khảo sát khả năng hòa tan lân, tổng hợp iaa và enzyme chitinase của vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN, TỔNG HỢP IAA
VÀ ENZYME CHITINASE CỦA VI KHUẨN
PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VÙNG RỄ LÚA


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
ThS. NGUYỄN THỊ PHA NGUYỄN THỊ PHƯƠNG OANH
MSSV: 3092498
LỚP: CNSH TT K35






Cần Thơ, Tháng 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)






DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Viện Nghiên
cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, động viên từ gia đình cùng sự chỉ dạy tận tình của quý thầy cô
cùng với sự giúp đỡ, hỗ trợ của bạn bè. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin
được gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Bố Mẹ, người luôn quan tâm cổ vũ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để con có
thể phấn đấu hết mình trong học tập cũng như nghiên cứu khoa học.
Cô Nguyễn Thị Pha, người đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm
và luôn quan tâm giúp đỡ em trong suốt tiến trình thí nghiệm.
Cô Trần Thị Xuân Mai, cô Nguyễn Thị Liên và anh Trần Văn Bé Năm đã tạo
điều kiện thuận lợi và sẵn sàng hỗ trợ để em hoàn thành tốt luận văn. Cám ơn thầy
Huỳnh Xuân Phong, cố vấn học tập, cùng quý thầy cô đã giảng dạy và truyền đạt cho
em những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường.
Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên cùng làm việc trong phòng thí
nghiệm Công nghệ gen thực vật, cám ơn mọi người đã tận tình giúp đỡ và động viên
tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Thân gửi đến tập thể lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 35 lời cám ơn thân
thương vì đã luôn đồng hành cùng tôi trong học tập và những hoạt động khác trong
suốt những năm tháng đại học.
Xin kính chúc quý thầy cô, tập thể sinh viên Viện nghiên cứu và phát triển Công
nghệ Sinh học lời chúc sức khỏe và thành công.
Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013



Nguyễn Thị Phương Oanh

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƯỢC
Vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-
Promoting Rhizobacteria – PGPR) đang được xem là nguồn tài nguyên sẵn có đầy
tiềm năng để sản xuất các chế phẩm sinh học nhằm thay thế dần các loại hóa chất
nông nghiệp được sử dụng phổ biến hiện nay. Trong đề tài này, khả năng hòa tan lân
khó tan, tổng hợp IAA trong môi trường không bổ sung tryptophan và tổng hợp
enzyme chitinase của 18 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm phân lập từ đất vùng
rễ lúa đã được khảo sát. Từ 18 dòng vi khuẩn, 6 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
chitinase tiếp tục được chọn để khảo sát khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae
trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy 18 dòng vi khuẩn này đều có khả năng hòa
tan lân khó tan, hàm lượng lân hòa tan tạo ra cao nhất sau 10 hoặc 15 ngày chủng.
Trong đó, dòng TV2B3 là dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan tốt nhất, hàm
lượng lân hòa tan đạt 465,010 mg/L tại thời điểm 10 ngày sau khi chủng. Khi kiểm tra
khả năng tổng hợp IAA trong môi trường không bổ sung tryptophan, sau 8 ngày, 12/18
dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA vào ngày 6 hoặc 8 sau khi chủng, hàm lượng
IAA được tổng hợp rất thấp, dao động trong khoảng 0,329 µg/mL (dòng NT4) – 3,630
µg/mL (dòng TV2B7). Sau 10 ngày ủ, 6 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chitinase
đều biểu hiện được khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae, với 2 dòng CT14 và
AM3 là 2 dòng vi khuẩn có tính đối kháng mạnh nhất, tỉ lệ ức chế nấm đạt lần lượt
64,44% và 61,48%, khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5% so với 4 dòng vi
khuẩn còn lại. Kết quả phân tích sự khác biệt di truyền bằng kỹ thuật BOX-PCR cho
thấy chưa phát hiện được sự khác biệt trong trình tự phân bố của yếu tố lặp BOX (cụ
thể là tiểu đoạn boxA) trong bộ gen của 6 dòng vi khuẩn này.
Từ khóa: BOX-PCR, chitinase, IAA, lân khó tan, vi khuẩn đối kháng

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
CÁC TỪ VIẾT TẮT vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về cây lúa 3
2.2. Vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-
Promoting Rhizobacteria - PGPR) 7
2.2.1. Vi khuẩn chi Azotobacter 8
2.2.2. Vi khuẩn chi Azospirillum 9
2.2.3. Vi khuẩn chi Bacillus 10
2.2.4. Vi khuẩn chi Pseudomonas 11
2.2.5. Vi khuẩn chi Azoarcus 11
2.3. Khả năng cố định đạm sinh học của các loài vi khuẩn vùng rễ 12
2.4. Khả năng hòa tan lân khó tan 13
2.5. Khả năng tổng hợp IAA 14
2.6. Khả năng tổng hợp chất kháng sinh, hoạt chất diệt nấm và các enzyme thuỷ

phân ngoại bào 16
2.7. Kỹ thuật BOX-PCR (BOX – Polymerase Chain Reaction) 17
2.8. Tình hình nghiên cứu 18
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.1. Phương tiện nghiên cứu 21
3.1.3. Hóa chất 22
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.1.4. Địa điểm 24
3.2. Phương pháp nghiên cứu 24
3.2.1. Xử lý mẫu 24
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan 24
3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tổng hợp IAA 26
3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tổng hợp chitinase của vi khuẩn 28
3.2.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng nấm in vitro của các dòng vi
khuẩn có khả năng tổng hợp chitinase 29
3.2.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn có
khả năng tổng hợp chitinase bằng kỹ thuật BOX-PCR 30
3.2.7. Xử lý số liệu 32
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan 33
4.2. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA 39
4.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp chitinase 41
4.4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng nấm in vitro của các dòng vi khuẩn có
khả năng tổng hợp chitinase 42
4.5. Kết quả phân tích khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật
BOX-PCR 44
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
5.1. Kết luận 46
5.2. Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Các phản ứng màu trong thí nghiệm khảo sát khả năng hòa tan lân khó
tan và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn
Phụ lục 2: Các enzyme cắt giới hạn được sử dụng và thành phần của phản ứng cắt
enzyme
Phụ lục 3: Kết quả thí nghiệm
Phụ lục 4: Kết quả thống kê

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Một số loài Azospirillum và nguồn phân lập 10
Bảng 2. Hàm lượng NH
4
+
(mg/L) và IAA (µg/mL) trung bình cao nhất tổng hợp bởi
các dòng vi khuẩn được chọn 21
Bảng 3. Thành phần môi trường Burk’s không đạm 22
Bảng 4. Thành phần môi trường NBRIP 23
Bảng 5. Công thức môi trường Luria-Bertani (LB) 23
Bảng 6. Công thức môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) 23
Bảng 7. Thành phần dãy đường chuẩn P
2
O
5
26
Bảng 8. Thành phần cho một phản ứng BOX-PCR 25 L 31
Bảng 9. Các bước chu kỳ nhiệt của phản ứng BOX-PCR 31

Bảng 10. Chỉ số hòa tan lân của các dòng vi khuẩn sau 5 ngày ủ 33
Bảng 11. Sự thay đổi pH môi trường sau 15 ngày chủng vi khuẩn 35
Bảng 12. Lượng lân hoà tan tạo ra trong dịch nuôi vi khuẩn xác định bằng phương
pháp so màu Oniani (mg/L) 36
Bảng 13. Hàm lượng IAA sinh ra trong dịch nuôi vi khuẩn xác định bằng phương pháp
so màu ở bước sóng 530 nm 40
Bảng 14. Tỷ lệ ức chế nấm (%) của các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme
chitinase 43










Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Biểu đồ sinh trưởng của một giống lúa 120 ngày không quang cảm 4
Hình 2. Bệnh đạo ôn trên lúa, khuẩn lạc trên môi trường PDA và bào tử đính của nấm
Pyricularia oryzae 6
Hình 3. Vi khuẩn Azotobacter 8
Hình 4. Chu trình nitơ 13
Hình 5. Các con đường tổng hợp IAA từ tiền tố tryptophan bởi vi khuẩn 15
Hình 6. Kiểm soát nấm Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum bằng các chủng vi
khuẩn đối kháng 16

Hình 7. Phổ điện di sản phẩm BOX-PCR của 18 chủng Burkholderia pseudomallei 17
Hình 8. Đường chuẩn IAA với nồng độ từ 0-80 µg/mL 28
Hình 9. Sơ đồ thử khả năng đối kháng nấm của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ 30
Hình 10. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP đặc 34
Hình 12. Đường chuẩn lân (trái) và phản ứng màu của một số nghiệm thức chủng vi
khuẩn vào ngày 15 sau chủng 38
Hình 13. Hàm lượng lân hoà tan trung bình (mg/L) tạo ra trong môi trường qua 15
ngày của 9 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân tốt nhất tại thời điểm 10
ngày sau chủng 38
Hình 15. Hàm lượng IAA tổng hợp bởi các dòng vi khuẩn qua 6 ngày 41
Hình 16. Vòng phân giải chitin hình thành bởi 2 dòng vi khuẩn TN4 và AM3 42
Hình 17. Thử nghiệm đối kháng nấm P. oryzae của một số dòng vi khuẩn 43
Hình 18. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại bởi cặp mồi BOXA1R 44
Hình 19. Kết quả phân cắt vùng gen giữa các tiểu đoạn boxA với enzyme AluI (trái) và
enzyme MboI 45
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
Bộ NN&PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Bp Base pair
BPB Bromophenol blue
BVTV Bảo vệ thực vật
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DAPG diacetyl phloroglucinol
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EtBr Ethidium bromide
Ha Héc-ta
HCN Hydrogen cyanide

IAA Indole-3-acetic acid
LB Luria Broth
PCR Polymerase Chain Reaction
PDA Potato Dextrose Agar
PGPR Vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật
(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria)
PSI Phosphate solubilization index (chỉ số hòa tan lân)
pv. Pathovar
REP-PCR Repetitive Extragenic Palindromic PCR
SDS Sodium doecyl sulfate
TBE Tris/Borate/EDTA
TE Tris-EDTA
USD United States Dollar
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa gạo (Oryza sativa L.) vốn đã được xem là loại cây trồng và mùa vụ quan
trọng nhất của Việt Nam từ nhiều thập kỷ qua. Hiện tại, trong bối cảnh dân số không
ngừng tăng nhanh, hoạt động sản xuất lúa gạo càng khẳng định được vai trò chủ đạo
của nó trong vấn đề đảm bảo an ninh lương thực cũng như mang lại nguồn thu nhập
không nhỏ cho nước ta từ hoạt động xuất khẩu. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn (Bộ NN&PTNN), diện tích canh tác lúa của cả nước năm 2012 là
7.753,2 nghìn héc-ta (ha), tăng 97,8 nghìn ha so với năm 2011 trong khi sản lượng đạt
43,7 triệu tấn, tăng 1,3 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt trên 3 tỉ USD. Tuy đạt được
những tín hiệu đáng mừng như vậy, nhưng trên thực tế, hoạt động sản xuất lúa gạo vẫn
đang phải đối mặt với rất nhiều khó khăn, đe dọa khả năng đáp ứng lương thực trong
thời gian tới: diện tích chuyên canh lúa có xu hướng bị thu hẹp do chính sách quy
hoạch, điều kiện thời tiết diễn biến thất thường, dịch bệnh có nguy cơ bùng phát và lây
lan nhanh trên diện rộng,….

Để duy trì đà tăng sản lượng, người nông dân buộc phải thâm canh, tăng vụ và
nhất là phải tăng đầu tư các loại phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật (BVTV)
nhằm làm tăng năng suất. Hiện tại, Việt Nam là một trong 15 quốc gia tiêu thụ phân
bón nhiều nhất trên thế giới, tổng lượng phân bón sử dụng năm 2010 dao động từ 9-9,5
triệu tấn và vẫn tiếp tục tăng qua các năm. Hiệu suất sử dụng thấp (chỉ từ 40-60%, cao
nhất chỉ đạt 75%) kết hợp với việc lạm dụng phân bón hóa học (phân đạm, lân,
NPK,…) đã và đang gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí, tăng
nguy cơ nhiễm sâu bệnh của cây trồng. Thêm vào đó, mỗi năm, một lượng thuốc
BVTV khổng lồ và đa dạng về chủng loại được sử dụng cho gần 100% diện tích canh
tác nông nghiệp: trung bình từ 15.000-25.000 tấn, ước tính trong số đó có hơn 1.000
loại có độc tính cao (Báo Sài Gòn Giải Phóng, 2013). Việc sử dụng tràn lan thuốc
BVTV càng làm xấu hơn tình trạng môi trường bởi nó làm mất cân bằng sinh học cũng
như làm giảm tính đa dạng sinh học của hệ sinh thái nông nghiệp, tăng hiện tượng
kháng thuốc của sâu bệnh và tăng các nguy cơ về sức khỏe ở người tiêu dùng. Ngoài
ra, sử dụng phân bón hóa học và thuốc BVTV không đúng cách còn gây ảnh hưởng
xấu đến chất lượng gạo, giảm giá trị và khả năng cạnh tranh trên thị trường. Chính các
tác động bất lợi của phân bón hóa học và thuốc BVTV đã thúc đẩy các nghiên cứu
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
phát triển các sản phẩm sinh học an toàn hơn với môi trường để thay thế một phần
hoặc hoàn toàn các loại sản phẩm này, hướng tới một nền nông nghiệp xanh, sạch hơn
và thật sự bền vững.
Vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-
Promoting Rhizobacteria - PGPR) hiện được xem là nguồn tài nguyên sẵn có đầy tiềm
năng để sản xuất các chế phẩm sinh học thay thế dần các loại hóa chất nông nghiệp
đang được sử dụng phổ biến. Từ các nghiên cứu đầu tiên cho thấy các tác động tích
cực của các loài vi khuẩn này trên sự sinh trưởng và năng suất cây trồng vào những
năm 1950, tính đến nay, hàng trăm chủng PGPR đã được phân lập, khảo sát và nghiên
cứu trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và cả ngoài đồng trên khắp thế giới nhằm tuyển
chọn được các chủng có biểu hiện nổi trội để đưa vào ứng dụng trong thực nghiệm

(Zehnder et al., 2001). Tuy nhiên, vì các tác động và kết quả nghiên cứu ngoài đồng
còn chưa được thống nhất cao và thường thay đổi tùy thuộc vào vị trí địa lý, vụ mùa
cũng như các loại cây trồng khác nhau (Lambert và Joos, 1989) nên các đặc tính kích
thích sinh trưởng thực vật của các loài vi khuẩn này cần được nghiên cứu ở phạm vi
rộng và chuyên sâu hơn để có thể tận dụng tiềm năng của chúng một cách tối ưu trong
sản xuất nông nghiệp. Từ nhu cầu thực tế đó, đề tài “Khảo sát khả năng hòa tan lân,
tổng hợp IAA và enzyme chitinase của vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa” được thực
hiện nhằm phát hiện các dòng vi khuẩn đất vùng rễ có tiềm năng ứng dụng cao, cung
cấp nguyên liệu cho các thí nghiệm sản xuất phân bón vi sinh khác.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan, tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) và
enzyme chitinase của 18 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm phân lập từ đất vùng
rễ lúa.
- Khảo sát khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae trong điều kiện in vitro của
các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme chitinase.
- So sánh sự khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn tổng hợp chitinase bằng kỹ
thuật BOX-PCR.



Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về cây lúa
Việt Nam là một trong những quốc gia có lịch sử phát triển nghề trồng lúa lâu đời
nhất tại Châu Á, theo các tài liệu khảo cổ của Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam,… cây
lúa đã có mặt tại nước ta từ khoảng 4000-3000 năm trước công nguyên. Cho đến nay,
hoạt động sản xuất lúa gạo vẫn giữ vị trí rất quan trọng trong nền kinh tế quốc dân của
nước ta, nó không những đóng vai trò đảm bảo nguồn cung lương thực trong nước, tạo
thu nhập cho đại bộ phận người dân mà còn mang lại một nguồn thu ngoại tệ không

nhỏ từ xuất khẩu để đầu tư phát triển các lĩnh vực khác.
2.1.1. Sinh học cây lúa
Về sinh học, cây lúa (Ozyza sativa L.) thuộc họ Hòa thảo (Poaceae), là cây hằng
niên có tổng số nhiễm sắc thể 2n=24, là loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng
rãi (từ khí hậu xích đạo, nhiệt đới đến ôn đới; từ vùng đất phù sa nước ngọt đến vùng
đất cát sỏi ven biển, nhiễm mặn, nhiễm phèn,…) và chiếm đại bộ phận diện tích trồng
lúa trên thế giới. Cây lúa là loại cây ngày ngắn, tức chỉ cảm ứng ra hoa trong điều kiện
quang kỳ ngắn. Phản ứng đối với quang kỳ (độ dài chiếu sáng trong ngày) thay đổi tùy
theo giống lúa. Dựa vào mức độ cảm ứng đối với quang kỳ, có thể phân biệt 2 nhóm
lúa chính: nhóm quang cảm và nhóm không quang cảm. Phần lớn các giống lúa cổ
truyền của nước ta đều là giống lúa quang cảm, chỉ trổ và chín theo mùa nên mỗi năm
chỉ trồng được 1 vụ, gây trở ngại lớn cho việc thâm canh tăng vụ. Vì vậy, các giống
lúa mới được lai tạo hiện nay hầu hết đều là các giống lúa không quang cảm ngắn ngày
(90-120 ngày) hoặc trung mùa (120-150 ngày). Thời gian sinh trưởng của lúa không
quang cảm hầu như không thay đổi khi trồng trong các thời vụ khác nhau nên cho
phép trồng nhiều vụ trong năm, miễn là đảm bảo được nước tưới và điều kiện dinh
dưỡng cho lúa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
2.1.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa
Đời sống cây lúa được tính từ lúc hạt nảy mầm cho đến khi lúa chín, có thể được
chia thành 3 giai đoạn chính (Hình 1): giai đoạn tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng,
bắt đầu từ khi hạt nảy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân hóa đòng), giai đoạn sinh sản
(sinh dục, bắt đầu từ lúc phân hóa đòng đến khi lúa trổ bông) và giai đoạn chín (bắt
đầu từ lúc trổ bông đến lúc thu hoạch).
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 1. Biểu đồ sinh trưởng của một giống lúa 120 ngày không quang cảm
(Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)
2.1.3. Bệnh hại cây lúa
Để đáp ứng nhu cầu lương thực vẫn không ngừng tăng nhanh, vấn đề thâm canh

tăng vụ đang ngày càng được đẩy mạnh, hầu như quanh năm lúc nào trên đồng ruộng
cũng có cây lúa ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau. Thêm vào đó, để đạt năng suất
cao, người nông dân phải sử dụng rất nhiều phân bón, đặc biệt là phân đạm. Tuy
nhiên, không phải ai cũng có các hiểu biết cần thiết về các loại sâu bệnh và biện pháp
phòng trừ an toàn cũng như cách bón phân, sử dụng thuốc BVTV sao cho hợp lý. Đó
chính là những điều kiện tốt cho bệnh hại lúa bộc phát, lưu tồn và phát triển, gây thiệt
hại cho ruộng lúa và làm giảm sút năng suất (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Hiện tại, có rất
nhiều tác nhân gây bệnh trên lúa (côn trùng, nấm, vi khuẩn, virus, chuột,…), trong đó
phổ biến nhất phải kể đến:
- Côn trùng: Rầy nâu (brown planthopper, Nilaparvata lugens Stal.), rầy lưng trắng
(white-back planthopper, Sogatella furcifera), rầy xanh (green leafhopper, Nephotettix
spp.), rầy bông/rầy zig-zag (Zig-zag leafhopper, Recilia dorsalis), bọ gai (hispa, Hispa
armigera), bọ xít hôi/bồ hút (rice bug, Leptocorisa oratorius), bù lạch (thrips,
Baliothrips biformis), sâu đục thân/sâu nách/sâu ống (stemborrer), sâu cuốn lá/sâu xếp
lá, sâu phao/sâu đeo (caseworm, Nymphula depunctalis), dòi đục lá (whorl maggot,
Hydrellia philippina),…
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Nấm: Pyricularia oryzae (bệnh đạo ôn, rice blast), Helminthosporium oryzae (bệnh
đốm nâu, brown spot), Cercospora oryzae (bệnh gạch nâu, narrow brown leaf spot),
Ustilaginoidea virens (bệnh than vàng, false smut), Thanatephorus
cucumeris/Rhizoctonia solani Kuhn (bệnh đốm vằn, sheath blight), Fusarium
moniliforme Shel (bệnh lúa von, Bakanae disease),…
- Vi khuẩn: Xanthomonas campestris pv. oryzae (bệnh cháy bìa lá, bacterial leaf
blight), Xanthomonas campestris pv. oryzae translucens (bệnh sọc trong, bacterial leaf
streak),…
- Virus: bệnh gây bởi virus truyền từ nơi này sang nơi khác và từ cây bệnh sang cây
khỏe qua trung gian là côn trùng. Một loại côn trùng chỉ có thể mang và truyền một số
bệnh do virus nhất định, ví dụ, rầy nâu có thể truyền bệnh lúa cỏ (grassy stunt virus),
lùn xoắn lá (ragged stunt virus) và vàng lùn (yellow draft virus) trong khi các bệnh

vàng cam (orange leaf virus) và lùn có bướu (gall dwarf virus) lại có vật trung gian là
rầy bông.
2.1.4. Bệnh đạo ôn trên lúa (rice blast)
Tác nhân chính gây bệnh đạo ôn (hay còn gọi là bệnh nổ lốp) trên lúa là nấm
Pyricularia oryzae (Pyricularia grisae), hay Pyricularia oryzae Cavara, một thành
viên của họ Dematiaceae, bộ Moniliales, lớp nấm nang (Ascomycetes), là tác nhân gây
bệnh rất hiệu quả, có thể sinh sản bằng cả hình thức vô tính và hữu tính. Nấm tạo bào
tử rất nhỏ, màu nâu nhạt, dạng quả lê ngược và có 2 vách ngăn, mỗi bào tử gắn với
cuống bào tử bởi rốn hạt (hilum) như nhú lồi, được hình thành từ vết bệnh khoảng 6
ngày sau khi nhiễm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010). Bào tử nấm phát
tán rộng, được phóng thích khi độ ẩm không khí đạt rất cao đặc biệt vào ban đêm,
chúng có thể bay xa vùng bệnh thậm chí đến 10.000 m và bay cao 24-25 m, nảy mầm
tốt nhất ở 25-28C khi có lớp nước tự do hay ẩm độ không khí bão hòa, sống đến 30
giờ trong điều kiện không khí khô ở 60C (Trang Nông nghiệp Việt Nam, ngày
22/02/2013). Trên bề mặt nước, 80% lượng bào tử có thể nẩy mầm được và sau 24 giờ
có khả năng sinh sản được. Khuẩn ty phát triển tốt khi ẩm độ không khí đạt 93%, cao
hơn hay thấp hơn, khuẩn ty sẽ phát triển kém. Trong quá trình gây bệnh, nấm kìm hãm
hô hấp và sự sinh trưởng cây lúa bởi một số độc tố như -pycolinic acid và
pyricularin.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bệnh đạo ôn có thể tấn công mọi bộ phận của cây lúa nhưng chủ yếu gây bệnh
trên phiến lá, đốt thân, cổ bông, gié và hạt. Bệnh có thể gây hại rất sớm từ giai đoạn
mạ nhưng thường bị nặng nhất là giai đoạn làm đòng đến sau trổ một thời gian. Trên
lá, vết bệnh lúc đầu nhỏ và có màu nâu, về sau phát triển thành vết bệnh điển hình có
dạng hình mắt én, hai đầu hẹp, ở giữa phình ra và có màu xám tro. Chung quanh vết
bệnh có viền nâu rõ rệt, ngoài viền thường có thêm một quầng vàng. Nhiều vết bệnh
liên kết lại làm cả lá lúa bị cháy khô. Khi xuất hiện trên đốt thân, bệnh gây gãy ngang
thân lúa hoặc gây bệnh khô cổ bông khi nấm tấn công cổ bông làm tắt nghẽn mạch dẫn
nhựa nuôi hạt, bông lúa bị gãy, hạt bị lép và lững (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Trên

giống kháng, các vết bệnh thường rất nhỏ, bằng đầu kim màu nâu, rất dễ nhầm lẫn với
vết bệnh tiêm lửa hoặc đốm nâu mới phát triển (Hình 2). Bệnh xuất hiện và phát triển
mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, sương mù nhiều, ruộng thiếu nước và bón nhiều phân
đạm hoặc sạ cấy quá dày. Hiện nay hầu hết các giống lúa đang được trồng phổ biến
trong sản xuất (đặc biệt là những giống có chất lượng gạo ngon đạt tiêu chuẩn xuất
khẩu) lại là những giống nhiễm hoặc kháng yếu với bệnh đạo ôn. Vì thế, nếu gặp thời
tiết phù hợp, cây lúa đang ở giai đoạn xung yếu đối với bệnh, mà ruộng lại bón thừa
phân đạm thì bệnh có thể hủy diệt cả ruộng lúa chỉ trong vài ngày.

Hình 2. Bệnh đạo ôn trên lúa, khuẩn lạc trên môi trường PDA và bào tử đính
của nấm Pyricularia oryzae
( ngày 22/02/2013)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.2. Vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật (Plant
Growth-Promoting Rhizobacteria - PGPR)
Vùng rễ được định nghĩa là vùng đất tiếp xúc trực tiếp và bao quanh rễ cây mà
tính chất lý hóa của nó bị ảnh hưởng bởi rễ, lông rễ và các chất tiết của cây thông qua
rễ, được mô tả lần đầu tiên bởi Lorenz Hiltner vào năm 1904 (Nelson, 2007). Vùng
không gian này không có ranh giới rõ ràng, thường có giới hạn ước lượng khoảng
1mm đến vài mm tính từ bề mặt rễ. Tại đây, trong quá trình sống của cây, rễ cây
không ngừng tiết ra các hợp chất tan trong nước như amino acid, đường, acid hữu cơ,
vitamin, nucleotide, flavonoid, enzyme, hormone và các hợp chất dễ bay hơi cũng như
thực hiện chức năng duy trì độ ẩm và độ thoáng khí cho vùng đất quanh rễ. Chính vì lý
do này mà các hoạt động sinh học và hóa học tại vùng rễ diễn ra rất mạnh mẽ, mật số
vi sinh vật (bao gồm vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật và tảo) cao hơn nhiều so với
các vùng đất xa rễ hơn. Các loài vi sinh vật có ích sống tại vùng rễ sẽ hình thành một
mối tương tác qua lại và cùng có lợi với cây chủ: cây cung cấp các chất dinh dưỡng
thiết yếu cần cho hoạt động sống của vi sinh vật qua dịch tiết rễ, và ngược lại, các vi
sinh vật này sẽ cung cấp cho cây các hợp chất hữu ích mà cây cần để thúc đẩy quá

trình sinh trưởng và phát triển. Mỗi loại cây trồng sẽ tiết qua bộ rễ dịch rễ có tỉ lệ C/N
cao, với thành phần khác nhau tùy thuộc từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển nhất
định, qua đó tạo nên môi trường có tính chọn lọc cao, quyết định thành phần và số
lượng vi sinh vật sống tại vùng rễ của nó (Rebecca Lines-Kelly, 2013).
Nhìn chung, vi khuẩn chiếm ưu thế trong số các loại vi sinh vật quần tụ tại vùng
rễ thực vật, bao gồm cả vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho cây
(pathogenic bacteria). Trong quần xã vi khuẩn, các loài có khả năng kích thích sinh
trưởng thực vật (PGPR) tuy chỉ chiếm từ 2-5%, nhưng chúng lại có khả năng định cư,
phát triển vượt trội so với các loài vi khuẩn còn lại nhờ vào mối tương tác chặt chẽ hơn
hẳn với cây trồng. PGPR có thể kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây chủ
thông qua ít nhất một trong các cơ chế: cải thiện nguồn dinh dưỡng bằng khả năng cố
định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan; tổng hợp và giải phóng các hormone sinh
trưởng thực vật hoặc các hợp chất có hoạt tính tương tự; phân giải các chất ô nhiễm có
nguồn gốc hữu cơ; sản xuất các hoạt chất kháng sinh hoặc kháng nấm góp phần hạn
chế, kiểm soát bệnh cây gây bởi các vi sinh vật có hại (Antoun và Prévots, 2005). Tập
đoàn các loài PGPR tại vùng rễ có độ đa dạng cao với các chi được nghiên cứu nhiều
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
nhất là Bacillus, Azoarcus, Pseudomonas, Burkholderia, Erwinia, Caulobacter,
Serratia, Arthobacter, Azotobacter, Azospirillum, Beijerinckia, Micrococcus,
Clostridium, Chromobacterum, Flavobacterium, Agrobacterium và Hyphomycrobium
(Foster et al., 1983; Prithiviraj et al., 2003; Gray và Smith, 2005). Theo nghiên cứu
của Kloepper et al. (1999) cũng như của Gray và Smith (2005), một số loài PGPR có
thể xâm nhập và sống trong rễ cây trồng, góp phần làm phong phú hơn cho tập đoàn vi
khuẩn nội sinh.
2.2.1. Vi khuẩn chi Azotobacter
Vi khuẩn Azotobacter được phân lập và đặt tên bởi nhà bác học Beyjeirinh vào
năm 1901, là vi khuẩn cố định đạm hiếu khí tự do, thường phân bố ở các vùng đất,
vùng nước có pH trung tính hoặc hơi kiềm. Azotobacter là vi khuẩn hình cầu (song cầu
khuẩn), Gram âm, không sinh nha bào, tế bào có kích thước dao động từ 1,5-5,5 m.

Khuẩn lạc có màu trắng trong, lồi, nhày, khi già chuyển sang màu vàng lục hoặc màu
nâu thẫm, tế bào được bao bọc bởi lớp vỏ dày và tạo thành nang xác, khi gặp điều kiện
thuận lợi nang xác này sẽ nứt ra và tạo thành các tế bào mới (Lê Xuân Phương, 2001).

Hình 3. Vi khuẩn Azotobacter
( ngày
14/08/2012)
Azotobacter đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường kép, cứ tiêu tốn 1 gam
đường glucose nó có khả năng đồng hóa được 8-18 mg nitơ (Nguyễn Đức Lượng,
1996). Ngoài khả năng cố định đạm sinh học, Azotobacter còn có khả năng sinh tổng
hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học, điển hình là các hormone thực vật như auxin,
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
một số vitamin thuộc nhóm B như B1, B6…, một số acid hữu cơ như: acid nicotinic,
acid pentotenic, biotin và các loại chất kháng sinh thuộc nhóm Anixomyxin.
Chi Azotobacter có rất nhiều loài khác nhau như Azotobacter chroococcum, A.
vinelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. Armeniacus, A. Paspali,…. Vi khuẩn
Azotobacter và một số loài vi khuẩn khác như Azoarcus sp., Burkholderia sp.,
Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum sp., Azotobacter sp. có thể được
phân lập từ vùng rễ hay một vài bộ phận của một số loài cây như lúa gạo, mía đường,
bắp, lúa miến, các loại cây ngũ cốc khác hay khóm và cà phê (Barriuso et al., 2008).
2.2.2. Vi khuẩn chi Azospirillum
Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình xoắn, hơi cong như hình dấu
phẩy hoặc hình chữ S, dài khoảng 2,0-3,8 µm, sinh trưởng tốt ở 30ºC, thuộc phân lớp
-proteobacteria, có khả năng di động và hình thành dạng giống nang bào trong điều
kiện bất lợi (Wikipedia, ngày 14/08/2012). Các chủng Azospirillum đã được phân lập
từ vùng rễ của nhiều loài cỏ và ngũ cốc ở nhiều vùng khí hậu trên thế giới (Bảng 1) và
bắt đầu được ứng dụng trong nông nghiệp từ những năm 1970 (Steenhoudt và
Vanderleyden, 2000). Cho đến năm 2011, nhóm vi khuẩn cố định đạm tự do này đã
được xác định gồm 10 loài dựa trên các đặc điểm chuyên biệt về hóa sinh và phân tử

của chúng: Azospirillum lipoferum, A. oryzae, A. Largimobile, A. Melinis,
A. brasilense, A. Irakense, A. amazonense, A. halopraeferens, A. Doebereinerae và
gần đây nhất là A. canadensis (Saharan và Nehra, 2011).
Quá trình biến dưỡng cacbon và nitơ được biến đổi linh hoạt tùy vào điều kiện
môi trường giúp vi khuẩn Azospirillum thích nghi tốt với môi trường phải cạnh tranh
dinh dưỡng như ở vùng rễ thực vật. Azospirillum có thể sử dụng nitơ ở dạng amonium,
nitrate, nitrite, amino acid và cả nitơ phân tử (N
2
). Ở điều kiện vi hiếu khí, các loài
Azospirillum tương tác chặt chẽ với rễ và vùng rễ của nhiều loài ngũ cốc và hoa màu
quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các loài cây này trên hai cơ chế chính là
cố định đạm và sản xuất phytohormone như IAA (Indole-3-acetic acid), IBA (Indole-
3-butyric acid), ABA (Abscisic acid) và Cytokynin. Azospirillum được xem là một
trong những chi vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng được nghiên cứu nhiều nhất
về khả năng sản xuất IAA (Martínez-Viveros et al., 2010). Liều chủng của các chủng
Azospirillum được áp dụng thành công cho cả những cây chưa từng bị xâm thực vùng
rễ bởi Azospirillum cũng như không cho sự khác biệt khi chủng vào cây thường niên
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
hay cây lâu năm. Một cách tổng quát, có thể nói các loài vi khuẩn thuộc chi
Azospirillum không có tính chuyên hoá. Sự ảnh hưởng của vi khuẩn Azospirillum lên
sự phát triển cây trồng hiện vẫn đang được đầu tư nghiên cứu (Saharan và Nehra,
2011; Steenhoudt và Vanderleyden, 2000).
Bảng 1. Một số loài Azospirillum và nguồn phân lập
Tên loài vi khuẩn
Nguồn phân lập
Tác giả mô tả
Azosprillum brasilense
Bề mặt rễ cây lúa mì, Brasil
Vùng rễ cỏ Pangola (Digitaria decumbens), Brasil

Baldani et al. (1986)
Tarrand et al. (1978)
A. lipoferum
Rễ lúa mì và rễ bắp, Brasil
Tarrand et al. (1978)
A. amazonense
Rễ và vùng rễ cây họ hòa bản ở vùng Amazone, Brasil
Tarrand et al. (1978)
A. halopraeferens
Rễ cỏ Kallar mọc trên đất nhiễm mặn, Pakistan
Magalhles et al. (1983)
A. irakense
Vùng rễ và rễ lúa, Irak
Khammas et al. (1989)
(*Nguồn: Steenhoudt và Vanderleyden (2000))
2.2.3. Vi khuẩn chi Bacillus
Bacillus là nhóm vi khuẩn Gram dương, có khả năng tạo bào tử, các tế bào
thường sắp xếp thành dạng chuỗi (streptobacillus), chiếm khoảng 90% nhóm vi khuẩn
Gram dương có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật sống tại vùng rễ. Các loài
Bacillus phổ biến là B. mycoides, B. firmus, B. subtilis, B. pumilus, B. megaterium, B.
thuringiensis và B. licheniformis (Antoun và Prévots, 2005). Tại vùng rễ thực vật, một
số chủng Bacillus có thể tiết ra các hợp chất giúp tăng cường lượng chất dinh dưỡng
sẵn có cho cây trồng và sản xuất các hormone thực vật như IAA hay gibberellin. Thêm
vào đó, chúng còn có khả năng tương tác bền vững và kích thích sự sinh trưởng cây
trồng rõ rệt. Ví dụ, vi khuẩn B. licheniformis có thể được dùng như phân bón sinh học
cho cà chua và hồ tiêu mà không làm biến đổi các điều kiện cần cho cây phát triển
trong nhà lưới; B. megaterium góp phần cải thiện sự mọc rễ cũng như chiều dài và
trọng lượng khô của rễ bạc hà; B. megaterium var. phosphaticum và B. mucilaginosus
có khả năng cải thiện nguồn khoáng và sự hấp thu khoáng của ớt và dưa leo trong điều
kiện đất nghèo dinh dưỡng có chứa đá khoáng,… (Kaymak et al., 2008; Han et al.,

2006; Supanjani et al., 2006). Bên cạnh đó, theo Antoun và Prévots (2005), vi khuẩn
Bacillus còn được chú ý nghiên cứu và sử dụng trong biện pháp đấu tranh sinh học,
kiểm soát một số tác nhân vi sinh gây bệnh cây trồng như Sclerotium rolfsii và
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Rhizoctonia solani trên cà chua, Colletotrichum gloeosporioides trên tiêu Cayene,
CMV (Cucumber mosaic virus) trên dưa leo,
2.2.4. Vi khuẩn chi Pseudomonas
Chi Pseudomonas được xem là đại diện cho các loài vi khuẩn Gram âm trong
quần xã vi khuẩn vùng rễ, gồm các loài vi khuẩn dạng que, có khả năng hô hấp hiếu
khí hoặc kỵ khí trong môi trường không có oxy, không có khả năng tạo bào tử, phản
ứng catalase và oxydase dương tính, có 1 hoặc nhiều chiên mao tập trung ở 1 đầu, và
do đó có khả năng di động tốt trong nước. Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30-
37
o
C, tuy nhiên một số chủng lại có thể sống ở nhiệt độ lên đến 40
o
C. Vi khuẩn
Pseudomonas có thể được nuôi trong môi trường đơn giản ở điều kiện pH trung tính,
có độ đa dạng loài cao tùy vào loại cây trồng và loại đất.
Một số loài vi khuẩn Pseudomonas có khả năng tiết pyoverdine (siderophore
huỳnh quang vàng xanh) hoặc một số dạng khác như pyocyanide (P. aeruginosa) hay
thioquinolobactin (P. fluorescens) khi sống trong điều kiện môi trường thiếu hụt sắt để
cạnh tranh với các loài vi sinh vật khác (Wikipedia, ngày 14/08/2012). Trong vùng rễ,
Pseudomonas làm biến đổi mạnh mẽ môi trường sống của chúng theo hướng có lợi
cho cây chủ thông qua các sản phẩm từ các con đường trao đổi chất thích nghi linh
hoạt với sự biến động của môi trường xung quanh. Ví dụ, các chất có tính kháng sinh
là siderophore hay HCN mà hầu hết các chủng Pseudomonas tiết ra sẽ ức chế sự sinh
trưởng của những vi sinh vật có hại và tăng cường lượng chất dinh dưỡng sẵn có cho
cây hấp thụ (Barriuso et al., 2008). Bên cạnh đó, một số chủng (chủ yếu thuộc loài

P. fluorescens và P. putida) còn có khả năng kích thích sự phát triển hệ rễ, sự phát
triển cây non, tăng trọng lượng tươi và năng suất cây trồng. Các loài Pseudomonas còn
sở hữu nhiều đặc tính quý như cố định đạm sinh học (P. Stutzeri, P. diminuta, P.
fluorescens, P. paucimobilis, P. pseudoflava, P. putida, P. saccharophila và
P. vesicularis (Chan et al., 1994)), hòa tan lân khó tan (P. fluorescens, P. putida,
P. chlororaphis (Cattenlla et al., 1999)), tiết hormone sinh trưởng IAA, khả năng đối
kháng sinh học (Antoun và Prévots, 2005).
2.2.5. Vi khuẩn chi Azoarcus
Chi Azoarcus gồm các vi khuẩn Gram âm, hiếu khí/vi hiếu khí có khả năng cố
định N
2
, có dạng hình que, kích thước từ 0,4-1,5x1,1-4,0 m, nhiệt độ sống tối ưu từ
30-40
o
C, tế bào có khả năng chuyển động nhanh nhờ chiên mao ở một đầu. Chúng có
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
thể phát triển tốt trong môi trường muối của các acid hữu cơ như: malate, succinate,
fumarate, D-lactate và cũng phát triển tốt trong ethanol, glutamate, nhưng không sống
được trong đường đơn hoặc đường đôi ngoại trừ một số loài không liên kết với thực
vật. Các loài Azoarcus có khả năng cố định đạm hữu hiệu đã được xác định là
A. indigens, A. communis và A. tolulyticus (Saharan và Nehra, 2011).
2.2.6. Vi khuẩn chi Serratia
Chi Serratia gồm các loài vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy tiện, có dạng hình que
thuộc họ Enterobacteriaceae như S. marcescens, S. ficaria, S. odorifera, S.
liquifaciens, S. rubidaea, S. pymuthica và S. fonticola,…. Một số chủng thuộc chi
Serratia được tìm thấy ở vùng rễ thực vật (điển hình là các chủng của loài
S. marcescens) được chú ý nghiên cứu chủ yếu trên khả năng khả năng hòa tan lân khó
tan (đặc biệt là các loại lân khoáng và các loại lân không tan cao như phosphate cứng
(rock phosphate), Ca

3
(PO
4
)
2
, hydroxyapatite) và sinh tổng hợp chitinase ngoại bào.
Các chủng Serratia như vậy đã được phân lập từ vùng rễ cây bông vải (Gossypium
hirsutum), bắp ngọt (Zea mays), lúa (Oryza sativa) và cả từ hạt lúa (Gyaneshwar et al.,
2002). Bên cạnh đó, một số chủng khác thậm chí còn có thể hỗ trợ sự phát triển của
cây trồng thông qua các cơ chế giúp gia tăng sức đề kháng chống lại các mầm bệnh
của cây (Kloepper et al., 1993).
2.3. Khả năng cố định đạm sinh học của các loài vi khuẩn vùng rễ
Đối với thực vật, lượng nitơ cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp amino acid và
nucleic acid được cung cấp từ 2 nguồn chính là khí N
2
trong khí quyển và dạng nitrate
(NO
3
-
) trong đất hay nước. Trong đó, khí N
2
được xem là nguồn nitơ sinh học dồi dào
do nó chiếm đến gần 80% thể tích không khí. Tuy nhiên, do có chứa liên kết ba cộng
hoá trị bền vững (NN), N
2
lại trơ về mặt hóa học và chỉ có thể được chuyển hoá, hay
cố định bởi số ít các loài vi khuẩn, một nửa trong số đó là các vi khuẩn sống tự do
trong đất và vùng rễ (Agrobacteria, Azotobacter, Klebsiella, Clostridium,…) một nửa
còn lại là các vi khuẩn lam sống trong đại dương. Các vi khuẩn này sử dụng enzyme
nitrogenase, một loại enzyme đặc hiệu và có cấu trúc phức tạp để chuyển N

2
và NO
3
-

thành ammonia (NH
3
) (Moran et al., 2012) theo sơ đồ:

từ đó NH
3
sẽ tham gia vào các quá trình trao đổi chất trong tự nhiên (Hình 4).
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Mặc dù chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ trong chu trình nitơ trên toàn cầu, sản phẩm của quá
trình cố định đạm lại là nguồn cung cấp Nitơ cao nhất cho cả môi trường sống trên cạn
và dưới nước (Lê Thị Hiền Thảo, 2011), tạo nên một khối lượng lớn đạm dễ tiêu cho
môi trường đất.

Hình 4. Chu trình nitơ (Moran et al., 2012)
Trong số các loài PGPR, Azospirillum sp. là vi khuẩn cố định đạm tự do được
nghiên cứu sớm nhất bởi Beijernick (1925) và hiện vẫn đang được nhiều nhà khoa học
đầu tư nghiên cứu. Khi kết hợp với Pseudomonas striata, A. brasilense làm tăng năng
suất hạt cũng như khả năng hấp thụ nitơ và phospho của cây cao lương (Alagawadi và
Gaur, 1992), còn khi kết hợp với Rhizobium sp. để ứng dụng trên cỏ ba lá, A.
brasilense Sp7 cho thấy khả năng khử acetylene, tạo nốt rễ giả và làm tăng trọng
lượng khô của cây (Oliveira et al., 1997). Nhiều vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định
đạm tốt thuộc các chi Azoarcus, Burkholderia, Gluconacetobacter và Pseudomonas
cũng đã được phân lập từ các vùng đất rễ khác nhau.
2.4. Khả năng hòa tan lân khó tan

Khả năng hoà tan lân khó tan được xem là hoạt động tăng cường dinh dưỡng cho
cây chủ rõ rệt nhất của các loài PGPR. Điều này là do cây chỉ có thể sử dụng được lân
từ đất dưới dạng hòa tan trong dung dịch đất (hay còn gọi là lân dễ tiêu, chủ yếu là
HPO
4
2-
hoặc H
2
PO
4
-
) nhưng hàm lượng lân hòa tan trong đất thông thường rất thấp,
thường chỉ ở mức 1 ppm hoặc thấp hơn (Goldstein, 1994) nên cây rất cần nguồn bổ
sung phospho từ các nguồn khác. Trong canh tác nông nghiệp, phần lớn lượng
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
phospho thực vật có thể sử dụng thường đến từ phân lân bởi lẽ quá trình phóng thích
phospho từ vật liệu hữu cơ có nguồn gốc thực vật vô cùng chậm. Mặc dù bón phân lân
trong thời gian dài có tác dụng cải thiện hàm lượng phospho trong đất, hầu hết lượng
phospho này lại dễ dàng bị cố định và tồn tại ở dạng khó tan (CaHPO
4
, CaHPO
4
.2H
2
O,
Ca
3
(PO
4

)
2
). Đến nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh một số vi khuẩn vùng rễ có khả
năng làm giảm pH của môi trường vùng rễ khi tiết ra các acid hữu cơ (gluconic acid,
citric acid, lactic acid và succinic acid), và chính điều kiện pH thấp tạo bởi các vi
khuẩn này giúp hoà tan lân ở dạng cố định, tăng hàm lượng phospho dễ tiêu cho cây
hấp thụ. Các vi khuẩn này đa số thuộc chi Bacillus, Burkholderia, Enterobacter,
Klebsiella, Kluyvera, Streptomyces, Pantoea và Pseudomonas (Chung et al., 2005;
Hariprasad và Niranjana, 2009; Oliveira et al., 2009).
2.5. Khả năng tổng hợp IAA
Hormone thực vật (phytohormone) là các hợp chất hữu cơ được tổng hợp ở một
lượng rất nhỏ và được kiểm soát chặt chẽ, đóng vai trò như tín hiệu hoá học trong các
quá trình hoá sinh, sinh lý cũng như phát sinh hình thái, qua đó giúp điều hoà sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật. Khả năng tổng hợp hormone thực vật không hạn chế
trên thực vật, mà nhiều loài vi khuẩn sống tương tác với thực vật (bao gồm cả các vi
khuẩn có lợi và gây hại) cũng có khả năng sản xuất một số loại hormone hay các hợp
chất có tính chất tương tự như các hormone này (Dobbelaere et al., 2003). Nhiều
nghiên cứu đã cho thấy PGPR có thể kích thích sự phát triển cây trồng thông qua sinh
tổng hợp auxin - chủ yếu là IAA, gibberellin, cytokinin hoặc điều hoà mức ethylene
nội sinh trong cây. Trong số các loài PGPR có khả năng tổng hợp hormone thực vật,
Azospirillum là chi được nghiên cứu nhiều nhất với khả năng tổng hợp auxin (IAA),
gibberellin và cytokinin.
IAA là dạng auxin chính thường được phát hiện trong thực vật với nhiều vai trò
sinh lý quan trọng như kích thích sự lớn lên và phân chia của tế bào, tham gia vào quá
trình biệt hóa mô, điều khiển tính hướng quang và hướng trọng lực của cây. Theo
Patten và Glick (1996), Khalid et al. (2004), có đến 80% các loài vi khuẩn sống trong
đất vùng rễ, bao gồm các loài PGPR, có khả năng tổng hợp IAA thông qua 3/6 con
đường tổng hợp IAA, ở cả 3 con đường này, vi khuẩn đều cần có amino acid
L-tryptophan làm tiền chất ban đầu (Hình 5). Lượng IAA do các loài PGPR tiết ra là
nguồn bổ sung quan trọng cho sự phát triển cây trồng, đặc biệt là đối với các bộ phận

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
đặc biệt nhạy với sự thay đổi của nồng độ IAA như bộ rễ. Khả năng tổng hợp IAA của
các loài PGPR khác nhau có sự khác biệt rõ rệt, thậm chí các chủng khác nhau trong
cùng một loài cũng có lượng IAA sinh ra không giống nhau, tùy thuộc vào lượng
tryptophan có sẵn trong dịch tiết rễ hoặc khả năng tự tổng hợp tryptophan của vi
khuẩn. Chính vì vậy, khi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA bởi vi
khuẩn trong điều kiện in vitro, tryptophan vẫn thường được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy để thay thế nguồn cung cấp từ dịch tiết rễ, sự bổ sung này trong hầu hết các
trường hợp, đã được chứng minh có tác dụng cải thiện đáng kể hàm lượng IAA sinh ra
(Spaepen và Vanderleyden, 2010).

Hình 5. Các con đường tổng hợp IAA từ tiền tố tryptophan bởi vi khuẩn
(Spaepen et al., 2007)
IAA do Azospirillum tổng hợp đã được chứng minh có thể làm biến đổi đặc điểm
hình thái và sinh lý của rễ cây được chủng (Harari et al., 1988; Kapulnik et al., 1985;
Tien et al., 1979). Theo trích dẫn của Shahab et al. (2009), năm 1974, Barea và Brown đã
phát hiện khả năng tiết IAA của vi khuẩn Azotobacter paspali, sau khi xử lý rễ của một
số loại cây trồng với loài vi khuẩn này, trọng lượng khô rễ và lá tăng có ý nghĩa. Ngoài
ra, Pseudomonas putida GR12-2 và nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ khác cũng đã được
chứng minh có khả năng sinh IAA, qua đó, làm tăng số lượng và chiều dài rễ ở cây non.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.6. Khả năng tổng hợp chất kháng sinh, hoạt chất diệt nấm và các enzyme
thuỷ phân ngoại bào
Các kháng sinh được biết đến nhiều nhất trong nhóm cơ chế này bao gồm 2,4-
diacetyl phloroglucinol (2,4-DAPG), HCN, butyrolactone, kanosamine, oligomycin A,
oomycin A, phenazine-1-carboxylic acid, pyoluteorin, pyrolnitrin, viscosinamine,
xanthobaccin, amphisin, tensin tropolone và siderophore. Trong số đó, 2,4-DAPG và
HCN là 2 hợp chất có tính kháng sinh được sử dụng hiệu quả nhất trong biện pháp đấu

tranh sinh học nhằm kiểm soát các tác nhân gây bệnh thực vật.
Một số loài PGPR lại tấn công vi sinh vật gây hại, chủ yếu là nấm, bằng các
enzyme thuỷ phân ngoại bào (cell wall hydrolases). Điển hình là chitinase ngoại bào
(extracellular chitinase) tiết bởi vi khuẩn Serratia marcescens đối kháng nấm
Sclerotium rolfsii (Ordentlich, 1988) hay chitinase ngoại bào tiết bởi chủng
Paenibacillus sp. 300 và chủng Streptomyces sp. 385 đối kháng nấm Fusarium
oxysporum f. sp. cucumerium; chitinase ngoại bào và enzyme laminarinase tiết bởi
Pseudomonas stutzeri đối kháng nấm F. oxysporum (Lim et al., 1991) hay β-1,3-
glucanase tổng hợp bởi Pseudomonas cepacia với khả năng phá huỷ vách tế bào của
Rhizoctonia solani, S. rolfsii và Pythuium ultinum (Fridlender et al., 2003). Bên cạnh
chitinase và β-1,3-glucanase, phenazine và 2,4-DAPG là 2 hợp chất kháng nấm khác
thường được tổng hợp bởi PGPR (Fuentes-Ramirez và Caballero-Mellado, 2005).

Hình 6. Kiểm soát nấm Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum bằng các
chủng vi khuẩn đối kháng: Sợi nấm R. solani (trái) và F. oxysporum (phải) bị ức
chế phát triển bởi các chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc (Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, 2012)