khảo sát khả năng phân hủy hydrogen peroxide của cao chiết lá cây sa kê (artocarpus altilis (park.) fosb) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ñó
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
HYDROGEN PEROXIDE CỦA CAO CHIẾT
LÁ CÂY SA KÊ (Artocarpus altilis (Park.) Fosb)
IN VITRO
Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG TRƯƠNG THỊ NGỌC TUYỀN
BỘ MÔN SINH HỌC MSSV: 3102707
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LỚP: SINH HỌC K36
Cần Thơ, Tháng 11/2013
i
LỜI CẢM ƠN
Luận văn tốt nghiệp là một bài học to lớn cũng như một thành quả đầu tiên của
thời sinh viên. Thành quả này góp một phần không nhỏ trong hành trang vào cuộc
sống đối với sinh viên nói chung và sinh viên ngành Sinh Học nói riêng. Tất cả
những điều tôi học được từ luận văn trên giúp tôi trau dồi thêm những kiến thức đã
học, kèm theo nhiều kinh nghiệm qu
ý báu có thể cho tôi khả năng định hướng tốt và
vững vàng cho những công việc thuộc chuyên ngành trong tương lai.
Trong quá trình làm luận văn tôi cũng gặp không ít khó khăn. Tuy nhiên, nhờ
có sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè đã giúp tôi vượt qua.
Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến Cô TS. Đái Thị Xuân Trang đã tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn
.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến quí Thầy Cô Bộ môn Sinh học - Khoa
Khoa Học Tự Nhiên đã cho tôi nền tảng kiến thức để tôi có thể học hỏi và trao dồi

thêm kỹ năng của mình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến quí Thầy Cô Bộ môn Hóa
học
- Khoa Khoa Học Tự Nhiên, các anh chị cán bộ Phòng Sinh Học Phân Tử -
Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành
tốt luận văn.
Tôi xin cám ơn bạn Huỳnh Ngọc Trúc và chị Hồ Ngọc Phụng lớp Sinh học
Khóa 35 đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, các bạn lớp
Sinh Học K36 đã chia sẻ, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
Trong bước đầu nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế và còn nhiều bỡ
ngỡ nên chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được
những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và anh chị khóa trước, các bạn học
cùng lớp để kiến thức của tôi trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Trương Thị Ngọc Tuyền
ii
LỜI CAM KẾT
Tôi xin cam đoan Luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu
của tôi dưới sự hướng dẫn của Cô Đái Thị Xuân Trang. Các số liệu và kết quả trình
bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được cá nhân nào công bố
trong bất kỳ luận văn nào trước đây.
Cán bộ hướng dẫ
n Sinh viên thực hiện
Đái Thị Xuân Trang Trương Thị Ngọc Tuyền
iii
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. Đái Thị Xuân Trang
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
iv
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Str
ess oxy hóa và gốc tự do 3
2.1.1. Stress oxy hóa 3
2.1.2. Gốc tự do 3
2.2. Chất chống oxy hóa 4
2.3. Hoạt động của các chất chống oxy hóa tự nhiên 6
2.3.1. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong nước 6
2.3.1.1. Các hợp chất phenol 6
2.3.1.2. Vitamine C 7
2.3.2. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong chất béo 8
2.3.2.1 Các carotenoid 8
2.3.2.2. Vitamine E 9
2.4. Giới thiệu về hydrogen peroxyde (H
2
O
2

) 10
2.5. Giới thiệu về Trolox 10
2.6. Giới thiệu về cây Sa Kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg) 11
2.6.1. Phân loại 11
2.6.2. Nguồn gốc 11
2.6.3. Hình thái 12
2.7 Các nghiên cứu về cây Sa Kê và giống Artocarpus 13
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 15
3.1. Phương tiện nghiên cứu 15
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 15
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị 15
3.1.3. Hóa chất 15
v
3.1.4. Đối tượng nghiên cứu 15
3.2. Phương pháp nghiên cứu 16
3.2.1. Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá cây Sa
Kê in vitro 16
3.2.1.1. Phương pháp trích cao lá cây Sa Kê bằng dung môi ethanol 16
3.2.1.2 Khảo sát hoạt động phân hủy gốc hydrogen peroxyde (H
2
O
2
)
(Hydrogen Peroxyde Scavenging Activity (HPSA) assay)
in vitro của cao
chiết lá cây Sa Kê
17
3.2.2. Thống kê phân tích số liệu 17
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1. Xác định độ ẩm và hiệu suất tạo cao chiết của lá Sa Kê 18

4.1.1. Độ ẩm của lá Sa Kê 18
4.1.2. Hiệu suất tạo cao chiết 19
4.2. Khảo sát hoạt động phân hủy gốc Hydrogen Peroxyde (H
2
O
2
) (Hydrogen
Peroxyde Scavenging Activity (HPSA) assay)
in vitro của cao chiết lá cây Sa Kê
19
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25
5.1. Kết luận 25
5.2. Kiến nghị 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26
vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Lá Sa Kê dùng trong thí nghiệm 17
Hình 4.2
Đường chuẩn khảo sát khả năng phân hủy H
2
O
2
in vitro của
Trolox 20
Hình 4.3
Phần trăm lượng Hydrogen Peroxyde (H
2
O
2
) còn lại sau phản

ứng với chất chống
oxy hóa có trong cao chiết lá Sa Kê 23
vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học (Fouad, 2006) 4
Bảng 2.2 Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa (Shi & Noguchi,
2001) 5
Bảng 4.1 Độ ẩm và hiệu suất tạo cao của lá Sa Kê 19
Bảng 4.2 Khả năng phân hủy gốc tự do H
2
O
2
của cao chiết lá cây Sa Kê .
21
viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ROS: Reactive Oxygen Species
RNS: Reactive Nitrogen Species
HPSA: Hydrogen Peroxyde Scavenging Activity
DCM: Dichloromethane
Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
OD: Optical Density
IC50: Inhibitory Concentration
ix
TÓM LƯỢC
Cây Sa Kê (Artocarpus altilis (Park.) Fosb.) là loài cây được người dân ở các nước
nhiệt đới sử dụng rộng rãi trong việc điều trị một số căn bệnh phổ biến như tiểu
đường, gout, cao huyết áp,… Nhiều nghiên cứu gần đây đã cho rằng
lá Sa Kê mang
nhiều tác dụng tiêu biểu của họ Dâu Tằm (Moraceae). Trong đó lá Sa Kê có thể thu

hái quanh năm. Chính vì vậy việc nghiên cứu một cách chuyên sâu về các tác dụng
dược l
ý để tăng giá trị sử dụng của loài cây này là cần thiết. Đề tài này được tiến
hành nhằm xác định khả năng phân hủy gốc tự do Hydrogen per
oxyde (H
2
O
2
) của
cao chiết lá
cây Sa Kê in vitro. Sự phân hủy gốc tự do của cao chiết được đo lường
thông qua khả năng hoạt động phân hủy gốc Hydrogen per
oxyde (Hydrogen
Peroxyde Scavenging Activity,
HPSA). Kết quả của nghiên cứu cho thấy cao chiết
lá Sa Kê có khả năng chống
oxy hóa dựa trên khả năng phân hủy H
2
O
2
. Khả năng
phân hủy gốc
H
2
O
2
của cao chiết tăng dần ở các nồng độ khảo sát 12,5; 25; 50; 100;
200; 400; 600; 800; 1000; 1200 và 1400 µg/ml.
Vì vậy, kết quả thí nghiệm chứng
minh cao chiết lá Sa Kê có khả năng phân hủy H

2
O
2
cao nhất lên đến 98,4% ở các
nồng độ
800 µg/ml.
Từ khóa: cây Sa Kê, HPSA, Hydrogen peroxyde, Trolox, stress oxy hóa,
chất chống oxy hóa, gốc tự do.
1
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Sự tạo thành các gốc tự do là quá trình tất yếu ở mọi cơ thể sống. Trong
khoảng hai thập niên gần đây, giới khoa học nói riêng và xã hội nói chung dành
sự quan tâm đặc biệt cho các “gốc tự do”, “stress
oxy hóa” và các “chất chống
oxy hóa” (Lại Thị Ngọc Hà et al, 2009). Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện
trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và
hoạt động của các chất chống
oxy hóa. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất
nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy
giảm hệ thần kinh (Alzheimer. Parkinson) và lão hóa sớm.
(Favier, 2003; Gardès
– Albert
et al, 2003; Pincemail et al, 1998; Fouad, 2006; Edeas, 2006).
Cây Sa Kê
, hay còn gọi là cây bánh mì (breadfruit) có tên khoa học là
Artocarpus altilis (Park.) Fosb. là một loài thuộc chi Artocarpus (chi Mít), họ
Dâu tằm (Moraceae).
Sa Kê có nguồn gốc ở Tây Thái Bình Dương, cụ thể là ở
Papua New Guinea và quần đảo Bismarck. Sa Kê có khả năng thích nghi với điều

kiện sinh thái rộng, ít bị sâu bệnh (Ragone, 1997, 2006). Đặc biệt,
lá Sa Kê còn
dùng được để chữa một số bệnh như gãy xương, bong gân, giảm đau thần kinh
hông, bệnh do nấm gây ra như bệnh tưa miệng (thrush), tiêu chảy, đau dạ dày và
lỵ, giúp giảm huyết áp
(Ragone, 2006). Vì vậy, ngày nay ở nước ta Sa Kê được
trồng rộng rãi, vừa làm thực phẩm, vừa làm cảnh
trong vườn nhà, các cơ quan,
đường phố, hoặc công viên và dùng chữa các bệnh.
Trong dân gian lá Sa Kê
được dùng để chữa phù thủng, viêm gan vàng da bằng cách nấu lá tươi để uống.
Việc việc chứng minh một cách khoa học về hiệu quả của các bài thuốc
chữa bệnh bằng lá Sa Kê trong dân gian là cần thiết
, từ đó có thể làm phong phú
hơn nguồn dược liệu
trong nước và thế giới.
Đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY H
2
O
2
CỦA CAO
CHIẾT LÁ
SA KÊ (Artocarpus altilis (Park.) Fosb.) IN VITRO” được thực
hiện nhằm đánh giá khả năng phân hủy H
2
O
2
ở mức độ in vitro trong việc giảm
bớt lượng gốc tự do tích tụ trong cơ thể mà gốc
H

2
O
2
là điển hình.
1.2. Mục tiêu đề tài
2
Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng phân hủy H
2
O
2
(một dạng chất oxy
hóa)
của cao chiết lá cây Sa Kê. Khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá cây Sa
Kê
được đánh giá in vitro bằng phương pháp HPSA (Hydrogen Peroxyde
Scavenging Activity).
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Trích các chất từ lá cây Sa Kê bằng dung môi ethanol 99%.
-
Sử dụng phương pháp HPSA để xác định khả phân hủy H
2
O
2
của lá cây
Sa Kê
in vitro.
3
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Stress oxy hóa và gốc tự do
2.1.1. Stress oxy hóa

Stress oxy hóa (oxydative stress) là sự rối loạn cân bằng giữa các chất
chống
oxy hóa và các chất oxy hóa trong cơ thể theo hướng tạo ra nhiều các chất
oxy hóa (Katalinic et al., 2006). Stress oxy hóa là kết quả của sự hình thành gốc
tự do vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể. Điều
này xảy ra khi các chất chống oxy hóa có nồng độ quá thấp, không đủ để trung
hòa các gốc tự do. Kết quả các gốc tự do sẽ tấn công các phân tử lipid, protein,
acid nucleic của tế bào dẫn đến tổn thương cục bộ và kết quả cuối cùng là gây sự
hoạt động bất thường của cơ quan (Meister, 1992). Stress oxy hóa là nguyên
nhân gây ra sự phát triển của ung thư, lão hóa, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer,
xơ vữa động mạch , suy tim, nhồi máu cơ tim, tiểu đường, gout,…(Halliwell,
2007; Valko et al, 2007; Singh et al, 1995).
2.1.2. Gốc tự do
Các gốc tự do là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive Oxygen
Species – ROS và Reactive Nitrogen Species –
RNS) là các dẫn xuất dạng khử
của
oxy và nitơ phân tử. Gốc tự do là tất cả các phân tử hóa học chỉ có một điện
tử duy nhất (electron mang điện âm) hay số điện tử lẻ. Do các phân tử mang điện
tử lẻ không cân bằng, không bền vững, dễ tạo ra phản ứng. Các phân tử mang
điện tử lẻ luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác,
và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới (Pal
et al., 2011). Gốc tự do
được chia thành hai nhóm lớn là các “gốc tự do” và dẫn xuất không phải gốc tự
do (Bảng
2.1). Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều
điện tử đơn lẻ. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như
oxy đơn, hydroperoxyde,
nitroperoxy
de là tiền chất của các gốc tự do. Các ROS và RNS phản ứng rất

nhanh với các phân tử quanh nó
, do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị
sinh học của các đại phân tử sinh học như DNA, protein, lipid. (Proctor,
1989;
Favier, 2003; Pincemail
et al., 1998; Minn, 2005; Fouad, 2006)
Các ROS và RNS được tạo ra là một quá trình tất yếu trong sự trao đổi
chất nhưng còn tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ
4
thể. Ở nồng độ thấp, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ: điều hòa
phân ly tế bào (apoptosis); kích hoạt các yếu tố phiên mã (NF
kB, p38-MAP
kinase,…) cho các gen t
ham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm; điều hòa biểu
hiện các gen mã hóa cho các enzyme chống
oxy hóa (Pincemail et al., 1998;
Favier, 2003; Pincemail, 2006). Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại
phân tử sinh học gây nên: đột biến ở DNA; biến tính protein;
oxy hóa lipid
(Favier, 2003; Pincemail
et al., 1998).
Bảng 2.1. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học (Fouad, 2006)
ROS/RNS
O
2
-
o
OH
ROO
o

H
2
O
2
1
O
2
NO
o
ONOO-
HOCl
Gốc superxyde
Gốc hydr
oxyl
Gốc peroxyde
Hydrogenperoxyde
Oxy
đơn
Oxyde nitrice
Peroxynitrite
Acid hypochlorique
2.2. Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc
đảo ngược quá trình
oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic
và Simic, 2000; Lachman et al., 2000; Singh và Rajini, 2004). Có nhiều cách
phân loại chất chống
oxy hóa, dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy
hóa được phân thành hai loại: các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống
oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc

tự do
nên kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình
oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do
(hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như
Cu, Fe; gây bất hoạt oxy đơn) (Singh và Rajini, 2004; Rolland, 2004). Cơ chế
hoạt động tóm tắt của các chất chống
oxy hóa được trình bày trong Bảng 2.2
5
Bảng 2.2 Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa (Shi & Noguchi,
2001)
1. Các chất chống oxy hóa bậc một: làm vô hiệu hóa tác động của các gốc tự do
Khử các gốc tự do
L° + AH → LH + A°
LOO° + AH → LOOH + A°
LO° + AH → LOH + A°
Tạo hợp chất với các gốc tự do
A° + LOO° → LOO
A° + LO° → LOA
2. Các chất chống
oxy hóa bậc hai: ngăn chặn sự tạo các gốc tự do
2.1. Phân giải hydroperoxyde và hydrogen peroxyde
Catalase
Phân giải hydrogen peroxyde
2 H
2
O
2
→ 2 H
2
O + O

2
Glutathion peroxydase (tế bào)
Phân giải hydrogen peroxyde và
hydroperoxy
de của acid béo tự do
2 H
2
O
2
+ 2 GSH → 2 H
2
O + GSSG
LOOH + 2
GSH → LOH + H
2
O +GSSG
Glutathion peroxydase (huyết tương)
Phân giải hydrogen per
oxyde và
hydroperoxy
de của phospholipide
2 H
2
O
2
+ 2 GSH → 2 H
2
O + GSSG
PLOOH +
2GSH → PLOH+H

2
O+GSSG
Peroxydase
Phân giải hydrogen peroxyde và
hydroperoxy
de của chất béo
LOOH + AH
2
→ LOH + 2 H
2
O + A
H
2
O
2
+ AH
2
→ 2 H
2
O + A
2.2. Tạo phức với kim loại gây phản ứng Fenton và Haber-Weiss
Transferrin, lactoferrin
Ceruloplassmin, albumin
Tạo phức với Fe
Tạo phức với Cu
2.3. Gây bất hoạt oxy đơn và ion superoxyd
Carotenoid
Gây bất hoạt oxy đơn
6
Superoxyde dimutase

Biến đổi ion superoxyde
2 O°
-
2
+ 2 H
+
→ 2 H
2
O + O
2
Hệ thống các chất chống oxy hóa ở cơ thể người có nguồn gốc nội sinh và
ngoại sinh. Các chất chống
oxy hóa nội sinh bao gồm các protein (ferritine,
transferrine, albumine, protein
sốc nhiệt - heat shock protein) và các enzyme
chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase). Các chất
chống
oxy hóa ngoại sinh là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường
thức ăn bao gồm vitamine E, vitamine C các carotenoid và các hợp chất phenolic.
Các chất này có nhiều trong rau, quả và được xem là các chất chống oxy hóa tự
nhiên. Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để
tăng cường hoạt động của hệ thống chống
oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có
nguồn gốc stress
oxy hóa (Niki et al., 1995; Pincemail et al., 1998; Lachman et
al
., 2000; Vansant et al., 2004).
2.3. Hoạt động của các chất chống oxy hóa tự nhiên
2.3.1. Các chất chống
oxy hóa hòa tan trong nước

2.3.1.1. Các hợp chất phenol
Các hợp chất phenol là một trong các nhóm sản phẩm trao đổi chất bậc hai
chủ yếu của thực vật, rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Ở thực vật, các hợp
chất phenol tạo màu cho thực vật (
anthocyanin); bảo vệ thực vật trước tia cực
tím, chống lại sự
oxy hóa; là hợp chất tín hiệu cho sự cộng sinh giữa thực vật và
vi khuẩn nốt sần; bảo vệ thực vật trước sự tấn công của vi sinh vật gây hại (như
vi khuẩn gây thối rễ ở khoai tây); là vật liệu góp phần vào độ bền của tế bào thực
vật và
tính thấm của màng tế bào đối với nước và khí (Al-Saikhan et al., 1995;
Chirinos
et al., 2007). Đối với các thực phẩm, các hợp chất phenol là những chất
hoạt động giữ vai trò chủ đạo quyết định hương vị của nhiều loại sản phẩm có
nguồn gốc từ thực vật. Các hợp chất này ảnh hưởng đến màu sắc và vị của hầu
hết các sản phẩm thực vật và ở một mức độ nhất định các hợp chất phenol còn
tham gia vào quá trình tạo ra các cấu tử thơm mới hình thành nên hương thơm
đặc biệt cho sản phẩm (Lê Ngọc Tú, 2003).
7
Các hợp chất phenol rất đa dạng về cấu trúc. Tùy vào cấu tạo mạch carbon
mà các hợp chất phenol được phân thành phenol đơn giản (C
6
), acid phenolic,
flavonoid (C
6
-C
3
-C
6
), stilbene (C

6
-C
2
-C
6
) và lignine (C
6
-C
2
)
n
. Cấu trúc của các
hợp chất phenol quyết định cơ chế hoạt động chống oxy hóa (Scalbert và
Wiliamson, 2000)
. Các cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol bao gồm
khử và gây bất hoạt các gốc tự do nhờ thế
oxy hóa khử thấp; tạo phức với các ion
Fe
2+
và Cu
+
; kìm hãm hoạt động của các enzyme có khả năng tạo các gốc tự do
như xanthine
oxydase (Jovanovic và Simic ,2000).
Hoạt động của xanthine oxydase cũng là một nguồn tạo các gốc tự do. Khi
có mặt của
oxy, enzyme này xúc tác sự oxy hóa xanthine thành acid uric, phân tử
oxy nhận điện tử và trở thành ion superoxyde.
Các flavanoid có cấu tạo vòng giống như vòng purin của xanthine được
xem như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxydase do đó ngăn ngừa sự tạo

ion superoxyde (Nicole, 2001). Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phenol
phụ thuộc chặt chẽ vào đặc điểm cấu tạo của chúng. Các bộ phận đảm nhiệm
chức năng chống
oxy hóa của phenol gồm các nhóm hydroxyl ở dạng ortho có
khả năng cho điện tử; liên kết đôi giữa C
2
và C
3
và nhóm ceton ở C
4
đảm bảo khả
năng tạo phức với kim loại
(Nicole, 2001; Amic et al., 2003).
2.3.1.2. Vitamine C
Vitamine C có khả năng gây bất hoạt các gốc tự do rất tốt do loại vitamine
này có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của chúng và khi đó
vitamine C trở thành dehydroascorbic acid (Pincemail et al., 1998; Pincemail,
2006).
Ngoài khả năng gây bất hoạt trực tiếp các gốc tự do, vitamine C còn có
khả năng hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác trong cơ thể như
vitamine E, carotenoid và flavonoid. Khi có sự tiếp xúc giữa vitamine E và gốc
tự do per
oxyde của acid béo, vitamine E chuyển điện tử của chúng cho gốc tự do
nhưng đồng thờ
i bản thân vitamine E lại trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamine
E ở dạng
oxy hóa). Vitamine C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamine E
Xanthine + 2O
2
+ H

2
O Acid uric + 2O
2
-
+ 2H
+
Xantine oxydase
8
nguyên dạng, sẵn sàng gây bất hoạt các gốc tự do peroxyde mới. Các carotenoid
và các flavonoid khi gây bất hoạt các gốc tự do cũng được hoàn nguyên với cơ
chế tương tự bởi vitamine C. Điều này góp phần hạn chế sự tự kích hoạt
oxy hóa
(pro-oxy
dante) của các gốc vitamine E và flavonoid (Jovanovic và Simic, 2000;
Burke
et al., 2001).
2.3.2. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong chất béo
2.3.2.1 Các carotenoid
Carotenoid là các hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh
vật có khả năng quang hợp. Carotenoid đem lại màu vàng đến đỏ cho thực vật
đồng thời tham gia quá trình quang hợp với vai trò là sắc tố phụ. Về mặt cấu tạo,
các carotenoid thường chứa một mạch carbon dài (35
– 40 carbon) mang nhiều
nối đôi, kết thúc bởi một cấu trúc vòng hoặc không; tùy thuộc vào sự có mặt hay
không của nhóm hydr
oxyl ở cấu trúc vòng mà các carotenoid được chia thành
caroten và xanthophylle. Đối với con người, các carotenoid là các chất chống oxy
hóa quan trọng vì nó có mặt trong rất nhiều loại thực phẩm đồng thời nó có khả
năng hoạt động trong môi trường chất béo là nơi rất dễ xảy ra sự
oxy hóa và gây

hậu quả nghiêm trọng (màng tế bào) (Sergio và Robert, 1999). Các hoạt động
chống
oxy hóa của các carotenoid bao gồm việc vô hoạt oxy đơn và vô hoạt các
gốc tự do
(Mortensen et al., 2001; Stahl và Sies, 2003; El-Agamey et al., 2004;
Stahl và Sies, 2005).
Oxy
đơn (O
2
) là sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa sinh học và là một
cấu tử có mặt trong không khí
(Jovanovic và Simic, 2000; Corol et al., 2002;
Baier
et al., 2006). Dưới tác dụng của tia cực tím A (UVA, λ = 320 - 400 nm),
các phân tử riboflavine, flavinmononucleotid (FMN) và flavin adenine
dinucleotid (FAD)
hấp thu năng lượng và chuyển lên trạng thái kích thích. Các
chất này chuyển năng lượng cho
oxy phân tử để trở lại trạng thái bình thường.
Oxy khi nhận năng lượng của các chất này trở thành oxy đơn (Krinsky, 1998;
Baier
et al., 2006). Để chuyển một phân tử oxy bình thường thành oxy đơn cần
một năng lượng 22 kcal. Phân tử
oxy đơn không ở dạng thuận từ như bình
thường mà ở dạng nghịch từ. Chính do vậy các oxy đơn rất dễ dàng phản ứng với
9
DNA, lipid, các phân tử không no của màng tế bào và gây bệnh (Corol et al.,
2002; Baier
et al., 2006).
Trong số tất cả các chất chống oxy hóa tự nhiên, các carotenoid có khả

năng gây bất hoạt
oxy đơn mạnh nhất (Krinsky, 1998) bởi một cơ chế vật lí.
Năng lượng dư của oxy đơn được chuyển cho carotenoid, oxy trở về trạng thái
bình thường trong khi carotenoid được chuyển lên trạng thái kích thích. Các
carotenoid này sau đó quay trở lại trạng thái bình thường bằng cách phát ra môi
trường năng lượng dư thừa mà nó nhận được từ
oxy đơn. Khả năng gây bất hoạt
oxy đơn của carotenoid phụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch C. Mỗi phân
tử carotenoid có khả năng gây bất hoạt 1000 phân tử oxy đơn trước khi tham gia
vào các phản ứng hóa học và bị biến đổi thành các hợp chất khác
(Krinsky,
1998).
Ngoài khả năng gây bất hoạt oxy đơn, các carotenoid còn gây bất hoạt các
gốc tự do bằng cách kết hợp các gốc này theo một trong các cơ chế: (1) chuyển
điện tử: Car + ROO → Car
+
+ ROO- ; (2) chuyển hydro: Car + ROO → Car
+
+
ROOH
; (3) cộng hợp: Car + ROO → ROOCar (với Car: carotenoid) (Britton,
1995; Mortensen
et al., 2001; El-Agamey et al., 2004).
Trong cơ thể, các carotenoid hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy
hóa khác. Các gốc tocopheryl được khử thành dạng hoạt động tocopherol nhờ
nhận được hydro từ vitamine C với chất vận chuyển trung gian là carotenoid
(Niki et al., 1995; Stahl và Sies, 2003). Thay vì bị thải ra ngoài qua con đường
nước tiểu như polyphenol và vitamine C
(Jovanovic và Simic, 2000; Tapiero et
al

., 2002) thì các carotenoid sẽ có đặc điểm hòa tan trong chất béo và được tích
lũy trong cơ thể, xâm nhập dễ dàng vào các vị trí dễ bị
oxy hóa như màng tế bào
do đó hiệu quả chống
oxy hóa của chúng cao hơn các chất chống oxy hóa hòa tan
trong nước (Huang et al., 2002; Brown et al., 2003).
2.3.2.2. Vitamine E
Trong tự nhiên vitamine E tồn tại ở dạng tocopherol và dạng tocotrienol.
Cả hai đều chứa một vòng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16 carbon. Trong cấu
tạo, các hợp chất tocotrienol khác với các tocopherol là có thêm ba nối đôi ở
chuỗi mạch C thẳng. Nhó
m hydroxyl gắn với vòng thơm quyết định tính chống
10
oxy hóa của vitamine E trong khi mạch carbon đảm bảo khả năng hòa tan trong
chất béo của chúng
(Huang et al., 2002).
Vitamine E
tan trong chất béo nên có khả năng thâm nhập sâu vào các
màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo không no và ngăn cản chuỗi phản ứng
oxy hóa lipid. Các vitamine E sẽ chuyển hydro cho gốc tự do peroxyde. Gốc
tocopheryl tạo thành được khử về trạng thái ban đầu nhờ vitamine C
(Niki et al.,
1995; Huang
et al., 2002; Pincemail, 2006).
Với LOO: gốc tự do peroxyde.
Khả năng chống
oxy hóa của vitamine E phụ thuộc vào mức độ cản trở
không gian của các nhóm methyl ở vị trí ortho đối với nhóm hydr
oxyl ở vòng
thơm. Nhóm hydr

oxyl càng bị cản trở ít (trường hợp δ-tocopherol và δ-
tocotrienol),
khả năng chống oxy hóa càng cao (Huang et al., 2002).
2.4. Giới thiệu về hydrogen peroxyde (H
2
O
2
)
Hydrogen peroxyde là một chất lỏng không màu ở nhiệt độ phòng có vị
đắng. Một lượng nhỏ khí hydrogen
peroxyde xảy ra tự nhiên trong không khí.
Hydrogen peroxyde là chất không ổn định, dễ dàng phân hủy thành oxy và nước,
sinh nhiệt (ATSDR, 2002).
Hydrogen peroxyde (H
2
O
2
) có vai trò tích cực trong sản xuất năng lượng
trong hệ thống cơ thể, thực bào, chuyển tín hiệu tế bào, điều chỉnh tăng trưởng tế
bào và tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng (Packer
et al., 2008).
Tuy nhiên, ở nồng độ cao các hydrogen peroxyde (H
2
O
2
) góp phần làm
thay đổi cấu trúc DNA,
oxy hóa lipid là nguyên nhân gián tiếp gây ra các căn
bệnh nguy hiểm như ung thư, gout, tiểu đường, suy tim
(Pincemail et al., 1998;

Favier, 2003).
Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chất chống oxy hóa
có trong thực vật trong việc phân hủy gốc H
2
O
2
có trong cơ thể (Ranju et al.,
2009; Anuj
et al., 2011; Serhat et al., 2012).
2.5. Giới thiệu về Trolox
Trolox là chất chống oxy hóa chuẩn thường được sử dụng để so sánh khả
năng làm sạch gốc tự do của các chất cần được khảo sát (Wong
et al., 2005).
Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7, 8 axit-tetramethylchromane-2-carboxylic) là một dẫn
Tocopherol-OH + LOO
0
→ Tocopherol-O + LOOH, với LOO: gốc tự do peroxyde.
11
xuất hòa tan trong nước có cấu trúc tương tự α-tocopherol. Trolox có lợi thế hơn
α-tocopherol, vì là chất béo hòa tan nên trolox có thể được kết hợp trong cả nước
và trong các khoáng lipid của tế bào (Burton and Ingold, 1983).
Hiện nay trolox thường được sử dụng như một chất tiêu chuẩn để kiểm soát
hoặc xét nghiệm chất chống oxy hóa (Cos et al., 2003; Tadolini et al., 2000).
Ngoài ra, trolox
được sử dụng để đánh giá vai trò của stress oxy hóa trong quá
trình
chết của tế bào như tế bào thần kinh và lão hóa (Jang et al., 2008; Benedetti
et al., 2008). Trolox có hiệu quả điều trị hỗ trợ trong các điều trị ung thư nhất
định
(Diaz et al., 2007).

2.6. Giới thiệu về cây Sa Kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg)
2.6.1. P
hân loại
Sa Kê là loài cây nhiệt đới thuộc chi Artocarpus, họ Moraceae (dâu
tằm/sung) (Jarrett, 1959; Fosberg, 1960). Tên gọi “Sa Kê” là để chỉ loài
Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg, nhưng đôi khi cũng được dùng khi nói
đến
A. camansi hoặc A. mariannensis. Artocarpus altilis được phân loại như loài
cây được thuần hóa, không tìm thấy ở dạng hoang dại, được thuần hóa từ
breadnut - A. camansi (Zerega et al., 2004, 2005).
Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), cây Sa Kê được phân loại như sau:
Ngành: Angiospermae
Lớp: Eudicots
Bộ: Rosales
Họ: Moraceae
Giống: Artocarpus
Loài:
A.altilis
Cây sakê còn có tên gọi là cây bánh mì. Tên khoa học là Artocarpus altilis
(Park) Forb
.
2.6.2. Nguồn gốc
Sa Kê phân bố rộng rãi khắp Thái Bình Dương và có sự thích nghi khá tốt
về
hình thái theo từng vùng miền, từ những loại trái không hạt đến những loại
nhiều hạt
(Ragone, 2006).
12
Gần một thế kỷ qua các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về nguồn gốc
của Sa Kê, tuy nhiên chưa có một giả thiết nào có khả năng thuyết phục cao cho

đến khi Zerega (2003) nghiên cứu về sự
phát sinh loài (phylogentic analysis) của
chi Artocarpus dựa trên dữ liệu hình thái và phân tử đã chứng minh mối quan hệ
gần gũi giữa
Sa Kê, A. camansi, và A. mariannensis.
Sakê đã có thời gian được coi là cây lương thực quý, cho quả với sản lượng
cao trên 200 quả mỗi mùa. Do đ
ó, các nhà thám hiểm và thương buôn người Tây
Ban Nha, Anh, Pháp coi trọng và vận chuyển buôn bán đến các vùng thuộc địa
của họ. Chủ yếu từ Philipines chuyển đến Mêxico, Trung Mỹ, Jamaica,… Sakê
đã được người Pháp đưa vào Việt Nam từ Indonesia và được trồng tại các tỉnh
miền Nam
.
2.6.3. Hình thái
Artocarpus altilis là cây thường xanh tương đối lớn, cao 15-20 m, có khi
đến 30 m. Trong suốt quá trình phát triển, chồi được bọc bởi hai lá kèm lớn, dài
đến 30 cm,
hai lá kèm sẽ già đi khi chồi nhô lên (Ragone, 1996). Hình thái lá
biến đổi cao giữa các cây, thậm chí trong cùng một cây. Lá lớn, dài khoảng 22,8-
90 cm và rộng 20-50 cm (Morton, 1987, Zerega et al., 2005), dạng trứng ngược
rộng hoặc dạng trứng rộng, từ lá nguyên đến xẻ thùy hình lông chim (Rago
ne,
1996
). Mặt dưới của lá thường có lông tơ màu trắng hoặc trắng đỏ nhạt dọc theo
gân lá. Nhựa trắng có ở hầu như khắp cây và rỉ ra khi bị tổn thương cơ học
(Harvey, 1999).
Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), Sa Kê là cây đại mộc to có mủ trắng. Lá Sa
Kê
có phiến to, có khía sâu,mặt dưới nhám. Lá kèm của Sa Kê có màu vàng, mau
rụng, lá dài 12-13 cm. Cụm hoa ở ngọn nhánh, cụm hoa đực dài 20 cm, mỗi hoa

đực có một tiểu nhụy. Cụm hoa cái cho ra hợp giả quả gần như tròn, có u nhọn,
to khoảng 20 cm, xanh nhạt và hơi
vàng, nạc trắng, không ngọt, chứa nhiều hột,
to 1 cm (var. seninifera), hay thường vắng (var. apyrena).
Sa Kê là cây l
ưỡng tính, cụm hoa gồm 1500-2000 hoa nhỏ gắn với đế hoa.
Cụm hoa đực kéo dài và có hình gậy tày, dài 12
,5-30 cm (Morton, 1987). Cụm
hoa cái hình cầu và phát triển thành hợp giả quả (Jarrett, 1976). Cụm hoa đực
xuất hiện sớm hơn cụm hoa cái để tránh hiện tượng tự thụ (Heard
, 1999). Cụm
13
hoa đực ở những cây có hạt cho nhiều hạt phấn có sức sống, ngược lại ở những
cây có ít hoặc không hạt thì cho ít hoặc không có hạt phấn có sức sống (Sunarto,
1981). Sự phát triển trái ở
Sa Kê không hạt đã được chứng minh rằng không cần
hạt phấn (Hasan và Razak, 1992). Các cây không hạt thường thiếu noãn phát
triển hoặc có nhiều noãn nhỏ bị chết. Khi cụm hoa cái phát triển, bao hoa của
từng hoa mở rộng và tạo thành phần tinh bột ăn được của quả.
Hình thái trái có sự đa dạng lớn về kích thước, hình dạng và những thuộc
tính khác. Thông thường, trái có dạng tròn, oval hoặc thuôn, dài khoảng 12 cm,
rộng 12
-20 cm và nặng 1-2 kg, nhưng đôi khi có thể lên đến 6 kg (Ragone,
1996
). Vỏ cũng biến đổi về màu sắc từ xanh sang đến vàng khi chín, một giống
khác thường (‘Afara’ từ French Polynesia) có vỏ màu hồng nhạt và cam nâu. Thịt
quả từ trắng kem đến vàng. Các phần nhỏ trên bề mặt trái có thể tương đối phẳng
hoặc hình nón nhô lên 5 mm. Do đó, trái có thể nhẵn, xù xì hoặc có gai (
Zerega
et al., 2005; Ragone, 2006a). Nhiều giống A. altilis là tam bội, cho trái không hạt

(2n=3x=84) (Murch
et al., 2007; Ragone, 2001), những giống khác là lưỡng bội
(2n=2x=56) và cho trái có một ít hạt. Trái trong v
òng 15-19 tuần sẽ chín và có
thể ăn sau khi nấu. Trái chín muồi có vỏ màu vàng hoặc vàng nâu, mềm, ngọt,
thịt quả màu kem, có thể ăn sống hoặc nấu. Hạt tròn hoặc dạng trứng, dài 1
-3 cm,
vỏ hạt màu nâu nhạt hoặc nâu đậm. Hạt nảy mầm nhanh và không thể làm khô
hay trữ. Chúng hiếm khi được dùng để nhân giống.
Sa Kê thường được nhân
giống vô tính, dùng chồi rễ hoặc đoạn cắt của rễ.
2.7 Các nghiên cứu về cây Sa Kê và giống Artocarpus
Nghiên cứu của Hasrat et al. (2004) cho rằng chiết xuất từ lá của cây Sa Kê
giảm stress phenylephrine ở động mạch của chuột lang từ 15% đến 35%.
Nghiên cứu của Jones et al. (2011) đã đưa ra những bằng chứng cụ thể về
thành phần các chất dinh dưỡng có trong Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg
và kết luận rằng loài cây này có đặc tính dinh dưỡng cao nên có thể sử dụng làm
lương thực cho con người.
Trong một nghiên cứu về chi Artocarpus của Chiang et al. (2013) đã dựa
trên các phương pháp phân tích thành phần các các chất chống oxy hóa có trong
14
các loài thuộc chi Artocarpus đã khẳng định rằng chi Artocarpus chứa một số
chất có khả năng chống oxy hóa, chống ung thư và chống viêm.
Nghiên cứu của Sindhu et al. (2013) cho rằng Artocarpus altilis có khả
năng ức chế tyrosinase nhằm ngăn chặn sự tổng hợp melanine trên da và chống
lại sự rối loại sắc tố trên da.
Nghiên cứu của Cheryl (2006) từ việc thu thập 30 loại dược liệu trong dân
gian. Sau quá trình phân tích các số liệu thu thập được, các nhà nghiên cứu cho
rằng lá của loài Artocarpus altilis có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp.
Nghiên cứu của Firdose et al. (2011) về thành phần của Artocarpus altilis

cho rằng chiết xuất từ các dung môi khác nhau của Artocarpus altilis (nước,
methanol, ethanol, acetone) cho thấy hàm lượng flavanoid và các chất chống oxy
hóa khá cao. Vì vậy, nghiên cứu này đã làm sáng tỏ khả năng chống oxy hóa tiềm
năng của một loại trái cây không được tận dụng như Artocarpus altilis.
Một nghiên cứu về Artocarpus altilis của Tare et al. (2012) khẳng định rằng
cành và lá của loài này có chứa nhiều chất chống oxy hóa, đặc biệt là thành phần
flavonoid phong phú, các flavonoid thu được bằng cách chiết xuất DCM
(dichloromethane) trong khi saponin được tìm thấy phong phú trong chiết xuất
methanol. Điều này cho thấy Artocarpus altilis là một tiềm năng đầy hứa hẹn sẽ
được sử dụng như chất chống oxy hóa và nguồn để trị bệnh khác nhau.
15
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thực hiện
:
Phòng thí nghiệm Sinh Học, Bộ môn Sinh, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại
Học Cần Thơ.
Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân tử, Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học,
Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: từ tháng 08/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Eppendorf 1,5 ml và 2 ml, micropipette (10 – 100 µl, 100 – 1000 µl), đầu
cone (vàng 100 µl, xanh 1000 µl), chai thủy tinh (50 ml, 250 ml, 1000 ml), cốc
thủy tinh (40 ml, 1000 ml), ống đong (10 ml, 1000 ml), kim mũi giáo, găng tay,
giấy bạc.
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm
máy cô quay (Evaporate),
máy đo quang phổ Beckman Coulter 640B (Mỹ), cân phân tích AB104-S, máy
đo pH Metler Toledo, máy trộn mẫu Vortex, máy khuấy từ.

3.1.3. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm gồm hydrogen peroxyde (H
2
O
2
)
(Merck - Germany), Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic
acid) (Denmark), ethanol 99
∞ (Trung Quốc), Na
2
HPO
4
.12H
2
O và
NaH
2
PO
4
.12H
2
O dạng tinh thể, natri hydroxyt (NaOH).
3.1.4. Đối tượng nghiên cứu
Lá Sa Kê vàng (tự rụng) được thu tại vườn sinh vật khoa Khoa học Tự
nhiên trường Đại học Cần Thơ. Cây được trồng tự nhiên không phun xịt thuốc.
Lá thu được cắt nhỏ phơi khô đến khi trọng lượng không đổi.