MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ pot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***








ĐỖ HOÀNG KHIÊM




MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY
TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG
HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ





Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***







MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY
TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG
HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ


Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học



Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG
KHIÊM
BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Khóa: 2002-2006

KS. NGUYỄN VĂN ÚT









Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***




FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF
CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS
AND DOG SPERM CAPACITATION



Graduation thesis
Major: Biotechnology

Professor: Student:
A.Professor. Dr. TRAN THI DAN DO HOANG KHIEM
Veterinarian. QUACH TUYET ANH Term: 2002 - 2006
Engineer. NGUYEN VAN UT











Ho Chi Minh City
09/2006

iv
LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt quá trình học tại trƣờng.
Cô Trần Thị Dân đã hết lòng hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt

nghiệp, một tấm gƣơng lao động, một phong cách làm việc cần đƣợc noi theo.
Thầy Đinh Xuân Phát, cô Quách Tuyết Anh và thầy Nguyễn Văn Út đã
truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm sống và làm việc, tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn
cho tôi trong suốt quá trình thực tập.
Thầy Trần Ngọc Hùng đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm về quá trình
thực tập tốt nghiệp.
Thầy Nguyễn Văn Thuận và thầy Nguyễn Thanh Bình đã truyền đạt những
kinh nghiệm nghiên cứu thực tế cho tôi.
Gia đình Bác Sáu, gia đình chị Hạnh và gia đình anh Phƣớc đã tạo điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này.
Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 và những ngƣời bạn thân đã chia sẽ
những vui buồn cũng nhƣ hỗ trợ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.

Thủ Đức, ngày 15-08-06

Đỗ Hoàng Khiêm

v
TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đỗ Hoàng Khiêm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “MỘT
SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN
TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ”
Hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN
2. BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH
3. KSCNSH. NGUYỄN VĂN ÚT
Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến 06/07/06 tại trƣờng Đại Học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Ngày nay, kỹ thuật thụ tinh in vitro ngày càng đƣợc hoàn thiện và có tiềm năng

lớn trong việc ứng dụng nhân giống nhanh ở những thú cao sản hoặc thú quý hiếm. Để
tiếp cận kỹ thuật này chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và xác
định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến phản ứng hoạt hóa tinh trùng nhằm hoàn
thiện dần các công đoạn trong việc nâng cao tỉ lệ chó quý hiếm đƣợc tạo ra từ kỹ thuật
thụ tinh in vitro. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:
1. Thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng nhanh hơn với phƣơng pháp vuốt và nuôi
cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo.
2. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính
(lamelle) cho tỉ lệ thành công 28,6% (tỉ lệ đĩa xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”) trong
khi phƣơng pháp không sử dụng lá kính cho kết quả thất bại.
3. Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng.
Chất lƣợng của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian bảo quản 0
giờ là tốt nhất, với hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động
trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03).

vi
MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG
Bìa 1 i
Bìa 2 ii
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt khóa luận iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt vii
Danh sách các bảng viii
Danh sách các hình ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu 1

1.3. Yêu cầu 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng 3
2.1.1. Cấu tạo 3
2.1.2. Chức năng 4
2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng 4
2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng 4
2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể 4
2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào 6
2.3.1. Bề mặt chai cấy 6
2.3.2. Các đặt tính vật lý 6
2.3.2.1. pH 6
2.3.2.2. Dung dịch đệm 7
2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu 7
2.3.2.4. Nhiệt độ 7
2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí 7
2.3.2.6. Độ nhớt 8
2.3.3. Tủ cấy 8
2.3.4. Kháng sinh 8
2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào 8
2.4.1. Nguồn nhiễm 8
2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật 8
2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác 9
2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào 9
2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng 10
2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp 10
2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp 11
2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue 11
2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 11
2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi 11

2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó 12
2.9. Tinh trùng 13
2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng 13

vii
2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng 14
2.9.3. Đặc tính của tinh trùng 15
2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong dƣờng sinh dục cái 16
2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó 17
2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng 17
2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó 19
2.11. Hoạt hóa tinh trùng 20
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Nội dung 23
3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện 23
3.3. Vật liệu 23
3.3.1. Nguồn mẫu 23
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị 23
3.3.3. Hoá chất 24
3.4. Phƣơng pháp 25
3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng 25
3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ 25
3.4.1.2. Xử lí ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm 25
3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng 26
3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 28
3.4.1.5. Nhuộm tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng trypan blue 29
3.4.2. Chuẩn bị tinh trùng cho quá trình thụ tinh in vitro 30
3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm 30
3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng 30
3.5. Xử lí số liệu 34

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
4.1. Thí nghiệm 1: thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng 35
4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng 35
4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa 37
4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng 37
4.3.2. Nồng độ của tinh trùng 38
4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình 39
4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome 40
4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng 41
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ LỤC 47

viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AR: acrosome reaction
BOEC: bovine oviductal epithelial cells
BSA: bovine serum albumin
DNA: deoxyribonucleic acid
DNP: deoxyribonucleoprotein
ECS: estrous cow serum
EGF: epidermal growth factor
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay
ET: embryo stransfer
FBS: phosphate buffered saline
FCS: fetal calf serum
FGF: fibroblast growth factor

HSA: human serum albumin
IGF: insulin – like growth factor
IVC: in vitro culture
IVF: in vitro fertilization
IVM: in vitro maturation
M II: metaphase II
PCR: polymerase chain reaction
PDGF: platelet – derived growth factor
RNA: ribonucleic acid






ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Giá trị pH 7
Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa HCO
3
-
, CO
2
và HEPES 9
Bảng 2.3 Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó của Iguer và Verstegen 19
Bảng 2.4 Công thức pha chế 4 môi trƣờng 20
Bảng 4.1 Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy 35
Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng 37

Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng 38
Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình 39
Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome 40
Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng 42

x
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

HÌNH TRANG
Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy 36
Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) 36
Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa 41
Hình 4.4 Tinh trùng đƣợc nhuộm sau phản ứng hoạt hóa 41
Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng 43

BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng 37
Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng 38
Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình 39
Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome 40
Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng 42

1

PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần
đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là
cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật

đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho
nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình.
Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển giải trí của con ngƣời đòi
hỏi sâu sắc hơn. Từ đó, chó đƣợc ƣa thích trong nhà phải là chó đẹp, quý, lạ mắt,
thƣờng là chó nhập và có giá thành cao. Do đó, tiềm năng của thị trƣờng này ở nƣớc ta
còn rất lớn. Tuy nhiên, những loại chó này thƣờng bị giới hạn về mặt sinh sản hay
nhân giống. Để giải quyết tốt những vấn đề này, tiềm năng của kĩ thuật thụ tinh in
vitro tỏ ra tối ƣu bởi vì kĩ thuật này có những ƣu điểm sau (Hoàng Kim Giao, 2003):
- Khai thác đƣợc nhiều nhất tiềm năng sinh sản của con cái, nhất là ở những
động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cái cao sản.
- Góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống và lai tạo giống
nhanh để đạt đƣợc những tính trạng mong muốn và năng suất cao.
- Đánh giá nhanh khả năng thụ tinh của những con đực giống.
- Cung cấp số lƣợng lớn phôi với giá thành hạ cho các nhà nghiên cứu và khai
thác tế bào mầm.
Hiện nay tỉ lệ phôi thai chó đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi trứng chín in vitro
(IVM), thụ tinh in vitro (IVF), nuôi cấy phôi (IVC) và chuyển cấy phôi (ET) vẫn còn
khá thấp (Farstad, 2000).
Vì vậy, để tiếp cận kĩ thuật thụ tinh in vitro và đáp ứng nhu cầu của xã hội về
những giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng kết quả nuôi cấy tế
bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó” đƣợc thực hiện.
1.2. Mục tiêu
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phôi và hoàn thiện khả năng thụ tinh của tinh
trùng, góp phần tăng khả năng thành công trong thụ tinh in vitro trên loài chó.


2

1.3. Yêu cầu
- Thiết lập quy trình nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng.

- Bố trí thí nghiệm để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tinh pha chế lên
khả năng hoạt hóa tinh trùng.

3

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng
2.1.1. Cấu tạo
Ống dẫn trứng đƣợc chia thành 4 đoạn (Trịnh Bình và ctv, 2004): đoạn tiếp giáp
sừng tử cung; đoạn eo; đoạn bóng phình to và đoạn loa có hình phễu, mở vào khoang
bụng, có những tua ít nhiều chụp lên mặt buồng trứng.
Thành ống dẫn trứng, từ trong ra ngoài, gồm ba tầng mô (Trịnh Hữu Hằng và
Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004): tầng niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ
ngoài.
- Tầng niêm mạc gồm biểu mô và lớp đệm.
Biểu mô đƣợc cấu tạo bởi bốn loại tế bào: tế bào có lông, tế bào không có
lông, tế bào đáy và tế bào trung gian.
Tế bào có lông: hình trụ, bào tƣơng sáng, đôi khi có hạt ở vùng chung
quanh nhân. Nhân hình trứng, kém bắt màu. Mặt tự do của tế bào có những lông dài
cắm vào thể đáy và chuyển động một chiều về phía tử cung. Bào tƣơng chứa ty thể, bộ
Golgi, lƣới nội bào và những hạt glycogen.
Tế bào không có lông: hình trụ, ít bào tƣơng. Nhân hình cầu hay hình
trứng, bắt màu đậm. Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao và những chỗ lõm
siêu vi. Bào tƣơng chứa bộ Golgi, ty thể, lƣới nội bào và những hạt chế tiết. Những tế
bào không lông là những tế bào chế tiết. Sản phẩm chế tiết của chúng rất cần thiết cho
noãn và tinh trùng đã lọt vào trong ống dẫn trứng.
Tế bào đáy: nhỏ, nằm rải rác, có bào tƣơng sáng, ít bào quan, nhân bắt
màu mạnh. Chức năng còn chƣa rõ ràng.
Tế bào trung gian: nằm chen vào giữa những tế bào có lông và tế bào chế
tiết. Nhân cũng bắt màu mạnh.
Lớp đệm ngăn cách với biểu mô ở màng đáy, có những chỗ lồi, đẩy biểu mô
lên và tạo thành những nếp nhăn của niêm mạc. Lớp đệm là một mô liên kết chứa

nhiều mạch máu và mạch bạch huyết. Trong lớp đệm có những tế bào hình thoi nhƣ
những nguyên bào sợi, một số tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân nằm trong một
lƣới sợi. Những tế bào hình thoi có tiềm năng phát triển giống nhƣ những tế bào ở lớp
đệm của nội mạc tử cung.
4

- Tầng cơ gồm hai lớp cơ trơn: lớp trong có các bó sợi cơ xếp theo hƣớng vòng; ở
lớp ngoài, các bó sợi xếp theo hƣớng dọc.
- Tầng vỏ ngoài: là một mô liên kết chứa mạch máu, dây thần kinh.
2.1.2. Chức năng
2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng
- Ống dẫn trứng là cơ quan tiếp nhận noãn đã đƣợc phóng thích từ buồng trứng
rồi vận chuyển về phía tử cung. Sự vận chuyển noãn trong lòng ống dẫn trứng đƣợc
tiến hành nhờ ba yếu tố:
+ Sự co bóp tầng cơ ống dẫn trứng là chủ yếu (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công
Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004).
+ Nhu động của các lông nhung theo hƣớng về phía tử. Estrogen có tác dụng
gây ra sự biệt hóa của tế bào có lông, còn progesterone có tác dụng tăng cƣờng sự
chuyển động của các lông.
+ Sự lôi cuốn noãn theo dòng nƣớc màng bụng. Nhờ hệ thống mạch bạch
huyết phong phú trong lớp đệm nên ống dẫn trứng là cơ quan hấp thụ nƣớc màng bụng
(Trịnh Bình và ctv, 2004).
- Sự vận chuyển tinh trùng trong ống dẫn trứng theo hƣớng ngƣợc lại sự vận
chuyển noãn, chủ yếu là nhờ sự co bóp của tầng cơ ống dẫn trứng.
2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Những sản phẩm của các tế bào chế tiết nằm trong biểu mô ống dẫn trứng đóng
vai trò quan trọng. Chúng tạo ra một môi trƣờng thuận lợi cho sự sống và sự chuyển
động của tinh trùng, làm cho tinh trùng đạt đƣợc khả năng gây thụ tinh cho noãn.
Chúng còn chứa những chất dinh dƣỡng rất cần thiết cho sự sống và phát triển của
noãn đã thụ tinh tới giai đoạn phôi nang, khiến cho phôi nang có thể làm tổ trong nội

mạc tử cung.
2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể
- Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng những loại tế bào bình thƣờng khác nhau để
nuôi cấy duy trì. Kết quả cho thấy mối liên quan nghịch giữa tuổi của mô cấy và vòng
đời sinh sản của tế bào. Ví dụ, tế bào gốc có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào biệt
hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trƣởng thành
(Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
5

- Tế bào đƣợc xem nhƣ đạt đến điểm cuối của vòng đời tái sản nếu mật độ tế bào
giảm còn phân nửa mật độ nuôi cấy ban đầu. Vòng đời tái sản có liên quan nghịch với
áp lực oxy xung quanh và có liên quan trực tiếp với mật độ nuôi cấy ban đầu (trích dẫn
từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
- Nhiều nghiên cứu gần đây đã đặt ra câu hỏi: khả năng tái sản có giới hạn của tế
bào trong nuôi cấy gắn liền với đặc tính của tế bào hay điều kiện nhân tạo do môi
trƣờng nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy có gây ra sự bất tử của tế bào hay không thì vẫn
chƣa đƣợc xác minh (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Tuy nhiên, ngƣời ta đã tạo
nên các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trƣởng liên tục trong môi
trƣờng nuôi cấy chuyền. Đó là những tế bào ung thƣ của cơ thể hoặc tế bào đƣợc làm
chuyển dạng “ung thƣ hóa” với những biến đổi di truyền. Ví dụ, tế bào HeLa đƣợc thu
nhận từ mô ung thƣ cổ dạ con, tế bào Namalwa là tế bào ung thƣ limphoma của chị
Namalwa (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
Có hai kiểu chết tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005):
+ Chết chƣơng trình: tế bào chết do thay đổi môi trƣờng sống, là quá trình phụ
thuộc ATP. Hình dạng tế bào nhăn nhúm, nhân vỡ, xuất hiện các thể tự hủy. Trong cơ
thể tế bào chết chƣơng trình sẽ đƣợc thực bào. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào, tế bào
chết chƣơng trình thƣờng xảy ra dƣới những điều kiện khác nhau:
Những dòng tế bào phụ thuộc yếu tố tăng trƣởng, tế bào chết chƣơng
trình do mất đi yếu tố tăng trƣởng.
Những dòng tế bào kết thúc sự biệt hóa khi nuôi cấy ngoài cơ thể, kết

thúc vòng đời tái sản.
Điều kiện nuôi cấy thay đổi hoặc nuôi cấy tế bào đã đạt mật độ cao.
Tế bào tiếp xúc với tác nhân gây độc tế bào.
+ Hoại tử tế bào: tế bào phồng to, nhiễm sắc thể “lên bông”, gây ly giải tế bào
trực tiếp, hoại tử tế bào nhanh chóng. Tế bào nuôi cấy ngoài cơ thể chết do quá trình
hoại tử, khi nhuộm trypan tế bào bắt màu xanh.
Sự sinh trƣởng của tế bào in vitro thƣờng trải qua 3 pha (Nguyễn Nhƣ Hiền,
2005):
+ Pha chậm (lag phase): là giai đoạn từ khi tế bào đƣợc cho vào môi trƣờng
đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Đây là khoảng thời gian tế bào thích nghi với môi
6

trƣờng mới (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Thời gian này dài hay ngắn tùy
thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô đƣợc trích tế bào.
+ Pha tiến triển (exponential growth): là giai đoạn tế bào phân chia liên tục,
tăng nhanh số lƣợng tế bào trong khoảng thời gian 15-25 giờ với số lƣợng tế bào đạt 1-
2.10
6
/cm
3
, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. Độ dài của pha này phụ thuộc dinh
dƣỡng, tốc độ phát triển, mật độ mà sự tái sản tế bào bị ức chế. Ở pha này, tốc độ phát
triển tế bào cao nhất (90% – 100%), tế bào đồng nhất và khả năng tái sản cao (trích
dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
+ Pha dừng (stationary phase): là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số
lƣợng tế bào không thay đổi, tức là giai đoạn mà môi trƣờng dinh dƣỡng nghèo dần và
bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện sự tự hoại tế
bào: nhân bị đứt chẻ, trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối (blebs).
2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào
2.3.1. Bề mặt chai cấy

Sự bám dính và phát triển tế bào có thể cải thiện bằng nhiều cách: dùng chai cấy
tái sử dụng tráng phủ một lớp collagen, fibronectin, gelatin… Gelatin thƣờng đƣợc
phủ lên bề mặt đĩa nhựa vì có lợi cho sự nuôi cấy tế bào cơ và tế bào biểu mô màng
trong (Freshney, 1987).
Độ sâu của môi trƣờng: tốt nhất từ 2 – 5 mm ( 0,2 – 0,5 ml/cm
2
), độ sâu của môi
trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng thấm nhập của oxy xuyên qua môi trƣờng đến tế bào
(trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
2.3.2. Các đặc tính vật lý
2.3.2.1. pH
Hầu hết các dòng tế bào phát triển ở pH 7,4. pH tối ƣu để phát triển thay đổi rất
ít ở những dòng tế bào khác nhau. Phenol red đƣợc bổ sung vào môi trƣờng làm chất
chỉ thị pH (Freshney, 1987). Nếu môi trƣờng chuyển dần từ đỏ sang vàng cam là tế
bào phát triển tốt, nếu từ đỏ chuyển sang vàng nhạt là môi trƣờng bị nhiễm khuẩn
(Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).




7

Bảng 2.1. Giá trị pH và màu sắc môi trƣờng (nguồn: Freshney, 1987)

* dùng phenol red
2.3.2.2. Dung dịch đệm
Đệm bicarbonate vẫn đƣợc sử dụng nhiều hơn các dung dịch đệm khác bởi vì ít
độc, giá rẻ và thuận lợi cho quá trình trao đổi chất mặc dù khả năng đệm kém ở pH
sinh lý. Hepes có khả năng đệm hiệu quả hơn ở pH từ 7,2 – 7,6 và thƣờng đƣợc sử
dụng ở nồng độ 10 hoặc 20 mM (Freshney, 1987).

2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến tế bào nuôi cấy. Ở những loài
khác nhau thì áp suất thẩm thấu của huyết tƣơng khác nhau. Ví dụ: ở ngƣời khoảng
290 mOsm/kg, ở chuột khoảng 310 mOsm/kg. Trong thực nghiệm, thƣờng điều chỉnh
trong khoảng từ 260 – 320 mOsm/kg (Freshney, 1987).
2.3.2.4. Nhiệt độ (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005)
- Nhiệt độ giảm sẽ làm giảm sự phát triển nhƣng không làm giảm khả năng sống
của tế bào, trừ khi thời gian hạ nhiệt độ kéo dài hơn 3 ngày.
- Nhiệt độ gia tăng sẽ làm tăng sự phát triển nhƣng sẽ làm giảm khả năng sống
của tế bào.
- Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến pH. Ở nhiệt độ thấp, CO
2
hòa tan tăng nên làm
thay đổi sự ion hóa.
2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí
Áp lực bề mặt của môi trƣờng hỗ trợ sự bám dính của tế bào vào đáy bình nuôi
cấy nhƣng ít đƣợc ứng dụng. Nuôi cấy ở điều kiện 5% CO
2
sẽ tạo bọt khí mà bọt khí
có liên quan đến lƣợng protein thoái hóa và nguy cơ nhiễm khuẩn (Freshney, 1987).



pH
Màu*
6,5
7,0
7,4
7,6
7,8

Vàng
Cam
Đỏ
Hồng nhạt
Tím
8

2.3.2.6. Độ nhớt
Độ nhớt của môi trƣờng đƣợc quyết định chủ yếu bởi huyết thanh và một phần do
sự phát triển của tế bào. Tăng độ nhớt của môi trƣờng với carboxy methyl cellulose
hoặc polyvinyl pyrolidone sẽ làm giảm sự hƣ hại của tế bào trong lúc khuấy và xử lí
trypsin (Freshney, 1987).
2.3.3. Tủ cấy
Số lần mở, sự rung lắc của tủ cấy ảnh hƣởng đến sự phát triển và sự phân bố của
tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
2.3.4. Kháng sinh
- Kháng sinh đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để làm giảm khả năng
nhiễm khuẩn. Tuy nhiên với kỹ thuật thao tác vô trùng có thể không cần sử dụng
kháng sinh vì có một số bất lợi nhƣ sau (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005):
+ Tạo điều kiện thuận lợi cho sự đề kháng kháng sinh của vi sinh vật.
+ Che dấu sự nhiễm khuẩn tiềm ẩn ở mức độ thấp và nhiễm Mycoplasma.
+ Ảnh hƣởng tế bào động vật hữu nhũ.
+ Tạo tâm lý chủ quan trong việc thực hiện kỹ thuật vô trùng.
+ Nhiễm nấm khó đƣợc kiểm soát.
- Nồng độ kháng sinh thƣờng sử dụng (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005):
+ Streptomycine: 100 µg/ml
+ Penicilline: 100 UI/ml
+ Gentamycine S: 250 µg/ml
2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào
2.4.1. Nguồn nhiễm (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005)

Không khí ẩm của tủ nuôi cấy là nguồn nhiễm chính và nhiễm có thể xảy ra ở bất
cứ giai đoạn nào, thao tác nào.
Tác nhân gây nhiễm: vi trùng, nấm men, nấm mốc, Mycoplasma, protozoa…
Theo dõi nhiễm: bằng mắt dƣới kính hiển vi.
2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền,
2005)
- Thay đổi pH đột ngột dẫn đến thay đổi màu sắc của chỉ thị màu trong môi
trƣờng. pH giảm rõ trong trƣờng hợp nhiễm trùng. Khi nhiễm nấm men, pH thay đổi ít,
trừ khi nhiễm nấm men nhiều. Tăng pH khi nhiễm nấm sợi.
9

- Đục môi trƣờng hoặc cặn ở đáy.
- Dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần, giữa những tế bào có những hạt
lấp lánh là môi trƣờng đã bị nhiễm khuẩn, hình tròn có những nụ nhỏ là nấm men.
- Nấm sợi: nhiều sợi mảnh, có thể thấy đám đậm độ của bào tử.
- Nhiễm Mycoplasma: có những dấu hiệu hủy hoại tế bào. Xác định Mycoplasma
bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, PCR, ELISA…
2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác (trích dẫn từ Phan Kim Ngọc, 2002)
- Mang găng tay khi thao tác.
- Sử dụng áo blouse, khẩu trang và nón che kín tóc.
- Hạn chế việc mang vật dụng cá nhân khi thao tác vô trùng.
- Trƣớc khi vào phòng thí nghiệm: vệ sinh cá nhân tốt, rửa sạch tay bằng xà
phòng, sát trùng bằng javel và cồn, chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ, môi trƣờng cần sử
dụng trong suốt thời gian làm việc, khử trùng phòng và tủ cấy bằng tia UV.
- Sau khi làm việc trong phòng thí nghiệm: dọn vệ sinh tủ cấy và phòng, sắp xếp
các dụng cụ và thiết bị gọn gàng đúng qui định, các dụng cụ đã sử dụng cần đƣợc rửa
sạch và sấy khô tại khu vực rửa dụng cụ, tắt các thiết bị không cần sử dụng, rửa sạch
tay bằng xà phòng và sát trùng bằng javel và cồn.
- Tất cả các mẫu vật, hóa chất dƣ thừa phải đƣợc mang ra khỏi khu vực thao tác
và đƣợc xử lý cẩn thận.

2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Freshney, 1987)
- Dung dịch đệm: sự lựa chọn dung dịch đệm phụ thuộc vào nồng độ CO
2
(bảng
2.2),

dung dịch tách mô, lớp đơn tế bào.
Bảng 2.2. Mối quan hệ giữa HCO
3
-
, CO
2
và HEPES (nguồn: Freshney, 1987)
Pha khí
Pha lỏng
CO
2

HCO
3
-

HEPES

Không khí
2%
5%
4 mM
8 mM
24 mM

10 mM
20 mM
50 mM

- Acid amin: nồng độ acid amin quyết định khả năng duy trì nồng độ tế bào tối
đa, ảnh hƣởng đến sự sống còn và tỉ lệ phát triển của tế bào.
10

- Vitamin: thông thƣờng chỉ bổ sung vitamin nhóm B vào môi trƣờng nuôi cấy vì
những vitamin khác đã có đủ trong huyết thanh. Việc thêm vitamin vào môi trƣờng
nuôi cấy chứa nồng độ huyết thanh thấp là cần thiết.
- Muối: K
+
, Na
+
, Mg
2+
, Ca
2+
, SO
4
2-
, Cl
-
, PO
4
3-
, HCO
3
-

… là thành phần chính tạo
áp lực thẩm thấu môi trƣờng. Nồng độ muối NaHCO
3
phụ thuộc vào nồng độ CO
2

trong pha khí.
- Glucose: đƣợc bổ sung vào trong hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy tế bào, đóng
vai trò là nguồn năng lƣợng chính.
- Chất hữu cơ: gồm nucleosides, những chất trung gian trong chu trình acid citric,
pyruvate và lipid. Sự bổ sung những chất này cần thiết cho quá trình tạo dòng hoặc
duy trì dòng tế bào đặc biệt.
- Hormon và các yếu tố tăng trƣởng: gồm insulin, hydrocortisone, PDGF, EGF,
FGF, IGF… Insulin giúp hấp thu glucose, acid amin và ảnh hƣởng đến sự phân bào.
IGF gắn đặc hiệu với thụ thể của insulin trên bề mặt của tế bào và có tác dụng tƣơng tự
insulin. Hydrocortisone làm tăng sự bám dính, thúc đẩy tăng sinh tế bào (Guner và ctv,
1977; McLean và ctv, 1986), ngăn cản sự phân bào (Freshney và ctv, 1980) và tăng sự
biệt hóa tế bào.
- Huyết thanh: đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp hormon, yếu
tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, acid amin, vitamin, chất khoáng, chất ức chế,
ketoacid, glucose và một số chất dinh dƣỡng khác.
2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng
2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp
Theo Phan Kim Ngọc (2002), nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên
những tế bào đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan. Các tế bào thu đƣợc trong lần nuôi cấy
này gọi là tế bào sơ cấp. Các tế bào sơ cấp thƣờng không thuần nhất vì là hậu duệ của
nhiều tế bào ban đầu khác nhau.
Nuôi cấy sơ cấp gồm 2 phƣơng pháp: nuôi cấy tế bào từ mảnh mô và nuôi cấy
tế bào sau tách mô bằng enzyme (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
- Nuôi cấy tế bào từ mảnh mô là phƣơng pháp nuôi cấy những mảnh mô đã

đƣợc cắt nhỏ (1 mm
3
), trên môi trƣờng thể tích nhỏ với nồng độ huyết thanh cao. Áp
lực bề mặt giúp mảnh mô tƣơng đối cố định, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào bám
dính vào bề mặt đáy đĩa và phát triển. Phƣơng pháp này không sử dụng enzyme
11

trypsin nên hạn chế đƣợc nguy cơ tổn thƣơng tế bào, nhƣng tế bào phát triển chậm. Vì
vậy, phƣơng pháp này thích hợp cho nuôi cấy các loại tế bào dễ bị tổn thƣơng và tránh
đƣợc nguy cơ mất tế bào.
- Nuôi cấy tế bào sau tách mô bằng enzyme là phƣơng pháp nuôi cấy những tế
bào đã đƣợc tách riêng lẻ nhờ phản ứng của enzyme (trypsin, collagenase,…). Phƣơng
pháp này tách đƣợc số lƣợng lớn tế bào trong thời gian ngắn trƣớc khi nuôi cấy nhƣng
tế bào dễ bị tổn thƣơng và đòi hỏi khối lƣợng mô nhiều hơn phƣơng pháp nuôi cấy tế
bào từ mảnh mô. Nồng độ tế bào trƣớc và sau nuôi cấy đƣợc xác định và số lƣợng đặc
trƣng cho từng loại tế bào nuôi cấy. Enzyme trypsin thƣờng đƣợc sử dụng trong
phƣơng pháp nuôi cấy này với 2 dạng là trypsin ấm và trypsin lạnh. Trypsin ấm mặc
dù làm tổn thƣơng tế bào nhiều hơn nhƣng tách tế bào nhanh hơn nên đƣợc ƣa chuộng
hơn phƣơng pháp trypsin lạnh. Có thể hạn chế tác động của trypsin làm tổn thƣơng tế
bào bằng cách nhũ tƣơng hóa cặn sau khi tách tế bào trong môi trƣờng có bổ sung
huyết thanh, lƣu trữ tạm trong điều kiện lạnh hoặc làm tăng độ nhớt của môi trƣờng.
2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp
Theo Phan Kim Ngọc (2002), sau khi tế bào nuôi cấy sơ cấp đã phân chia đầy
đủ (tế bào một lớp đạt 80% bề mặt giá thể), ngƣời ta xử lý chúng với trypsin hoặc
trypsin - EDTA để tách rời các tế bào. Một phần trong số tế bào đó đƣợc dùng để nhân
số lƣợng tế bào lên trong lần nuôi cấy tiếp theo đƣợc gọi là nuôi cấy chuyền hay nuôi
cấy thứ cấp.
2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue
Theo Nigel Jenkins 1999, trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào
trƣớc khi đếm. Chất nhuộm này thâm nhập vào màng của những tế bào không còn khả

năng tồn tại hoặc phát triển, những tế bào này bắt màu xanh. Vì vậy có thể phân biệt
đƣợc chúng với những tế bào còn sống (không bắt màu với chất nhuộm này). Dung
dịch trypan blue có nồng độ 2%, đƣợc pha trong PBS (phosphate – buffered saline).
Dung dịch trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào với tỉ lệ 1:1, thời gian
2 phút ở nhiệt độ phòng.
2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng
2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi
Năm 1992, Xu và ctv đã thành công trong việc tạo phôi bò in vitro bằng
phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa phôi bò và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của bò
12

(bovine oviductal epithelial cells, BOEC). BOEC này đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp
nuôi cấy tế bào từ mảnh mô, những mảnh BOEC đƣợc tách bằng cách dùng 2 kẹp vuốt
mạnh ống dẫn trứng. Sau một đêm nuôi cấy BOEC trong môi trƣờng nuôi cấy, hình
ảnh những mảnh BOEC trông giống nhƣ cấu trúc hình sâu (worm-like). Bởi vì trong
mảnh BOEC có một số tế bào chết và tế bào sống đƣợc thấy rất rõ khi quan sát dƣới
kính hiển vi, thêm vào đó là sự xuất hiện và chuyển động của những lông rung của
BOEC. Đến ngày nuôi cấy thứ ba một số BOEC có khả năng hình thành lớp đơn
(monolayer) trông giống nhƣ cấu trúc bóng nƣớc (vesicle-like). Sự tồn tại của BOEC
đƣợc xác định qua sự chuyển động của lông rung, lông rung này vẫn đƣợc thấy đến
ngày nuôi cấy thứ 10. Một số tế bào bắt đầu bám vào đáy đĩa vào ngày thứ tƣ hoặc thứ
năm. Nhƣng chúng không hình thành lớp đơn phân tử (tạo vesicle-like), thậm chí đến
ngày thứ 10. Những tế bào và những “bóng nƣớc” (vesicle-like) tồn tại đến 7 tuần nuôi
cấy.
2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó
Năm 2002, Luisa Bogliolo và ctv đã thành công trong việc làm tăng tỉ lệ chín
của trứng chó in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa trứng và tế bào biểu mô
ống dẫn trứng của chó. Những tế bào biểu mô này đƣợc tách bằng cách dùng dao cạo
trên bề mặt trong của ống dẫn trứng và chúng đƣợc tạo huyễn dịch trong môi trƣờng
nuôi cấy chín trứng với nồng độ xấp xỉ 10

4
tế bào/ml. Sau 48 giờ đồng nuôi cấy, tỉ lệ
phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII mà không đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô là
4%. Khi đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô của đoạn loa và đoạn bóng của ống dẫn
trứng, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII tƣơng ứng là 15,6% và 16,7%.
2.9. Tinh trùng
2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng
Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy
ra khi bắt đầu thành thục tính dục. Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào
mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng. Theo Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy
(2001), quá trình này có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn tạo tế bào mầm (giao tử),
biệt hóa chức năng để thụ tinh (phân bào giảm nhiễm) và biệt hóa về cấu trúc để có
khả năng di chuyển chủ động.
- Sự tạo giao tử: trong giai đoạn đầu của bào thai, các tế bào mầm di chuyển
đến tuyến sinh dục đang phát triển. Trong trƣờng hợp sinh tinh, các tế bào này vào
13

trong ống tinh của tinh hoàn. Những tế bào mầm này chƣa trƣởng thành gọi là tinh
nguyên bào, sẽ phát triển bằng cách phân bào nguyên nhiễm. Tinh nguyên bào nằm
dọc bờ ngoài của ống tinh, gần với các tế bào đệm (tế bào Sertoli). Các tế bào Sertoli
tồn tại trong suốt cuộc đời tính dục và số lƣợng của chúng là nhân tố hạn chế việc sản
sinh tinh trùng. Trƣớc tuổi thành thục tính dục, các tinh nguyên bào không hoạt động.
Từ tuổi thành thục sinh dục trở đi, tinh nguyên bào phân chia liên tục bằng quá trình
phân bào nguyên nhiễm tạo nên nhiều tế bào và cung cấp liên tục các tế bào mới (tinh
trùng).
- Sự biệt hóa về chức năng: một vài tế bào dừng phân chia và biệt hóa thành tế
bào tinh trùng nguyên thủy. Mỗi tế bào tinh trùng nguyên thủy trải qua quá trình phân
bào giảm nhiễm. Phân chia giảm nhiễm đầu tiên tạo ra 2 tế bào tinh trùng thứ cấp, khi
quá trình phân chia giảm nhiễm thứ 2 hoàn thành tạo nên 4 tiền tinh trùng đơn bội. Sự
sinh tinh nhạy cảm với điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là sự thay đổi về nhiệt độ. Nhiệt

độ thích hợp là khoảng 2 độ dƣới nhiệt độ cơ thể.
- Sự biệt hóa về cấu trúc: các tiền tinh trùng biệt hóa thành tinh trùng trƣởng
thành. Quá trình biệt hóa này gọi là hiện tƣợng sinh tinh. Các tiền tinh trùng dài ra
phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dƣới của tế bào Sertoli qua các
cầu nối bào tƣơng. Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng
(tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002). Chỉ sau khi sự biệt
hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh. Cuối cùng tinh trùng
vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục
trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định. Độ dài thời gian của quá trình sinh
tinh trùng là ổn định cho mỗi loài.
2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng
Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), nhƣ những tế bào khác,
tinh trùng cũng đƣợc bao bọc bởi màng tế bào và cũng có các cấu trúc bên trong
(nhân, ty thể…). Cấu tạo gồm 3 phần (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phần đầu
chứa vật chất di truyền, phần cổ và đuôi có liên quan đến chức năng vận động. Đầu
mang acrosome nổi rõ và đƣợc nối chặt với phần cổ, do đó hiện tƣợng mất đầu trên
tinh trùng chó xảy ra với tần số thấp hơn so với ngựa và các loài nhai lại. Tinh trùng
chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác. Nó có dạng sợi dài, đƣờng
kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm.
14

- Đầu tinh trùng: dài khoảng 5,6 µm, có 2 phần gồm nhân và thể chóp
acrosome. Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc
biệt là những phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp song song và gắn rất chặt
chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần nhƣ cấu trúc của tinh thể. Nhân chiếm
65% thể tích của đầu tinh trùng. Số nhiễm sắc thể trong tinh trùng là đơn bội, không có
RNA. Phần trƣớc đƣợc bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng nhƣ 1 cái túi mỏng
gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân. Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân
nhƣ: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid. Chúng có liên
quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh.

- Cổ tinh trùng: là phần rất ngắn, dài 1 µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy
phía sau của nhân. Tế bào chất ở cổ có chứa 2 trung tử: trung tử gần nằm sát nhân,
trung tử xa nằm xa nhân hơn và từ đó bắt nguồn của 9 cặp sợi trục kéo dài đến tận đuôi
tinh trùng.
- Đuôi tinh trùng: dài khoảng 49,26 - 50,26 µm, đƣợc bao bọc bằng 1 màng
chung và đƣợc chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi. Đoạn giữa nằm
từ cổ đến vòng nhẫn Jensen, có tiết diện lớn hơn đoạn chính và chót đuôi. Lõi của
đoạn giữa và toàn bộ chiều dài của đuôi là một tập hợp bó trục. Tập hợp này gồm 9
cặp vi ống ngoài xếp đồng tâm xung quanh 2 vi ống đơn ở trung tâm và chúng đƣợc
bao quanh bằng 9 sợi chắc, dày. Bó trục và những sợi ƣa áp suất của đoạn giữa đƣợc
phủ bên ngoài bằng những ty thể. Bọc ty thể chứa các enzyme oxy hóa và
oxyphosphoryl hóa. Trong đoạn giữa cũng có nhiều chất dự trữ năng lƣợng:
phospholipid, lecithin, plasmalogen… Vì vậy, ty thể đƣợc xem nhƣ nguồn phát sinh
năng lƣợng cần thiết cho hoạt động của tinh trùng. Đoạn chính là đoạn dài nhất của
đuôi tinh trùng, bắt đầu từ vòng nhẫn Jensen kéo dài đến chỗ tiếp giáp với chót đuôi.
Khác với đoạn giữa, đoạn này không có bọc ty thể. Một vỏ bọc gồm những sợi chắc
phủ bên ngoài đoạn chính và đoạn giữa có vai trò duy trì khả năng ổn định cho các yếu
tố co rút của đuôi. Chót đuôi là phần tận cùng, ngắn nhất của đuôi. Nó chỉ gồm những
sợi của bó trục trung tâm và đƣợc bao bọc bằng màng tế bào.
2.9.3. Đặc tính của tinh trùng
Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài
tuần nhƣng khi đƣợc phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ. Khi trữ ở nhiệt
độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn.
15

Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động về phía
trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và
tính tiếp xúc với điện. Tinh trùng sống thì luôn luôn chuyển động. Đuôi ngoằn ngoèo
uốn khúc chuyển động gây một xung động để tự tiến tới trƣớc. Ngoài ra, tinh trùng có
đầu giống hình quả lê nên tự nó chuyển động xung quanh trục của thân nó. Sự rung

động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động
tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội
tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức
phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng
chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu
hƣớng lội ngƣợc dòng nƣớc, ngƣợc với trọng lực của giọt tinh dịch. Đối với một vật lạ,
tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn
trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm
của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng
hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi
là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản
thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, đặc tính của dòng điện chạy từ
cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định.
2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái
Sự vận chuyển của tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái đƣợc ghi nhận gồm 3
giai đoạn (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997): vận chuyển nhanh,
thành lập các ổ chứa và phóng thích chậm, kéo dài. Ngay sau khi đƣợc phóng thích,
tinh trùng di chuyển nhanh chóng nhờ vào khả năng hoạt động của chúng cũng nhƣ
nhờ có hoạt động co rút tăng lên của lớp cơ tử cung và màng treo ống dẫn trứng. Thời
gian của giai đoạn vận chuyển nhanh này kéo dài khoảng 2 – 10 phút. Khi di chuyển,
tinh trùng đƣợc tách khỏi tinh thanh và hoà vào dịch tiết của đƣờng sinh dục cái. Phần
lớn tinh trùng đƣợc giữ lại trong những nếp màng nhầy phức tạp của các hốc trong cổ
tử cung, thiết lập những ổ chứa tinh trùng. Ở loài chó, ổ chứa tinh trùng khu trú trong
các tuyến nội mạc tử cung. Sau khi đã thiết lập đủ các ổ chứa tinh trùng trong đƣờng
sinh dục, tinh trùng đƣợc phóng thích liên tiếp trong thời gian dài. Sự phóng thích
chậm rãi này đảm bảo cho tinh trùng có khả năng liên tục tiến vào ống dẫn trứng để
thụ tinh trứng. Tốc độ và kiểu hoạt động của tinh trùng đƣợc thay đổi khi tinh trùng