một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ aspergillus niger bằng phương pháp lên men rắn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG




LÊ THỊ NHANH



MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ Aspergillus niger
BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN



Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM






Cần Thơ, 2013


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



Tên đề tài:
MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ Aspergillus niger
BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN


Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện
Trần Thanh Trúc Lê Thị Nhanh
MSSV: 2101945
Lớp: CNTP K36




Cần Thơ, 2013
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -i-
LỜI CAM ĐOAN

Xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Lê Thị Nhanh với sự

hƣớng dẫn của Ts. Trần Thanh Trúc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn
là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài
“Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus niger
bằng phƣơng pháp lên men rắn” đã đƣợc hội đồng chấm luận văn thông qua.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Ngƣời hƣớng dẫn Ngƣời viết


Trần Thanh Trúc Lê Thị Nhanh

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -ii-
LỜI CẢM ƠN

Em cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi đƣợc thực hiện luận văn tốt nghiệp
dƣới sự hƣớng dẫn của Trần Thanh Trúc.
Lời cảm ơn đầu tiên, em xin đƣợc gởi đến Cô Trần Thanh Trúc đã giành nhiều thời
gian và công sức để tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em
hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời, Thầy luôn đóng góp
cho em rất nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian hƣớng dẫn, cùng em
tìm hƣớng giải quyết cho những vấn đề mới phát sinh để có kết quả thu nhận tốt
nhất.
Trong suốt quá trình làm luận văn, em cũng đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt
tình cũng nhƣ sự ủng hộ, động viên to lớn của Chị Lê Thị Bảo Ngọc và các anh chị
trong phòng thí nghiệm D006, các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm K36.
Xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm
– khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ, đã tận tình
giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá

trình học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, em xin đƣợc gởi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sự khuyến
khích, ủng hộ đã dành cho em trong suốt chặng đƣờng để hoàn thành đƣợc luận văn
này.
Xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Sinh viên thực hiện


Lê Thị Nhanh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -iii-
TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ
Aspergillus niger bằng phương pháp lên men rắn” được thực hiện với mục tiêu
nghiên cứu khảo sát một số điều kiện lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
protease ưa acid trên môi trường rắn (SSF) với dòng A.niger đặc hiệu.
Kết quả nghiên cứu đã xác định được điều kiện lên men rắn sinh tổng hợp protease
từ dòng A. niger S
5
dựa trên việc khảo sát một số yếu tố như cơ chất lên men phù
hợp, tác động của độ ẩm, pH, nhiệt độ và thời gian ủ đến hiệu quả thu nhận
protease. Kết quả cho thấy bột đậu nành là cơ chất cho hiệu quả lên men tổng hợp
protease tốt nhất. Quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất khi sử dụng dung dịch
đệm citrate - phosphate có pH 5 để điều chỉnh độ ẩm môi trường ban đầu, đồng
thời môi trường lên men bổ sung dinh dưỡng và khoáng chất gồm yeast extract
(0,5%), K
2

HPO
4
(0,4%), NaCl (0,1%), MgSO
4
(0,05%), thời gian ủ thích hợp là 72
giờ ở nhiệt độ 31

C. Ước tính hoạt tính protease đạt được ở điều kiện lên men tốt
nhất là 0,126

0,012 U/g cơ chất.
Từ khóa: Aspergillus niger, bột đậu nành, hoạt tính cao, lên men rắn SSF,
protease acid.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -iv-
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
TÓM TẮT iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH vi
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2
Chƣơng 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 3

2.1.1 Tổng quan 3
2.1.2 Tính chất của protease ƣa acid 4
2.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease 5
2.1.4 Cơ chế phản ứng của enzyme protease 5
2.1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến động học protease 6
2.1.6 Tầm quan trọng của việc sử dụng protease trong thực tiễn 8
2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Aspergillus niger 9
2.2.1 Giới thiệu chung 9
2.2.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger 10
2.2.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản 10
2.3 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ĐẾN
QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE 11
2.3.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình sinh tổng hợp protease 11
2.3.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy 14
2.3.3 Độ ẩm môi trƣờng 14
2.3.4 Điều kiện pH ban đầu của môi trƣờng 14
2.3.5 Ảnh hƣởng của thời gian ủ 15
2.3.6 Ảnh hƣởng của phƣơng thức lên men đến quá trình tổng hợp protease 15
2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 16
Chƣơng 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 19
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 19
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 19
3.1.3 Hóa chất sử dụng 19
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu 20
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -v-
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc kết quả 20

3.2.3 Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả 22
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23
3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình len men sinh
tổng hợp protease trên môi trƣờng rắn SSF 23
3.3.3 Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến khả năng thu
nhận protease có hoạt tính cao từ Aspergillus niger 24
3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến quá trình
sinh tổng hợp protease 25
3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến quá trình tổng hợp
protease ở các nhiệt độ khác nhau 26
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA CƠ CHẤT LÊN MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
PROTEASE 27
4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM MÔI TRƢỜNG LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG
TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO 28
4.3 ẢNH HƢỞNG CỦA pH MÔI TRƢỜNG LÊN MEN BAN ĐẦU ĐẾN KHẢ
NĂNG THU NHẬN PROTESE TỪ Aspergillus niger 29
4.4 ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ ĐẾN QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP PROTEASE
Ở CÁC NHIỆT ĐỘ KHÁC NHAU 31
4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ tƣơng ứng từng nhiệt độ 31
4.4.2 Xác định nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men sinh tổng hợp
protease từ A. niger ở thời gian tối ƣu (72 giờ) 32
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34
5.1 KẾT LUẬN 34
5.2 ĐỀ NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
PHỤ LỤC 1. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix
PHỤ LỤC 2. SỐ LIỆU THỐNG KÊ xiii
PHỤ LỤC 3. MỘT SỐ HÌNH ẢNH xxii

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -vi-
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc không gian protease 3
Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease 3
Hình 2.3: Hình thái Aspergillus sp 11
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease thu đƣợc từ quá trình lên men
Aspergillus niger 33
Hình PL1.1: Đƣờng chuẩn Tyrosine xii
Hình PL3.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu xxii
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -vii-
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Các chất ức chế protease thông dụng 8
Bảng 2.2: Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào
nấm mốc Aspergillus sp. 12
Bảng 3.1: Phƣơng pháp và thiết bị sử dụng để phân tích các chỉ tiêu 20
Bảng 3.2: Phƣơng pháp xác định lƣợng tyrosine trong mẫu 21
Bảng 4.1: Hoạt tính protease thu đƣợc từ ba nguồn cơ chất lên men 27
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng lên men đến hoạt tính protease từ dòng nấm
mốc A. niger S
5
28
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến hoạt tính protease 30
Bảng 4.4: Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ ở các nhiệt độ khác nhau 31

Bảng PL1.1: Cách pha dung dịch đệm citrate – phosphate ix
Bảng PL1.2: Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ tyrosine xi
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -viii-
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

A. niger Aspergillus niger
CFU Colony Forming Unit (mật số bào tử hình thành)
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
EGTA Ethylene Glycol Tetra Acetic acid
KCN Khu Công Nghiệp
PMSF Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
rpm revolutions per minute
SSF Solid State Fermentation
TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn
TTHĐ Trung Tâm Hoạt Động
U Đơn vị hoạt tính enzyme
U/g Units per weight (gram) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 g cơ chất)
U/mL Units per volume (mL) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 mL cơ chất)
v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lƣợng)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 1 -
CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI
Protease là một trong những enzyme đƣợc ứng dụng rất nhiều trong thực tiễn và
đƣợc ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y tế, nghiên cứu
khoa học … Trong công nghiệp thực phẩm, protease đã có những đóng góp rất to

lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con ngƣời. Protease đƣợc sử dụng
trong các quá trình đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, làm tăng chất lƣợng sản
phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm… Protease
chiếm khoảng 60% thị trƣờng enzyme công nghiệp (Rao et al., 1998). Trong đó,
protease đƣợc thu nhận từ vi sinh vật chiếm khoảng 40% sản lƣợng enzyme đƣợc
bán trên toàn thế giới (Godfrey và West, 1996). Protease đƣợc thu nhận từ nhiều
nguồn khác nhau nhƣ động vật (gan, dạ dày…), thực vật (đu đủ, khóm…) và vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm…). Trong đó, protease có nguồn gốc vi sinh vật có vai trò to lớn
trong các ngành sản xuất công nghiệp. Hiện nay trên thế giới công nghệ thu nhận
protease từ vi sinh vật hiện đang nhận đƣợc sự quan tâm rất lớn.
Nấm mốc đƣợc sử dụng nhƣ nguồn sinh tổng hợp protease phổ biến hiện nay và
đƣợc xem nhƣ nguồn thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong
công nghiệp. Nguồn sinh tổng hợp protease từ nấm mốc ổn định, không phụ thuộc
theo mùa và vi sinh vật sinh trƣởng nhanh trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền
(Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004). Ngoài ra, enzyme vi sinh vật có
nhiều ƣu điểm hơn enzyme đƣợc thu nhận từ động vật và thực vật do chúng có hoạt
tính thủy phân cao hơn và sản lƣợng lớn hơn. Khoảng 2% vi sinh vật trên thế giới
đã đƣợc xác định có khả sinh tổng hợp các loại enzyme khác nhau (Padmavathi,
2013).
Aspergillus niger (A. niger) là dòng nấm sợi phân bố rất rộng rãi trên nhiều loại cơ
chất tự nhiên và trong các sản phẩm nông công nghiệp (Pansear et al., 2010), đƣợc
biết đến với khả năng sinh tổng hợp protease (Paranthaman et al., 2009). Tuy nhiên,
không phải tất cả nấm mốc đều có khả năng sinh enzyme nhƣ nhau và ngay cả
những dòng cùng một giống cũng không có khả năng sinh tổng hợp enzyme với
hoạt tính tƣơng đồng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Ngoài ra, để sản xuất enzyme từ
vi sinh vật, quá trình lên men rắn (SSF) thƣờng đƣợc thực hiện. Đây là phƣơng pháp
đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất protease. Quá trình này sử dụng các cơ chất rẻ
tiền thƣờng là các phụ phẩm nông nghiệp với các điều kiện tối ƣu cho quá trình lên
men nhằm đạt giá trị thu hồi protease cao nhất (Qazi et al., 2008).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 2 -
Các ngành công nghiệp nói chung và công nghiệp thực phẩm nói riêng đang trên đà
phát triển. Điều này hứa hẹn cho một nhu cầu to lớn về protease. Mặt khác, các phụ
phế phẩm dồi dào của nƣớc ta có thể sử dụng nhƣ nguồn cơ chất cho quá trình sản
xuất protease ƣa acid từ A. niger. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất
lƣợng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang đƣợc nghiên cứu
trong nhiều năm qua. Tuy nhiên, những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực này vẫn
chƣa đáp ứng đƣợc việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme
này trong đời sống.
Việc nghiên cứu cải thiện và nâng cao hoạt tính protease đƣợc thu nhận từ vi sinh
vật, thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho quá trình tổng hợp enzyme này là
vấn đề cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Chính vì vậy, nghiên cứu về khả
năng sinh tổng hợp protease cần đƣợc tiến hành một cách cụ thể thông qua các bƣớc
khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình sinh tổng hợp protease từ dòng nấm mốc
trên.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài này là tìm ra điều kiện lên men thích hợp cho
quá trình sinh tổng hợp protease ƣa acid trên môi trƣờng rắn (SSF) với dòng A.niger
đặc hiệu.
Từ mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài đƣa ra các nội dung nghiên cứu sau:
1) Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình lên men rắn sinh tổng hợp
protease.
2) Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến khả năng thu nhận protease có
hoạt tính cao từ Aspergillus niger.
3) Khảo sát ảnh hƣởng của pH ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp protease.
4) Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến quá trình tổng hợp protease ở các nhiệt
độ khác nhau.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 3 -
CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE
2.1.1 Tổng quan
Protease (hay còn gọi là proteinase hoặc peptidase) nằm trong lớp các enzyme thủy
phân hydrolase, là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide
(-CO-NH-)
n
của chuỗi polypeptide trong phân tử protease đến sản phẩm cuối cùng
là các acid amin.

Hình 2.1: Cấu trúc không gian protease
Nguồn: hoahocngaynay.com
Thông thƣờng protease đƣợc chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và
endopeptidase (Rao et al., 1998).










Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease

Nguồn:
Protease
Exopeptidase
Endopeptidase
Metallo protease
Serine protase
Aspartic protease
e
Carboxypeptidas
eCarboxypeptida
se
Aminopeptidase
Cystein proteases
e
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 4 -
 Exopeptidase: tách liên kết peptide ở gần cuối của chuỗi polypeptide. Dựa theo vị
trí hoạt động của các enzyme này, exopeptidase đƣợc phân loại tƣơng ứng thành
aminpeptidase và carboxypeptidase.
• Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
• Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu C tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
 Endopeptidase: cắt các liên kết peptide ở vùng bên trong của chuỗi polypeptide.
Tùy theo động học cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành 4 nhóm: serine
protease, protease aspartic, protease cystein và metalloprotease.
• Serine protease: là những protease chứa nhóm OH của gốc serin trong trung tâm
hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.

Các serin protease thƣờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc
hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.
• Protease aspartic: Hầu hết các protease aspartic thuộc nhóm pepsin (các enzyme
tiêu hóa: pepsin, chymosin, cathepsin, renin) có chứa nhóm cacboxyl trong trung
tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH trung tính.
• Protease cystein: chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động, thƣờng hoạt động ở
pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
• Metallo proteinase: thƣờng tím thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật
bậc cao hơn. Metallo proteinase hoạt động ở pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh
dƣới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease còn đƣợc phân loại theo khoảng pH hoạt động, và đƣợc chia
thành:
+ Protease acid: pH 2  4
+ Protease trung tính: pH 7  8
+ Protease kiềm: pH 9 – 11
(Ahmed et al., 2011).
2.1.2 Tính chất của protease ƣa acid
Protease ƣa acid (EC 3.4.23) còn đƣợc gọi là aspartic acid protease. Đây là một
endopeptidase với khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng từ 30 - 45kDa.
Enzyme này có khả năng hòa tan trong nƣớc và hoạt động tối ƣu ở độ pH thấp
(Vishwanatha et al., 2009). Điểm đẳng điện của protease ƣa acid nằm trong khoảng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 5 -
pH 3,0 - 4,5. Trung tâm hoạt động của enzyme này có chứa chuỗi trình tự các acid
amin Asp-Xaa-Gly, trong đó Xaa có thể là Ser hoặc Thr. Các protease ƣa acid bị ức
chế bởi pepstatin (Fitzgerald et al., 1990).
Ngoài ra, các hợp chất diazoketone nhƣ diazoacetyl-dl-norleucine methyl ester
(DAN) và 1,2-epoxy-3 (p-nitrophenoxy) propan (EPNP) trong sự hiện diện của các

ion đồng cũng ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme này (Rao et al., 1998).
Protease ƣa acid thƣờng đƣợc tiết ra bởi nấm (Tremacoldi et al., 2004). Một số
protease ƣa acid tiết ra từ các dòng Aspergillus gọi aspergillopepsin (Percin et al.,
2009) và có hoạt động tối đa ở pH 3 - 4 (Rao et al., 1998)
2.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease
Trong trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin
đặc trƣng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên
cứu chung về TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét
chung nhƣ sau (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004):
 TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và một số trƣờng hợp còn
có cả cofacto kim loại. Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21A,
có thể phân biệt thành sáu phần dƣới TTHĐ (subsite), mỗi phần dƣới TTHĐ tƣơng
ứng với gốc aa trong phân tử cơ chất. Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên
cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể protease acid của Rhizopus chinenis và
Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa
chúng có khe hở vào khoảng 20A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc
Asp

35 và Asp

215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.
 Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo
hơn vì cấu trúc không gian của chúng không đƣợc giữ vững bởi các cầu disulphite.
2.1.4 Cơ chế phản ứng của enzyme protease
Những enzyme peptidase đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân
thông qua hai bƣớc chính (Barrett, 1994):
 Bƣớc 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị với nguyên tử cacbon trong
nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine.
Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium
(phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân

thành một acyl-enzyme, vòng imidazole và một amine (phản ứng khử) (Fastrez and
Fersht, 1973).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 6 -
 Bƣớc 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H
2
O theo
chiều ngƣợc lại của bƣớc một để tái sinh lại enzyme.
2.1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến động học protease
Giống nhƣ các enzyme khác, các nghiên cứu đối với protease cũng khẳng định, biến
đổi động học của enzyme này chịu ảnh hƣởng của các yếu tố nhƣ nồng độ enzyme,
nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ cũng nhƣ tác động của các chất hoạt hóa và kìm hãm
(Ly Nguyen, 2004; Duvetter, 2007; Arotupin et al., 2008).
2.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Các nghiên cứu đối với protease cho thấy, phản ứng của protease thuộc trƣờng hợp
đơn giản nhất - chỉ có một cơ chất, theo phƣơng trình 1.1:

(1.1)
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, P: sản phẩm; k
1
, k
-1
là hằng số tốc độ phản ứng tạo
thành phức chất ES và phân ly phức chất ES thành E và S, k
2
là hằng số tốc độ phản
ứng tạo thành E và P (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Với sự biến đổi động học phản ứng theo phƣơng trình một cơ chất, hằng số

Michealis – Menten cũng đƣợc ứng dụng để thể hiện tốc độ của phản ứng và đặc
trƣng cho protease. Ở giai đoạn đầu phản ứng, nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố
định và nồng độ cơ chất thay đổi, ngƣời ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi
nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục tăng, đƣờng biễu diễn uốn cong
và với nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biễu diễn
tiệm cận với giá trị V
max
.







Hình 2.4: Phƣơng trình Michealis – Menten
K
m
là hằng số Michealis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc ½ vận tốc V
max
.
PE
k
ES
k
SE 
21


k

1
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 7 -
Hằng số K
m
tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme cũng nhƣ phƣơng pháp xác định hoạt
tính. So với giá trị K
m
tìm đƣợc từ protease nguồn gốc thực vật, hằng số K
m
của
protease từ nấm mốc đều có giá trị cao hơn. Nói cách khác, ái lực của protease từ
nấm mốc đối với cơ chất thấp hơn hay độ nhạy của protease từ nấm mốc kém hơn
protease từ thực vật (Duvetter, 2007).
2.1.5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của protease
Hoạt tính của protease phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trƣờng. pH môi trƣờng ảnh
hƣởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó,
phức chất enzyme  cơ chất và độ bền của enzyme. (Đậu Thị Kim Dung, 2006).
Mỗi enzyme hoạt động trong một dãy pH khác nhau, pH tối ƣu của đa số enzyme
vào khoảng giá trị trung tính (6  8). Tuy nhiên, đối với protease từ nấm mốc thì pH
hoạt động tối ƣu dao động trong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007).
2.1.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động protease
Giống nhƣ các phản ứng của enzyme khác, tốc độ của phản ứng phân giải peptit do
protease sẽ gia tăng cùng với sự gia tăng nhiệt độ đến một mức tối ƣu, sau đó hoạt
tính của protease giảm. Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của protease dao động trong
khoảng từ 30 ÷ 40°C, phụ thuộc vào nguồn enzyme. Mặc dù vậy, trong điều kiện
thay đổi áp suất, nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme cũng thay đổi (Verlent
et al.,2004; Castro et al., 2006; Sila et al., 2007).

2.1.5.4 Ảnh hưởng của cation kim loại đến hoạt động của protease
Các cation kim loại thƣờng đƣợc sử dụng với vai trò chất hoạt hóa đối với hoạt
động của enzyme (Marangoni, 2003). Hoạt động của protease gia tăng cùng với sự
tăng nồng độ cation kim loại và đạt đến giá trị tối ƣu, ở trên điểm này hiệu quả hoạt
động của enzyme thƣờng giảm. Ở nồng độ cao, cation kim loại ức chế hoạt động
của enzym. Điều này đƣợc hiểu dựa trên nhóm carboxyl bị khóa bởi cation kim loại,
phản ứng enzyme không xảy ra và đây là nguyên nhân ức chế khi có nồng độ
cation kim loại cao (Nari et al., 1991). Theo Leiting và Wicker (1997) ở cùng mức
độ ion hóa, các cation hóa trị II kích hoạt protease khác nhau. Đối với protease đƣợc
ly trích từ việc lên men chủng Acinetobacter sp. NQ6, K
+
, Na
+
, Mg
2+
là những ion
hoạt hóa mạnh, có khả năng làm tăng hoạt tính protease, còn ion Ca
2+
có ảnh hƣởng
không đáng kể. Ion Zn
2+
chỉ ức chế protease ở nồng độ cao 10-20 mM. Các ion kim
loại khác Cu
2+
, Co
2+
, Pb
2+
và Hg
2+

ức chế protease ngay ở nồng độ thấp 2 mM và
ức chế hoàn toàn ở nồng độ cao đối với Pb
2+
và Hg
2+
Chất tạo gọng kìm EDTA
kìm hãm protease hoàn toàn ở mọi nồng độ (Quyền Đình Thi, 2007).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 8 -
2.1.5.5 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động protease
Một yếu tố thƣờng ảnh hƣởng đến sự ổn định protein là sự phân giải bởi chính
protease có mặt trong môi trƣờng. Biện pháp an toàn nhất để giảm bớt sự phân giải
protease là làm việc nhanh trong môi trƣờng lạnh hoặc sử dụng các chất kìm hãm
protease. Chất kìm hãm hoạt động protease đƣợc sử dụng tùy thuộc vào từng loại
protease. Một số chất ức chế thông dụng đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các chất ức chế protease thông dụng
Chất ức chế protease
Loại protease
Nồng độ sự dụng
PMSF
Serine protease
0,1  1 mM
Aprotinin
Serine protease
5 g/mL
Benzamidin
Serine protease
1 mM

Pepstatin A
Acid protease
1 g/mL
Leupeptin
Thiol protease
1 g/mL
EDTA & EGTA
Protease kim loại
0,1  1 mM
Nguồn: Phan Thị Bích Trâm (2011)
2.1.6 Tầm quan trọng của việc sử dụng protease trong thực tiễn
Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thuộc công nghiệp thực phẩm,
công nghiệp nhẹ, dƣợc phẩm, nông nghiệp, nghiên cứu khoa học… Yêu cầu trên
toàn thế giới về enzyme này gia tăng ngày càng nhanh chóng (Vishwanatha et al.,
2009).
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease đƣợc dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn.
Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt), tiêm dung dịch enzyme vào
thịt (tiêm dung dịch enzyme vào con vật trƣớc khi giết mổ) (Nguyễn Thị Tuyết Mai,
2006).
Trong chế biến thủy sản, enzyme protease đƣợc sử dụng nhằm rút ngắn thời gian
làm và cải thiện hƣơng vị của nƣớc mắm (Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2006).
Trong công nghiệp sữa, protease đƣợc dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính
làm đông tụ sữa của chúng. Và ứng dụng này đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành
công nghiệp sữa trong quá trình sản xuất pho mát (Neelakantan et al., 1999).
Protease từ một số vi sinh vật nhƣ : A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,…
đƣợc dùng trong sản xuất phomat (Trần Xuân Ngạch, 2007). Trong sản xuất bánh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 9 -
mì, bánh quy, protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ
xốp, nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ
bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của Aspergillus Oryzae dùng để thủy
phân protease trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn (Lê Xuân Phƣơng,
2001).
Protease ƣa acid còn có ứng dụng trong sản xuất vật liệu gia vị, thủy phân protein,
giúp làm tăng nồng độ của các acid amin trong quá trình lên men của nƣớc tƣơng
(Rao et al., 1998).
Bên cạnh đó, protease ƣa acid cũng là một yếu tố rất hữu ích trong ngành công
nghiệp da và lông thú (
2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Aspergillus niger
2.2.1 Giới thiệu chung
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên
các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng địa lý
khác nhau trên thế giới. Hiện nay, A. niger đƣợc sử dụng chủ yếu trong công nghiệp
sản xuất enzyme (điển hình nhƣ α - amylase, glucoamylase, pectinase, protease,
cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid
hữu cơ nhƣ acid citric, acid gluconic,…(Pansear et al., 2010).
Nấm mốc là vi sinh vật có thay đổi đáng kể trong lịch sử phân loại. Các nghiên cứu
khởi đầu đã phân chia nấm thuộc ngành Thallophyta thuộc giới phụ Cryptogamae,
giới Plantae (thực vật). Các khảo sát về đặc tính cấu trúc dƣới kính hiển vi tiếp theo
đã chứng minh nấm không thuộc thực vật lẫn động vật (Sumbali, 2005). Samson và
van Reenen-Hoekstra (1988) đã phân chia nấm thật thành 4 lớp: Phycomycetes,
Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes. Hệ thống phân loại này đã tồn
tại một thời gian dài và A. niger đƣợc phân loại thuộc giới nấm (Fungi), ngành phụ
nấm bất toàn Deuteromycotina, lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ
Moniliaceae, chi Aspergillus và loài Aspergillus niger (Samson và van Reenen-
Hoekstra, 1988).

Tuy nhiên, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70 của
thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứu phân chia nhóm của Whittaker (1969, trích dẫn
bởi Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi Sumbali,
2005) đã đề nghị khóa phân loại mới cho giới nấm nói chung và A. niger nói riêng
thuộc:
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 10 -
Ngành: Amastigomycota
Ngành phụ: Ascomycotina
Lớp: Ascomycetes
Lớp phụ: Plectomycetidae
Bộ: Eurotiales
Họ: Eurotiaceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus niger
Nguồn: Sumbali, (2005)
Với đặc điểm chính trong họ Eurotiaceae là bào tử đính ở dạng thể bình (Cao Ngọc
Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
2.2.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger
Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trƣởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:
- Khuẩn ty dinh dƣỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thƣớc nhỏ, màu
trắng. Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trƣờng nuôi cấy
để hút dƣỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng.
- Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thƣớc lớn hơn
khuẩn ty dinh dƣỡng rất nhiều, trong suốt. Khuẩn ty sinh sản hƣớng vào không khí
để lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già.
Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dƣỡng tạo thành các
hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình

thành các bào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen.
(Nguồn: Klich, 2002; Samson et al., 2007)
2.2.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản
Aspergillus niger là loại nấm không có giai đoạn sinh sản hữu tính, A. niger sinh
sản vô tính chủ yếu bằng bào tử đính (Gams, 1985) (hình 2.3).

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 11 -

Hình 2.3: Hình thái Aspergillus sp.
(a) khối bào tử đính, (b) bào tử đính, (c) tế bào gốc , (d) cuống thể bình và thể bình
Nguồn: Onion et al., (1981)
Cơ quan sinh sản có dạng nhƣ hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính phát triển từ một
tế bào có đƣờng kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là
tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dài với phần
đỉnh phồng to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề
mặt túi là các cuống thể bình màu nâu, dài 10 - 15 m, là nơi sinh ra các thể bình.
Thể bình có một tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính đƣợc tạo thành nối tiếp nhau
trong miệng thể bình thành chuỗi hƣớng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay
miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già). Bào
tử đính hình cầu, thƣờng dẹt, đƣờng kính 4 - 5 m, nhƣng thƣờng nhỏ hơn (Onions
et al., 1981). Loài A. niger đƣợc phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus
bởi khối bào tử đính màu đen.
2.3 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE
2.3.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình sinh tổng hợp protease
Các loại nấm mốc trong tự nhiên có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống. Với
mỗi nguồn cơ chất nhất định, chúng sẽ sinh tổng hợp enzyme tƣơng thích, đặc hiệu

với cơ chất đó nhằm chuyển cơ chất từ dạng phức tạp khó hấp thu thành dạng cơ
chất đơn giản dễ hấp thu (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Nói cách khác, muốn thu
nhận enzyme nào thì phải có sự hiện diện của cơ chất đặc hiệu với enzyme đó trong
môi trƣờng nuôi cấy (Rombouts và Pilnik, 1981). Tác động của cơ chất đặc hiệu đạt
hiệu quả cao khi ở một nồng độ nhất định. Nếu vƣợt quá nồng độ tối đa cho phép
thì khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm (Rombouts và Pilnik, 1981).
Thành phần môi trƣờng là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh tổng hợp
protease cũng nhƣ các enzyme khác từ vi sinh vật. Trong thành phần môi trƣờng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 12 -
phải có đủ các chất đảm bảo đƣợc sự sinh trƣởng bình thƣờng của vi sinh vật và
tổng hợp enzyme (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010; bảng 1.2).
Bảng 2.2: Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào
nấm mốc Aspergillus sp.
Nguyên tố
Nguồn gốc
Chức năng
Thức ăn đa lƣợng
Carbon
Hợp chất hữu cơ hoặc
CO
2

Xây dựng thành phần vật chất cơ bản
của tế bào
Oxygen
H
2

O, hợp chất hữu cơ,
CO
2
, Nƣớc
Xây dựng nên vật chất và nƣớc trong tế
bào, O
2
là chất nhận điện tử trong hô
hấp hiếu khí
Nitrogen
NH
3,
NO
3
-
, hợp chất
hữu cơ, CO
2
, N
2

Xây dựng nên acid amin, nucleotide của
acid nucleic và coenzyme
Hydrogen
H
2
O, hợp chất hữu cơ,
H
2

Xây dựng nên các hợp chất hữu cơ.
Tham gia các quá trình sinh năng lƣợng
nhƣ các proton
Phospho
Phosphate vô cơ
Xây dựng nên các acic nucleic,
nucleotide, phospholipid, acid teichoic
Thức ăn vi lƣợng
Lƣu huỳnh
SO
4
2-
,
H
2
S, SO
2
, hợp
chất hữu cơ chứa lƣu
huỳnh
Xây dựng nên cystein, methionine,
glutathione và nhiều coenzyme
Kali
Muối kali
Xây dựng nên các cation vô cơ của tế
bào và là đồng nhân tố của các enzyme
Magie
Muối magie
Dạng các cation vô cơ của tế bào và là
đồng nhân tố cho nhiều phản ứng

enzyme
Calcium
Muối Calcium
Cation vô cơ là đồng nhân tố cho nhiều
enzyme và là cấu phần của nội bào tử
Sắt
Muối sắt
Cấu phần của cytochrome và các protein
khác cũng là đồng nhân tố cho một số
phản ứng enzyme
Nguồn: Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành (2010)
2.3.1.1 Ảnh hưởng của thành phần đa lượng
Trong các yếu tố ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng, nguồn carbon là thành
phần đầu tiên, đóng vai trò đặc biệt trong sự phát triển của vi sinh vật. Trong quá
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 13 -
trình sinh tổng hợp protease, nguồn carbon có độ methoxyl hóa cao và đơn phân tử
nhƣ acid pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác thƣờng đƣợc
sử dụng. Các thành phần này không chỉ đóng vai trò đơn thuần là nguồn carbon cho
sự phát triển của vi sinh vật, mà còn là một cơ chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình
sinh tổng hợp protease. Nguồn nitrogen cũng có vai trò nhƣ chất cảm ứng, ảnh
hƣởng không nhỏ đến quá trình sinh tổng hợp protease. Nitrogen tham gia vào quá
trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào
sinh vật. Tuy nhiên, khi nồng độ nitrogen tăng cao sẽ là chất kìm hãm cho sự sinh
tổng hợp enzyme. Tỷ lệ giữa carbon và nitrogen trong môi trƣờng, hay tính cân
bằng của môi trƣờng dinh dƣỡng về carbon và nitrogen có ý nghĩa lớn đối với sinh
tổng hợp sinh khối của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme (Sajjaanantakul và
Pitifer, 1991). Môi trƣờng có đủ lƣợng carbon và nitrogen cần thiết sẽ tích lũy

lƣợng enzyme lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không đƣợc bù đắp bằng sự dƣ thừa
của cấu tử kia (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Ngoài ra, do acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme, acid amin có ảnh
hƣởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng nhƣ quá trình sinh tổng hợp enzyme.
Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitrogen và là nguồn năng
lƣợng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)
2.3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng
Các nguyên tố đa vi lƣợng có ảnh hƣởng lớn đến sự sinh trƣởng và tổng hợp
enzyme của vi sinh vật. Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh
chất và nhiều coenzyme, đồng thời để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy
hóa sinh học. Phospho ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi và các vi
sinh vật khác. Cation Mg
2+
có ảnh hƣởng đến độ bền nhiệt của enzyme tuy nhiên
MgSO
4
sẽ có ảnh hƣởng xấu đến sự tổng hợp enzyme bởi nấm sợi. Trong khi đó,
lƣu huỳnh - có mặt trong các acid amin quan trọng nhƣ methionine, cysteine, có vai
trò tích cực trong việc kích thích sự hình thành enzyme. Ngoài ra, calcium, mangan,
corban,… cũng ảnh hƣởng đến sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Nhìn chung, thành phần khoáng đƣợc sử dụng trong nuối cấy protease khá ổn định,
chủ yếu thành phần là: yeast extract (0,5%), K
2
HPO
4
(0,4%), NaCl (0,1%), MgSO
4

(0,05%) (Irfan et al., 2011).
Mặc dù thành phần cơ chất lên men có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm mốc,

tăng khả năng tổng hợp enzyme nhƣng các điều kiện lên men điển hình nhƣ nhiệt
độ, thời gian, độ ẩm hay pH ban đầu của môi trƣờng ủ là những yếu tố có sự chi
phối rất lớn đến quá trình phát triển và hình thành enzyme .
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 14 -
2.3.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình nuôi cấy và khả năng sinh
enzyme của vi sinh vật. Ở nhiệt độ thấp, sản lƣợng protease thu đƣợc không cao
(Damare et al., 2006). Tuy nhiên ở nhiệt độ cao, quá trình trao đổi chất và phát triển
của vi sinh vật bị hạn chế (Haq et al., 2006). Đồng thời, enzyme protease bị biến
tính và mất hoạt tính xúc tác do sự kéo dài và phá vỡ của các liên kết hydro trong
cấu trúc của enzyme (Conn et al., 1987). Nhiệt độ tối ƣu của các loài Aspergilus
khác nhau thì khác nhau và nằm trong khoảng 30
o
C-40
o
C (Coral et al. 2002;
Charles et al., 2008; Negi và Banerjee 2010).
2.3.3 Độ ẩm môi trƣờng
Thành phần nƣớc chiếm từ 70 ÷ 90% khối lƣợng cơ thể vi sinh vật, tất cả quá trình
phân hủy thức ăn và các phản ứng chuyển hóa các chất trong tế bào đều diễn ra với
sự có mặt của nƣớc. Độ ẩm cao ảnh hƣởng đến độ thoáng khí, ngƣợc lại độ ẩm thấp
quá sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của sợi nấm cũng nhƣ khả năng tạo
enzyme (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010).
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối ƣu của môi trƣờng là 58 ÷ 60% và sự
duy trì độ ẩm của môi trƣờng ổn định trong quá trình nuôi đóng vai trò quan trọng.
Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50% làm kìm
hãm sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật cũng nhƣ giảm hiệu quả hình thành

enzyme (Pandey et al., 2000). Khi nuôi cấy trong điều kiện không đƣợc vô trùng
tuyệt đối thì độ ẩm môi trƣờng sau khi cấy giống không đƣợc vƣợt quá 60% để
tránh sự nhiễm khuẩn, vi sinh vật lạ (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.3.4 Điều kiện pH ban đầu của môi trƣờng
Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt, do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và
hàm ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích sau lên men thƣờng ít thay đổi trong suốt
thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trƣờng ủ có ảnh hƣởng
không nhỏ đến sự phát triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme. Giá trị pH tối ƣu
của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch,
2007). Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc điểm từng enzyme, loại cơ chất và nguồn
nấm mốc, giá trị pH tối ƣu cho hoạt động của vi sinh vật lên men, tạo ra enzyme là
khác nhau. Thêm vào đó, trong quá trình sinh tổng hợp enzyme, pH thƣờng giảm
nhẹ vào thời gian đầu do sự phân hủy các chất, điển hình nhƣ sự chuyển hóa các
protein thành các acid amin mang tính acid, sau đó pH thƣờng tăng dần do quá trình
trao đổi chất tạo ra các chất mang tính kiềm nhƣ ammonium,… Tuy nhiên, quá trình
này còn phụ thuộc vào nguồn vi sinh vật và sản phẩm tạo thành (Lê Gia Hy và
Khuất Hữu Thành, 2010).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ


Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 15 -
Theo O'Donnell et al., (2001) Aspergillus niger có khả năng giảm pH xuống sau hai
ngày lên men.
2.3.5 Ảnh hƣởng của thời gian ủ
Thời gian lên men ảnh hƣởng đáng kể đến việc sinh tổng hợp enzyme cũng nhƣ
hoạt tính của enzyme. Vi sinh vật cần thời gian để phát triển và sản sinh enzyme.
Tuy nhiên, khi thời gian ủ quá dài, môi trƣờng cạn dần chất dinh dƣỡng, vi sinh vật
phát triển kém và do đó hoạt tính enzyme sẽ giảm. Khảo sát thực nghiệm là phƣơng
pháp phổ biến để xác định đƣợc thời gian nuôi thích hợp giúp thu đƣợc enzyme có
hoạt tính cao và hiệu suất thu hồi lớn (Radha, 2012). Việc tạo bào tử là hiện tƣợng

không mong muốn vì thƣờng làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với A. niger, quá
trình sinh tổng hợp enzyme nhiều nhất thƣờng kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính
bào tử (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.3.6 Ảnh hƣởng của phƣơng thức lên men đến quá trình tổng hợp protease
Trong việc sản xuất protease từ vi sinh vật, cả hai kỹ thuật: lên men chìm (SmF) và
lên men bề mặt (SSF) đều có thể đƣợc sử dụng (Pandey et al., 2001; Mukhtar và
Haq, 2008). Tuy nhiên, quá trình lên men trạng thái rắn là một phƣơng pháp thích
hợp để sản xuất protease ƣa acid từ nấm (Tremacoldi et al., 2004). Các nghiên cứu
trƣớc đã cho thấy enzyme thu đƣợc từ phƣơng pháp SSF có hoạt tính cao hơn so với
phƣơng pháp SmF khi nuôi cấy trên cùng loại vi sinh vật và cơ chất lên men
(Viniegra-González et al., 2003). Tuy nhiên, lý do vi sinh vật sản xuất ra enzyme
trên môi trƣờng rắn SSF có hoạt tính cao hơn trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng lỏng
SmF vẫn chƣa đƣợc giải thích cụ thể. Nhìn chung, sự khác biệt quan trọng giữa quá
trình lên men SmF và SSF là độ ẩm môi trƣờng. Do độ hoạt động của nƣớc trong
môi trƣờng lên men SmF rất cao nên mức độ nhiễm vi sinh vật không mong muốn
gia tăng (Patil et al., 2006). Hesseltine (1977) đã chỉ ra một số thuận lợi và bất lợi
của SSF so với SmF.
2.3.6.1 Thuận lợi
- Môi trƣờng nuôi cấy đơn giản;
- Một số cơ chất có thể đƣợc sử dụng trực tiếp làm môi trƣờng rắn hoặc bổ sung
thêm một số chất dinh dƣỡng;
- Sản phẩm thu nhận có nồng độ cao, dễ dàng tinh sạch;
- Sử dụng kết hợp các cơ chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật, bào tử hoặc tế bào;
- Độ ẩm thấp và mật số nấm mốc lớn nên hạn chế đƣợc sự lây nhiễm của nhiều loại
vi sinh vật khác;