phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh metan trong nước thải của nhà máy giấy tái chế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH METAN
TRONG NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY GIẤY TÁI CHẾ


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG NGUYỄN THỊ HOÀNG NGÂN
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN MSSV: 3092493
LỚP: CNSH TT K35



Cần Thơ, 2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS. TS. Trần Nhân Dũng Nguyễn Thị Hoàng Ngân
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2



ThS. Võ Văn Song Toàn
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp ở Trường Đại học Cần
Thơ, bên cạnh những thuận lợi còn có nhiều khó khăn, thất bại. Không những bản thân cố
gắng, tìm tòi nghiên cứu mà còn nhờ vào sự động viên, khích lệ của gia đình, sự hướng
dẫn và giúp đỡ của thầy cô, bạn bè đó là nguồn động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành đề tài
nghiên cứu này.
Tôi xin được bày t lng bit ơn sâu sắc của mình đn Phó giáo sư - Tin sĩ Trần
Nhân Dũng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ, Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn – người thầy cố vấn chuyên môn của tôi - đã
truyền đạt kinh nghiệm, kin thức và cũng cố tinh thần tôi trong suốt thời gian làm việc,
giúp tôi có định hướng nghiên cứu và áp dụng vào thực tiễn cuộc sống, đồng thời đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên

cứu này.
Xin được gi lời cảm ơn chân thành đn tất cả qu Thầy Cô Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học đặc biệt là Thầy Đỗ Tấn Khang luôn tận tình giúp đỡ và
truyền dạy cho tôi kin thức, giúp tôi có những kin thức hữu ích phục vụ cho việc thực
hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên, cùng các anh chị học viên cao học, các
bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ và chia s nhiều
kinh nghiệm qu báu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày t lòng bit ơn sâu sắc đn gia đình và người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian
qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Kính chúc qu vị nhiều sức khe, hạnh phúc và thành đạt.
Xin trân trọng cảm ơn!

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƯỢC
Đề tài: “phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh metan trong nước thải nhà máy
giấy tái chế” được tiến hành dưới mục đích tìm ra và khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn
sinh metan. Môi trường nuôi cấy không có thành phần carbon hữu cơ được chuẩn bị kị
khí bằng cách sục khí N
2
để đuổi khí O
2
, thời gian sục 40 phút ở tốc độ dây 1kg/cm
3
cho
500ml môi trường là thời gian tối ưu. Khí N
2
sau đó được thay thế

bằng hỗnhợp khí H
2
và
CO
2
theo tỉ lệ 1:4, hỗn hợp khí này đóng vai trò như cơ chất. Mặc dù thí nghiệm không
phát hiện được vi khuẩn sinh metan, mà thay vào đó là 5 dòng vi khuẩn có khả năng cố
định CO
2
bằng những enzyme tương tự như những enzyme trong loài vi khuẩn sinh
methan. 5 loài lần lượt là D1, D2, D3, D4 và D5. Trong đó có D1 thuộc loài Shigella với
mức độ đồng hình là 97% và D3, D4 thuộc loài Enterobacteria với mức độ đồng hình đều
là 99%. Tuy mức độ đồng hình của D3 và D4 với Enterobacteria cùng cao như nhau
nhưng do có sự khác biệt về hình thái cũng như khả năng trao đổi chất nên 2 dòng D3 và
D4 có thể là hai nhóm nhỏ khác nhau của cùng loài Enterobacteria. Nhìn chung, khả
năng trao đổi chất của cả 5 dòng thể hiện qua độ giảm thể tích khí đều diễn ra mạnh và
nhanh, trong đó mạnh nhất là 2 dòng D1: 7,67% và D4: 8% , kế đến là D3: 6,33%.
Đường tăng trưởng của cả 5 dòng đều có pha chỉ số ngắn, trong vòng 12 giờ đầu, và đi
vào pha chết ở ngày thứ 4 hoặc thứ 5.
Từ khóa: áp suất, cố định CO
2
, đồng hình, kị khí, Methan.

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
Trang

PHẦN KÝ DUYỆT i
LỜI CẢM TẠ i
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT viii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1 Đăt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan: 3
2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí 5
2.3 Sơ lược về vi sinh vật kị khí trong nước thải nhà máy giấy tái chế 7
2.4 Các nghiên cứu liên quan 8
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
3.1 Phương tiện nghiên cứu 9
3.1.1 Thời gian 9
3.1.2 Địa điểm 9
3.1.3 Nguyên liệu 9
3.1.4 Dụng cụ, thit bị và hóa chất 9
3.2 phương pháp nghiên cứu 12
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3.2.1 Thit lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí 12
3.2.2 Khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí 13
3.2.3 Phân lập vi khuẩn 14
3.2.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO
2
và H
2
của vi khuẩn thông
qua độ giảm áp suất khí 15
3.2.5 Khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn 16
3.2.6 Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA 17
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 19
4.1 Kết quả thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí 19
4.2 Kết quả khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ
khí 21
4.3 Kết quả phân lập 23
4.4 Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa CO
2
và H
2
25
4.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn 27
4.5.1 Kt quả khảo sát đường tăng trưởng của D1 27
4.5.2 Kt quả khảo sát đường tăng trưởng của D2 1
4.5.3 Kt quả khảo sát đường tăng trưởng của D3 29
4.5.4 Kt quả khảo sát đường tăng trưởng của D4 30
4.5.5 Kt quả khảo sát đường tăng trưởng của D5 31
4.6 Kết quả giải trình tự vùng gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn 33
4.6.1 Kt quả giải trình tự vùng gene 16S RNA của dòng D1 34

4.6.2 Kt quả giải trình tự dòng D3: 37
4.6.3 Kt quả giải trình tự dòng D4: 39
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1 Kết luận 44
5.2 Kiến nghị 44
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1
PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU KẾT QUẢ 3
PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THỐNG KÊ VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 6


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần khí biogas 6
Bảng 2. Thành phần môi trường theo Zeikus 10
Bảng 3. Thành phần khoáng 11
Bảng 4. Thành phần vitamin 11
Bảng 5: Các nghiệm thức của thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO
2
và H
2

của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí 15
Bảng 6: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn 23
Bảng 7. Đặc điểm hình thái của 3 dòng D1, D3, D4 41
Bảng 8. Nồng độ oxy ở các nghiệm thức thời gian

Bảng 9: Khảo sát khả năng chuyển hóa CO
2
và H
2
của các dòng vi khuẩn
Bảng 10. Mật số vi khuẩn D1
Bảng 11. Mật số vi khuẩn D2
Bảng 12. Mật số vi khuẩn D3
Bảng 13. Mật số vi khuẩn D4
Bảng 14. Mật số vi khuẩn D5
Bảng 15: Số liệu thống kê hàm lượng oxy
Bảng 16: Số liệu thống kê hàm lượng khí giảm

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH

Hình 1. Chức năng của CoM trong sự sản sinh CO
2
4
Hình 2. Vai trò của F420 4
Hình 3. Quá trình tổng hợp metan 5
Hình 4. Quá trình phân hủy ym khí được chia thành 3 giai đoạn chính 6
Hình 5: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR 1
Hình 6: Hệ Thống nuôi cấy kỵ khí. 20
Hình 7: Hàm lượng oxy ở các nghiệm thức thời gian. 21
Hình 8: Hình dáng vi khuẩn và kt quả nhuộm gram xem dưới vật kính dầu x100 24
Hình 9: Phần trăm thể tích khí mất đi của các dòng 25
Hình 10: Đường tăng trưởng của D1 27
Hình 11: Đường tăng trưởng của D2 28

Hình 12: Đường tăng trưởng của D3 29
Hình 13: Đường tăng trưởng của dòng D4 30
Hình 14: Đường tăng trưởng của dòng D5 31
Hình 15: Kt quả kiểm tra sản phẩm PCR khuch đại vùng gene 16S rRNA trên gel
agarose 1,5% của 3 dòng vi khuẩn. Sản phẩm điện di xuất hiện ở kích thước khoảng
1500bp 33
Hình 16: Kt quả tra cứu trên Blast của D1 34
Hình 17: Sơ đồ miêu tả đơn giản cơ ch cố định CO
2
của enzyme PEPC 35
Hình 18: Thông số kt quả so sánh trên BLAST N của dong D1 và Shigella
sonnei Ss046 36
Hình 19: Kt quả tra cứu trên Blast của D3 37
Hình 20: Thông số kt quả so sánh trên BLAST N của dòng D3 và Enterobacter sp.
REICA 38
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Hình 21: Kt quả tra cứu trên Blast của D4 39
Hình 22: Thông số kt quả so sánh trên BLAST N của dòng D4 và Enterobacter sp.
REICA 40
Hình 23: Cây phả hệ (phylogenic tree) giữa các dòng D1, D3 và D4 với các loài
đồng hình trên ngân hàng gene so sánh với một số chủng methanogen Error!
Bookmark not defined.
Hình 24: Phổ đồ giải trình tự gene 16S của D1
Hình 25: Phổ đồ giải trình tự 16s của D3
Hình 26: Phổ đồ giả trình tự của D4

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TỪ VIẾT TẮT
PEPC: Phosphoenolpyruvate carboxylase
DNA: Deoxyribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid
TNHH: Trách nhiệm hữu hạn
NT: Nghiệm thức

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đăt vấn đề
Công nghiệp giấy là một trong những nền công nghiệp chim vị trí quan trọng trong
kinh t quốc gia. Mỗi năm Việt Nam sản xuất 1,13 triệu tấn giấy, trong tổng số đó giấy tái
ch chim 70% (Vũ Ngọc Bảo, 2010). Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích to lớn về kinh t
– xã hội, nghành công nghiệp này cũng phát sinh nhiều vấn đề môi trường bức xúc cần
phải giải quyt, đặc biệt là nước thải.
Nước thải của các nhà máy giấy có hàm lượng COD khá cao 22000-46500 mg/l, BOD
chim từ 40-60% COD (Công ty môi trường Ngọc Lân, 2012). Do đó việc x lý trước khi
xả vào nguồn tip nhận là một điều tất yu. Các phương pháp hóa l đã được ứng dụng để
giải quyt vấn đề một cách nhanh chóng. Tuy nhiên những phương pháp này để lại các
chất tồn đọng gây ô nhiễm môi trường về lâu dài và có chi phí vận hành cao. Vì vậy,
phương pháp x lý sinh học được xem như là phương pháp triệt để nhất. Mặc dù vậy,
phương pháp này cn bị hạn ch do thời gian x lý chậm. Nên việc tăng hiệu suất và rút
ngắn thời gian x lý là một ưu tiên hàng đầu. Dựa trên l do đó đề tài được xây dựng với
mục đích tìm kim những loài vi khuẩn sinh metan - một trong những loài sinh trưởng
chậm, nhưng có hiệu quả kinh t cao do khả năng sản xuất metan thu hồi- tối ưu về thời
gian sinh trưởng và khả năng sinh khí để ứng dụng vào chu trình x l nước thải.
Methanogen là vi khuẩn cổ sinh metan hoạt động như mắc xích cuối trong chuỗi
chuyển hóa cơ chất ở hồ kị khí. Loài vi khuẩn này không những phân giải được các acid
béo, methanol cùng nhiều chất gây ô nhiễm khác mà còn có khả năng sản sinh ra khí
metan, một khí đóng vai tr quan trọng trong thành phần biogas do cung cấp nhiệt lượng
cao. Ngoài hình thức sinh trưởng dị dưỡng, methanogen còn có hình thức hóa tự dưỡng.

Chúng có khả năng s dụng CO
2
như nguồn cơ chất carbon. Làm giảm sự hiện diện của
CO
2
hòa tan trong nước thải - nguyên nhân dẫn đn các bệnh l môi trường, ức ch hoặc
gây ngộ độc CO
2
cho các sinh vật hiu khí, gây mất cân bằng sinh thái. Đồng thời, do có
sự hiện diện của loài vi sinh vật này mà hồ kị khí có khả năng tái tạo khí đốt khá cao góp
phần đem lại giá trị kinh t (metan thu hồi gần bằng 4% tổng lượng khí đốt) (Barker,
1956).
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Tuy nhiên ở Việt Nam các nghiên cứu chuyên sâu về loài vi sinh vật này còn nhiều
hạn ch dẫn đn những lợi ích mà loài này đem lại vẫn chưa được nghiên cứu và ứng
dụng rộng rãi. Vì vậy đề tài với mục đích tìm ra một số dng methanogens trong nước
thải nhà máy giấy tái ch để quan sát đánh giá về khả năng sinh methan và tốc độ tăng
trưởng của từng dòng với hi vọng có thể chọn được những dòng có khả năng sinh methan
cao trong thời gian ngắn nhằm hỗ trợ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn sinh metan.

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan:
Vi khuẩn sinh metan sống trong môi trường kị khí bắt buộc. Kt hợp với các vi sinh
vật kị khí khác để phân giải các chất hữu cơ có trong nước thải, đầm bùn và dịch tiêu hóa
cũng như các hệ sinh thái khác. Vi khuẩn sinh metan được chia thành nhiều nhóm với
nhiều hình dạng khác nhau. Tuy vậy, tất cả có chung một vài đặc điểm nhất định. Các vi
khuẩn này đều có khả năng s dụng hidro như một nguồn năng lượng. Nguồn carbon chủ
yu từ forrmate, methanol. Một phương thức khác là có thể tổng hợp carbon cho t bào từ
CO
2
. Theo tính toán thì hydro và formate là nguồn năng lượng tương đương nhau, hai
nguồn năng lượng thấp hơn là methanol và acetate. Phân tích trên một mol CH
4
tạo thành

cho thấy năng lượng do hô hấp hydro nhiều hơn khoảng 4 lần năng lượng do lên men
acetate (Zeikus, 1977).
Hình thái: Có 4 kiểu hình thái của vi khuẩn sinh metan: dạng hạt kê, hình que, hình
cầu và dạng xoắn. Dạng hình que thường cong và có thể kt hợp thành hình chuỗi hoặc
dạng sợi mảnh.Vi khuẩn sinh metan rất đa dạng về cấu trúc và không có những đặc điểm
cấu trúc đặc trưng để nhận bit. Cấu trúc vách t bào cũng hoàn toàn khác nhau, hầu ht
là vi khuẩn Gram dương nhưng một số loài có thể là Gram âm hoặc đa dạng Gram. Chỉ
mỗi loài Methanobacterium có thành t bào là Gram dương đặc trưng (Ziekus, 1977).
Phân loại sinh học: việc phân loại chủ yu dựa vào hình dạng t bào, nguồn carbon
và đặc điểm sinh lý (Bryant, 1974). Sự khác nhau về hình thái, không giống nhau về tổ
chức cấu tạo, nguồn dinh dưỡng đa dạng và giá trị G+C của DNA nằm ở các mức khác
nhau cho thấy sự đa dạng về nguồn gốc và phương thức chuyển hóa nguồn năng lượng
của các vi khuẩn sinh metan.
Phương thức chuyển hóa: đặc điểm chuyển hóa nổi bật của các loài vi khuẩn này
là kt hợp sự oxi hóa hydro và sự kh CO
2
. Sự khác nhau giữa vi khuẩn sinh metan và các
loài sinh vật tự dưỡng s dụng CO
2
làm nguồn carbon cho t bào là vi khuẩn sinh metan
s dụng CO
2
cho cả việc cố định carbon và sự kh metan.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Thành phần sinh hóa đặc trưng: hai thành phần sinh hóa được coi là đặc trưng của
vi khuẩn sinh metan là Coenzyme M (CoM) (Tzeng et al, 1975) và F
420
(Cheeseman et al,
1972). CoM có phân t hóa học là HSCH

2
CH
2
SO
3
, cấu trúc phân t và tổng hợp hóa học
của CoM được nghiên cứu bởi Taylor và Wolfe (1974).

Hình 1. Chức năng của CoM trong sự sản sinh CO
2

(*Nguồn: Gunsalus et al, 1978)
Hợp chất huỳnh quang (Fluorescent compound), F
420
, hiện diện trong hầu ht các
nghiên cứu về loài vi khuẩn này. Cấu trúc của F
420
hiện tại vẫn chưa được tìm ra.Hợp chất
này có đỉnh hấp thụ cao nhất tại bước sóng 420 nm ở trạng thái oxi hóa.

Hình 2. Vai trò của F420
(*Nguồn: Tzeng et al, 1975)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Sự tổng hợp metan: Vi khuẩn sinh metan s dụng hydro- carbon dioxide, formate,
methanol, acetate, cơ ch chính xác cho mỗi cơ chất trên là tùy thuộc vào mỗi loài. Mô
hình chuyển hóa được miêu tả như sau.
Hình 3. Quá trình tổng hợp metan
(*Nguồn: Barker, 1956)
2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí

Đặc điểm nước thải có thể x lý bằng hồ kỵ khí là hàm lượng chất hữu cơ cao như
protein, chất béo, carbohydrate ….
Các hệ thống ym khí ứng dụng khả năng phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật
trong điều kiện không có oxy. Quá trình phân hủy ym khí chất hữu cơ rất phức tạp liên
hệ đn hàng trăm phản ứng và sản phẩm trung gian. Tuy nhiên người ta thường đơn giản
hóa chúng bằng phương trình sau đây:
Chất hữu cơ lên men ym khí CH
4
+ CO
2
+ H
2
+ NH
3
+ H
2
S




Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 1 Thành phần khí biogas

(*Nguồn: aao.htmlhttp
://www.duongnhat.com.vn/, ngày 6/8/2013)
Methane có nhiệt trị cao (gần 9.000 kcal/m
3
). Do đó, nhiệt trị của Biogas khoảng
4.500 - 6.000 kcal/m
3
, tùy thuộc vào phần trăm của methane hiện diện trong Biogas.

Hình 4. Quá trình phân hủy yếm khí được chia thành 3 giai đoạn chính
(*Nguồn: McCathy và Donchin, 1981)
Thành phần
Phần trăm
Methane (CH
4
)
55¸65%
Carbon dioxide (CO
2
)
35¸45%
Nitrogen (N
2
)
0¸3%
Hydrogen (H
2
)
0¸1%

Hydrogen Sulphide (H
2
S)
0¸1%
3.Tạo metan
1. Phân hủy các
chất hữu cơ cao phân
t
2. Tạo nên các
acid
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

2.3 Sơ lược về vi sinh vật kị khí trong nước thải nhà máy giấy tái chế
Theo các nghiên cứu của Bộ Công Thương – Vụ Khoa Học Công nghệ (2009) thì
các nhóm vi sinh, hầu ht là vi khuẩn, đều tham gia vào việc chuyển hoá các hợp chất hữu
cơ cao phân t phức hợp thành khí metan. Thêm vào đó là sự tương tác đồng bộ giữa các
nhóm vi khuẩn liên quan đn quá trình phân hủy ym khí các chất thải. Mặc dù có thể có
sự hiện diện của một số nấm và nguyên sinh động vật, nhưng rõ ràng vi khuẩn luôn vượt
trội về số lượng. Có bốn nhóm vi khuẩn liên quan đn việc chuyển hóa các chất phức hợp
thành những phân t đơn giản như metan và dioxit carbon. Những nhóm vi khuẩn này
hoạt động trong một mối quan hệ đồng bộ, nhóm này phải thực hiện việc trao đổi chất của
nó trước khi chuyển phần việc còn lại cho nhóm khác.
- Nhóm 1: Vi khuẩn thủy phân:
Các nhóm vi khuẩn ym khí cắt vỡ các hợp chất hữu cơ phức hợp (cellulose) thành
các đơn phân t dễ hoà tan. Các đơn phân t này sẵn sàng làm thức ăn cho nhóm vi khuẩn
k tip. Sự thủy phân các phân t phức hợp được sự xúc tác của enzym cellulases.
- Nhóm 2: Vi khuẩn tạo axít gây lên men:
Nhóm vi khuẩn tạo acid (Acidogenic) chuyển đường thành những axít hữu cơ, rượu
và các ketone (như ethanol, methanol, glycerol, acetone), acetate, CO

2
, và H
2
. Acetate là
sản phẩm chính của quá trình lên men carbon hydrate.
- Nhóm 3: Vi khuẩn tạo Aceton:
Vi khuẩn tạo aceton chuyển các acid béo (như: acid propionic và butyric) và rượu
thành acetate, hydro, and CO
2
, những chất này sẽ được s dụng bởi nhóm vi khuẩn tạo
metan. Nhóm này đi hi nồng độ hydro thấp để chuyển hoá các axít béo và do đó cần
phải theo dõi sát nồng độ hydro. Dưới điều kiện nồng độ hydro cục bộ cao, sự tạo thành
acetate giảm và chất nền sẽ chuyển thành acid propionic, butyric và ethanol thay vì
metan.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Nhóm 4: Vi khuẩn tạo khí metan:
Trong tự nhiên vi khuẩn tạo mêtan khó tính này thường có ở các lớp bùn trầm tích
hoặc trong dạ dày của các loài ăn c. Nhóm này được tạo thành bởi các vi khuẩn gram âm
và gram dương với các hình dạng khác nhau. Các vi sinh tạo mêtan sinh trưởng chậm
trong nước thải, chu kỳ sinh có thể từ 2 ngày ở 35
0
C cho đn 50 ngày ở 10
0
C. Khoảng
2/3 mêtan được tạo ra từ sự chuyển hoá acetate của nhóm vi khuẩn này. 1/3 còn lại là do
sự giảm CO
2
tạo ra bởi hydro.
2.4 Các nghiên cứu liên quan

Rất nhiều thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sinh metan đã và đang được thực hiện,
với nguồn chủ yu là từ dạ c của động vật nhai lại hoặc trong hệ tiêu hóa của động vật
nói chung. Hungate và Bryant là những người đi đầu trong lĩnh vực nghiên cứu về loài vi
khuẩn này với các nghiên cứu về môi trường và hệ thống nuôi cấy.
Hungate (1969) đưa ra phương pháp su dụng ống “hungate” – một ống roll tube có
nắp cao su và nắp nhựa chuyên biệt để nuôi cấy kỵ khí vi khuẩn sinh methan. Bryant
thành công trong việc xác lập môi trường nuôi cấy chuyên biệt mà sau này tất cả các
phòng thí nghiệm nghiên cứu về metahnogens đều dựa vào.
Cheeseman (1972), Edward và McBride (1975) đưa ra phương pháp s dụng kính
huỳnh quang để nhận bit vi khuẩn sinh metan, trong đó sự phát hiện ra hợp chất huỳnh
quang F
420
đã giúp đỡ các nhà khoa học dễ dàng nhận bit loài vi sinh vật cổ này một
cách nhanh chóng. Sau đó bằng cách đưa ra cấu tạo phân t và sơ bộ hóa hoạt động của
phân t này Ferry, Smith và Wolfe (1974) đã củng cố thêm các thông tin khoa học xung
quanh hợp chất này. Các đặc điểm về hình thái, tính chất, sinh lý của dòng vi khuẩn này
đã được Zeikus (1977) nghiên cứu và phát hành.
Skillman et al (2006) nhận thấy với những cặp mồi 16S khác nhau sẽ cho kt quả đa
dạng sinh học khác nhau của một cộng đồng methanogens, vì th việc lựa chọn cặp mồi
phù hợp nên luôn được quan tâm. Cùng nhiều nghiên cứu có liên quan.

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 – 12/2013.
3.1.2 Địa điểm: Thí nghiệm được tin hành tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Công
nghệ Enzyme, phòng Sinh học Phân t thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ
Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

3.1.3 Nguyên liệu
Mẫu nước thải thu từ nhà máy TNHH Ch Bin và Thương mại Bao Bì Tân Hưng
đường Cái Sơn Hàng Bàng , Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ.
Thu và xử lý mẫu
- Nguyên tắc: thu mẫu ở độ sâu 2m trong điều kiện kị khí bắt buộc. S dụng hệ
thống ống thu có valve một chiều, dọc thân ống có phần cao su trong, mềm.
- Tiến hành:
Làm sạch ống thu bằng alcohol và tiệt trùng bằng dung dịch iodine.
Lấy mẫu ở một độ sâu 2m.
S dụng ống tiêm và kim tiêm. Làm đầy ống tiêm với hỗn hợp khí H
2
và CO
2
. Giữ
ống đứng thẳng, trút xuống để giữ khí hidro không bị thoát ra.
Đẩy ht khí ra ngoài, hút mẫu, cho mẫu vào chai đã đóng nắp và được làm đầy bằng
khí H
2
và CO
2
, giữ mẫu tránh ánh sáng.
Trữ mẫu ở 4
o
C.
3.1.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
- Dụng cụ
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Chai thủy tinh 50ml, nắp cao su butyl, nhắp nhôm, ống đong, pipet, chai môi trường,
bơm kim tiêm 10cc, bơm kim tiêm 100cc, cốc thủy tinh, que cấy, đèn cồn

- Thiết bị
Hệ thống bình khí, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh Hitsuji, tủ lạnh đông Sanyo, máy đo
quang phổ Thermo spectronic, máy vortex Ikams3 basic, cân phân tích, cuvette, ống
glycerol, ống nghiệm và một số dụng cụ khác.
- Hóa chất
Iod, Fushin, Crystal violet, Ethanol 70%, KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
, NH
4
Cl, MgCl
2
.H
2
O,
Nitrilotriacetic acid, FeCl
2
.4H
2
O, MnCl
2
.4H
2
O, CoCl
2

.6H
2
O, ZnCl
2
, CaCl
2
, H
3
BO
3
,

Sodium molybdate, KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
, NH
4
Cl, MgCl
2
.H
2
O, nitrilotriacetic acid,
FeCl
2
.4H

2
O, MnCl
2
.4H
2
O, CoCl
2
.6H
2
O, ZnCl
2
, CaCl
2
, H
3
BO
3
, Sodium molybdate, nước
cất.
- Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 2. Thành phần môi trường theo Zeikus
Thành phần
Khối lượng (g/l)
NH
4
Cl
0,9
KH
2
PO

4

0,75
K
2
HPO
4

1,45
MgCl
2
.6H
2
O
0,2
Vitamin
10 ml
Khoáng
9 ml
(*Nguồn: Zeikus ,1977)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Bảng 3. Thành phần khoáng
Thành phần
Khối lượng (g/l)
CoCl
2
.6H
2

O
0.17
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
0.01
ZnCl
2

0.l
H
3
BO
3

0.01
FeCl
2
.4H
2
O
0.4
MnCl
2
.4H
2

O
0.1
CaCl
2

0.02
(*Nguồn: Zeikus ,1977)
Bảng 4. Thành phần vitamin
Thành phần
Khối lượng
(mg/l)
Nicotinic acid
10
Thiamine
10
Biotin
5
Folic acid
5
B12
5
(*Nguồn: Zeikus ,1977)


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3.2 phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí
Mục đích: Thit lập được một hệ thống an toàn và vận hành dễ dàng, có khả năng
tạo môi trường nuôi cấy không có thành phần oxy.

Tiến hành:
- Bình khí N
2
và CO
2
được đặt từ Công ty MITAGAS, Cần Thơ với chỉ tiêu chất
lượng là 99,99%. Bình khí H
2
được đặt từ Công ty Vạn Tấn Phát, Thành phố Hồ Chí
Minh với chỉ tiêu chất lượng là 99,99%. S dụng hệ thống dây dẫn khí nén hai lớp xuất sứ
Mỹ, van khí đồng, đồng hồ áp suất TANAKA Đài Loan và máy hút chân không.
- Hệ thống được lắp đặt theo sơ đồ bên dưới và các khớp nối được sit chặc bằng cổ
dê kim loại. Các van được gia cố bằng cao su non và kiểm tra rò rỉ khí bằng dung dịch xà
phòng. Kiểm tra toàn bộ hệ thống khí bằng cách nhúng dây dẫn vào dung dịch xà phòng
và vận hành th. Nu không có hiện tượng sủi bọt khí trên dây và lượng khí ra đều thì hệ
thống khí coi như được thit lập thành công.
- Phần ống khí s dụng sục môi trường (có màu xanh lá trong hình vẽ) được kh
trùng bằng cồn 70 và đặt trong tủ cấy, ở mỗi ống khí ra có gắn màng lọc vi khuẩn.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Hình 5: Hệ thống khí dự trù lắp đặt
3.2.2 Khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí
Mục đích: Xác định được thời gian đẩy khí thích hợp để tạo môi trường ym khí
Nguyên tắc: Dùng khí nitơ sục vào môi trường nhằm thay th vị trí của oxy trong môi
trường đó (đẩy oxy) cho đn khi môi trường không còn oxy trở nên kỵ khí hoàn toàn.
Tiến hành:
- Thí nghiệm được tin hành trong ba nghiệm thức thời gian 20 phút, 30 phút và 40
phút, mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần. Nghiệm thứ đối chứng là môi trường không

sục khí.
- Chuẩn bị chai môi trường 500ml, thổi khí nitơ tại áp suất dây là 1 kg/cm
3
được đo
bởi đồng hồ khí TANAKA, Đài Loan. Sau khi sục đủ thời gian, dùng pipet rút 20
ml dung dịch cho vào chai 50ml đang được sục khí với cùng áp suất dây. Rút chai
ra nhẹ nhàng, đóng nắp cao su rồi dập nắp nhôm khít lại. Thay hỗn hợp khí H
2
và
CO
2
, dùng kim tiêm cân bằng áp suất chai với áp suất khí quyển.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Dùng máy sắc k khí để phân tích thành phần phần trăm oxy có trong hỗn hợp khí.
3.2.3 Phân lập vi khuẩn
- Mục đích thí nghiệm: Phân lập vi khuẩn sinh metan.
- Nguyên tắc: Methanogen sống trong môi trường kị khí bắt buộc và có thể s dụng
H
2
như chất cung cấp năng lượng và CO
2
là nguồn carbon. S dụng môi trường
chuyện biệt của Ziekus để phân lập vi khuẩn, ủ tại 25
0
C.
- Tiến hành:
 Dựa vào thí nghiệm khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường
ym khí.
 Chuẩn bị môi trường trong chai nắp xanh 500ml (chuẩn bị môi trường đặc bằng

cách thêm 2% agar vào môi trường lng). Sục khí nitơ. Sau đó dùng pipet rút
20 ml dung dịch từ chai môi trường cho vào chai 50ml đang sục khí, nhẹ nhàng
lấy chai ra và nhanh tay đóng nắp lại. Thay hỗn hợp khí H
2
và CO
2
, dùng kim
tiêm cân bằng áp suất chai với áp suất khí quyển. Kh trùng ở 121
0
C, 20 phút.
 Khi môi trường đặc còn ấm, để chai môi trường nằm nghiêng 45
0
.
 Khi cấy, dùng kéo mở từ từ nắp nhôm, hạ miệng chai vào kim khí đang thổi khí
N
2
. Dùng kim cấy thực hiện cấy trải trên môi trường thạch nghiêng trong khi
chai môi trường vẫn đang được làm đầy bằng khí N
2
. Thay khí N
2
bằng hỗn
hợp khí H
2
và CO
2
tỉ lệ 4:1. Nhanh tay đóng nắp lại. Giữ chai đứng thẳng trong
khi trữ để nước trên bề mặt có thể chảy xuống đáy chai. Lặp lại các bước cho
đn khi các khuẩn lạc hoàn toàn giống nhau. Lúc đó ta có được mẫu vi khuẩn
ròng. Trữ mẫu vào glycerol và giữ ở -20

0
C.
Chỉ tiêu đánh giá
Quan sát khuẩn lạc: hình dáng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc.
Quan sát vi khuẩn: hình dạng vi khuẩn dưới vật kính dầu x100, gram.