phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở huyện sơn hòa, tỉnh phú yên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC





PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH
VI KHUẨN NỘI SINH CÂY LÚA
TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở HUYỆN SƠN HÒA,
TỈNH PHÚ YÊN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Gs. Ts. CAO NGỌC ĐIỆP TRẦN HẢI MY
MSSV: 3092490
LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, Tháng 11/2013
PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)



Cao Ngọc Điệp Trần Hải My



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

……………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp và Ths. Văn Thị Phương Như đã tận tình hướng dẫn,
truyền đạt kinh nghiệm, góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn
tốt nghiệp đại học này.
Ban Lãnh đạo Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, trường Đại học
Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập và thực hiện luận văn.
Quý thầy cô Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, trường Đại học
Cần Thơ đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học
tập.
Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ và chị Trần Thị Giang - cán bộ phòng thí nghiệm vi
sinh vật đất và vi sinh vật môi trường Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh
học, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ thiết bị, dụng cụ
cũng như hóa chất giúp tôi thực hiện tốt luận văn.
Tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 35 và anh chị em ở phòng thí
nghiệm vi sinh vật đất và vi sinh vật môi trường đã giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn
trong quá trình tôi học tập và thực hiện luận văn.
Cuối lời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Cha, Mẹ, những người thân và bạn bè đã
luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận
văn tốt nghiệp đại học này.
Xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến những sự quan tâm và giúp đỡ quý báo này!

i
TÓM LƢỢC

Hai mươi sáu dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập trên môi trường RMR từ
rễ và thân của 9 mẫu lúa thu ở 3 địa điểm thuộc huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên. Tất cả
các dòng vi khuẩn đều thuộc Gram âm, tế bào có dạng hình que và có khả năng

chuyển động. Kết quả khảo sát cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn này đều có khả năng
cố định đạm, hòa tan lân khó tan và sinh tổng hợp IAA, trừ 2 dòng SH22 và SH26
không có khả năng tổng hợp IAA trong điều kiện không có tryptophan. Trong đó,
lượng NH
4
+
cao nhất được dòng SH22 tổng hợp (4,175 µg/ml) sau 4 ngày chủng, dòng
SH4 hòa tan được lượng P
2
O
5
cao nhất (196,188 µg/ml) ở ngày thứ 15 và dòng SH9
sinh tổng hợp được lượng IAA cao nhất (13,333 µg/ml) ở ngày thứ 4 sau khi chủng
trong môi trường RMR không bổ sung tryptophan trong khi dòng SH16 lại tổng hợp
được IAA cao nhất (19,250 µg/ml) ở ngày thứ 4 trong môi trường có bổ sung
tryptophan. Trong 26 dòng vi khuẩn phân lập được, tám dòng vi khuẩn nội sinh có đặc
tính tốt nhất, trong đó 4 dòng khả năng cố định đạm tốt đồng thời cũng có khả năng
hòa tan lân khá cao và tổng hợp IAA khá tốt so với những dòng khác là SH9, SH15,
SH16 và SH18 và 4 dòng SH4, SH6, SH7 và SH17 có khả năng hòa tan lân cao nhất
trong tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được.

Từ khóa: cây lúa, cố định đạm, hòa tan lân, huyện Sơn Hòa, IAA, vi khuẩn nội sinh




ii
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
TỪ VIẾT TẮT vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
2.1. Sơ lƣợc về cây lúa 3
2.1.1. Đặc điểm sinh vật học của cây lúa 4
2.1.2. Nhu cầu về dinh dưỡng của cây lúa 5
2.2. Khát quát về vi khuẩn nội sinh 7
2.2.1. Giới thiệu 7
2.2.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật không thuộc họ đậu 7
2.2.3. Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 14
2.3. Địa lý và điều kiện tự nhiên huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên 18
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 20
3.2.1. Dụng cụ, thiết bị 20
3.2.2. Nguyên vật liệu 20
3.2.3. Hóa chất 20
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 24
3.3.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn 24
3.3.2. Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc 25
iii
3.3.3. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 25
3.3.4. Xác địnhđặc tính những dòng vi khuẩn nội sinh 26
3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƢƠNG 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
4.1. Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập 32
4.1.1. Phân lập vi khuẩn 32
4.1.2. Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập 34
4.3. Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn 41
4.4. Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn 44
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
5.1. Kết luận 51
5.2. Đề nghị 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Các hình ảnh
Phụ lục 2: Kết quả khả năng tổng hợp đạm của các dòng vi khuẩn
Phụ lục 3: Kết quả khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn
Phụ lục 4: Kết quả khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn
1. Kết quả khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn trên môi trƣờng RMR
không bổ sung tryptophan
2. Kết quả khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn trên môi trƣờng RMR
có bổ sung tryptophan
iv
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001) 21
Bảng 2: Thành phần môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005) 22
Bảng 3: Thành phần môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999) 23
Bảng 4: Thành phần của dãy đường chuẩn NH
4
+
27
Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P

2
O
5
29
Bảng 6: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA 30
Bảng 7: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường RMR 33
Bảng 8: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường RMR 35
Bảng 9: Tỷ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
36
Bảng 10: Khả năng tổng hợp NH
4
+
của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi
trường RMR sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày chủng 40
Bảng 11: Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường
RMR sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày chủng 43
Bảng 12: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường
RMR không có bổ sung tryptophan sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày
chủng 46
Bảng 13: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường
RMR có bổ sung tryptophan sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày chủng 48

v
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Cây lúa (*Nguồn: ngày 17/07/2013) . 4
Hình 2: Tổng quát các lộ trình sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn (Spaepen et al., 2007) . 17
Hình 3: Vòng pellicle xuất hiện cách mặt môi trường RMR bán đặc 0,5 cm 34
Hình 4: Đặc điểm của một số khuẩn lạc phân lập trên môi trường RMR 37
Hình 5: Lượng đạm tổng hợp trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn theo ngày sau

khi chủng 41
Hình 6: Lượng lân hòa tan trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn theo ngày sau khi
chủng 44
Hình 7: Lượng IAA tổng hợp trung bình của các dòng vi khuẩn nuôi trong môi trường
RMR không bổ sung tryptophan theo ngày sau khi chủng 47
Hình 8: Lượng IAA tổng hợp trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn nuôi ở môi
trường RMR có bổ sung tryptophan theo ngày sau khi chủng 49
Hình 9: Lượng IAA tổng hợp trung bình của 26 dòng vi khuẩn phân lập được nuôi
trong môi trường RMR không có bổ sung tryptophan và có bổ sung
tryptophan 49

vi
TỪ VIẾT TẮT
IAA Indole-3-acetic acid
IAAld Indole-3-acetaldehyde
IAM Indole-3-acetamide
IPA Indole-3-pyruvate
IPDC Indole-3-pyruvate decarboxylase
LSD Least Significant Difference Test
N Nitrogen
NBRIP National Botanical Research Institute's Phosphate growth medium
P Phosphor
RMR Rennie Medium supplemented with Rice and malate
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa (Oryza sativa L.) là loại ngũ cốc quan trọng nhất trên thế giới và là nguồn
lương thực của hơn 50% dân số trên thế giới (Gyaneshwar et al., 2001). Với nhu cầu
về lúa gạo ngày càng tăng, sản lượng và chất lượng lúa gạo cũng phải tăng để đáp ứng

nhu cầu đó. Để đạt sản lượng mong muốn, nông dân đã sử dụng một lượng lớn phân
bón hóa học và thuốc trừ sâu trong canh tác lúa.
Khoảng 60% phân đạm hóa học được sử dụng để bón cho ngũ cốc, trong đó
khoảng 10% sử dụng cho sản xuất lúa gạo. Tuy nhiên, cây trồng chỉ sử dụng được hơn
50% lượng phân bón này. Việc sử dụng không hiệu quả phân đạm góp phần làm ô
nhiễm nitrat trong đất và nước ngầm, dẫn đến ảnh hưởng tiêu cực tới sức khỏe con
người và sự phát triển nông nghiệp bền vững. Hơn nữa, sản xuất phân đạm đòi hỏi
năng lượng nhiều gấp sáu lần so với năng lượng cần thiết để tạo ra phân lân hoặc phân
kali (Da Silva et al., 1978).
Ngoài đạm, lân cũng là một nguyên tố dinh dưỡng chính của cây trồng, có tác
dụng thúc đẩy sự phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng. Thiếu lân,
năng suất cây trồng bị giảm sút, ngay cả khi được cung cấp đủ đạm (Nguyễn Minh
Hưng, 2007). Tuy nhiên, phần lớn lân trong đất ở dạng vô cơ khó tan hoặc hữu cơ mà
cây trồng không thể hấp thụ được. Nguồn bổ sung chủ yếu là phân lân vô cơ và phân
lân hóa học nhưng theo Premono et al. (1996) thì cây trồng chỉ có thể hấp thu 0,1%
lượng lân bón vào, phần lớn lượng lân còn lại chuyển thành dạng khó tan phải nhờ đến
vi sinh vật chuyển hóa thành dạng lân dễ tan để cây trồng hấp thụ.
Để giảm nhu cầu sử dụng phân bón hóa học, vi khuẩn nội sinh thực vật đóng vai
trò quan trọng. Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở rễ, vùng
rễ, thân và lá của nhiều loại cây trồng như lúa, khóm, ngô, mía, sài đất,… và có nhiều
đặc tính như khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan, sinh tổng hợp những hormone
tăng trưởng thực vật. Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật có những đặc
tính tốt trong sản xuất phân bón sinh học và canh tác lúa cũng như một số loại cây
trồng khác là rất lớn và là một trong những biện pháp hiệu quả để tăng năng suất cây
trồng, giảm lượng phân bón hóa học cũng như giảm tác động xấu do phân hóa học gây
ra cho đất, cải thiện nông nghiệp và bảo vệ môi trường.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Trên thế giới, nhiều vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở rễ, vùng rễ và thân cây lúa
như Azospirillum sp., Burkholderia sp., Enterobacter sp., Herbaspirillium sp.,

Klebsiella sp.,… (Koomnok et al., 2007; Mano và Morisaki, 2008). Ở Việt Nam, đặc
biệt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn
nội sinh ở cây lúa như phân lập được Burkholderia vietnamiensis, Azospirillum
lipoferum từ cây lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Van et al., 1994; Cao Ngọc Điệp et
al., 2007). Bên cạnh đó, hiệu quả của những dòng vi khuẩn nội sinh trên các giống lúa
cao sản cũng được nghiên cứu như Pseudomonas stutzeri với cây lúa cao sản trồng
trên đất phù sa nông trường Sông Hậu, Cần Thơ (Ngô Thanh Phong và Cao Ngọc
Điệp, 2011). Tuy nhiên, việc nghiên cứu và hiểu biết về các loài vi khuẩn nội sinh hữu
ích ở cây lúa trồng ở miền Trung, đặc biệt vùng miền núi của tỉnh Phú Yên - Phú Yên
là một trong những vựa lúa lớn của miền Trung - vẫn còn nhiều hạn chế.
Vì các lý do trên, đề tài “Phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh cây
lúa trồng trên đất ở huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập được một số dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa và khảo sát đặc tính cố định
đạm, hòa tan lân khó tan và sinh tổng hợp IAA của những dòng vi khuẩn nội sinh này.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về cây lúa
Cây lúa (Oryza spp.) là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới.
Lúa trồng thuộc hai loài (Oryza sativa và Oryza glaberrima) trong họ Poaceae, có
nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khu vực Đông Nam Châu Á và Châu Phi.
Oryza sativa, thường được gọi là lúa Châu Á, chứa hai phân loài lớn, thứ (var.)
japonica hoặc jinica hạt to và ngắn, phát triển ở vùng khí hậu ôn đới và thứ (var.)
indica hạt dài, phát triển ở vùng nhiệt đới Châu Á.
Chi Oryza Sativa var japonica thường được trồng trong các khu vực khô, vùng
Đông Á ôn đới, các vùng cao của khu vực Đông Nam Á và các sơn nguyên có độ cao
ở Nam Á, trong khi chi Oryza Sativa var indica chủ yếu là trồng ở vùng đồng bằng.
Lúa trồng là các loài thực vật sống một năm, có thể cao tới 1-2 m, đôi khi cao
hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (1-2,5 cm) và dài 30-100 cm. Các hoa nhỏ tự thụ phấn

mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống và dài 20-40 cm. Hạt là loại
quả thóc (hạt nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5-12 mm và dày 2-3 mm
(
2013).
Cây lúa sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 20º- 30ºC, nhiệt độ càng tăng cây
lúa phát triển càng mạnh. Khi nhiệt độ trên 40ºC hoặc dưới 17ºC, cây lúa tăng trưởng
chậm lại, thấp hơn 13ºC cây lúa ngừng sinh trưởng, nếu kéo dài một tuần lễ cây lúa sẽ
chết. Cây lúa cần lượng mưa khoảng 900-1000 mm cho một vụ và nhu cầu nước qua
các thời kỳ sinh trưởng không giống nhau. Trong đất ngập nước, cây lúa phát triển
thuận lợi, cho năng suất cao và ổn định nhất. Cây lúa có thể trồng trên các loại đất
khác nhau nhưng đất trồng lúa tốt cần có khả năng giữ nước tốt, có pH thích hợp trong
khoảng 5,5 - 7,5 và giàu các chất dinh dưỡng (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
Ở Việt Nam, lúa là cây trồng cổ truyền và là cây trồng quan trọng nhất hiện nay
vì diện tích gieo trồng lúa chiếm đến 61% diện tích trồng trọt cả nước
(
2013). Lúa vừa đảm bảo lương thực cho hầu hết dân số vừa đóng góp vào việc đưa
Việc Nam trở thành một quốc gia xuất khẩu gạo đứng thức hai thế giới (Nguyễn Như
Hà, 2006).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.1.1. Đặc điểm sinh vật học của cây lúa
Các giống lúa Việt Nam có những đặc điểm khác nhau về chiều cao, thời gian
sinh trưởng (dài hay ngắn), chịu thâm canh, chịu chua mặn và chống chịu sâu bệnh,
Tuy nhiên, cây lúa đều có những đặc tính chung về hình thái, giải phẫu và đều có
chung các bộ phận rễ, thân, lá, bông và hạt (
2013).

Hình 1: Cây lúa (*Nguồn: ngày 17/07/2013)
Rễ: Rễ lúa là loại rễ chùm, rễ lúa có hai loại: rễ mầm mọc từ phôi hạt, có tác
dụng hút nước và chất dinh dưỡng đến lúc cây có 3 lá và rễ đốt mọc ra từ các đốt thân

nằm dưới mặt đất, có tác dụng hút chất dinh dưỡng nuôi cây, trao đổi không khí và giữ
cho cây lúa đứng vững.
Thân: Là loại thân thảo. Thời kỳ mạ và lúa non, thân lúa do các bẹ lá tạo thành.
Sau khi làm đốt, thân lúa do các lóng và đốt tạo thành, bên ngoài có bẹ lá bao bọc. Số
lóng trên mỗi thân phụ thuộc vào giống: giống dài ngày 7-8 lóng, giống trung ngày 6-7
lóng và giống ngắn ngày có 4-5 lóng.
Lá: Lúa có lá mầm và lá thật. Lá mầm mọc trong quá trình ngâm ủ và thời gian
đầu sau khi gieo.Lá thật là lá mọc trong quá trình sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa
và tồn tại trong suốt quá trình sinh trưởng của cây lúa. Số lá trên cây phụ thuộc vào
giống: giống dài ngày ≥ 20 lá, giống trung ngày 16-18 lá và giống ngắn ngày 12-15 lá.
Bông lúa: Do trên một bông lúa có nhiều hoa lúa, quá trình trỗ lại không đồng
thời nên hoa lúa nở theo quy luật từ trên xuống dưới, từ ngoài vào trong. Thời gian nở
hoa phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thời tiết. Nếu thuận lợi, nhiệt độ thích hợp, đủ
nắng, hoa nở rộ vào 8-9 giờ sáng. Nếu trời nắng nóng, hoa lúa sẽ nở sớm vào lúc 7-8
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
giờ sáng. Nếu trời âm u, thiếu ánh sáng hoặc gặp rét, hoa lúa sẽ trỗ muộn từ 12-14 giờ
trưa. Thời gian phơi màu, thụ tinh của hoa lúa từ khi nở vỏ trấu đến lúc khép lại
khoảng 50-60 phút.
Hạt lúa: Mỗi một hạt lúa được hình thành từ một hoa lúa. Các hạt lúa xếp sát và
gối lên nha tạo thành bông lúa. Tuỳ vào các giống lúa khác nhau mà độ dài bông, số
lượng hạt cũng như mật độ xếp hạt của bông lúa khác nhau
( 2013).
2.1.2. Nhu cầu về dinh dƣỡng của cây lúa
Các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu được đối với sự sinh trưởng và
phát triển của cây lúa bao gồm: đạm (N), lân (P), kali (K), vôi, sắt, kẽm, đồng, silic,
lưu huỳnh, carbon, oxy và hydro, Phân bón đều có thể cung cấp được tất cả các chất
dinh dưỡng trên (trừ carbon, oxy, hydro) cho cây lúa. Trong đó, 3 yếu tố dinh dưỡng
mà cây lúa cần với lượng lớn và cũng là các chất cần thiết cho các quá trình sống diễn
ra trong cây lúa là đạm, lân và kali. Các nguyên tố khoáng còn lại, cây lúa cần với

lượng rất ít và hầu như đã có sẵn ở trong đất, nếu thiếu thì có thể tuỳ theo điều kiện cụ
thể mà bón bổ sung. Các yếu tố dinh dưỡng cung cấp cho cây lúa có vai trò khác nhau,
với hàm lượng cung cấp khác nhau trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa.
Phân bón có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa,
từ giai đoạn mạ cho đến lúc thu hoạch. Cùng với các yếu tố khác, phân bón cung cấp
cho cây nguồn nguyên liệu để tái tạo ra các chất dinh dưỡng như: tinh bột, chất đường,
chất béo và protein,… Ngoài ra, chúng còn giữ vai trò duy trì sự sống của toàn bộ cây
lúa, không có nguồn dinh dưỡng thì cây lúa sẽ chết. Tuy nhiên, trong thực tế, cây lúa
chỉ hút được khoảng 2/3 - 3/4 lượng phân bón, lượng phân bón còn lại bị trông theo
nước, bốc hơi và tồn dư trong đất
( 2013).
2.1.2.1. Nhu cầu về đạm
Đạm có vai trò quan trọng trong việc phát triển bộ rễ, thân, lá, chiều cao và đặc
biệt ảnh hưởng tới quá trình đẻ nhánh của cây lúa (Nguyễn Như Hà, 2006). Theo
Ladha và Reddy (2003), đạm cũng là dưỡng chất quan trọng, là yếu tố cấu thành năng
suất lúa trồng và 1 kg đạm sản xuất được 15-20 kg lúa hạt. Đạm còn có vai trò quan
trọng đối với việc hình thành đòng và các yếu tố cấu thành năng suất lúa khác như số
hạt/bông, trọng lượng 1000 hạt và tỷ lệ hạt chắc. Vì vậy, việc cung cấp đạm đủ và
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
đúng lúc cho cây lúa có vai trò quyết định đến việc đạt năng suất cao (Nguyễn Như
Hà, 2006). Ngoài ra, đạm cũng làm tăng hàm lượng protein trong gạo, ảnh hưởng tới
đặc tính vật lý và sức đề kháng đối với sâu bệnh hại cây lúa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
Trong quá trình sinh trưởng, cây lúa có nhu cầu đạm tăng từ thời kỳ đẻ nhánh tới thời
kỳ trổ bông, rồi giảm sau khi trổ. Cây lúa cần nhiều đạm nhất vào hai thời kỳ: thời kỳ
đẻ nhánh khoảng 70% - là thời kỳ hút đạm có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất lúa và
thời kỳ làm đòng khoảng 10-15 % - là thời kỳ hút đạm có hiệu suất cao (Nguyễn Như
Hà, 2006). Cây lúa đòi hỏi lượng phân đạm từ 60-100 kg/ha để đạt năng suất lúa từ 5-8
tấn/ha và cây lúa cần một lượng phân đạm hóa học cao hơn để có năng suất ổn định
(Stoltzfus et al., 1997). Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng phân đạm cho lúa lại thấp,

thường không quá 40% (Nguyễn Như Hà, 2006) dẫn đến việc lạm dụng quá mức phân
bón hóa học gây nên ô nhiễm môi trường và làm hại đến sức khỏe của nông dân cũng
như người tiêu dùng. Bên cạnh đó, giá thành sản xuất phân đạm hóa học không ngừng
tăng cũng ảnh hưởng tới thu nhập của nông dân. Trong khi đó, ở vùng nhiệt đới, nhiều
nghiên cứu cho thấy nguồn đạm sinh học chỉ thỏa mãn được khoảng 50 kg N/ha/vụ
(Roger và Ladha, 1992). Hơn nữa, theo Fischer et al. (2003), nguồn đạm tự nhiên từ sự
cố định đạm sinh học với vi sinh vật sống tự do chỉ đủ sản xuất ra lúa gạo có năng suất
từ 2 - 3,5 tấn/ha. Do đó, nguồn đạm sinh học được cung cấp từ nguồn phân xanh, phân
chuồng và phân bón sinh học với những vi sinh vật cố định đạm nội sinh cây lúa sẽ
giúp tăng năng suất, đảm bảo chất lượng hạt lúa, giảm chi phí sản xuất, phục hồi độ
phì nhiêu cho đất, không gây ô nhiễm môi trường và đảm bảo sự phát triển bền vững
hệ sinh thái nông nghiệp (Sturz et al., 2000).
2.1.2.2. Nhu cầu về lân
Lân có vai trò kích thích cây lúa ra rễ mạnh, hình thành nhiều nốt sần
( 2013), có ảnh
hưởng tới tốc độ đẻ nhánh của cây lúa, làm cho cây lúa trổ bông đều, chín sớm hơn,
tăng năng suất và phẩm chất hạt thóc. Để tạo ra một tấn lúa, câu lúa cần khoảng 7,1 kg
P
2
O
5
, trong đó có khoảng 6 kg P
2
O
5
tích lũy chủ yếu vào hạt (Nguyễn Như Hà, 2006).
Lượng hữu dụng của lân trong đất rất thấp. Thời gian ngập nước càng lâu, giúp
pH đất gia tăng và độ hữu dụng của lân cũng gia tăng. Do đó, lượng lân hữu dụng lúc
chuẩn bị sạ vụ hè thu thì thấp hơn đầu vụ đông xuân. Lân rất ít di chuyển, nên bón lân
chôn vùi vào trong đất ở độ sâu vùng rễ thì giúp cho lúa hấp thụ tốt hơn. Nhu cầu hấp

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
thụ lân của cây lúa chủ yếu vào thời kỳ sinh trưởng đầu của cây lúa
( 2013). Cây lúa hút lân
mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh và làm đòng nhưng xét về cường độ thì cây lúa hút
lân mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh (Nguyễn Như Hà, 2006).
2.2. Khát quát về vi khuẩn nội sinh
2.2.1. Giới thiệu
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật mà không có những tổn hại
đáng kể hay dấu hiệu nhiễm bệnh và hậu quả tiêu cực đối với cây chủ (Kobayashi và
Palumbo, 2000). Những vi khuẩn này thường được phân lập từ bề mặt mô hay từ bộ
phận của thực vật như rễ, thân, lá và hạt. Tuy nhiên, ở hầu hết thực vật, rễ có lượng vi
khuẩn nội sinh trong mô cao hơn ở trên bề mặt mô (Santi et al., 2013).
Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sinh trưởng và chuyển hóa các chất trong cây.
Chúng có thể xâm nhập mô thực vật qua bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay
rễ bên; có thể chui vào rễ qua lông hút và có thể nằm giữa các tế bào nhu mô rễ hay
biểu bì rễ. Chúng cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí
tổn thương trên cây (Roos và Hattingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi
khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến
các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel
et al., 2002).
2.2.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật không thuộc họ đậu
2.2.2.1. Vi khuẩn Azoarcus
Azoarcus là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, hình que và có khả năng chuyển
động (Bilal và Malik, 1987; Bilal et al., 1990; Malik et al., 1991; Reinhold et al.,
1986). Loài vi khuẩn này vừa có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí vừa
có khả năng tổng hợp IAA và phát triển tốt trên môi trường chứa muối acid hữu cơ
nhưng không tốt trên môi trường chứa carbohydrate (Malik et al., 1997).
Hầu hết các chi Azoarcus được phân lập từ cỏ Kallar (Leptochloa fusca (L.)
Kunth) trồng ở vùng đất mặn thuộc Pakistan (Reinhold-Hurek et al., 1993; Hurek et

al., 1995). Azoarcus hiện diện trong rễ, bề mặt rễ (Bilal and Malik, 1987; Reinhold-
Hurek et al., 1993) và cả trong thân cỏ Kallar (Hurek et al., 1993, 1994; Egener et al.,
1998). Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa và giúp kích thích sự sinh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
trưởng của lúa (Malik et al., 1997; Egener et al., 1998; Engelhard et al., 2000). Theo
Malik et al. (1980), khi khai phá những vùng có cỏ Kallar phát triển tốt để trồng lúa mì
thì thấy lúa mì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân đạm hóa học.
Theo Reinhold-Hurek et al. (1993), dựa vào nhiều nghiên cứu về hình thái, tính
năng dinh dưỡng và sinh hóa cũng như một số kỹ thuật sinh học phân tử, chi Azoarcus
được xác định có 2 loài là A. communis và A. indigenous. Năm 1995, theo một nghiên
cứu tại đại học Michigan State, một loài khác thuộc chi Azoarcus - Azoarcus
tolulyticus lần đầu tiên được mô tả, là một vi khuẩn cố định đạm tự do, chịu được ở
điều kiện kỵ khí và được phân lập từ đất, biển và nước ngọt bị nhiễm dầu
( 2013).
2.2.2.2. Vi khuẩn Azospirillum
Theo Bashan et al. (1995), Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có khả
năng chuyển động và có dạng hình que ngắn. Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố
định đạm hiện diện ở trong rễ, vùng đất xung quanh rễ, thân và lá của cây trồng (Glick,
1995). Chúng sống tự do trong đất, trong vùng rễ cây hay cộng sinh với rễ của các loại
ngũ cốc, cỏ và cây có củ.
Theo Peng et al. (2006) có 8 loài vi khuẩn cố định đạm thuộc chi Azospirillum
được mô tả, bao gồm 2 loài được tìm thấy đầu tiên là Azospirillum lipoferum and
Azospirillum brasilense (Tarrand et al., 1978) và 6 loài được lần lượt được mô tả sau
đó là Azospirillum amazonense (Magalhães et al., 1983), Azospirillum halopraeferens
- là vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca (L.) Kunth)
(Reinhold et al., 1987), Azospirillum irakense được phân lập từ rễ và đất vùng rễ lúa
(Khammas et al., 1989), Azospirillum largimobile (Sly và Stackebrandt, 1999),
Azospirillum doebereinerae - là vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ cây cỏ C4
Miscanthus (Eckert et al., 2001) và Azospirillum oryzae - được phân lập từ rễ của cây

lúa (Xie và Yokota, 2005). Năm 2006, một loài Azospirillum có khả năng cố định đạm
mới là Azospirillum melinis đã được phân lập từ thân và rễ cỏ molasses (Melinis
minutiflora Beauv.) trồng ở Trung Quốc (Peng et al., 2006).
Azospirillum spp. có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan, hấp thu khoáng
chất, sản xuất nhiều loại kích thích tố thực vật, trong đó chủ yếu là IAA và
gibberellins, phân hủy siderophore và sản xuất enzyme (Bashan et al., 2004).

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.2.2.3. Vi khuẩnAzotobacter
Vi khuẩn Azotobacter là nhóm vi khuẩn cố định đạm sống tự do, Gram âm, hiếu
khí ( 2013), có hình que, di động nhờ chiêm
mao ( 2013), có nhiều trong đất
kiềm hoặc đất trung tính, trong môi trường nước và ở một số loài thực vật
( 2013). Azotobacter có tính
mẫn cảm với độ pH, nồng độ phosphate cao và nhiệt độ trên 35ºC (Nguyễn Hữu Hiệp
và Cao Ngọc Điệp, 2012). Một số loài của chi Azotobacter có khả năng cố định đạm từ
ammonia; sản xuất vitamin và các chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự nảy mầm
của hạt; tổng hợp IAA và tổng hợp các hormone kích thích tăng trưởng khác như
gibberellin và cytokinin giúp cho sự phát triển của rễ,… (Saikia et al., 2008).
Azotobacter thuộc họ Azotobacteraceae. Họ Azotobacteraceae gồm có 2 chi là
chi Azomanas với 3 loài: A. agilis, A. insignis và A. macrocytogenes và chi
Azotobacter với 7 loài được biết đến là Azotobacter chroococcum (được mô tả bởi
Beyerinkom vào năm 1901), Azotobacter vinelandii (được mô tả bởi Lipman năm
1903), Azotobacter beijerinckii (được mô tả bởi Lipman vào năm 1904), Azotobacter
nigricans (được mô tả bởi Krasil'nikov vào năm 1949), Azotobacter paspali (được mô
tả bởi Döbereiner et al. năm 1966; và Thompson và Skerman vào năm 1980),
Azotobacter armeniacus (được mô tả bởi Thompson và Skerman vào năm 1981) và
Azotobacter salinestris (được mô tả bởi Page và Shivprasad vào năm 1991) (Saikia et
al., 2008). Trong đó, Azotobacter chroococcum - loài đầu tiên thuộc chi Azotobacter

được phát hiện và mô tả vào năm 1901 bởi nhà thực vật học và vi sinh vật học Hà Lan
Martin Beyerinkom - thường được tìm thấy nhiều nhất trong nhiều loại đất trên thế
giới (Martyniuk, 2003).
Nhiều nước đã sản xuất phân bón vi sinh có chứa Azotobacter đã được sử dụng
phổ biến dưới dạng bột khô như Amrutham ở Ấn Độ hay dạng dịch lỏng như
Azotobacterin (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012).
2.2.2.4. Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, hình que, có thể sinh trưởng và
phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí nhưng phát triển tốt nhất trong điều
kiện ít khí oxy (Caballero-Mellado et al., 2004). Vi khuẩn này sống cộng sinh với cây
trồng, có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây. Ngoài ra, một số
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
dòng của loài Burkholderia như B. tropica và B. unamae có khả năng hòa tan
phosphate và sản xuất siderophore (Caballero-Mellado et al., 2007).
Theo Coenye và Vandamme (2003) có hơn 40 loài Burkholderia được tìm thấy,
chúng có mặt khắp nơi trong tự nhiên. Tuy nhiên, trong một thời gian dài, khả năng cố
định đạm của chi Burkholderia chỉ được tìm thấy ở loài Burkholderia vietnamiensis, là
một loài vi khuẩn được phân lập từ rễ cây lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis et
al., 1995). Theo Estrada-de los Santos et al. (2001) cũng tìm thấy Burkholderia
vietnamiensis và một loài Burkholderia kururiensis có khả năng cố định đạm trong rễ
của bắp, sorghum và cà phê trồng tại Mexico. Hiện nay, nhiều loài Burkholderia được
xác nhận có khả năng cố định đạm được tìm thấy như B. tropica ở thân và trái khóm
(Cruz et al., 2001) và ở cây bắp, cây teosinte trồng tại Mexico, ở rễ cây mía trồng tại
Brazil và Nam Phi (Reis et al., 2004); B. phymatum và B. tuberum ở rễ cây họ đậu
(Vandamme et al., 2002); B. unamae ở bắp, mía đường và cà phê (Caballero-Mellado
et al., 2004) và ở vùng rễ cây cà chua trồng tại Mexico (Caballero-Mellado et al.,
2007); B. xenovorans ở vùng rễ bắp trồng tại Hà Lan (Salles et al., 2006) và ở vùng rễ
cây cà chua trồng tại Mexico (Caballero-Mellado et al., 2007) và B. silvatlantica ở bắp
và mía đường (Perin et al., 2006),…

Theo thí nghiệm của Van et al. (2000), cây lúa được chủng Burkholderia
vietnamiensis dòng TVV75 - một dòng vi khuẩn được phân lập từ đất phèn ở miền
Nam Việt Nam - đã cho những hiệu quả đáng kể như bề mặt lá tăng 30% ở ngày 14,
khả năng đâm chồi tăng 33% và số lượng rễ tăng 57% ở ngày 24, sản lượng hạt lúa
tăng từ 13-22% và cho năng suất tương đương với lúa trồng được bón phân đạm hơn
25-30 kg N/ha.
2.2.2.5. Vi khuẩn Enterobacter
Vi khuẩn Enterobacter thuộc nhóm γ-Proteobacteria, hầu hết vi khuẩn
Enterobacter là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí không bắt buộc và có dạng hình que. Một
số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật, là vi
khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật (
2013), có khả năng tổng hợp phytohormone, cố định đạm từ không khí và hoạt động
kiểm soát sinh học (Madhaiyan et al., 2010).
Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng
rễ một số cây cỏ ở Triều Tiên. Loài Enterobacter intermedium này có khả năng hòa
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản
xuất hợp chất 2-ketogluconic acid.
Năm 2010, một dòngvi khuẩn Ah-143T với tên gọi Enterobacter arachidis sp.
nov. được phân lập từ vùng đất rễ của cây lạc (Arachis hypogaea L. ‘ALR-2’) thu từ
mảnh đất thí nghiệm của đại học nông nghiệp Tamilnadu thuộc Coimbatore Ấn Độ.
Dòng vi khuẩn này có khả năng cố định đạm từ không khí và tổng hợp indole-3-acetic
acid (IAA), siderophore, phytohormone và 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
deaminase (ACCD) (Madhaiyan et al., 2010).
Hardoim et al. (2013) đã phân lập được 2 loài Enterobacter mới là Enterobacter
oryziphilus sp. nov. (các dòng REICA_084, REICA_142T và REICA_191) và
Enterobacter oryzendophyticus sp. nov. (các dòng REICA_032, REICA_082T và
REICA_211) từ rễ lúa. Cả 2 loài này đều có khả năng cung cấp đạm và phosphor để
kích thích sự phát triển của lúa.

2.2.2.6. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus
Năm 1988, một chivi khuẩn nội sinh hấp thụ acid acetic có khả năng cố định đạm
- Acetobacter diazotrophicus được phát hiện và phân lập từ rễ và thân cây mía đường
trồng ở Brazil bởi Cavalcante và Döbereiner. Chúng hiện diện trong các khoảng trống
gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi khuẩn nội sinh bắt buộc (Cavalcante và
Döbereiner, 1988). A. diazotrophicus cũng được phân lập từ những cây trồng khác
như cỏ Cameroon (Pennisetum purpureum), coffee (Coffea arabica), trà, chuối, ragi,
lúa và khóm và kể cả trên những côn trùng gây hại cây mía (Muthukumarasamy et al.,
2002). Sau đó, căn cứ vào phân tích trình tự 16s rRNA, Acetobacter diazotrophicus
được đổi tên lại thành Gluconacetobacter diazotrophicus (Yamada et al., 1997).
Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm, chịu được acid, sống
trong môi trường hiếu khí bắt buộc, có thể tăng trưởng được ở pH rất thấp 3,0 và có
khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí. Loài vi khuẩn này sử dụng nhiều
nguồn carbon khác nhau như sucrose, gluconate, glucose, fructose, mannitol và
arabinose,… nhưng nguồn carbon tốt nhất cho sự phát triển là sucrose ở nồng độ cao
10% và thậm chí ở nồng độ sucrose cao hơn (30%) chúng vẫn có thể phát triển
(Muthukumarasamy et al., 2002; Burris, 1994).
Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có thể cố định đạm trong điều kiện
O
2
thay đổi liên tục (Dong et al., 2002), có khả năng nội cộng sinh cố định đạm mà
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
không gây hại cho cây và có thể cung cấp hơn một nửa lượng đạm ở dạng hữu ích cho
cây trồng (Cojho et al., 1993). Hơn nữa, Gluconacetobacter diazotrophicus còn tổng
hợp được hormone thực vật như auxin, gibberellin, tổng hợp chất kích thích tăng
trưởng (phytohormone) như IAA, có thể hòa tan kẽm và lân khó tan, tăng khả năng
hấp thu dinh dưỡng của cây và tạo ra vitamin cũng như enzyme giúp cây phát triển
(Muthukumarasamy et al., 2002; Munoz et al., 2003; Madhaiyan et al., 2004).
2.2.2.7. Vi khuẩn Herbaspirillium

Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm β-Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, vi
hiếu khí và là vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu
(James et al., 1997). Hầu hết các loài của Herbaspirillum thuộc nhóm vi khuẩn nội
sinh trong các mô thực vật. Chúng có khả năng cố định đạm mạnh trong vùng rễ
(Baldani et al., 1986) và phát tán đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al.,
1997). Ngoài ra, Herbaspirillum còn tổng hợp được các phytohormone như IAA,
auxin và gibberellin (Muthukumarasamy et al., 2007).
Herbaspirillum được báo cáo lần đầu tiên bởi Baldani et al. (1986) như một loài
vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ của cây lúa (Oryza sativa), bắp (Zea mays) và
cây cao lương (sorghum) (Sorghum bicolor) và được cho là loài Herbaspirillum
seropedicae vì ở thời điểm này, chỉ có một loài thuộc chi Herbaspirillum được biết
đến. Sau đó, Baldani et al. (1996) đã phân lập được Herbaspirillum rubrisubalbicans
từ rễ, thân và lá của cây mía (Saccharurn spp.). Cả hai loài vi khuẩn này đã được tìm
thấy ở rễ, thân và cả lá của các cây bắp, cỏ voi, sorghum và mía đường (Olivares et al.,
1996); chuối và khóm (Cruz et al., 2001); lúa hoang và lúa trồng (Elbeltagy et al.,
2001).
Gần đây, một vài loài Herbaspirillum mới đã được phát hiện như Herbaspirillum
frisingense sp. nov. được phân lập từ rễ của các loài cây C4 cho sợi (Kirchhof et al.,
2001) và Herbaspirillum hiltneri sp. nov. được phân lập từ rễ của lúa mì (Rothballer et
al., 2006).
2.2.2.8. Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ-Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, có dạng
hình que, không hay ít chuyển động ( 2013).
Chi vi khuẩn này có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân khó tan. Vi
khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
và sống nội sinh trong cây. Chi Klebsiella có 2 loài quan trọng là Klebsiella
pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Khoảng 30% các dòng của Klebsiella pneumoniae
có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí (Postgate, 1998).

Nhiều dòng vi khuẩn Klebsiella đã được phân lập và nghiên cứu về khả năng
tổng hợp IAA như Klebsiella pneumonia dòng GR9 ở rễ và thân cây mía
(Govindarajan et al., 2007), Klebsiella oxytoca dòng GR-3 ở rễ và thân của cây cỏ
đuôi mèo (Typha australis) (Jha và Kumar, 2007), Klebsiella pneumoniae ở vùng rễ
của lúa mì (Triticum aestivum) (Sachdev et al., 2009) và dòng Klebsiella SN 1.1 ở đất
vùng rễ lúa (Chaiharn và Lumyong, 2011).
Theo Lü và Song (2000), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập
từ rễ lúa có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ
nitơ không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole-3-
pyruvicacid của chúng.
Ở Ấn Độ, các nhà nghiên cứu sử dụng K. oxytoca dòng GR-3 chủng cho giống
lúa Malviya dhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và
tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập
rễ bên và rễ bất định cho cây (Jha và Kumar, 2007).
Theo nghiên cứu của Chaiharn và Lumyong (2011), dòng Klebsiella SN 1.1 có
khả năng tổng hợp IAA cao nhất (291,97 ± 0,19 ppm) trong môi trường nuôi cấy có bổ
sung L-tryptophan và hòa tan phosphat vô cơ cao trong 216 dòng vi khuẩn được phân
lập từ đất vùng rễ lúa ở miền Bắc Thái Lan.
2.2.2.9. Vi khuẩn Pseudomonas
Chi Pseudomonas thuộc nhóm γ-Proteobacteria, thường là Gram âm, hiếu khí, có
hình que, có chiên mao ở cực và không có khả năng tạo bào tử
( 2013). Chúng có khả năng hô hấp hiếu khí
hay kỵ khí trong môi trường không có oxy. Nhiệt độ phát triển thuận lợi của
Pseudomonas spp. là 30-37ºC (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Nhiều loài trong chi Pseudomonas được xác định là vi khuẩn nội sinh trong cây
bông vải và bắp ngọt (McInroy và Klopper, 1995), đậu nành (Hung và Annapurana,
2004), cây lúa hoang và lúa trồng (Koomnok et al., 2007),… Pseudomonas fluorescens
và Pseudomonas putida là 2 loài Pseudomonas có sắc tố huỳnh quang chính được tìm
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

thấy ở vùng rễ chuối (Vlassak et al. 1992), ở đất vùng rễ và rễ của cây lanh (flax)
(Linum usitatissinum L.) và cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) (Lemanceau et
al. 1995).
Một số loài vi khuẩn Pseudomonas có khả năng cố định đạm như P. diminuta, P.
fluorescens, P. paucimobilis, P. pseudoflava, P. putida, P. saccharophila, P. stuzeri và
P. vesicularis (Chan et al., 1994); có khả năng hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng
dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như P. chlororaphis, P. fluorescens, P. putida, và P.
stuzeri (Cattenlla et al., 1999), có thể tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như
auxin và cytokinin giúp kích thích sự phát triển của rễ cây làm gia tăng khả năng hấp
thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số cây trồng bao gồm cả cây lúa như P.
fluorescens, P. putida và P. syringae (Glickmann et al., 1998; Vlassak et al. 1992).
2.2.3. Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
2.2.3.1. Khả năng cố định đạm
Đạm là là chất dinh dưỡng cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của cây
trồng. Không khí có khoảng 80% là khí nito nhưng cây trồng không thể hấp thu trực
tiếp khí nito trong không khí được. Cây trồng chỉ có thể hấp thu đạm có sẵn trong đất
ở dạng ammonium và nitrate thông qua rễ của chúng. Các vi khẩn nội sinh thực vật có
khả năng sử dụng đạm trong không khí nhờ sự cố định đạm sinh học, là quá trình
chuyển nito trong không khí thành thành dạng đạm nguyên tử rồi thành dạng đạm vô
cơ ammonia - dạng đạm mà cây trồng có thể hấp thụ được, sau đó vi khuẩn sẽ chuyển
hóa tiếp một phần thành dạng acid amin hữu cơ để vi khuẩn sử dụngnhờ sự xúc tác của
enzyme nitrogenase (Santi et al., 2013). Enzyme nitrogenase gồm heterotetrameric
protein MoFe liên kết với homodimeric protein Fe. Các electron sẽ đi vào
homodimeric Fe protein và được vận chuyển tới protein MoFe nhờ năng lượng ATP,
qua đó electron được hoạt hóa để phản ứng với nito. Mỗi electron được chuyển đến
MoFe protein đủ để phá vỡ một liên kết của N
2
, dù vậy cũng chưa có sự hiểu biết
chính xác là 3 chu kỳ như thế sẽ chuyển một phân tử N
2

thành ammonia. Nitrogenase
sẽ liên kết mỗi nguyên tử nito với ba nguyên tử hidro để tạo ammonia (NH
3
)
( 2013). Phản ứng khử nito với xúc tác của
enzyme nitrogenase có thể được tóm tắt như sau:
N
2
+ 6e
-
+ 12 ATP + 12 H
2
O → 2 NH
4
+
+ 12 ADP + 12 P
i
+ 4 H
+
Quá trình khử này gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau:
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
N
2
+ 2 H
+
→ [NH=NH] + 2 H
+
→ [NH=NH] + 2 H
+

→ 2 NH
3

Ammonia tạo ra trong chu trình tiếp tục được đồng hóa tạo thành những acid
amin cung cấp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007).
Theo Dilworth (1966), enzyme nitrogenase cũng khử C
2
H
2
(acetylene) thành
C
2
H
4
(ethylene) và nhờ điều này các nhà nghiên cứu đã tìm ra phương pháp khử
acetylene (ARA) dùng để xác định hoạt động enzyme nitrogenase rất hữu ích trong
việc định lượng quá trình cố định đạm, từ đó có thể chọn lọc những dòng vi khuẩn có
khả năng cố định đạm tốt.
Ở một số sự cộng sinh như Klebsiella sp. với cây lúa hay Azospirillum sp. với
bắp, việc bổ sung nguồn carbon như sodium malate là rất cần thiết cho hoạt động của
enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm (Santi et al., 2013).
2.2.3.2. Khả năng hòa tan lân khó tan
Lân là một trong những dưỡng chất cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển của
cây trồng và cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Cây
trồng chỉ có thể sử dụng được lân dưới dạng hòa tan trong đất. Tuy nhiên, nồng độ lân
hòa tan trong đất thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn (10M H
2
PO
4
-

) (Goldstein,
1994). Lân thường được bổ sung vào đất dưới dạng phân bón dạng hòa tan mà cây
trồng dễ sử dụng nhưng lượng lân vô cơ hòa tan này nhanh chóng bị cố định và kết tủa
thành dạng không hòa tan và trở nên không có giá trị đối với cây trồng (Rodríguez và
Fraga, 1999). Bên cạnh đó, nhều loại đất như đất đỏ bazan, đất đen,… có hàm lượng
lân trong đất khá cao nhưng cây lại không hút được để sử dụng do lân ở dạng khó tan.
Trong đất, lân cũng tồn tại dưới dạng vật chất hữu cơ. Lân hữu cơ có thể chiếm đến
30-50% lân tổng số (Paul và Clark, 1988). Các hợp chất lân vô cơ được hình thành do
quá trình phân giải lân hữu cơ (còn gọi là quá trình khoáng hóa lân hữu cơ), phần lớn
là các muối phosphat khó tan mà cây trồng không thể hấp thu (Trần Cẩm Vân, 2005).
Một số vi khuẩn cộng sinh cố định đạm có khả năng hòa tan lân do chúng có thể
tiết ra các acid hữa cơ hòa tan các hợp chất lân khó tan (Yahya and Al-Aseawi, 1989).
Các acid hữu cơ này có trọng lượng phân tử thấp, chủ yếu là acid gluconic và acid 2-
ketogluconic (Goldstein, 1995; Rodríguez và Fraga, 1999). Các acid hữu cơ khác như
acid glycolic, acid oxalic, acid malonic và acid succinic cũng được nhận diện trong
một số vi khuẩn có khả năng hòa tan lân (Banik and Dey, 1982; Illmer và Schinner,
1992).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Vi khuẩn tiết ra những acid hữu cơ có thể hòa tan lân khó tan do làm giảm pH, sự
chelate hóa của các ion dương và cạnh tranh vị trí hấp thụ trong đất (Nahas, 1996).
Theo Kucey et al. (1989), sự làm giảm pH đất rất quan trọng trong cơ chế hòa tan lân
dạng khó tan trong đất.
Ngoài cơ chế acid hóa, theo Moghimi và Tate (1978), các vi khuẩn còn có thể
hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion. Trong đó, phức
cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp hòa tan lân khó tan khi có cấu
trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức.
2.2.3.3. Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-acetic acid (IAA) là một loại auxin phytohormone tự nhiên mà nhiều
loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp được (Spaepen et al., 2007). IAA chi phối sự phân

chia tế bào ở giai đoạn đầu phát tiển của cây trồng, sự giản dài tế bào, phân hóa sinh
mô và phát triển quả và hạt. Ngoài ra, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá
mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự tạo
thành lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001). Theo Spaepen và
Vanderleyden (2011) trên 80% vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ có khả năng tổng
hợp IAA. Nhiều loài vi khuẩn cố định đạm sống tự do, vi khuẩn sống cộng sinh có cơ
chế tổng hợp IAA từ tiền chất chính là L-tryptophan như Azospirillum brasilense
(Somers et al., 2005), Azotobacter (Ahmad etal., 2005) và Enterobacter cloacae
(Koga et al., 1991). Từ tiền chất là L-tryptophan, có ít nhất 5 lộ trình được mô tả cho
sự tổng hợp IAA, trong đó vi khuẩn tổng hợp IAA chủ yếu qua hai lộ trình là lộ trình
indole-3-pyruvate (IPA) và indole-3-acetamide (IAM), các lộ trình khác như lộ trình
tryptamine, lộ trình Tryptophan side-chain oxidase (TSO) và lộ trình indole-3-
acetonitrile (IAN) (Spaepen và Vanderleyden, 2011).