phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (lutraria philippinarum)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG










VŨ THỊ XUÂN




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN
TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum)


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nha Trang, tháng 07 năm 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
==========



VŨ THỊ XUÂN




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN
TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum)



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Hƣớng dẫn khoa học:

TS. NGUYỄN VĂN DUY

Nha Trang, tháng 07 năm 2012

i
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh
học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng
dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn Duy, Bộ môn
Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã định hướng,
dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt
nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng
thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành
đề tài.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những
người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn
giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và
thực hiện đồ án vừa qua.



Nha Trang, tháng 7 năm 2012

Sinh viên

Vũ Thị Xuân


ii
MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1.Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 3
1.1.1.Tình hình dịch bệnh 3
1.1.2.Các biện pháp phòng trừ 7
1.2.Tình hình nuôi trồng và đặc điểm sinh học của tu hài 8
1.2.1.Tình hình nuôi tu hài 9
1.2.2.Đặc điểm sinh học 9
1.3.Tổng quan về bacteriocin 11
1.3.1.Đặc điểm chung của bacteriocin 11
1.3.2.Phân loại bacteriocin 12
1.3.2.1.Bacterioin của vi khuẩn Gram âm 14
1.3.2.2.Bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng 15
1.3.2.3.Bacteriocin của cổ khuẩn 16
1.3.3.Di truyền bacteriocin 16
1.3.4.Sinh tổng hợp bacteriocin 19
1.4.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh bacteriocin 20
1.5.Tiềm năng ứng dụng của bacteriocin biển 23
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Vật liệu 26

2.1.1. Mẫu tu hài 26
2.1.2. Chủng vi sinh vật chỉ thị 26
2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất chuyên dụng 27

iii
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28
2.2.1. Phân lập vi khuẩn biển 28
2.2.2. Xác định đặc điểm hình thái 29
2.2.2.1. Hình thái khuẩn lạc 29
2.2.2.2. Nhuộm Gram 30
2.2.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn 32
2.2.3.1. Thu dịch chiết tế bào 32
2.2.3.2. Khảo sát sơ bộ khả năng sinh chất kháng khuẩn 32
2.2.4. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 33
2.2.5. Định danh vi khuẩn 34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Phân lập tổng số vi khuẩn hiếu khí từ tu hài 36
3.2. Sàng lọc vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn 37
3.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 38
3.4. Một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 42
3.4.1. Hình thái khuẩn lạc 42
3.4.2. Nhuộm Gram 45
3.5. Định danh vi khuẩn 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
Kết luận
Kiến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iv

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Bacteriocin của vi khuẩn và cổ khuẩn 13
Bảng 2.1. Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển 26
Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn biển từ tu hài 37
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng một số vi khuẩn chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển 37
Bảng 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tế bào hai chủng X1.4 và X1.5
tƣơng ứng bằng đƣờng kính vòng kháng khuẩn đối với chủng chỉ thị B1.1 41

v
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Tu hài Lutraria philippinarum 10
Hình 1.2.Tổ chức di truyền của bacteriocin 17
Hình 1.3. Số lƣợng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi thời kỳ 10 năm từ
1950-2010 đƣợc trích dẫn trên Pubmed. 20
Hình 2.1. Mẫu tu hài đƣợc dùng để phân lập vi khuẩn biển 26
Hình 2.2. Trình tự pha loãng mẫu phân lập 29
Hình 2.3. Phƣơng pháp cố định phiến vết 30
Hình 2.4. Phƣơng pháp nhuộm Gram 31
Hình 2.5. Minh họa vùng kháng khuẩn của bacteriocin trên đĩa thạch 33
Hình 3.1. Vi khuẩn biển phân lập từ tu hài ở nồng độ pha loãng 10
-7
sau 24 giờ nuôi
cấy ở 37
0
C 36
Hình 3.2. Hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị B1.1 của các chủng vi khuẩn biển 38
Hình 3.3. Khả năng kháng của dịch chiết tế bào của chủng X1.5 và X1.4 trƣớc và sau
khi trung hòa pH 39

Hình 3.4. Xác định bản chất protein của chất kháng khuẩn trong dịch chiết tế bào cuả
chủng X1.5 và X1.4 40
Hình 3.5. Kiểm tra độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô cuả chủng X1.5 và X1.4 42
Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.4 cấy ria và điểm 43
Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.5 cấy ria và điểm 43
Hình 3.8. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.9 cấy ria và điểm 44
Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.11 cấy ria và điểm 44
Hình 3.10. Tế bào của chủng chủng X1.4 sau khi nhuộm Gram 45
Hình 3.11. Tế bào của chủng chủng X1.5 sau khi nhuộm Gram 46
Hình 3.12. Tế bào của chủng chủng X1.9 sau khi nhuộm Gram 46
Hình 3.13. Tế bào của chủng chủng X1.11 sau khi nhuộm Gram 47
Hình 3.14. Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng X1.5 48


vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT
Chữ viết tắt
Viết đầy đủ
1
BLIS
Bacteriocin-Like Inhibitory Substance
2
CFU
Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
3
FAO
Food and Agriculture Organization of the United Nations
4

IHHNV
Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis
5
IHN
Infectious Hematopoietic Necrosis
6
NCBI
National Center for Bioinformatic Information
7
OD
Optical Density (Mật độ quang)
8
RSIV
Red Seabream Iridovirus
9
TSA
Trypticase Soy Agar
10
TSB
Trypticase Soy Broth
11
TSV
Taura Sydrome in Penaeus Vannamei
12
VHS
Viral Haemorrhagis Septicamia
13
VNN
Viral Nervous Necrosis
14

WSSV
White Spot Syndrome Virus
15
YHV
Yellow Head Disease

1
LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam có bờ biển dài hơn 3.260 km, với diện tích vùng biển rộng hơn 1
triệu km
2
, gấp 3 lần diện tích đất liền. Nuôi trồng thủy sản hiện là một trong những
lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển mạnh nhất ở nƣớc ta. Hoạt động nuôi trồng
thủy sản đang tạo ra nguồn thu nhập chính cho ngƣ dân các vùng ven biển nƣớc ta
nhờ có điều kiện tự nhiên phù hợp cho nuôi trồng một số loài hải sản chủ lực và nhờ
có nguồn thu lớn từ xuất khẩu. Tuy nhiên, dịch bệnh thƣờng xuyên xảy ra đã gây
thiệt hại kinh tế hàng triệu đô la Mỹ mỗi năm. Trong số các tác nhân gây bệnh thì vi
khuẩn điển hình là các loài Vibrio, đƣợc coi là một trong những nguyên nhân chính.
Hơn nữa, cùng với hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các vi
khuẩn gây bệnh ngày càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh
và truyền nhiễm cũng tăng theo.
Để giải quyết vấn đề này, ngƣ dân thƣờng xuyên sử dụng các chất kháng
sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006). Tuy nhiên chất kháng sinh
dƣờng nhƣ đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do việc lạm dụng quá mức.
Việc sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi
khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thƣờng và gây ra hiện tƣợng mất cân bằng vi sinh
(microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản phẩm thủy sản
có hại cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, các giải pháp thay thế thân thiện với
con ngƣời và môi trƣờng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhƣ sử dụng

vaccine. Nhƣng việc sử dụng vaccine thƣờng tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân
công và gây stress mạnh cho động vật nuôi (Corripio-Myar et al, 2007; Smith,
2007). Hơn nữa vẫn chƣa có vaccine ngừa bệnh cho tôm và nhuyễn thể
(Subasinghe, 2009).
Vấn đề đặt ra là cần tìm một chất kháng sinh thế hệ mới có hiệu quả tốt trong
phòng và trị bệnh, an toàn, thân thiện với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy bacteriocin là chất kháng sinh thế hệ mới đáp
ứng đủ các yêu cầu mong muốn do bản chất là protein an toàn và thân thiện với môi
trƣờng, phổ kháng khuẩn hẹp giúp hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn. Tuy nhiên

2
các nghiên cứu gần đây mới chỉ tập trung nghiên cứu về bacteriocin của vi khuẩn
lactic nhằm ứng dụng bảo quản thực phẩm.
Hệ vi sinh vật biển đa dạng và phong phú là tiềm năng lớn cho các nghiên
cứu các hoạt chất sinh học đặc biệt là các hợp chất kháng khuẩn. Tuy nhiên, các
nghiên cứu về vi sinh vật biển sản xuất bacteriocin hoặc các hợp chất tƣơng tự
bacteriocin (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances, BLIS) đặc biệt là các vi sinh
vật biển sống bám trên động vật biển lại rất ít. Cho đến nay, những nghiên cứu nhƣ
vậy vẫn hoàn toàn bỏ ngỏ ở Việt Nam.
Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các
chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (Lutraria philippinarum)” với các
nội dung chính:
- Phân lập vi khuẩn biển từ tu hài
- Sàng lọc vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn
- Xác định hoạt tính bacteriocin của các chủng phân lập

3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản
Theo Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc, nuôi trồng thủy
sản đang phát triển nhanh chóng hơn so với tất cả các ngành sản xuất thực phẩm
động vật khác (Romero et al, 2012). Đóng góp vào nguồn cung toàn cầu của một số
loài cá, động vật giáp xác và động vật thân mềm đã tăng từ 3,9% tổng sản lƣợng
tính theo trọng lƣợng trong 1970 đến 33% trong năm 2005. Ƣớc tính ngành thủy
sản và nuôi trồng thủy sản cung cấp cho thế giới với khoảng 110 triệu tấn thủy sản
mỗi năm(FAO, State of World Fisheries and Aquaculture 2010), tính trên bình quân
đầu ngƣời là tƣơng đƣơng 16,7 kg trên một ngƣời. Cung cấp này, 47% có nguồn
gốc từ sản xuất nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, sản xuất nuôi trồng thủy sản đã và
đang gặp khó khăn bởi tình hình dịch bệnh diễn ra rất phức tạp và không thể đoán
trƣớc tỉ lệ chết của thủy sản nuôi (Romero et al, 2012).
1.1.1. Tình hình dịch bệnh
Nuôi trồng thủy sản đang trở thành một ngành công nghiệp tập trung, với số
lƣợng ít hơn, nhƣng quy mô lớn hơn nhiều các trang trại nuôi thủy sản. Các bệnh
truyền nhiễm gây nguy hiểm và có thể gây thiệt hại nặng nề cho ngƣời nuôi và các
vấn đề nghiêm trọng đến sức khỏe vật nuôi thủy sản. Hơn nữa, cùng với hiện tƣợng
biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các dịch bệnh trên quy mô lớn ngày
càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh và truyền nhiễm
cũng tăng theo. Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản bao gồm: dịch bệnh do nấm và
ký sinh trùng, bệnh do virus và bệnh do vi khuẩn.
Nấm là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh ở cá nhƣ: Bệnh nấm thủy mi – gây
ra do do 4 giống nấm Leptolegnia, Aphanomyces, Saprolegnia và Achlya; Bệnh
nấm mang - gây ra bởi Branchiomyces. Các loại nấm gây hại nhiều đối với nhiều
loại cá nuôi giai đoạn cá con, cá thịt và trứng cá. Nấm gây bệnh trên cá làm cho cá
bị ngứa ngáy, lở loét, kém ăn.

4
Ký sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên cá biển nuôi. Nguyễn Thị Muội
và Đỗ Thị Hòa (1978 -1980) đã phát hiện đƣợc 80 loài ký sinh trùng ký sinh trên cá
biển. Nhiều loại ký sinh trùng nhƣ: ký sinh trùng đơn bào (Amyloodinium), ký sinh
trùng bánh xe (Trichodiniosis), và các loại sán lá đơn chủ (Monogeneansis,
Neobenedenia girellae, Benedenia epinepheli và Benedenia sp.) cũng là nguyên
nhân gây ra một số bệnh ở cá nuôi. Mặc dù không gây tổn thất lớn nhƣng nó làm
cho cá chậm lớn, giảm chất lƣợng thịt cá, tạo cơ hội cho vi khuẩn và virus tấn công
(Đỗ Thị Hòa et al, 2004).
Virus là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên cá biển nuôi lồng bè. Các tác
nhân virus gây bệnh thƣờng gặp chủ yếu ở tôm nuôi nhƣ bệnh đốm trắng (WSSV),
bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV), hội chứng Taura
(TSV)… Ở trên cá biển nuôi, tác nhân virus gây bệnh đƣợc ghi nhận nhiều là virus
gây bệnh tử hoại thần kinh (VNN). Bệnh này gây ra trên nhiều loài cá biển và phân
bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau (Takana et al, 2003). Bệnh này đã đƣợc
phát hiện trên các loại cá mú (Epinephelus spp.) cá chẽm (Lates calcarifer) và cá
bớp (Rachycentron canadum) nuôi ở Khánh Hòa, Việt Nam (Trần Vĩ Hích et al,
2008). Một số bệnh do virus cũng gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi cá biển trên
thế giới nhƣ virus IHN gây hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi vân, iridovirus gây ra
hiện tƣợng hoại tử mang và da ở cá tầm trắng. Ngoài ra, một số bệnh khác do virus
cũng đã đƣợc ghi nhận ở các loài cá khác nhƣ bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút
do virus VHS gây nên ở cá hồi, cá trích, cá bơn; bệnh do RSIV ở cá vƣợc, cá tráp
và cá mú song.
Hiện nay, bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề ƣơng nuôi cá
thƣơng phẩm. Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do vi khuẩn đã đƣợc ghi
nhận nhƣ: bệnh đốm trắng ở thận trên cá giò nuôi thƣơng phẩm, bệnh Vibriosis,
bệnh mòn vây cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá mú, cá giò, cá
chẽm (Đỗ Thị Hòa et al, 2008). Theo thống kê Ở Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ
nuôi cá biển bị chịu tác hại của bệnh do vi khuẩn. Bệnh có thể xảy ra ở nhiều loài cá

biển nuôi nhƣ cá mú, cá chẽm, cá hồng, đặc biệt giai đoạn cá nhỏ (5 - 20cm), cá

5
nuôi lồng thƣờng chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn với tỷ lệ chết có thể đạt 50-
100%, đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng (Đỗ Thị Hòa, 2008). Các vi khuẩn gây
bệnh trên cá biển đã đƣợc biết nhƣ : Vibrio spp., Aeromonas spp., Flexibacter sp.,
Pseudomonas fluorescents, Pseudomonas putida, Photobacterium damsela, (Đỗ Thị
Hòa, 2008). Trong đó, nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh đang đƣợc chú ý hơn cả
vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hƣởng nghiêm trọng của chúng trong nghề nuôi
trồng thủy sản hiện nay.
Vibrio – vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản. Bệnh vibriosis
là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi khuẩn Vibrio
spp. gây ra. Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc
tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi
trƣờng nhƣ cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch
bệnh vibriosis ở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa et al, 2004). Vibrio là tác nhân
gây bệnh nguy hiểm đối với động vật thủy sản. V. anguillarum, V.salmonicida,
và V.vulnificus là ba trong số những loài gây bệnh chính cho vài loài cá. Số
lƣợng chết gây ra bởi Vibrio trên cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai
đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ
(Thompson et al, 2004).
Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh, bệnh
vibiosis đã trở thành các bệnh thƣờng gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy
sản (Đỗ Thị Hòa et al, 2004). Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát đƣợc ở khắp
mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nƣớc lợ và nƣớc mặn, sự phân bố của bệnh
này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ.
Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang đƣợc nuôi phổ biến ở nhiều
quốc gia châu Á, nhƣ cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thƣờng
bị bệnh này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển. Bệnh thƣờng thể hiện các
dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau

một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu. Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tƣợng
xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể gây chết hàng

6
loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa et al,
2004). Từ cá bệnh ở Việt Nam ngƣời ta đã phân lập đƣợc một số loài vi khuẩn nhƣ
Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, và V. anguillarum (Phan Thị Vân et al,
2000). Ngoài ra có những báo cáo khác về bệnh do Vibrio ở cá nhƣ vi khuẩn V.
anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V. salmonicida
gây bệnh ở cá vùng nƣớc lạnh (Đỗ Thị et al, 2004).
Nghiên cứu bệnh ở động vật thân mềm cho đến nay còn rất hạn chế, chƣa có
nhiều nghiên cứu về lĩnh vực này. Bệnh và địch hại đối với động vật thân mềm
đƣợc quan tâm ở hai giai đoạn: Ấu trùng và trƣởng thành trong quá trình ƣơng nuôi.
Ký sinh trùng là đối tƣợng rất nguy hiểm, ngoài ra Vi khuẩn cũng gây bệnh cho ấu
trùng động vật thân mềm. Nghiên cứu của Davis (1954) phát hiện ra loại vi khuẩn
Sirolpidium zoophhorum gây hại cho giai đoạn ấu trùng động vật nhuyễn thể.
Nghiên cứu của Gaillo (1954) cho thấy, hai loại vi khuẩn của Vibrio và một loại giả
đơn bào khuẩn que Pseudomonas trong quá trình đồng hoá và dị hoá chúng tiết ra
chất độc, khi hàm lƣợng chất độc đạt tới nồng độ cao nhất. Sẽ làm ấu trùng nhuyễn
thể hai mảnh vỏ ngừng sinh trƣởng thậm chí làm ấu trùng chết hàng loạt (Đào Minh
Đông, 2004).
Địch hại của Tu hài là một số loài cua biển và cá sống ở tầng đáy. Chúng tấn
công và ăn Tu hài rất mạnh. Trong quá trình nuôi thƣơng phẩm Tu hài nếu không sử
dụng các biện pháp để bảo vệ Tu hài thì tỷ lệ thu hồi sẽ thấp.
Trong sản xuất giống nhân tạo qua quan sát trên kính hiển vi thấy ấu trùng
Tu hài thƣờng gặp phải một số bệnh: nguyên sinh động vật và bệnh nấm. Nguyên
sinh động vật chúng tấn công vào trong cơ thể ấu trùng và gây chết hàng loạt, nhất
là giai đoạn ấu trùng Spat. Trong quá trình ƣơng nếu bể ƣơng không thay nƣớc
thƣờng xuyên và kịp thời thì nấm phát triển rất nhanh, làm bẩn môi trƣờng nƣớc và
làm ấu trùng chết hàng loạt (Lê Xân, 2001).

Thời gian gần đây từ tháng 8 năm 2011 đến nay, theo thu nhận từ ngƣời dân
nuôi tu hài cho thấy tu hài mắc bệnh không co đƣợc vòi, vòi bị sƣng, rìa vỏ bị thâm
đen, tu hài chết ở các độ tuổi và kích cỡ khác nhau. Theo kết quả xét nghiệm của

7
Trung tân chẩn đoán thú y Trung ƣơng ngày 30/5/2012 thì tất cả các mẫu xét
nghiệm đều dƣơng tính với vi khuẩn Vibrio spp. và nội ký sinh Perkinsus spp
1.1.2. Các biện pháp phòng trừ
Động vật thủy sản sống trong nƣớc nên vấn đề phòng và trị bệnh không
giống gia súc trên cạn. Mỗi khi trong ao động vật thủy sản bị bệnh, không thể chữa
từng con mà phải chữa bệnh theo quần đàn, thuốc dùng phải tính cho tổng số cá thể
trong ao nuôi nên tốn kém nhiều, các loại thuốc chữa bệnh ngoài da cho động vật
thủy sản thƣờng phun trực tiếp xuống nƣớc, nên chỉ áp dụng với ao có diện tích
nhỏ, còn các thủy vực có diện tích mặt nƣớc lớn không sử dụng đƣợc phƣơng pháp
này. Các thuốc chữa bệnh bên trong cơ thể động vật thủy sản phải trộn vào thức ăn,
nhƣng những con bị bệnh lại không ăn, những con khỏe lại ăn rất nhiều, nên dù có
sử dụng loại thuốc đúng nhƣng hiệu quả cũng không cao và những con khỏe mạnh
cũng phải dùng thuốc làm ảnh hƣởng tới sinh trƣởng của chúng. Có một số thuốc
khi chữa bệnh cho động vật thủy sản có thể tiêu diệt đƣợc nguyên nhân gây bệnh (vi
khuẩn, nấm, ký sinh trùng) nhƣng kèm theo phản ứng phụ nặng nề với động vật
nuôi và môi trƣờng nuôi Vì vậy các nhà nuôi trồng thủy sản luôn đặt vấn đề phòng
bệnh cho động vật thủy sản lên hàng đầu và nguyên tắc là: ”phòng bệnh là chính,
chữa bệnh khi cần thiết” (Đỗ Thị Hòa, 2004).
Các biện pháp phòng trừ đang đƣợc áp dụng trong nuôi trồng thủy sản nhƣ
ngăn chặn sự xâm nhập và kìm hãm sự phát triển của tác nhân gây bệnh, quản lý
môi trƣờng nuôi thích hợp và nâng cao sức đề kháng của động vật thủy sản nuôi
(Đỗ Thị Hòa, 2004).
Biện pháp phòng và trị bệnh do nấm hiện nay thƣờng dùng muối ăn (NaCl)
nồng độ 2 - 3%, sulfate đồng (CuSO
4

) nồng độ 0,5g/m
3
nƣớc để tắm cho cá nuôi.
Biện pháp phòng ngừa các bệnh do ký sinh trùng thƣờng là giữ vệ sinh ao cá
nhất là ao ƣơng, cải tạo ao nuôi kỹ càng, thả cá với mật độ vừa phải và tẩy giun sán
định kỳ cho cá nuôi bằng thuốc.

8
Hiện nay chƣa có biện pháp chữa trị cho bệnh bởi virus trên cá nuôi nên để
giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh virus thì phải đảm bảo nguồn giống sạch virus và hạn
chế nhập, xuất khẩu các loại cá có nguy cơ nhiễm virus đã biết.
Vấn đề cấp bách hiên nay đối với ngƣời nuôi là thâm canh nuôi trồng thủy
sản đã dẫn đến ngày càng tăng các vấn đề với bệnh do vi khuẩn. Các bệnh chủ yếu
do Aeromonas, Vibrio, Cytophaga, Streptococcus, Pasteurella, Mycobacterium, và
Edwardsiella chi (Bảng 1.1). Để giải quyết vấn đề này, nông dân thƣờng xuyên sử
dụng các chất kháng sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006). Tuy
nhiên chất kháng sinh dƣờng nhƣ đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do việc
lạm dụng quá mức. Việc sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng
kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thƣờng và gây ra hiện tƣợng mất
cân bằng vi sinh (microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản
phẩm thủy sản có hại cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, các giải pháp thay thế
thân thiện với môi trƣờng nhƣ sử dụng vaccine. Nhƣng việc sử dụng vaccine
thƣờng tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân công và gây stress mạnh cho động vật
nuôi (Corripio-Myar et al, 2007; Smith, 2007). Hơn nữa vẫn chƣa có vaccine ngừa
bệnh cho tôm và nhuyễn thể (Subasinghe, 2009). Do vậy, sử dụng các vi khuẩn sinh
bacteriocin có thể là giải pháp thay thế rất phù hợp với vai trò kép bởi vì bacteriocin
sẽ là một chất kháng sinh thế hệ mới an toàn và thân thiện với sức khỏe con ngƣời
và môi trƣờng, trong khi đó các vi khuẩn đóng vai trò của probiotic.
1.2. Tình hình nuôi trồng và đặc điểm sinh học của tu hài
Việt Nam có bờ biển kéo dài hơn 3200km, có khoảng 112 cửa sông và 1,7 triệu

ha mặt nƣớc nuôi trồng thủy sản. Trong đó diện tích bãi triều khoảng 666,00ha
(Phạm Thƣợc, 2005) tạo nên tiềm năng lớn cho nghề nuôi các đối tƣợng hải sản,
đặc biệt là loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia). Nhuyễn thể hai mảnh vỏ
đang trở thành ngành có tiềm năng kinh tế, với giá trị xuất khẩu đứng thứ ba trong
ngành thủy sản Việt Nam. Trong những năm gần đây nghề nuôi thƣơng phẩm tu hài
(Lutraria philippinarum) - một loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ đặc sản – đang phát
triển mạnh đem lại lợi ích kinh tế cao cho hộ nuôi.

9
1.2.1. Tình hình nuôi tu hài
Tu hài phân bố chủ yếu ở vùng biển Hải Phòng-Quảng Ninh nhƣ các vùng
Vạn Bội, vịnh Lan Hạ, Cát Dứa, Lão Vọng, Cống Kê, Cáp Quan, Vạn Dong, Soi
Gianh, Đầu Bê, Cửa Vạn và Lạch Miều. Hai khu vực tập trung chủ yếu là từ đông
đảo Cát Bà đến Hòn Đá Mài và từ Đảo Cống Tây đến Cây Khế Đông (Phạm Thƣợc,
2005). Năm 2001, Phòng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn huyện Cát Hải đã
phối hợp với ngƣ dân thử nghiệm nuôi thƣơng phẩm Tu hài ở hai địa điểm: Vụng
Chùa Đá thuộc đảo Trà Bản và đảo Đồng Chén thuộc xã đảo Bản Sen – Vân Đồn.
Thử nghiệm nuôi thƣơng phẩm với hình thức nuôi trên bãi triều tự nhiên và nuôi
khay. Kết quả sau thời gian nuôi 120 ngày với cỡ giống thả ban đầu 2,5 – 3cm tăng
lên 4,5 – 5cm với khối lƣợng đạt 20 – 25g/con, tỷ lệ sống đạt 80% (Đào Minh
Đông, 2004). Dần dần mô hình này đƣợc nhân rộng ra và trở thành đối tƣợng nuôi
chủ lực, chuyển đổi cơ cấu sản xuất và góp phần xoá đói giảm nghèo cho ngƣ dân
ven biển, tạo điều kiện đẩy mạnh kinh tế vùng. Năm 2007 cả hai vùng có trên 250
hộ nuôi Tu hài sử dụng trên 550,20ha diện tích mặt nƣớc, trong đó khu vực Cát Bà
có diện tích khoảng 33ha. Cả hai vùng có khoảng 12.424 ô lồng nuôi cá, có thể nuôi
treo kết hợp với đối tƣợng nhuyễn thể trong đó có Tu hài. Ở Cát Bà có khoảng 476
bè nuôi cá với 6724 ô lồng (Sở thuỷ sản Hải Phòng, 2007). Việc ngƣ dân nuôi kết
hợp cá lồng và treo nhuyễn thể là hƣớng đi đúng nhằm tận dụng diện tích mặt nƣớc,
tăng thu nhập cho ngƣời nuôi đồng thời bảo vệ đƣợc môi trƣờng sinh thái. Tu hài đã
đƣợc di giống vào nuôi và phát triển nguồn lợi tại. Trong 2 năm 2004 và 2005 tu hài

đã đƣợc di giống vào nuôi tại khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang (Phạm Thƣợc,
2005). Cho đến nay thì tu hài đã đƣợc mở rộng vùng nuôi tại Khánh Hòa ra cả vịnh
Cam Ranh và vịnh Vân Phong.
1.2.2. Đặc điểm sinh học
Tu hài (Lutraria philippinarum) là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có khối
lƣợng cá thể có thể đạt đến 150 – 160 g/con, vỏ mỏng, tỷ lệ phần “thịt” lớn, thơm
ngon. Tu hài phân bố ở vùng biển ấm nhƣ Philippin, Ôxtrâylia, Việt Nam,… nhƣng

10
cũng chỉ ở một số phạm vi rất hẹp. Tu hài có giá trị kinh tế cao so với tất cả các loài
nhuyễn thể hai vỏ và nhiều loài hải sản khác phân bố ở Việt Nam. Thịt tu hài chứa
tới 11,63% đạm, 0,42% đƣờng, 1,22% muối khoáng, đặc biệt có tới 18 loại axit
amin không thay thế. Thịt tu hài thơm ngon nhất vào mùa sinh sản từ tháng 12 đến
tháng 2 (Lê Xân et al, 2001).
Tu hài là đối tƣợng thân mềm hai mảnh vỏ có vị trí phân loại nhƣ sau:
Ngành động vật thân mềm: Mulusca
Lớp hai mảnh vỏ: Bivalvia
Bộ biện mang: Eulamellibranchia
Họ vọp: Mactridae
Loài Tu hài: Lutraria rhynchaena (Jonas, 1844)
Hay : Lutraria philippinarum (Reeve, 1858)
Tên tiếng Anh: Gweo- Duck (Otter Clam)
Tên tiếng Việt: Tu hài
Nguồn : Phạm Thƣợc (2005)

Hình 1.1. Tu hài Lutraria philippinarum
Tu hài có cơ thể đƣợc bảo vệ bởi hai tấm vỏ khá đều nhau, chiều dài thân dài
hơn chiều dài cơ thể, hai vỏ dính liền nhau ở phần lƣng bởi dây nề. Vỏ đƣợc cấu tạo
bằng đá vôi, màu sắc thay đổi theo môi trƣờng sống. Vỏ không có khả năng khép
chặt nhƣ vỏ trai, hầu, vẹm Các gờ sinh trƣởng khá rõ nét, vết màng áo sâu và rõ.

Màng áo ngoài gồm 2 tấm giáp liền với vỏ và bao phủ toàn bộ cơ thể, mở ra ở phần

11
bụng. Phần cuối phát triển tạo thành 2 vòi ống hút và xả. Mép màng áo dày có khả
năng vận chuyển cát khi đào hang. Ống xiphông khá phát triển – do đặc điểm sống
đáy, tu hài đào hang sống vùi dƣới đáy cát, cát sỏi hoặc mảnh vụn vỏ hầu, hà, san
hô. Vì vậy mọi trao đổi chất của Tu hài đều thông qua 2 ống xiphông này.
Tu hài đào hang sâu tới 40 – 50cm, di chuyển theo chiều sâu của hang, chỉ
thò hai ống xiphông lên lấy thức ăn và hô hấp. Chất đáy cho tu hài cƣ trú là đáy cát
sỏi lẫn vỏ hầu, hà không thấy Tu hài sống ở đáy bùn hoặc thuần cát.
Tu hài là loài ƣa độ muối cao và ổn định (từ 24 – 33
0
/
00
), thích hợp nhất là từ
29 – 32
0
/
00
. Tu hài sống chủ yếu ở nơi có nền đáy là cát thô, lẫn sỏi, đá nhỏ, vùng
rạn san hô và một vài nơi có nền đáy là cát pha bùn. Tu hài phân bố tập trung thành
bãi ở đới trung, hạ triều cho tới vùng ngập nƣớc dƣới triều độ sâu tới 10m. Chúng
sống vùi trong nền đáy ở độ sâu 20 – 50cm (Nguyễn Xuân Dục, 2005). Khi điều
kiện môi trƣờng thay đổi, đặc biệt ở những vùng chịu ảnh hƣởng của nƣớc ngọt, Tu
hài sẽ trồi lên mặt bãi và di chuyển bằng cách: 2 ống xiphông căng duỗi ra phía
trƣớc, chân thò ra uốn cong và bật mạnh xuống nền đáy đẩy mạnh Tu hài lên khỏi
mặt bãi. Nhờ dòng nƣớc chúng di chuyển đến nơi ở mới.
Cũng giống nhƣ các loài động vật nhuyễn thể khác, Tu hài là loài mang tấm
ăn lọc. Tu hài không có khả năng lựa chọn thức ăn theo mùi vị và chất lƣợng, nƣớc
cùng với thức ăn theo ống xiphông hút vào xoang màng áo qua các kẽ mang, thức

ăn có kích thƣớc thích hợp đƣợc giữ lại nhờ các tấm mang. Sau đó thức ăn đƣợc
chuyển xuống xúc biện và đƣa xuống dạ dày. Phần thức ăn không tiêu hóa, đƣợc
tống ra ngoài qua hậu môn vào xoang áo và thoát ra ngoài qua ống xiphông thoát.
Thức ăn là các loài tảo phù du, trong đó chủ yếu là các loài tảo Silic nhƣ:
Coscinodicus, Navicula, Nitszchia, Cyclotella , các mảnh vụn hữu cơ và các vi
sinh vật khác (Nguyễn Xuân Dục, 2005).
1.3. Tổng quan về bacteriocin
1.3.1. Đặc điểm chung của bacteriocin
Bacteriocin đã đƣợc phát hiện cách đây gần trăm năm từ nghiên cứu của
Gratia về khả năng của Escherichia coli kháng lại E.coli có tên gọi là colicin để xác

12
định đƣợc loài vi khuẩn đã sinh ra (Gratia, 1925). Thuật ngữ bacteriocin không xuất
hiện cho đến những năm 1950 (Desriac et al, 2010).
Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp
và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với
giống sản xuất (Tagg, 1976). Bacteriocin đƣợc sản xuất ở hầu hết các dòng vi khuẩn
và có thể là tất cả các thành viên của cổ khuẩn (Bakkal, 2012). Một họ bacteriocin
rất đa dạng về kích thƣớc protein, vi khuẩn kháng mục tiêu, phƣơng thức hoạt động,
sự phóng thích, cơ chế miễn dịch và có thể đƣợc chia thành hai nhóm chính: nhóm
sản xuất bởi vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng (Heng et al. 2007). Hơn nữa một số
nhỏ bacteriocin từ các loại cổ khuẩn cũng đang đƣợc nghiên cứu đặc điểm (Suphan
Bakkal, 2012). Một số loài vi khuẩn sản xuất độc tố có thể biểu hiện nhiều tính
năng giống nhƣ bacteriocin, nhƣng chƣa đƣợc đầy đủ đặc trƣng, những độc tố này
đƣợc gọi là các chất ức chế giống nhƣ bacteriocin hoặc BLIS (Messi et al, 2003).
Bacteriocin khác biệt với kháng sinh truyền thống ở những điểm chủ yếu nhƣ
bacteriocin đƣợc tổng hợp nhờ ribosome, phổ kháng khuẩn hẹp thƣờng chỉ có khả
năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất (Riley và
Wertz, 2002b), tế bào chủ miễn dịch với chúng (Trần Thị Tƣởng An, 2007).
1.3.2. Phân loại bacteriocin

Đến nay, khoảng 200 bacteriocin đã đƣợc nghiên cứu về các đặc điểm
(Bactibase, 2007). Phân loại bacteriocin vẫn chƣa đƣợc thống nhất và đang là vấn
đề gây tranh cãi. Mặc dù đến những năm 1993, phân loại bacteriocin đƣợc xác định
bởi Klaenhammer vẫn đƣợc sử dụng nhiều nhất (Klaenhammer, 1993). Năm 2005,
Cotter et al đề xuất sửa đổi (Cotter, 2005) và tranh luận bởi Heng và Tagg trong
năm 2006 (Tagg, 2006). Theo cập nhật mới nhất của Bakkal và cộng sự (2012) thì
bacteriocin đƣợc chia thành ba nhóm chính là nhóm sinh ra từ vi khuẩn Gram âm,
nhóm sinh ra từ vi khuẩn Gram dƣơng và nhóm sinh từ cổ khuẩn (Bakkal, 2012).
Dƣới đây là miêu tả ngắn về những lớp bacteriocin từ vi khuẩn và cổ khuẩn và
những loại bacteriocin của mỗi lớp (Bảng 1.1).

13
Bảng 1.1. Bacteriocin của vi khuẩn và cổ khuẩn

Bacteriocin
Loại/Lớp
Trọng
lƣợng
phân
tử
(kDa)
Ví dụ
Tài liệu tham
khảo
Vi khuẩn Gram âm
Colicin

Tạo lỗ trên màng
20-80

Colicin A, B
Cascales et al (2007)
Michel - Briand &
Baysse ( 2002)
Gillor et al (2004)
Reeves (1965)
Nuclease
Colicin E2, E3
Giống
colicin
Chƣa biết
20-80

S-pyocin
Klebicin
Giống đuôi
phage

Chƣa biết
> 80

R và F pyocin
Microcin
Biến đổi sau dịch mã
< 10
Microcin C7
Không biến đổi
Microcin B17
Colicin V
Vi khuẩn Gram dƣơng

Lớp I

Type A-dạng thẳng tích
điện dƣơng
< 5

Nisin
Heng et al (2007)
Drider et al (2006)
Field et al (2007)
Maqueda et al (2004)
Type B-hình cầu, tích
điện âm hoặc không tích
điện
Mersacidin
Type C-hỗn hợp
Lacticin 3147
Lớp II

Class IIa-kháng Listeria
< 10

Pediocin PA1
Class IIb-hỗn hợp
Carnobacteriocin B2
Lớp III

Type IIIa-enzyme phân
giải
> 10

Lysostaphin
Type IIIb-peptide không
phân giải
Helveticin
Lớp IV
Peptide vòng
< 10
Enterocin AS-48
Cổ khuẩn
Halocin
Microhalocin
< 10

Halocin A4, C8, G1
Shand et al (2007)
Connor & Shand
(2002)
Ellen et al (2011)
Sun et al (2005)
Protein halocin
> 10

Halocin H1, H4
Sulfolobicin


Chƣa biết
~20

Sulfolobicin

(Nguồn: Bakkal, 2012)



14
1.3.2.1. Bacterioin của vi khuẩn Gram âm
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm đƣợc chia làm 4 loại: colicin, bacteriocin
giống colicin, bacteriocin giống đuôi phage và microcin (Bảng 1.1).
Các loại colicin từ E. coli đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Hơn nữa, chúng đang
đƣợc sử dụng nhƣ một hệ thống mẫu để nghiên cứu cấu trúc, chức năng và tiến hóa
của bacteriocin (Riley & Wertz, 2002a, 2002b). Nhìn chung các loại colicin nhạy
cảm với protease, nhiệt có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 90 kDa (Pugsley & Oudega,
1987). Có hai loại colicin chính dựa trên kiểu giết của chúng là tạo lỗ màng và
nuclease. Những loại colicin tạo lỗ màng (colicin A, B, E1, Ia, Ib, K, E1, 5) giết các
dòng nhạy cảm nhờ tạo lỗ trên màng. Những loại colicin nuclease (colicin E2, E3,
E4, E5, E6, E7, E8, E9) giết bằng hoạt động của các DNase, RNase hoặc tRNAse
(Gillor et al., 2004).
Những loại bacteriocin có bản chất protein sản xuất bởi các loài vi khuẩn
Gram âm khác đƣợc nhóm bacteriocin giống colicin do có đặc tính tƣơng tự colicin
về cấu trúc và chức năng (Bảng1.1).Giống nhƣ colicin, chúng có thể có nuclease
(pyocin S1, S2) và các lỗ màng (pyocin S5) (Michel-Briand & Baysse, 2002).
Klebicin của loài Klebsiella, S-pyocin của Pseudomonas aeruginosa, và alveicin
của loài Hafnia alvei là một trong những bacteriocin giống colicin đƣợc nghiên cứu
nhiều nhất.
Các loại bacteriocin giống đuôi phage là những cấu trúc lớn hơn nhƣng
giống nhƣ đuôi của thực khuẩn. Một số nghiên cứu thậm chí còn cho rằng chúng là
khiếm khuyết các hạt thực khuẩn thể (Bradley, 1967). Pyocin R và F của P.
aeruginosa là một số nghiên cứu kỹ lƣỡng nhất về bacteriocin giống đuôi thể thực

khuẩn. Chúng đƣợc mã hóa trong một nhóm gen lớn, trải dài một khu vực DNA lớn
hơn 40 kb. Có 44 khung đọc mở liên kết với kiểu hình R2/F2, trong đó bao gồm gen
điều chỉnh, gen ly giải, và các gen độc. Pyocin R2 và F2 cho thấy các trình tự tƣơng
tự nhƣ gen sợi đuôi của P2 và thể thực khuẩn lambda (Nakayama et al., 2000).
Cuối cùng, các vi khuẩn Gram âm sản xuất các bacteriocin peptide rất nhỏ
(<10 kDa) đƣợc gọi là microcin. Microcin có thể đƣợc chia thành hai lớp: microcin

15
sửa đổi sau dịch mã (microcins B17, C7, J25, và D93) và microcin không sửa đổi
(microcins E492, V, L, H47, và 24) (Bảng 1.1). Microcin đƣợc mã hóa trên nhiễm
sắc thể (Gillor et al, 2004).
1.3.2.2. Bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng
Bacteriocin của các vi khuẩn Gram dƣơng thƣờng đƣợc chia thành bốn lớp
dựa trên kích thƣớc, hình thái học, đặc điểm vật lý và hóa học.
Lớp I bao gồm các bacteriocin lantibiotic là các peptide kích thƣớc nhỏ (<5
kDa) (Field et al., 2007). Chúng là những biến đổi trong quá trình dịch mã, kết hợp
với các acid amin phi truyền thống (non-traditional) nhƣ là dehydroalanine,
dehydrobutyrine, methyl-lanthione, and lantionine (Cleveland et al., 2001). Lớp này
đƣợc chia thành loại A, B và C. Loại A là những peptide thẳng dài tích điện dƣơng,
trong khi loại B là peptide hình cầu hoặc là trung hòa hoặc tích điện âm. Các
bacteriocin thuộc loại C thì là bacteriocin hoạt động phối hợp của hai peptide hoạt
động. Nisin và lacticin là các bacteriocin thuộc loại C đã đƣợc nghiên cứu
(McAuliffe et al, 2001).
Lớp II là các bacteriocin nhỏ (<10 kDa), bền nhiệt và không bị biến đổi trong
quá trình dịch mã (Heng et al, 2007). Lớp II cũng đƣợc chia thành hai nhóm. Lớp
IIa các peptide giống pediocin hoặc loại kháng Listeria, có chứa trình tự bảo tồn N-
terminal (YGNGVxCxxxxCxV). Lớp IIb là các bacteriocin có hoạt động phối hợp
của hai peptide hoạt động (Nissen-Meyer et al, 1992).
Lớp III là các peptid không bền nhiệt khá lớn (> 10 kDa), đƣợc chia thành
hai phân nhóm. Loại IIIa là các bacteriolysin là các enzyme phân giải. Lysostaphin

là bacteriocin nghiên cứu nhiều nhất trong phân nhóm này. Loại IIIb là bacteriocin
không phân giải.Helveticin J (37 kDa) sản xuất bởi Lactobacillus helveticus thuộc
loại này (Joerger & Klaenhammer, 1986).
Cuối cùng, lớp IV là các bacteriocin có đặc điểm cấu trúc độc đáo. Axit amin
đầu tiên và cuối cùng các bacteriocin đƣợc liên kết cộng hóa trị với nhau, do đó
chúng có cấu trúc vòng. Enterocin AS-48 đƣợc sản xuất bởi Enterococcus faecalis

16
subsp.liquefaciens S-48 là bacteriocin đặc trƣng đầu tiên thuộc lớp này (Maqueda et
al, 2004).
1.3.2.3. Bacteriocin của cổ khuẩn
Cổ khuẩn cũng tạo ra các chất kháng khuẩn giống nhƣ bacteriocin gọi là
archaeocin (Shand & Leyva, 2007). Chúng ít đƣợc nghiên cứu hơn so với các loại
bacteriocin của vi khuẩn. Nhƣ vậy đến nay, hai loại chính của archaeocin đã đƣợc
xác định bao gồm halocin của Halobacteria và sulfolobicin của loài Sulfolobus.
Halocin có thể là peptide (<10 kDa) và / hoặc protein (> 10 kDa) (Shand & Leyva,
2007). Theo Torreblanca và Meseguer (1994), Sản xuất halocin là một đặc tính phổ
biến của Halobacteria. Halocin nằm trên plasmid lớn (hoặc nhiễm sắc thể nhỏ).
Halocin H4 và S8 đƣợc định vị tƣơng ứng trong khoảng ~ 300 kbp và ~ 200 kbp
của plasmid. Hoạt động của chúng thƣờng đƣợc phát hiện vào cuối pha tăng trƣởng
và đầu pha cân bằng (Cheung et al., 1997). Chƣa có nhiều nghiên cứu về
sulfolobicin. Prangishvili và cộng sự (2000) đã tuyển chọn các chủng Sulfolobus
islandicus phân lập từ miệng núi lửa ở Iceland có sản sinh sulfolobicin. Nghiên cứu
này dự đoán rằng sulfolobicin hoạt động liên quan đến màng và không đƣợc tiết từ
tế bào. Sulfolobicin cũng liên quan với lỗ màng kích thƣớc đƣờng kính dao động từ
90 đến 180 nm (Prangishvili et al, 2000). Sulfolobicin rất giống bacteriocin, chịu
nhiệt và nhạy cảm khi xử lý protease. Phƣơng hành động của chúng vẫn còn chƣa
biết (Ellen et al, 2011).
1.3.3. Di truyền bacteriocin
Bacteriocin có thể đƣợc mã hóa trên nhiễm sắc thể, plasmid hoặc các gen

nhảy. Ví dụ, colicin của E. coli và halocin H4 là mã hóa trên plasmid trong khi
pyocin của P. aeruginosa là nhiễm sắc thể (Cheung et al, 1997). Lacticin 481 đã
đƣợc chứng minh là nằm trên gen nhảy Tn5721 (Dufour et al, 2000) và một số loài
vi khuẩn nhƣ Serratia marcescens có bacteriocin mã hóa trên cả plasmid và nhiễm
sắc thế (Riley & Wertz, 2002b). Sự khác biệt về chức năng của các bacteriocin
đƣợc sản sinh bởi vi khuẩn Gram âm, Gram dƣơng và cổ khuẩn đƣợc xem xét ở

17
mức độ di truyền. Nói chung, đầy đủ các chức bacteriocin sản xuất bởi các vi khuẩn
Gram âm đƣợc mã hóa thông qua ba gen liên kết chặt chẽ là gen độc tố, miễn dịch
và các gen phân giải (Hình 1.2A). Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong di
truyền học của colicin, bacteriocin giống colicin, bacteriocin giống đuôi phage và
microcin (Hình 1.2). Ví dụ, các cụm gen colicin bao gồm ba gen liên quan
bacteriocin xếp gần nhau trong một cụm, trong khi bacteriocin giống colicin nhƣ
pyocin S3 không có một gen phân giải (Hình 1.2A-B).

Hình 1.2.Tổ chức di truyền của bacteriocin
(Nguồn: Bakkal, 2012)
(Mũi tên ngang đại diện cho gen, không mở rộng)
A- tổ chức di truyền cụm gen colicin. PSO và Pimm đại diện cho vùng
promoter của SOS và các gen miễn dịch.caa gen mã hóa colicin A; cai mã hóa gen
miễn dịch và cal mã hóa gen lysis (chuyển thể từ Cascales et al, 2007).