nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG








PHAN THỊ BÍCH NGỌC



NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE
TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ


Luận văn tốt nghiệp đại học
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM






Cần Thơ, 12/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE
TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ




Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGs.Ts. Nguyễn Văn Mười Phan Thị Bích Ngọc
MSSV: 2101943
Lớp Công nghệ Thực phẩm K36


Cần Thơ, 2013
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -i-
LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Phan Thị Bích Ngọc
với sự hướng dẫn của PGs. Ts. Nguyễn Văn Mười. Các số liệu và kết quả trình
bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm
theo đây, với đề tài “Nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú” đã được

hội đồng chấm luận văn thông qua.

Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013
Người hướng dẫn Người viết


Nguyễn Văn Mười Phan Thị Bích Ngọc














Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -ii-
LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
Thầy Nguyễn Văn Mười và cô Trần Thanh Trúc, những người đã trực tiếp hướng
dẫn, giúp đỡ em tận tình. Đồng thời cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận
lợi cũng như giải đáp những thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cô Nguyễn Thị Hoàng Minh, cán bộ phòng thí nghiệm D006 đã tạo điều kiện thuận

lợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình.
Chân thành cám ơn sự giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các Thầy Cô ở Trường
Đại học Cần Thơ, đặc biệt là Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Anh Trần Bạch Long – học viên Cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 19, anh
đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ em tận tình về kiến thức cũng như
phương pháp học tập, nghiên cứu.
Các bạn bè thân yêu và thầy cố vấn học tập kính mến của lớp Công nghệ thực phẩm
khóa 36 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập
bên nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu đề tài.
Các anh chị và các bạn thực tập cùng phòng thí nghiệm D006 đã giúp đỡ rất nhiều
trong quá trình nghiên cứu đề tài.
Con cảm ơn cha mẹ, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành
trang cho con bước vào đời.
Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học
Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại
trường.
Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công.
Em xin chân thành cảm ơn.
Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013
Sinh viên thực hiện


Phan Thị Bích Ngọc
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -iii-
TÓM TẮT

Đề tài tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng trích ly protease từ
mẫu thịt đầu tôm sú – sản phẩm phụ của ngành chế biến tôm đông lạnh. Ảnh hưởng

của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly, điều kiện pH của môi trường, đặc
biệt là tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận
protease từ thịt đầu tôm sú đã được khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng với
cấu trúc có tâm. Kết quả khảo sát cho thấy, dịch chiết protease thu được từ thịt đầu
tôm sú có hoạt tính tối ưu là 13,48 U/g CKNL (chất khô nguyên liệu) khi sử dụng
dung dịch đệm glycine - NaOH với pH 9 làm dung môi trích ly với tỷ lệ nguyên liệu
và dung môi là 1: 4 (w/v). Việc áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng đã xác định
được điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu lần lượt là 46 °C và 44,6 phút.
Từ khóa: nhiệt độ, pH, protease, thịt đầu tôm sú, thời gian, tỉ lệ dung môi.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -iv-
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
TÓM TẮT iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH vi
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii
Chương 1 TỔNG QUAN 1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2
Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 THỊT ĐẦU TÔM SÚ - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME
PROTEASE 3
2.1.1 Tôm sú – nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu 3
2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta 5
2.2 KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN 6
2.2.1 Tổng quan về protease 6

2.2.2 Hệ serine protease 8
2.2.3 Protease của tôm sú 10
2.2.4 Khả năng ứng dụng protease 11
2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA VIỆC TRÍCH LY PROTEASE TỪ TẾ BÀO ĐỘNG
VẬT 13
2.3.1 Lý thuyết chung 13
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme 14
2.4 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY THÍCH
HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM) 16
2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH LY VÀ
ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT 17
2.5.1 Nghiên cứu trong nước 17
2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 17
Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 19
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 19
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 19
3.1.3 Hóa chất sử dụng 19
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.2.1 Nguyên liệu 20
3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu 20
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -v-
3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú 20
3.2.4 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 20
3.2.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 21
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22
3.3.2 Xác định thành phần hóa lý và hoạt tính protease ban đầu có trong thịt đầu tôm 22
3.3.3 Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ mẫu và dung môi trích ly protease từ thịt đầu tôm sú

phù hợp 23
3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả trích ly
protease 24
3.3.5 Thí nghiệm 3: Xác định tương tác của nhiệt độ và thời gian ủ đến hiệu quả trích ly
protease 26
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1 THÀNH PHẦN HÓA LÝ CƠ BẢN CỦA THỊT ĐẦU TÔM 29
4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NGUYÊN LIỆU VÀ DUNG MÔI ĐẾN QUÁ TRÌNH
TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ 30
4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC ĐIỀU CHỈNH pH MÔI TRƯỜNG ĐẾN HIỆU QUẢ
TRÍCH LY PROTEASE 31
4.4 ẢNH
HƯỞNG
CỦA TƯƠNG TÁC NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN
HIỆU QUẢ THU NHẬN PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ 32
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38
5.1 KẾT LUẬN 38
5.2 ĐỀ NGHỊ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix
PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiii
PHỤ LỤC 3 SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSINE xix
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -vi-
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon 4
Hình 2.2 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease 6
Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase 7
Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay 8

Hình 2.4 Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 8
Hình 2.5 Hình dạng các gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 9
Bảng 3.1 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả được sử dụng 20
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 24
Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 25
Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 28
Hình 4.3 Ảnh hưởng của các thừa số khảo sát (tương tác đơn, tương tác đa) đến quá trình
trích ly protease từ thịt đầu tôm sú 34
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thời gian đến hoạt tính của enzyme
protease được chiết tách 35
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của
enzyme protease được chiết tách 36
Hình 4.6 Đồ thị tương quan giữa họat tính protease xác định bằng thực nghiệm và tính toán
theo phương trình hồi quy 36
Hình PL1 . Đường chuẩn Tyrosine xx
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -vii-
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú 5
Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay 7
Bảng 3.1 Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm 27
Hình 4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu và dung môi đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu
tôm sú 30
Bảng 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ứng với dung môi đến hiệu quả trích ly protease 32
Bảng 4.3 Ảnh
hưởng
của các nhân tố mã hóa đối với
phương

trình hồi quy 33
Bảng PL1 Xây dựng đường chuẩn nồng độ tyrosine ix
Bảng PL2 Phương pháp xác định lượng tyrosine trong mẫu x
Bảng PL3 Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn tyrosine xix
Bảng PL4 Số liệu xây dựng đường chuẩn tyrosine xix

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -viii-
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

CCD Central Composite Design
CKNT Chất khô nội tạng
CKTĐT Chất khô thịt đầu tôm
CPE Chế phẩm enzyme
DC Dịch chiết
DFP Diisopropyl Fluoridate Phospho
Đvtn Đơn vị thí nghiệm
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EMS Early Mortality Syndrome
HLSO Head Less Shell On
IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology
LysNA Lys-β- Naphthylamide
PMSF Phenyl Methane Sulfonyl Flouride (PMSF)
SBTI Soya Bean Trypsin Inhibitor
RSM Response Surface Methods
TCA Trichloacetic acid
U/g Units per weight (gam) of substrate
U/mL Units per volume (mL) of substrate
VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers
W/v Weight/volume

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác đã và đang là
một trong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Hiện nay, các
nước phát triển đang áp dụng các chế phẩm enzyme trong sản xuất để tạo ra những
sản phẩm có năng suất và chất lượng cao với giá thành hạ (Saurel, 2003;
Suutarinenn và Autio, 2004; Ngô Tiến Hiển, 2001). Việt Nam là nước giàu tiềm
năng về nông sản, nhu cầu các loại enzyme phục vụ trong chế biến thực phẩm là
rất lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam hoàn toàn không có xưởng sản xuất chế phẩm
enzyme, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại một khối lượng lớn những loại
enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b).
Protease là enzyme thủy phân có giá trị thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% tổng
lượng enzyme công nghiệp được cung cấp trên thị trường thế giới (Joo và Chang,
2006) với nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông
nghiệp, mỹ phẩm và đặc biệt trong y học hiện hiện đại (Joo và Chang, 2006 ; Nedra
et al., 2011). Hơn thế nữa, các nghiên cứu ứng dụng protease gần đây đã chỉ ra vai
trò tích cực của việc sử dụng các protease trung tính và đặc biệt là protease ưa kiềm
trong việc tầm soát các bệnh liên quan đến sự nghẽn mạch do sự đông tụ của fibrin
(Phan Thị Bích Trâm et al., 2007) hay ứng dụng trong thủy phân protein, làm mềm
thịt (Heu và Kim, 2002), thủy phân tạo dịch trích protein từ phụ phẩm cá

(Prasertsan và Prachumratana, 2013), khử protein trong phụ phẩm tôm, giúp quá
trình chiết tách chitin, chitosan đạt hiệu quả tốt (Nedra et al., 2011). Chính điều này
đã mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú,
giúp tận dụng triệt để lượng phụ phẩm của tôm trong quá trình chế biến và tăng hiệu
quả kinh tế cho ngành thủy sản nói chung, ngành xuất khẩu tôm nói riêng.
Với tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình chế biến khoảng 34% khối lượng
ban đầu (Tran et al., 2011), trung bình hàng năm Việt Nam có khoảng 35.000 ÷
46.000 tấn đầu tôm được thải ra từ các nhà máy. Hiện nay, lượng đầu tôm chủ yếu
dùng làm phân bón, thức ăn gia súc, thủy sản. Tuy nhiên giá trị thành phẩm của
các sản phẩm này chưa cao. Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm
trong thời gian gần đây là một hướng mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu
tôm phụ phẩm, đây được xem như là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể
sử dụng như thực phẩm mà không hề ảnh hưởng đến môi trường chung quanh
(Trung et al., 2003). Tuy nhiên, việc sản xuất chitosan đòi hỏi phải loại bỏ lượng
thịt trong đầu tôm (chiếm đến 15,25% khối lượng đầu tôm và 5,5% so với nguyên
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
2
liệu tôm sú tươi), tạo ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường. Chính vì thế, yêu cầu
đặt ra là nghiên cứu biện pháp sử dụng nguồn nguyên liệu giàu protein và enzyme
protease nhằm nâng cao giá trị thương phẩm của tôm sú, đồng thời làm giảm tác
động ô nhiễm môi trường do quá trình xử lý đầu tôm gây ra là vấn đề có tính cấp
thiết.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục đích chung của đề tài là xác định một số yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến hiệu
quả trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Để đạt được mục tiêu đã được đặt ra, đề tài
tập trung vào các nội dung cụ thể sau:
 Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly protease thích hợp.
 Xác định pH của dung môi thích hợp giúp gia tăng hiệu quả trích ly protease
 Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian trích ly protease từ thịt đầu tôm sú.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
3
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 THỊT ĐẦU TÔM SÚ - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME
PROTEASE
2.1.1 Tôm sú – nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu
2.1.1.1 Tổng quan
Tôm sú (có tên khoa học là Penaeus monodon, Fabricius, 1798, trích dẫn bởi
Holthuis, 1980) là loài sống ở nơi đáy bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ đến 40 m
nước. Khi tôm trưởng thành thường di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước
sâu hơn.
Tôm sú được phân loại như sau:
Giới: Animalia
Ngành: Arthropoda
Phân ngành: Crustacea
Lớp: Malacostraca
Bộ: Decapoda
Phân bộ: Dendrobranchiata
Họ: Penaeidae
Chi: Penaeus
Loài: Penaeus monodon.
(Ngun: Holthuis, 1980)
Trong tự nhiên tôm sú nước mặn đến mùa sinh sản sẽ tiến vào gần bờ để đẻ trứng,
trứng nở ra ấu trùng và trải qua năm thời kỳ biến thái: Naupilus, Zoea, Mysis,
Postlarvae, Juvenile. Từ đây ấu trùng theo sóng biển dạt vào cửa sông nơi nước
biển và nước sông pha trộn lẫn nhau nên độ mặn thấp hơn. Đây chính là điều kiện
tốt cho ấu trùng phát triển. Tôm sú có đặc điểm sinh trưởng nhanh, trong 3 ÷ 4
tháng có thể đạt cỡ bình quân 40 ÷ 50 gam.

(Holthuis, 1980)



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
4








Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon
(Ngun:
2.1.1.2 Tình hình sản xuất tôm đông lạnh ở Việt Nam
Tôm đông lạnh đã và đang là một mặt hàng xuất khẩu có kim ngạch cao ở Việt Nam
và đang cạnh tranh mạnh mẽ với thị trường xuất khẩu lớn trên thế giới đặc biệt Thái
Lan đang gặp khó khăn do vấn đề tôm bệnh. Hơn thế nữa, nguồn cung tôm thế giới
bị hạn chế bởi sản lượng tôm từ Thái Lan giảm mạnh do ảnh hưởng của EMS khiến
giá tôm tăng trên toàn cầu. Nhờ đó, giá trị xuất khẩu tôm Việt Nam sang các thị
trường lớn tăng lên.
Trong đó, tôm sú là sản phẩm chính, chiếm hơn 50% tổng lượng tôm xuất khẩu
trong cả nước. Theo số liệu của VASEP (2010), tổng khối lượng xuất khẩu của mặt
hàng tôm sú là 121.399 tấn, chiếm 10,44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản trong cả
nước và 56,7% tổng giá trị xuất khẩu ngành tôm. Đến cuối tháng 6 năm 2013, tổng
lượng xuất khẩu tôm sú có sụt giảm, nhưng vẫn là ngành hàng chủ lực nhất. Trong
đó, mặt hàng tôm sú bỏ đầu HLSO là sản phẩm được ưa chuộng trên nhiều thị

trường, đặc biệt trên thị trường Nhật Bản. Tôm sú HLSO Việt Nam cỡ 16/20 cuối
tháng 6/2013 tăng thêm 5,5 USD/kg so với tháng 1/2013, từ 10,72 USD/kg lên
16,23 USD/kg. Tôm sú HLSO cỡ 16/20 từ Ấn Độ cũng tăng thêm gần 5 USD/kg, từ
11,03 USD/kg lên 15,95 USD/kg.
(Ngun: />khau-tom-Viet-Nam.htm)
Tình hình hiện nay mở ra hướng khai thác nguồn thịt đầu tôm sú dồi dào này cho
chế biến các sản phẩm giá trị gia tăng, nâng cao giá trị của con tôm sú ở Việt
Nam.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
5
2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta
Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (bảng 2.1) cho
thấy, đây chính là nguồn giàu protein, đồng thời thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao
(7,3) khi so sánh với pH của thịt tôm tươi (pH = 6,8 ÷ 6,9; Nguyễn Xuân Phương,
2003). Điều này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật
và các biến đổi sinh hóa, hóa học gây hư hỏng (Tran et al., 2011).
Bảng 2.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú
Thành phần
Giá trị
Nước (%)
82,30 ± 0,83
Protein (%)
14,82 ± 0,38
Lipid (%)
1,48 ± 0,48
Tro (%)
1,11 ± 0,03
pH
7,30 ± 0,10

(Ngun: Tran et al., 2011)
Một trong những ứng dụng phổ biến nhất là sử dụng đầu tôm trong chế biến chitin,
chitosan. Ngô Thị Hoài Dương et al., 2008 cũng đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền
xử lý bằng acid formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm
thiểu lượng hóa chất và chất thải gây ô nhiễm môi trường. Nguyễn Văn Thiết và Đỗ
Ngọc Tú (2008) đã nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu – vỏ tôm bằng các phương
pháp sinh học (sử dụng Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa). Nhiều nghiên cứu trong
nước đã tận dụng nguồn đầu tôm chủ yếu cho chế biến thức ăn gia súc. Phan Thị
Bích Trâm và Phạm Thu Cúc (2004) đã xác nhận thành công của việc xử lý vỏ đầu
tôm với rỉ đường và enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm. Trịnh Ngọc
Vinh (2006) đã tiến hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm vi khuẩn Lactobacillus spp.
giúp quá trình lên men được nhanh hơn. Sau đó, khảo sát nồng độ đường, nồng độ
muối, nồng độ vi khuẩn Lactobacillus spp. thích hợp trong việc bảo quản đầu vỏ
tôm bằng phương pháp lên men ủ chua. Qua đó, góp phần tạo ra sản phẩm thức ăn
gia súc có chất lượng cao hơn, có tính phổ biến rộng rãi, giá trị kinh tế cao và giảm
thiểu việc gây ô nhiễm môi trường. Phạm Thị Đan Phượng và các cộng sự (2008)
cũng đã nghiên cứu xử lý carotenoprotein thu hồi từ quá trình sản xuất chitin và
bước đầu thử nghiệm phối trộn thức ăn cá.
Các nghiên cứu này đều cho thấy tầm quan trọng của việc ứng dụng một hệ
enzyme protease nhằm trợ giúp cho quá trình thủy phân dịch protein có sẵn trong
nguồn nguyên liệu đầu tôm này là cần thiết. Đặc biệt, việc trích ly enzyme
protease có sẵn trong nội tại của đầu tôm là vấn đề có ý nghĩa quan trọng.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
6
2.2 KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN
2.2.1 Tổng quan về protease
2.2.1.1 Khái niệm enzyme protease
Protease là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein:
Hình 2.2 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease

(Barrett, 2001)
2.2.1.2 Phân loại enzyme protease
Việc phân loại nhóm enzyme protease được thay đổi qua các thời kỳ (Barrett,
2001). Theo Grassmann và Dyckerhoff, 1928 (trích dẫn bởi Barrett, 2001) protease
phân chia thành proteinase và peptidase. Theo Bergmann và Ross (1936, trích dẫn
bởi Barrett, 2001) gọi chung việc thủy phân liên kết peptide nên sử dụng danh từ
peptidase và được chia thành hai nhóm là endopeptidase và exopeptidase. Dựa trên
việc phân tích nghĩa rộng và nghĩa hẹp của từ “peptidase” nên để tránh nhầm lẫn
theo yêu cầu của IUBMB protease được coi là peptidase nhưng chia làm hai loại là
endopeptidase (proteinase) và exopeptidase. Năm 1960, Hartley (trích dẫn bởi Phan
Thị Bích Trâm, 2010) đã phân loại enzyme thủy phân protein theo bốn nhóm dựa
theo tên hóa học các amino acid tham gia vào tâm vị trí xúc tác:
- Aspartic peptidase là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trong
trung tâm hoạt động, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian
bằng liên kết không cộng hóa trị giữa enzyme và cơ chất. Các nhóm carboxyl
này thuộc mạch bên R của aspartic, glutamic hoặc có thể là nhóm carboxyl
đầu C của chuỗi polypeptide. Aspartic peptidase thường hoạt động trong
vùng pH acid và bị ức chế đặc hiệu bởi pepstatin.
- Cysteine peptidase: Các enzyme thuộc nhóm này có nhóm thiol (-SH) của
cysteine trong trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm –CO của liên kết
peptide tạo phức hợp trung gian thiolacyl-enzyme. Các cysteine peptidase
thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính, chúng chỉ hoạt động khi nhóm
thiol ở trạng thái không bị bao vây. Do đó các chất như cysteine, acid
ascorbic thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này. Cystatin,
leupeptin là các chất ức chế thuận nghịch và E64 chất ức chế không thuận
nghịch cho nhóm cysteine peptidase rất thông dụng hiện nay.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
7
- Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa các

ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết
peptidase tạo phức hợp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giống
như nhóm aspartic peptidase. Nhóm kim loại peptidase hoạt động mạnh nhất
ở vùng pH trung tính và bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA.
- Serine peptidase: Là những protease có nhóm hydroxyl (-OH) của serine
trong trung tâm hoạt động. Các peptidase serine này thường là hoạt động ở
vùng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm, nhóm –OH của serine tác động lên
nhóm –CO của liên kết peptide tạo hợp chất trung gian acyl-enzyme. Các
enzyme thuộc nhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin. Chúng
bị ức chế bất thuận nghịch dưới tác dụng diisopropyl-phosphofluoridate
(DFP), phenylmethanesulfonyl flouride (PMSF), coumarin và một số chất ức
chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành (SBTI), aprotinin, chymostatin.
Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lãnh vực
nhất là nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng
pH khá rộng từ trung tính đến kiềm mạnh đã làm tăng khả năng ứng dụng
nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác. Đặc biệt được ứng dụng
rộng rãi trong các ngành công nghiệp thuộc da và chất tẩy rửa. Hiện nay
nhóm serine protease đã được phát hiện và nghiên cứu trên nhiều đối tượng
khác nhau với các tên thông dụng ở bảng 2.2.







Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase
(Ngun: Đặng Thị Đăng Phương, 2005)

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
8
Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay
Enzyme
Vị trí cắt
Nguồn
Trypsin
Chymotrypsin
Elastase
Plasmin
Thrombin
Carboxypeptidase A
Arg, Lys
Tyr, Trp, Phe
Gly, Ala, Val
Arg, Lys
Arg
Đầu C các amin
Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác
Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác
Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác
Máu
Máu
Hệ thống tiêu hóa ở động vật
(Ngun: Phan Thị Bích Trâm, 2010)

2.2.2 Hệ serine protease
Serine protease có chung nhóm phân loại EC 3.4.21 là một trong số các enzyme
được nghiên cứu khá rộng rãi ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình
tiêu hóa của động vật phổ biến nhất là trypsine, chymotrypsine và elastase. Serine
protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ thể như phá cục máu
nghẽn và hoạt hóa các bổ thể (Phan Thị Bích Trâm, 2011; Gupta et al., 2002).
Trung tâm hoạt động của nhóm enzyme này chứa các amono acid aspartic,
histidine và serine trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế
được trình bày ở Hình 2.4.

Hình 2.4 Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease
(Ngun: Phan Thị Bích Trâm, 2011)


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
9
Cơ chế theo hình 2.4 gồm 3 phản ứng:
Phản ứng 1: Nhóm –OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với
nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp
tứ diện (tretahedral complex).
Phản ứng 2: Ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên
chuyển diện tích lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng
mạch polypeptide đầu N và hình thành các hợp chất trung gian acyl-enzyme mới.
Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại
và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease.
Như vậy, ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tính chất cắt riêng
biệt là do trong phân tử protein có một “túi” (pocket) luôn được định vị gần trung
tâm hoạt động nhóm serine (Hình 2.5).

Hình 2.5 Hình dạng các gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease
(Ngun: Phan Thị Bích Trâm, 2011)
Hình dạng và sự tích điện của túi khác nhau sẽ cho các vị trí cắt chuyên biệt của
từng serine protein khác nhau.
Chymotrypsine với túi chỉ chứa các nhánh amino acid kỵ nước vì vậy nhóm này
chỉ thích hợp với các mạch bên -R của phenylalanin, tryptophan, tyrosine của
chuỗi polypeptide.
Trypsine với các túi chứa aspartic ở vị trí trong cùng nên chỉ thích hợp với các
mạch bên R của các amino acid tích điện dương như arginine, lysine.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
10
Elastase với túi chứa hai phân tử valine nên chỉ chứa đủ các amino acid của mạch
bên R như glycine, alanine và valine.
Plasmin thuộc nhóm serine protease (EC 3.4.21.7) là enzyme quan trọng có mặt
trong máu để thủy phân các cục máu nghẽn fibrin, hoạt động giống trypsine có
khả năng thủy phân các liên kết peptide có mạch bên R của asginine và lysine
trong chuỗi polypeptide.
(Gupta et al., 2002)
2.2.3 Protease của tôm sú
Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác
khác nhau rất nhiều. Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có
xương sống. Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác
nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá. Các
protease tìm thấy trong tôm bao gồm carboxypeptidases A và B, trypsine,
chymotrypsine, cathepsine, và collagenase (Hernandez - Cortes et al., 1997; Honjo
et al., 1990; Kim et al., 1992; Liu and Cheung 1989; Nip et al., 1985; Roy et al.,
1996; Tsai et al., 1986; Van Worrnhoudt et al., 1992).
Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội
bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc

biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập
trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác.
Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của
một enzyme:
- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung
tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính
này để tách chiết chúng.
- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium),
ethanol, acetone… để thu nhận chế phẩm enzyme.
- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt
hóa hay ức chế.
- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ,
pH môi trường.
Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu (1993) về protease đầu tôm biển
và Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các
enzyme tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
11
Theo Nguyễn Việt Dũng (1999) thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở
môi trường gần trung tính.
Để ly trích protease từ đầu tôm sú, môi trường được sử dụng tương tự nhau. Theo
một số nghiên cứu cho thấy, hoạt tính protease trên một đơn vị khối lượng nội tạng
cao hơn nhiều so với đầu tôm ở cùng chế độ tách chiết (gấp từ 3,41 ÷ 4,33 lần).
Điều này dễ hiểu vì nội tạng tôm là cơ quan tiêu hóa nên tập trung nhiều enzyme,
còn đầu tôm thì lại có thêm cả phần vỏ và thịt tôm có ít hoạt tính sinh học. Hoạt tính
protease cao của nội tạng tôm cũng giúp giải thích, sự hư hỏng xảy ra thường thấy
nhất ở tôm là hiện tượng long đầu, và thời gian bảo quản tôm đã bỏ đầu, tách chỉ
bao giờ cũng dài hơn tôm nguyên con ở cùng điều kiện chế biến và bảo quản
(Nguyễn Lệ Hà, 2011).

Protease đầu tôm đều thể hiện hoạt tính rất yếu ở vùng acid, đạt cực đại ở vùng
trung tính pH = 7 và giảm dần khi pH tăng trong vùng điều kiện, điều này phù hợp
với đặc điểm của hệ enzyme tôm là không có pepsin hoạt động trong môi trường
acid (Baranowski et al., 1984). Protease từ nội tạng tôm nhạy cảm với pH hơn và
protease từ đầu tôm còn nhạy cảm hơn nữa, việc tăng nhẹ pH trong vùng điều kiện
cũng làm hoạt tính của chúng giảm đáng kể.
2.2.4 Khả năng ứng dụng protease
2.2.4.1 Các ứng dụng cơ bản
Protease là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da,
công nghiệp sản xuất xà phòng.
- Trong chế biến thực phẩm: Sử dụng nhiều nhất để cải tiến công nghệ sản
xuất nước mắm hoặc nước tương từ các chế phẩm cá, bánh dầu đậu nành
bằng việc bổ sung protease từ giai đoạn thô sơ dùng dịch chiết mủ đu đủ
xanh, vỏ dứa, ruột cá, ruột lợn đến giai đoạn cao hơn dùng chế phẩm enzyme
thêm vào quá trình thủy phân như chế phẩm bromelain, papain, ficin, chế
phẩm protease từ nấm mốc A. oryzae, vi khuẩn Bacillus subtilis hoặc nấm sợi
và cả các chế phẩm từ đầu tôm. Những kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ
sung protease vào cá thì hàm lượng đạm amin tăng cao, quá trình thủy phân
nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian chế biến nước mắm.
- Một lĩnh vực khác nghiên cứu sản xuất bột đạm cao cấp cho trẻ em và người
lớn tuổi từ bột đậu nành sử dụng chế phẩm prozima có chứa bromelain để cải
biến kích thước phân tử protein và xử lý các protein ức chế tiêu hóa có sẵn
trong nguyên liệu, hoặc sử dụng các protease thương mại Alcalase,
Novozyme, Flavourzyme thủy phân bột đậu nành tách béo nhằm làm tăng
hàm lượng amino acid tự do đạt hiệu suất thủy phân cao và rút ngắn thời gian
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
12
thủy phân làm giảm thiểu sự hoạt động của vi sinh vật. Ngoài ra, enzyme

protease còn được sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm khác như
làm phomat, làm mềm thịt…
- Trong y học: Một số protease như trypsine, -chymotrypsine dùng sản xuất
thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp
rất thông dụng trên thị trường dược phẩm. Nghiên cứu chế phẩm protease có
tên gọi “prozimabo” trong điều trị bỏng giúp giả mạc rụng nhanh, vết bỏng
nhanh khỏi. Đặc biệt hiện nay protease được ứng dụng trong điều trị bệnh
tim mạch, chúng rất đa dạng và có nguồn gốc khác nhau: Từ động vật, thực
vật, đến vi sinh vật, chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy
phân fibrin, fibrinogen.
- Trong nông nghiệp: Protease được bổ sung vào thức ăn động vật nuôi nhằm
tăng khả năng tiêu hóa, chúng được xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử
dụng hoặc xử lý sơ bộ thức ăn. Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn hợp
protease và các enzyme thủy phân khác cũng được sử dụng cho ngành nuôi
trồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi
trường nước nuôi.
Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi trong một số ngành khác như công nghiệp
thuộc da để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không
làm ảnh hưởng đến chất lượng da. Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả
năng tẩy vết bẩn có thành phần là protein.
(Phan Thị Bích Trâm, 2011)
2.2.4.2 Ứng dụng của protease kiềm ngun gốc động vật
Protease ưa kiềm là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu trên thị trường enzyme thế
giới (Godfrey và West, 1996). Bên cạnh nguồn protease ưa kiềm nguồn gốc vi
khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, điển hình như
Alkazym (Novodan, Conpenhagen, Đan Mạch), Tergazyme (Alconox, NewYork,
USA), Ultrasil (Henkel, Dusseldorf, Đức), còn có nhiều enzyme nguồn gốc động
vật, điển hình như Pronod 153 L được ly trích từ máu, keratin protease (trích ly từ
da, lông heo) cũng được biết đến với nhiều ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất xà
phòng, xử lý chất thải, ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc nhờ vào việc thủy

phân dịch protein các phụ phẩm của thủy sản.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
13
2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA VIỆC TRÍCH LY PROTEASE TỪ TẾ BÀO
ĐỘNG VẬT
2.3.1 Lý thuyết chung
Giai đoạn đầu của quá trình tách chiết enzyme là thu nhận dịch chiết từ một vật liệu
sinh học nghiền nát sơ bộ nào đó (bột, mầm thóc, hạt nảy mầm, một mô động vật
nào đó, một sinh khối vi khuẩn hoặc nấm…) trong dịch chiết đương nhiên chứa
protein và enzyme.
Trong việc nghiên cứu enzyme người ta thường hay sử dụng dịch nghiền đồng thể.
Để thu nhận loại dịch này khối vật liệu sinh học được rửa sạch và nghiền trong cối
hoặc trong một thiết bị chuyên dụng. Trong khi nghiền người ta thêm nước hoặc
dung dịch đệm và kính nghiền nát để giúp phá vỡ tế bào. Sản phẩm thu được sau
khi nghiền được gọi chung là dịch đồng thể. Trong khối dịch này chứa các mãnh tế
bào, nhân, lục lạp của lá, ty thể và các bộ phận khác của tế bào như sắc tố, protein
hòa tan…
Dịch nghiền sau đó được ly tâm phân đoạn ở các tốc độ tăng dần khác nhau. Để thu
nhận các enzyme trong dịch chiết hoặc từ các phân đoạn dưới tế bào có thể dùng
nước, dung dịch đệm, dung dịch muối, hỗn hợp glycerine với nước hoặc dung môi
hữu cơ. Cho đến nay không có phương pháp ly trích và tinh sạch chung cho các
enzyme. Để tách và tinh chế một enzyme nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một
cách có hiệu quả nhất các biện pháp khác nhau.
(Mai Xuân Lương, 2004).
Quá trình ly trích enzyme từ cơ chất rắn, dựa trên sự phân tách cấu tử (enzyme) từ
chất rắn (nguyên liệu) do tác động của dung môi, tuân theo định luật Fick (McCable
et al., 1993):

*

.
A
Az AB
dx
JD
dz

(2.1)
Trong đó:
J*
Az
: Thông lượng chất khuếch tán A theo phương z, kgmolA/ m
2
.giây.
D
AB
: Hệ số khuếch tán của chất A vào B (dung môi), m
2
/giây.
x
A
: Phân mol chất A trong hệ thống.
z: Khoảng cách khuếch tán (m).
Dấu (-) về mặt vật lý nghĩa là quá trình khuếch tán xảy ra theo chiều giảm nồng độ
của chất khuếch tán.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
14
Nói cách khác, vận tốc truyền của một quá trình truyền tỷ lệ thuận với động lực của
quá trình và tỷ lệ nghịch với trở lực của quá trình (McCabe et al., 1993). Động lực

của quá trình ly trích enzyme phụ thuộc vào sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa
dung môi và cơ chất rắn (Lonsane và Krishnaiah, 1992); chịu sự chi phối của mức
độ xuyên thấu của dung môi vào cơ chất (mô tế bào động vật, nguyên liệu sử dụng
trích ly enzyme) hay khoảng cách khuếch tán – trở lực của quá trình ly trích (Harris,
1995).
Dựa trên phương trình (2.1), hiệu quả của quá trình ly trích phụ thuộc vào một số
yếu tố cơ bản:
- Sự chênh lệch nồng độ.
- Diện tích tiếp xúc.
- Khả năng hòa tan của chất tan (hay enzyme) vào dung môi.
- Độ nhớt của dung môi.
- Khả năng khuếch tán của dung môi vào bên trong cơ chất rắn.
- Nhiệt độ trích ly.
- Tốc độ khuấy trộn để cải thiện hiệu quả khuếch tán.
(Rao, 2010)
Đối với quá trình ly trích cơ chất rắn từ dung môi lỏng nói chung và enzyme nói
riêng, quá trình khuếch tán chất tan vào dung môi còn chịu ảnh hưởng của đặc tính
liên kết của enzyme và cơ chất, điển hình như tương tác kỵ nước, liên kết hydrogen,
lực Val de Walls (Palit và Banerjee, 2001).
Nói cách khác, đặc điểm của nguồn nguyên liệu – một trong những động lực thúc
đẩy sự chênh lệch nồng độ của enzyme trong cơ chất và dung môi, các điều kiện
ly trích như loại dung dịch đệm, pH của dung dịch sử dụng ly trích, thời gian cũng
như nhiệt độ ly trích là những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả thu hồi
enzyme.
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme
2.3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nguyên liệu
Sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa dung môi và canh trường bề mặt sau lên men
càng lớn sẽ thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan ra ngoài dung môi càng tăng
(McCabe et al., 1993). Khi tỷ lệ dung môi và cơ chất thấp, không đủ xâm nhập vào
toàn bộ mẫu sử dụng để trích ly (Lonsane và Krishnaiah, 1992), không đủ cho sự

khuếch tán chất tan (enzyme) vào dung môi. Hơn nữa, một lượng dung môi sẽ
được giữ lại trong nguyên liệu cũng là nguyên nhân làm giảm hiệu quả thu nhận
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD
15
chất tan (Rao, 2010), hiệu quả thu nhận enzyme thấp. Tuy nhiên, tỷ lệ dung môi và
nguyên liệu cao, không những hoạt tính enzyme bị pha loãng mà còn tạo điều kiện
thuận lợi cho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng của protein hay
enzyme trích ly.
2.3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường
Sự thay đổi pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự tương
tác giữa enzyme và cơ chất. Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào diện tích phân bố trên
cả enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt động của phân tử enzyme. Mỗi
enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối ưu. pH tối ưu cho
hoạt động của các enzyme có nguồn gốc động vật, điển hình như protease từ nội
tạng cá tra (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006) hay từ thịt đầu tôm sú
(Nguyễn Lệ Hà, 2011) vào khoảng 7. Giá trị pH quá cao hay quá thấp có thể làm
enzyme bị biến tính. Giá trị pH tối ưu của mỗi enzyme có thể thay đổi trong một
khoảng nhất định tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và bản chất của các
loại dung dịch đệm (Phan Thị Bích Trâm, 2010).
2.3.2.3 Tác động của nhiệt độ và thời gian trích ly
Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc
phản ứng. Nhiệt độ tăng kéo theo tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì
tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Đa số enzyme có nhiệt độ tối
ưu khoảng 40 ÷ 50 °C. Ở nhiệt độ trên 70 °C, phần lớn enzyme đều mất hoạt tính.
Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộc
vào nguồn gốc sản sinh ra chúng. Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh
vật, thực vật cao hơn động vật. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme không cố định
mà thay đổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng
tồn tại của enzyme (Rao, 2010).

Ngoài ra, thời gian trích ly cũng là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể
đến hoạt tính enzyme. Việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc
gia tăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình
thẩm thấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích
protease. Tuy nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn
định và ức chế hoạt động của enzyme. Điều này cũng xảy ra với trường hợp thời
gian ly trích dài. Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu
tố như kích thước nguyên liệu cấu trúc loại protein, tác động đến sự khuếch tán
enzyme vào dung môi, khi enzyme phải xuyên qua khoảng trống bên trong với
đường đi quanh co, kết quả là khoảng cách khuếch tán dài (McCabe et al., 1993). Ở
cùng tỷ lệ dung môi sử dụng, thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình