. Vì
vậy, những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng
lượng và chất dinh dưỡng.
Cạnh tranh chất sắt
Tất cả các vi sinh vật đều cần chất sắt cho sinh trưởng (Reid et al., 1993). Hiện
tượng siderophores là hiện tượng vi khuẩn tiết ra chất kết tủa các ion sắt có

trọng lượng phân tử thấp trong môi trường. Các vi sinh vật này sẽ hấp thu các
phân tử Fe kết tủa này và làm mất Fe trong môi trường. Các vi sinh vật gây
bệnh cần nhiều sắt để tăng trưởng, do vậy dẫn đến hiện tượng cạnh tranh Fe

7
của vi sinh vật trong thủy vực, kết quả làm hạn chế mầm bệnh trong môi
trường (Neilands et al., 1981; Wooldridge et al., 1993).
Tóm lại, các chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus có thể góp phần làm
giảm rủi ro do dịch bệnh nhờ vào khả năng giúp cải thiện sức khỏe của tôm cá,
cải thiện môi trường và ức chế tác nhân gây bệnh trong ao nuôi.
2.2.2 Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Litopenaeus vannamei (Bone 1931)
Tôm Litopenaeus vannamei (Bone 1931) vỏ mỏng có màu trắng đục nên có
tên là tôm Bạc, bình thường có màu xanh lam, chân bò có màu trắng ngà nên
gọi tôm chân trắng.
Ở vùng biển tự nhiên, tôm chân trắng thích nghi sống nơi đáy là bùn, độ sâu
khoảng 72 m, có thể sống ở độ mặn trong phạm vi 5-50‰, thích hợp ở độ mặn
nước biển 28-34‰, pH = 7,7-8,3, nhiệt độ thích hợp 25-32
o
C, tuy nhiên chúng
có thể sống được ở nhiệt độ 12–28
o
C.
Tôm thẻ chân trắng là loài ăn tạp giống như những loài tôm khác. Song không
đòi hỏi thức ăn có hàm lượng đạm cao như tôm sú.
2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản
2.3.1 Sơ lược về probiotic
“Probiotic là hổn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động
có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự

do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường
giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề
kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của
môi trường sống” (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007).
Probiotic bao gồm những vi khuẩn có lợi (vi sinh vật hữu ích) và trong thủy
sản hầu hết những sinh vật này là vi khuẩn lactic acid (Lactobacillus
Carnobacterium…), giống Vibrio (Vibrio alginolyticus), giống Bacillus (B.

8
subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. polymyxa,…), Actinomycetes,
Nitrobacteria…được áp dụng trong các bể ương nuôi, trong ao để hạn chế sự
nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh (Xiang-Hong et al., 1998; Lê Đình
Duẩn và ctv, 2007). Cũng theo nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv. (2007)
một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp các
enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase,
chitinase, một số vitamin thiết yếu và chất khoáng. Ngoài ra, trong các chế
phẩm sinh học giúp xử lý nước và nền đáy ao thường bổ sung thêm các chủng
nấm sợi và xạ khuẩn (thuộc nhóm Aspergillus, Streptomyses ).
Theo Nair et al. (1985) vi khuẩn lactic acid và một số nhóm vi khuẩn khác có
khả năng tiết ra chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila
và Vibrio parahaemolyticus. Sử dụng các nhóm vi khuẩn có lợi phân lập từ
ruột cá bơn (Scophthalmus maximus) trong ao nuôi có thể kìm hãm vi khuẩn
V.anguillarum gây bệnh (Olsson et al., 1992), điều này chứng tỏ nhóm vi
khuẩn có lợi đã cạnh tranh có hiệu quả với nhóm vi khuẩn gây bệnh (Phạm
Thị Tuyết Ngân, 2007).
Nghiên cứu của Xiang-Hong et al. (1998) cũng cho biết một số vi khuẩn hữu
ích có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo. Tác giả còn cho biết
thêm những vi khuẩn có lợi trong nước sẽ loại trừ nhanh NH
3
, H

2
S, vật chất
hữu cơ có hại. Ngoài ra, chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi.
Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh
vật hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Verschuere et al. (2000) đã nghiên cứu
và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến
chất lượng nước, do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật
chất hữu cơ thành CO
2
. Vì vậy, Bacillus sp. giúp giảm tích lủy chất hữu cơ và
các chất hòa tan (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007).
3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản
Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn
chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể
khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là
biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al.,
1998). Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm
sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học
không những làm tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn
định môi trường nước mà còn tăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng.

9
Theo Vijayabaskar et al. (2008) ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà
cụ thể là nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế
mầm bệnh do vi khuẩn A.hydrophila gây ra.
Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippine, khi việc sử
dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho
vi khuẩn kháng thuốc, mà xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh
đến con người nếu sử dụng quá liều lượng. Vì lý do đó mà probiotic được ứng
dụng rộng rãi cho nghề nuôi tôm ở Philippine, nghiên cứu cho thấy rằng có thể

cứu sống 80% tôm bệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học
(Moriarty et al., 1999). Nhiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sịnh
học trong nuôi thủy sản cho kết quả rất khả quan, không chỉ cải thiện chất
lượng nước, giảm lượng dùng kháng sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có
thể nâng cao năng suất nuôi và chất lượng của sản phẩm (Xiang-Hong et al.,
1998). Probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi thủy sản. Nhưng việc
sử dụng Probiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản chất của các vi
sinh vật có ích và đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi (Balcaszar et al.,
2006).
2.4 Sự siến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi thuỷ sản.
2.4.1 Nhiệt độ
Trong các ao nuôi nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh
tổng hợp các chất hữu cơ cho cơ thể sinh vật, cũng như vai trò phân huỷ của vi
sinh vật và trao đổi chất của tôm nuôi. Theo Whetstone et al. (2002) tôm có
thể sống tốt ở nhiệt độ 23-34
o
C tối ưu là 26 - 29
o
C nhưng không thay đổi quá
5
o
C trong ngày (Boyd et al., 2003).
2.4.2 pH
Theo Chanratchakool et al. (1995) thì pH của nước rất quan trọng, ảnh hưởng
trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi. pH thích hợp cho tôm nuôi 7.50 - 8.35
và khoảng dao động hằng ngày không vượt quá 0.5 đơn vị pH.
Nguồn nước có độ pH từ 7,5-8,5 là điều kiện tối ưu để vi khuẩn nitrate hóa
tăng trưởng. Khi giá trị pH > 8,5 vi khuẩn Nitrobacter có thể bị ức chế
nhiều hơn Nitrosomonas làm cho nitrite được tích lũy (Briggs et al., 1994).
Nitrite được chuyển hóa thành Nitrate nhờ vi khuẩn Nitrobacter (Soon et al.,

1999). Từ những kết quả trên có thể nhận định pH thích hợp nuôi trồng
thủy sản nói chung là từ 6-9 và riêng nuôi tôm thẻ từ 7,5-8,5 là phù hợp nhất
(pH tốt nhất nên gần bằng 8,0).
2.4.3 TSS

10
TSS biểu thị vật chất lơ lửng trong nước làm hạn chế quá trình quang hợp của
thực vật thủy sinh do cản trở khả năng xuyên ánh sáng vào nước, làm giảm
hàm lượng oxy hòa tan trong nước. Trong ao nuôi tôm nếu độ đục được thể
hiện bởi sinh lượng của phiêu sinh vật thì đây là một yếu tố có lợi, trong khi
đó độ đục được biểu thị bởi vật chất lơ lửng, hạt sét thì sẽ gây bất lợi
cho tôm nuôi (Hargreaves et al., 1999). Theo Boyd et al. (2002) thì độ đục tốt
cho ao nuôi dao động từ 40-100 ppm nhưng không dao động quá 10%. Trong
thực tế ao nuôi thì độ đục thường tăng dần về cuối vụ, chúng chịu tác động của
các yếu tố nội tại như sục khí (quạt nước) hay do bên ngoài tác động (sóng
gió) làm xói lở thành ao hay nguồn nước cấp và thức ăn dư thừa theo thời gian
(Hargreaves et al., 1999).
2.4.4 Oxy hòa tan (DO – Dissolved Oxygen)
Oxy hòa tan trong nước lý tưởng cho tôm là trên 5 ppm (Swingle, 1969 được
trích bởi Lê Bảo Ngọc, 2005) và không được vượt 15 ppm (Whetstone et al.,
2002). Theo nghiên cứu của Summerfelt (1996) thì hàm lượng oxy hòa tan
vào trong nước chịu sự chi phối bởi nhiệt độ, nhiệt độ càng tăng thì hàm lượng
oxy bão hòa trong nước càng giảm. Nếu nhiệt độ nước ở 10°C thì hàm lượng
oxy bão hòa là 11,3 ppm, khi nhiệt độ tăng lên ở 25°C thì hàm lượng oxy bào
hòa giảm xuống 8,5 ppm.
Nghiên cứu tốc độ tiêu thụ oxy hòa tan cho thấy sự hô hấp của quần thể sinh
vật đáy có thể dễ dàng tiêu thụ từ 2-3 ppm oxy hòa tan trong nước ao trong
vòng 24 giờ (Boyd, 1998). Wang et al. (2000) nghiên cứu sự phân phối oxy
trong ao cho thấy có 70% lượng oxy tiêu hao cho các sinh vật đáy, sự oxy hóa
các hợp chất hữu cơ và chỉ có 20% lượng oxy tiêu tốn cho quá trình hô hấp

của tôm.
2.4.5 Tiêu hao oxy hóa học (COD – Chemical Oxygen Demand)
Theo TCVN 5943 (1995), nước sử dụng cho nuôi trồng thủy sản phải nhỏ hơn
35 ppm, trên 35 ppm được xem là ô nhiễm và dưới 10 ppm là nghèo dinh
dưỡng. Kết quả thí nghiệm của Briggs và Fung-Smith (1994) khi nuôi tôm ở
mật độ 20 con/m
2
, 30 con/m
2
, 75 con/m
2
thì hàm lượng COD lần lượt là 18,7
ppm, 27,6 ppm và 39 ppm. Ngoài ra còn cho thấy càng về cuối vụ thì hàm
lượng COD trong nước ao nuôi càng tăng.
2.4.6 Ammonia tổng cộng (TAN - Total Ammonia Nitrogen)
Nồng độ NH
3
được coi là an toàn cho ao nuôi là 0,13 ppm (Chen et al., 1998).
Trong ao nuôi tôm thì hàm lượng NH
3
phải nhỏ hơn 0,1 ppm được xem là
thích hợp (Whetstone et al., 2002). Các hợp chất vô cơ hòa tan quan trọng của
nitơ là NH
3
, NH
4
+
, NO
3
−

và NO
2
−
. Trong đó NH
3
và NO
2
−
độc đối với các loài

11
động vật thủy sinh còn NH
4
+
và NO
3
−
là nguồn dinh dưỡng tốt mà thực vật
thủy sinh dễ hấp thu nhất tạo nên các hợp chất hữu cơ trong thủy vực. Ngoài
ra, NH
3
và muối của nó sẽ biến thành dạng đạm Nitrite (NO
2
−
) và Nitrate
(NO
3
−
) nhờ vi khuẩn Nitrite và Nitrate hóa. Tuy nhiên NH
3

được cung cấp
trong các thủy vực từ quá trình phân hủy bình thường các protein, xác bã
động thực vật, sản phẩm bài tiết của động vật hay từ phân bón vô cơ và hữu
cơ, trong đó nguồn NH
3
chủ yếu từ sự bài tiết trực tiếp của động vật thủy sinh
(Chen et al., 1992; 1998). Theo Adhikari et al., (2003) cho rằng NH
3
trong
khoảng 0,02-0,05 ppm là tối ưu cho ao nuôi thủy sản, trong môi trường nước
mặn NH
3
và NO
2
−
ít gây độc cho tôm, việc xử lý Formalin có thể làm giảm độ
độc của NH
3
và việc bón phân là phương pháp tốt nhất làm giảm độc tính của
Nitrite trong ao nuôi (Adhikari et al., 2003; Limsuwan et al., 1997).
2.4.7 Độ kiềm tổng cộng
Tổng hàm lượng base trong nước tính bằng mg/L của CaCO
3
là tổng độ kiềm.
Base trong nước bao gồm: hydroxid, ammonia, borate, phosphate, silicate,
bicarbonate và carbonate, nhưng hầu hết nước trong ao, bicarbonate và
carbonate cao hơn các base khác . Tổng độ kiềm trong nước có nguồn gốc từ
sự hòa tan của đá vôi trong đất, vì vậy hàm lượng tổng độ kiềm được xác định
đầu tiên qua tính chất của đất. Ao ở vùng đất cát thường có tổng độ kiềm nhỏ
hơn 20 mg/L, trong khi ao ở vùng đất đá vôi có tổng độ kiềm lớn hơn 100

mg/L. Mức độ dinh dưỡng của nước ao tăng với sự gia tăng tổng độ kiềm ít
nhất 150 mg/L. Tuy nhiên ao nuôi có tổng độ kiềm trên 20 mg/L có thể năng
suất cá và động vật thủy sinh khác cao. Nếu độ kiềm dưới 20 mg/L cần phải
bón vôi. Ở ao nuôi tôm thì tổng độ kiềm thích hợp trong khoảng 80-120 mg/L.













12
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Thiết bị và dụng cụ
Chuẩn bị 9 bể composite có thể tích 100L
Máy đo pH và nhiệt độ
Máy sục khí
Hóa chất cố định mẫu
Hóa chất phân tích mẫu
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Và một số dụng cụ khác.

3.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi
NaCl, K
2
HP4, clorine, muối trung hòa Na
2
S
2
O
3

Môi trường chuyên biệt cho Bacillus, môi trường NA, glucose…
Và một số hóa chất khác dùng trong phòng phân tích chất lượng nước
tại Khoa Thủy Sản – Trường Đại học Cần Thơ
3.1.3 Nguồn vi khuẩn, tôm thẻ chân trắng, bể nuôi và nguồn nước.
Nguồn vi khuẩn: Hai chủng Bacillus B2 và Bacillus B41 đã được phân lập tại
khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ. Hai chủng vi khuẩn phân lập được bố trí
vào bể tôm thẻ chân trắng.
Tôm thẻ chân trắng: tôm được mua từ trại giống tại Cần Thơ, mua về nuôi
trong bể cho đến khi tôm đạt trung bình 1 g/con thì bố trí thí nghiệm. Tôm
được đo chiều dài và cân 20 con trước khi bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu
nhiên. Tôm được xử lí bằng formol ở nồng độ 30mg/L khoảng 15-30 phút
trước khi bố trí thí nghiệm. Mật độ thả 0,5 con/lít.
Nguồn nước biển 100‰

có nguồn gốc từ Vĩnh Châu, Sóc Trăng được pha với
nước máy đạt độ mặn 16‰. Nước được xử lí bằng clorine với nồng độ
30mg/L, sau đó tiệt trùng bằng Na
2
S
2

O
3
và sục khí trong khoảng 12-24 giờ.
Sau đó kiểm tra lại bằng PDP trước khi cho nước vào bể bố trí.

13
Bể composite 100 lít đã được xử lí đúng kĩ thuật. Bể được bố trí trong phòng
kín, theo hệ thống hở, được sục khí liên tục.
3.2 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm
Tôm được cho ăn 4 lần/ngày bằng thức ăn công nghiệp Grow Feed vào lúc 06
giờ, 11giờ, 16 giờ và 21 giờ. Bể được xiphong 2 lần/ngày vào sáng và chiều.
Chạy máy sục khí trong suốt quá trình thí nghiệm, mỗi bể 1 viên đá sục khí.
Nước được thay định kì 30 ngày/lần, thay với 1/3 lượng nước trong bể và bổ
sung cho đạt 100 lít.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng ngày 1 tháng 10 đến ngày 30 tháng 12
năm 2013 tại Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần
Thơ.
Thí nghiệm được tiến hành với 3 nghiệm thức: Nghiệm thức 1 ( ĐC) – không
cấy vi khuẩn, nghiệm thức 2– cấy vi khuẩn Bacillus chủng B2, nghiệm thức 3
– cấy vi khuẩn Bacillus chủng B41. Mật độ cấy là 10
6
CFU/mL/nghiệm thức.
Thí nghiệm được tiến hành trong 9 bể composite 100 lít đã được sát trùng
bằng clorine trước khi bố trí thí nghiệm. Nước được bơm vào bể với thể tích
100 lít. Mật độ thả tôm 0,5 con/lít. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên.
Trong suốt quá trình thí nghiệm, các chỉ tiêu chất lượng nước (nhiệt độ, pH,
TSS, COD, TAN và độ kiềm tổng cộng), tỉ lệ sống của tôm và mật độ vi

khuẩn được theo dõi. Đối với pH và nhiệt độ được kiểm tra 2 lần/ngày (6 giờ
và 15 giờ); TSS, COD, TAN và độ kiềm tổng cộng kiểm tra định kì 5
ngày/lần. Sau mỗi lần kiểm tra, nếu độ kiềm tổng cộng thấp thì dùng NaHCO
3
để nâng kiềm ở mức ổn định.
Mẫu vi khuẩn được thu trước khi bổ sung vi khuẩn, định kì 5 ngày thu mẫu
một lần cho đến kết thúc thí nghiệm.
3.3.2 Phương pháp pha loãng mẫu
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (0,9%) đã tiệt trùng ở
121
o
C trong 20 phút để pha loãng mẫu.
Dùng pipet rút 1ml dung dịch nuôi vi khuẩn được bố trí trong các ống nghiệm
cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dụng nước muối sinh lý (0,9%) đã chuẩn
bị sẵn, ta được độ pha loãng 10
-1
. Từ ống nghiệm 10
-1
, lắc đều dung dịch trong

14
ống nghiệm, dùng pipet rút 1ml chuyển sang ống chứa 9ml nước muối sinh lý
khác, lắc đều dung dịch ta được độ pha loãng 10
-2
, tiếp tục pha loãng đến độ
pha loãng thích hợp.
3.3.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn
Ba chủng vi khuẩn vi khuẩn Bacillus B2 và Bacillus B41 được phục hồi trên
môi trường NA. Các chủng này sau đó được tiếp tục nuôi tăng sinh bằng môi
trường glucose. Sau khi nuôi tăng sinh, mật độ vi khuẩn được xác định bằng

phương pháp đo OD ở bước sóng 600nm.
3.3.4 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước
Chuẩn bị trước khi thu mẫu
Hệ thống ống nhựa PVC, nhiệt kế, ống falcon tiệt trùng…Các ống nghiêm
chứa 9ml nước muối sinh lý tiệt trùng (121
o
C trong 15-20 phút).
Môi trường NA + 1,5% muối NaCl, TCBS và môi trường chuyên biệt cho
Bacillus.
Phương pháp thu mẫu
Mẫu nước được thu bằng ống fancol tiệt trùng, thu mẫu cách mặt nước khoảng
20-30cm. Sau đó trữ lạnh ngay ở 4
o
C và tiến hành phân tích trong vòng 2 giờ.
3.3.5 Phương pháp xác định mật độ tổng vi khuẩn Bacillus
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (0,9%) đã tiệt trùng ở
121
o
C trong 20 phút để pha loãng mẫu.
Dùng pipet rút 1ml dung dịch nuôi vi khuẩn được bố trí trong các ống nghiệm
cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dụng nước muối sinh lý (0,9%) đã chuẩn
bị sẵn, ta được độ pha loãng 10
-1
. Từ ống nghiệm 10
-1
, lắc đều dung dịch trong
ống nghiệm, dùng pipet rút 1ml chuyển sang ống chứa 9ml nước muối sinh lý
khác, lắc đều dung dịch ta được độ pha loãng 10
-2
, tiếp tục pha loãng đến độ

pha loãng thích hợp.
Sau khi pha loãng, để nhiệt kế vào một ống nghiệm khác có chứa nước. Sau đó
để vào tủ sấy 80ºC trong 10 phút rồi lấy các ống nghiệm ra (Nguyễn Lân
Dũng, 1983). Sau đó, dùng micropipete hút 100µL dung dịch huyền phù vi
khuẩn cho vào các đĩa chứa môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus rồi
dùng que thủy tinh tán đều đến khi mẫu khô. Ủ ở 28ºC trong 24 - 48 giờ. Sau
khi ủ, xác định mật số như cách đã trình bày ở trên. Hoặc kiểm tra số khuẩn
lạc trên đĩa môi trường (dao động từ 20-200 khuẩn lạc) và tính trung bình của
môi trường đó.

15
Mật độ vi khuẩn tính theo công thức:
Đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU/mL) = số khuẩn lạc * độ pha
loãng * 10
3.2.6 Tính tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm.
Tốc độ tăng trưởng của tôm
Trước khi bố trí thí nghiệm 20 con tôm được cân ngẫu nhiên, tính được trọng
lượng trung bình (Wi). Khi kết thúc thí nghiệm cân ngẫu nhiên 20 con tôm
trong mỗi ngiệm thức (Wf). Tốc độ tăng trưởng trọng lượng được tính theo
công thức sau: Tăng trưởng = Wf – Wi
(Wf: khối lượng cuối, Wi: khối lượng đầu).
Tỉ lệ sống của tôm
Tỉ lệ sống của tôm được xác định khi kết thúc thí nghiệm bằng công thức: Tỉ
lệ sống(%) = số cá thể cuối / số cá thể đầu *100
3.3 Phương pháp thu và phân tích các chỉ tiêu
Tất cả các chỉ tiêu môi trường được phân tích theo phương pháp chuẩn
(APHA, 2005), đang được áp dụng tại phòng phân tích chất lượng nước, khoa
Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. Mẫu nước được thu cách mặt nước
khoảng 20-30 cm. Sau đó, mẫu được trữ lạnh ngay ở 4
o

C và phân tích trong
vòng 2 giờ.
Các chỉ tiêu như nhiệt độ, pH, đều được ghi nhận trước khi tiến hành thu mẫu.
Các chỉ tiêu thủy hóa (DO, COD, TAN, độ kiềm tổng cộng) được thu cùng
thời điểm với thu mẫu vi sinh, trước khi bổ sung vi khuẩn.











16
Bảng 3.1 Phương pháp thu và phân tích các chỉ tiêu
Chỉ tiêu
Chu kì theo
dõi
Giờ thu mẫu
Phương pháp phân
tích
Môi trường nước
Nhiệt độ
2 lần/ngày
6h – 15h
Máy đo
pH

2 lần/ngày
6h – 15h
Máy đo
TSS
5 ngày/lần
7 – 8 giờ sáng
Cân trọng lượng
(lọc, sấy 105
o
C)
Oxy hòa tan
(DO)
5 ngày/lần
7 – 8 giờ sáng
Winkler
COD
5 ngày/lần
7 – 8 giờ sáng
Hoàn lưu kín
TAN
5 ngày/lần
7 – 8 giờ sáng
Indophenol Blue,
Phenate
Độ kiềm
tổng cộng
5 ngày/lần
7 – 8 giờ sáng
Chuẩn độ acid
3.4 Phương pháp tính toán và xử lí số liệu

Các số liệu thu thập được tính toán và thống kê mô tả bằng phần mềm Excel.
Số liệu được so sánh thống kê ANOVA một nhân tố và phép thử DUNCAN
bằng chương trình SPSS. Mức ý nghĩa thống kê (0,05).

17
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Biến động một số chỉ tiêu môi trường nước
4.1.1. Nhiệt độ
Nhìn chung nhiệt độ trong ba nghiệm thức dao động từ 28-28,67. Nhiệt độ
giữa các nghiệm thức không có sự biến động là do các nghiệm thức được bố
trí trong phòng kín nên nhiệt độ biến động không đáng kể giữa ngày- đêm và
cùng chịu sự chi phối của nhiệt độ từ môi trường bên ngoài vào là như nhau.
Theo Whetstone et al. (2002) tôm có thể sống và sinh trưởng tốt ở nhiệt độ từ
25-30
o
C. Theo Chanratchkool et al. (1995) nhiệt độ cao hơn 33
o
C hay thấp
hơn 25
o
C thì có khả năng bắt mồi của tôm giảm 30-50%, tôm sẽ giảm hoạt
động tạo điều kiện cho mầm bệnh phát triển. Theo Boyd et al. (2002) chênh
lệch nhiệt độ ngày đêm không quá 5
o
C trong ngày được xem là tối ưu cho tôm
nuôi. Như vậy nhiệt độ trong thí nghiệm này là phù hợp cho sự phát triển của
tôm.
20

21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1 2 3
Nghiệm thức
Nhiệt độ (oC)
Sáng
Chiều

Hình 4.1 Sự biến động nhiệt độ trong ngày của các nghiệm thức
4.1.2. pH
Nhìn chung pH ở các nghiệm thức biến động không đáng kể qua các lần thu
mẫu. Các nghiệm thức có xu hướng tăng nhẹ vào giữa thời gian thí nghiệm.