nghiên cứu sử dụng các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.17 MB, 56 trang )

i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
  

DƢƠNG DUY KHÁNH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2013
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO
SƠ CẤP TỪ PHÔI VỊT ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS VIÊM GAN VỊT
VÀ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
  

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Cần Thơ, 2013
GVHD:
PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU

Sinh viện thực hiện:
DƢƠNG DUY KHÁNH
MSSV: 3092671
LỚP: THÚ Y – K 35
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO
SƠ CẤP TỪ PHÔI VỊT ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS VIÊM GAN VỊT
VÀ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS

i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
  
Đề tài: “Nghiên cứu sử dụng các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân
lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus” do sinh viên Dƣơng

Duy Khánh thực hiện tại phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08
năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013 Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013
Duyệt của bộ môn Duyệt của giáo viên hƣớng dẫn
PGS.TS. HỒ THỊ VIỆT THU
Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013
Duyệt của Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng
ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ luận văn nào trước đây.
Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013
Tác giả luận văn
Dƣơng Duy Khánh
iii

LỜI CẢM TẠ
Con kính dâng luận văn này với lòng biết ơn vô hạn đến ba mẹ, người đã sinh
thành dưỡng dục, suốt đời tận tụy vì con và luôn mong cho con công thành
danh toại.
Tôi xin tỏ lòng tri ân sâu sắc đến cô Hồ Thị Việt Thu, người đã hết lòng dìu
dắt, truyền đạt nhiều kiến thức và kinh nghiệm quí báu cũng như giúp đỡ cho
tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi chân thành cảm ơn đến:
Cô Nguyễn Thị Bé Mười cố vấn học tập đã tận tình chỉ dạy và giúp đỡ tôi
trong suốt những năm học vừa qua.
Quý thầy cô Trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là thầy cô bộ môn Thú y và bộ

môn Chăn nuôi thú y khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tình
giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt những năm qua.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến anh Lê Trần Hoài Khanh đã tận tình hướng dẫn và
tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Cám ơn tất cả các bạn lớp Thú Y K35 đã chia sẻ cùng tôi buồn vui trong quá
trình học tập cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Xin kính gởi đến quý thầy, cô, người thân, anh, chị, bạn bè tôi lời chúc sức
khỏe, thành công và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo đã dành thời gian đọc,
xem xét và đóng góp ý kiến quý báu cho đề tài tốt nghiệp của tôi.
iv

TÓM LƢỢC
Đề tài: “Nghiên cứu sử dụng các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân
lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus” do sinh viên Dương
Duy Khánh thực hiện tại phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08
năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phân
lập virus viêm gan vịt trên một số môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt qua các
thí nghiệm sau: (i) tính chỉ số TCID
50
/0,1ml trên tế bào xơ phôi vịt (DEF -
Duck Embryo Fibroblast), kết quả cho thấy ở độ pha loãng 10
-4,74
, 0,1ml
huyễn dịch virus gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy và chúng tôi sử dụng liều pha
loãng 100TCID
50
để dùng trong các thí nghiệm sau; (ii) so sánh tính thích ứng
của virus viêm gan vịt type 1 thông qua việc khảo sát thời gian trung bình tạo

bệnh tích tế bào (CPE – Cytopathic Effect) đầu tiên trên từng loại tế bào,
chúng tôi thu nhận kết quả sau, đối với tế bào xơ phôi vịt (DEF) là 39,13 giờ,
tế bào thận phôi vịt (DEK - Duck Embryo Kidney) là 35,38 giờ và tế bào gan
phôi vịt (DEL - Duck Embryo Liver) là 31,63 giờ sau khi gây nhiễm virus; và
so sánh hiệu quả giữa hai loại thuốc nhuộm đều cho thấy khả năng quan sát
các bệnh tích tế bào khi nhuộm crystal violet tốt hơn nhuộm neutral red; và
(iii) phản ứng vi trung hòa được thực hiện trên ba loại tế bào phôi vịt với 1
mẫu huyết thanh âm tính, 2 mẫu huyết thanh miễn dịch và 4 mẫu huyết thanh
kiểm tra. Kết quả cho thấy mẫu huyết thanh âm tính và các mẫu huyết thanh
kiểm tra đều xuất hiện bệnh tích tế bào, cho kết quả âm tính (hiệu giá kháng
thể dưới 4log2) không có kháng thể hoặc có kháng thể với hàm lượng thấp.
Còn 2 mẫu huyết thanh miễn dịch đều cho kết quả dương tính với hiệu lượng
kháng thể cao ≥ 4log2.

v

MỤC LỤC
TRANG DUYỆT LUẬN VĂN i
LỜI CAM ĐOAN ii
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM LƯỢC iv
MỤC LỤC v
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH HÌNH viii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ix
Chƣơng 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 2
2.1.1. Đặc tính của tế bào động vật nuôi cấy 2
2.1.2. Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật 2

2.1.3. Các giai đoạn phát triển của tế bào nuôi cấy 3
2.1.4. Các dòng tế bào nuôi cấy 3
2.1.5. Dụng cụ nuôi cấy tế bào 3
2.1.6. Một số môi trường nuôi cấy tế bào 4
2.1.7. Các biểu hiện bệnh tích tế bào dưới tác động của virus trong môi trường tế
bào lớp đơn 5
2.1.8. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 6
2.1.9. Đánh giá tình trạng nuôi cấy 6
2.1.10. Các vấn đề cần nuôi cấy trong tế bào động vật 7
2.2. Virus viêm gan vịt 7
2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus 7
2.2.2. Sức đề kháng của virus viêm gan vịt type 1 8
2.2.3. Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1 8
2.2.4. Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1 9
2.2.5. Nuôi cấy tế bào phôi vịt 10
Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1. Thời gian và địa điểm 11
3.1.1. Thời gian 11
3.1.2. Địa điểm 11
vi

3.2. Vật liệu và hóa chất 11
3.2.1. Đối thượng thí nghiệm 11
3.2.2. Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 11
3.2.3. Các hóa chất và môi trường 12
3.3. Nội dung nghiên cứu 13
3.4. Phương pháp nghiên cứu 13
3.4.1. Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy 13
3.4.2. So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp 14
3.4.3. Xác định kháng thể kháng DHV-1 trên môi trường tế bào qua phản ứng vi

trung hòa 16
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu 18
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
4.1. Kết quả thu nhận lớp tế bào DEF, DEK và DEL 19
4.2. Chuẩn độ virus 22
4.3. So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp 23
4.3.1. Thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên của ba loại tế bào 23
4.3.2. So sánh mức độ xuất hiện CPE trên từng loại tế bào thông qua nhuộm
crystal violet và neutral red 25
4.4. Kết quả phản ứng vi trung hòa 28
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
5.1. Kết luận 31
5.2. Đề nghị 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
Phụ chƣơng 1. CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 35
Phụ chƣơng 2. XỬ LÝ SỐ LIỆU 37
Phụ chƣơng 3. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 45

vii

DANH SÁCH BẢNG
Hình Tên hình Trang
Bảng 4.1. Kết quả tỷ lệ CPE do DHV-1 gây ra theo nồng độ virus trên môi trường
tế bào DEF 22
Bảng 4.2. Thời gian xuất hiện CPE trung bình của ba loại tế bào sau khi gây nhiễm23
Bảng 4.3. So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và
Neutral red trên tế bào DEF 25
Bảng 4.4. So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và
Neutral red trên tế bào DEK 25

Bảng 4.5. So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và
Neutral red trên tế bào DEL 26
Bảng 4.6. Kết quả phản ứng vi trung hòa trên 3 loại tế bào 28

viii

DANH SÁCH HÌNH
Hình Tên hình Trang
Hình 2.1. Bình Roux (T-flask) 4
Hình 2.2. Đĩa microplate 4
Hình 2.3. Erlenmeyer 4
Hình 2.4. Spinner flask 4
Hình 2.5. Các môi trường nuôi cấy tế bào 5
Hình 3.1. Bố trí thí nghiệm chuẩn độ virus 14
Hình 3.2. Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm trên hai
loại tế bào 16
Hình 3.3. Bố trí thí nghiệm phản ứng vi trung hòa 17
Hình 4.1. Thời gian tạo lớp của tế bào DEF 20
Hình 4.2. Thời gian tạo lớp của tế bào DEK 20
Hình 4.3. Thời gian tạo lớp của tế bào DEL 21
Hình 4.4. Biểu đồ thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên 23
Hình 4.5. Tế bào tạo bệnh tích CPE đầu tiên sau khi gây nhiễm 24
Hình 4.6. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi quan sát tươi 27
Hình 4.7. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Crystal violet 27
Hình 4.8. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Neutral red 28
Hình 4.9. Kết quả phản ứng vi trung hòa trên tế bào 29
Hình 4.10. Kết quả phản ứng vi trung hòa qua nhuộm Crystal violet 29

ix

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT
Viết tắc
Nguyên chữ
Nghĩa tiếng việt
1
CPE
Cytopathic Effect
Bệnh tích tế bào
2
Ctv

Cộng tác viên
3
DEF
Duck Embryo Fibroblast
Tế bào xơ phôi vịt
4
DEK
Duck Embryo Kidney
Tế bào thận phôi vịt
5
DEL
Duck Embryo Live
Tế bào gan phôi vịt
6
DHV
Duck Hepatitis Virus
Vi rút viêm gan vịt
7

DMEM
Dulbecco – Modified Eagle Medium

8
DPBS
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
Solution
Muối đệm phosphate
Dulbecco
9
EDTA
Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

10
EMEM
Eagle Minimum Essential Medium

11
FBS
Foetal Bovine Serum
Huyết thanh bào thai bò
12
Hela

Tế bào ung thư cổ tử cung
người
13
HEPES
Hydroxy-Ethyl-Piperazine-Ethane-
Sulphonic acid

14
MEM
Minimum Essential Medium
Môi trường nuôi cấy tế bào
15
MTTT

Môi trường tăng trưởng
16
PD
Proportional distance
Khoảng cách tỷ lệ
17
SE
Standard Error
Sai số chuẩn
18
TCID
50
Tissue Culture Infective Dose 50
Liều gây chết 50%
19
UV
Ultraviolet light
Ánh sáng tia cực tím
20
Vero

Thận khỉ xanh Châu Phi

1

Chƣơng 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của mọi cơ thể sống. Các sinh
vật đa bào được cấu tạo từ nhiều loại mô. Các mô được cấu tạo từ những tế
bào cùng loại. Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1938) đã mở ra khả
năng nuôi cấy tế bào thực vật và động vật. Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có
những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục
đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học trong đó việc
nuôi cấy virus trên mô tế bào là một thành tựu lớn trong nghiên cứu virus học.
Nhờ việc phát hiện ra phương pháp này mà công việc nghiên cứu virus đã
được đẩy mạnh. Đây là phương pháp được ứng dụng rất rộng rãi để phân lập
và chuẩn độ virus. Ngoài ra, phương pháp này còn rất hiệu quả trong nghiên
cứu các phản ứng huyết thanh và dùng để chế vaccine (Phạm Văn Ty, 2005).
Hiện nay, bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan
nhanh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Xuân Bình, 2002).
Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con 1-3 tuần tuổi với tỷ lệ chết cao từ 50-95%, có
khi tới 100%. Bệnh cũng có thể gặp vịt mới nở hoặc vịt 5-6 tuần tuổi (Hồ Thị
Việt Thu và ctv). Virus viêm gan vịt hiện có 3 type: 1, 2 và 3. Type 1 phổ biến
hơn cả. Cho đến nay bệnh vẫn gia tăng, lưu hành ở nhiều địa phương trên khắp
cả nước, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuôi.
Mặc dù việc nghiên cứu các phương pháp phân lập và khống chế bệnh viêm
gan vịt do virus đã nhiều trên môi trường tế bào tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn
chế. Từ nhu cầu thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng
các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và
xác định kháng thể kháng virus”.
Mục tiêu đề tài:
Nghiên cứu loại môi trường tế bào sơ cấp phù hợp từ phôi vịt để phân lập
virus viêm gan vịt và ứng dụng xác định kháng thể kháng virus trên môi
trường tế bào.

2

Chƣơng 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật
2.1.1. Đặc tính của tế bào động vật nuôi cấy
Tế bào động vật có tính cơ học yếu do chúng có kích thước tương đối lớn,
trung bình khoảng 10µm và không có thành tế bào. Do đó, trong điều kiện in
vitro, tế bào động vật có thể vỡ bởi những tác động cơ học khi thay đổi môi
trường cho tế bào, tách tế bào,…(Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007).
Hầu hết các loại tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để sống và phân chia (trừ
tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục). Nếu tế bào bám dính vào
bề mặt nuôi cấy, chúng sẽ phát triển kéo dài trên bề mặt nuôi cấy và tế bào sẽ
ngừng phát triển khi chúng hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt nuôi cấy
(Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007).
Trong quá trình nuôi cấy, tế bào có thể bị tổn thương và chết hàng loạt bởi cơ
chế ức chế kiềm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (negative feed - back). Đây là
cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài một chất nào đó, được thực hiện bởi
chính sự gia tăng nồng độ của chất này trong môi trường. Do đó, sau một thời
gian nuôi cấy cần thay đổi môi trường nuôi.
Tế bào động vật có thể được bảo quản trong một thời gian dài bằng phương
pháp làm lạnh sâu trong nitơ lỏng (-196
0
C). Khi giải đông và hoạt hóa, tế bào
phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như ban đầu.
Do tế bào có khả năng phân chia và tốc độ phát triển chậm, kém thích nghi với
môi trường, nên đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone, để tăng
trưởng và phân chia.
2.1.2. Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật
Nuôi cấy sơ cấp: Nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên của những tế
bào vừa được tách ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002). Việc nuôi

cấy được thực hiện sau khi tách các tế bào từ mô bằng phương pháp cơ học
hay phương pháp xử lý enzyme và có thể tăng trưởng trong môi trường thích
hợp. Đây là giai đoạn chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để thu được các
dòng tế bào tương đối đồng dạng.
Trong giai đoạn này, các tế bào dễ tách rời nhau, sống và bám vào cơ chất
thành một lớp mỏng hoặc tồn tại được trong dịch huyền phù.
Nuôi cấy thứ cấp: Khi những tế bào sơ cấp phát triển và làm đầy bề mặt bình
nuôi cấy, chúng cần được cấy chuyền để có bề mặt cho sự phát triển. Các tế
3

bào được tách khỏi bình nuôi cấy bằng enzyme (thường là trypsin), enzyme
này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất. Ngay sau khi tế
bào được tách rời, enzyme được bất hoạt bằng môi trường nuôi cấy (có huyết
thanh), huyền phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới.
2.1.3. Các giai đoạn phát triển của tế bào nuôi cấy
Giai đoạn thích nghi (lag phage): đây là giai đoạn đầu tiên, nó phụ thuộc rất
nhiều yếu tố như thành phần, mật độ, trạng thái ban đầu của tế bào Pha này
xảy ra sớm, không tăng về số lượng tế bào (số lượng tế bào có thể giảm). Nếu
mật độ và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này kéo dài hơn.
Giai đoạn phát triển (log phage): sau khoảng thời gian nuôi cấy, số lượng tế
bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng. Trong chẩn đoán, thường sử dụng bình tế
bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển).
Giai đoạn ổn định (stationary phage): mật độ tế bào không tăng, số tế bào
chết bằng tế bào sinh trưởng. Sự sinh trưởng của tế bào hạn chế do: hết dưỡng
chất trong môi trường nuôi cấy, các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có
thể ức chế sự phát triển của tế bào, tế bào phủ kín trên chất nền nên không còn
bám vào và không thể sinh sản được nữa.
Giai đoạn suy giảm (decline phage): số lượng tế bào chết tăng nhanh, mật độ
tế bào giảm xuống (trích dẫn Nguyễn Ngọc Thanh Thảo, 2007).
2.1.4. Các dòng tế bào nuôi cấy

Dòng tế bào liên tục (continued cell line, established cell line): là dòng tế bào
được nuôi cấy qua nhiều thế hệ trong điều kiện in vitro và có thể duy trì sự
phân bào trong thời gian dài mà không thay đổi đặc tính. Ví dụ: tế bào Vero
(tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung
người),…
Dòng tế bào giới hạn (Finite celle line, temporary cell line): là dòng tế bào chỉ
có khả năng sống trong điều kiện nuôi cấy giới hạn. Ví dụ: tế bào tế bào xơ
phôi gà (CEF - Chicken embryo fibroblast).
2.1.5. Dụng cụ nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture): thường dùng các đĩa microplate, đĩa
petri, bình Roux (flask). Các dụng cụ được chọn tùy vào số lượng tế bào, bản
chất môi trường nuôi cấy, giá thành và thói quen của người sử dụng.
4

Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture): nuôi cấy trong bình lắc Erlenmeyer
hoặc trong bình có cánh quạt xoay từ (Spinner flask). Trong đó, tế bào được
giữ ở trạng thái huyền phù trong môi trường.

2.1.6. Một số môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Môi trường MEM (Minimum Essential Medium): là môi trường cơ bản được
bổ sung muối Earle, các thành phần khác như amino acid không thiết yếu, L-
Glutamine, vitamine đảm bảo cho sự phát triển của tế bào, cần bổ sung 5-10%
huyết thanh vào môi trường.
Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi

trường tối thiểu do H.Eagle thiết lập, là môi trường chứa nồng độ cao các
amino acid (không có L-Glutamine) và vitamine, chứa kháng sinh
kanamycine, cần bổ sung thêm 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.
Môi trường D’MEM (Dulbeco – Modified Eagle Medium): là môi trường
E’MEM do Dulbeco cải tiến với thành phần một amino acid cao gấp hai lần và
Hình 2.1. Bình Roux (T-flask)
( />ell-culture/tissue-culture-flask/)
Hình 2.2. Đĩa microplate
( />plate-v-bottom-pinch-bar-sterile.aspx)
Hình 2.3. Erlenmeyer
(eohistoricodeenfermeria.o
rg/lista_colecciones.php?cat=3&instrumen
to=1&scat1=5&scat2=131)
)
Hình 2.4. Spinner flask
( />65-Spinner/15148-Corning-Proculture-
Spinner-Flasks.htm)
5

số vitamine cao gấp bốn lần, bổ sung thêm glucose để nuôi cấy được nhiều
loại tế bào hơn.

2.1.7. Các biểu hiện bệnh tích tế bào dƣới tác động của virus trong môi
trƣờng tế bào lớp đơn
Virus gây nhiễm bệnh viêm gan vịt và đặc điểm gây nhiễm trên môi trường tế
bào biểu hiện bệnh tích tế bào khi gây nhiễm virus.
Sự nhân lên của virus làm cản trở chức năng bình thường của tế bào và gây ra
những biến đổi kiểu hình (phenotypic changes) gọi là bệnh tích tế bào (CPE –
cythopathic effect). Theo Cann (2005), các CPE có thể là:
Biến đổi hình dạng (altered shape): tế bào co tròn hoặc có hình tua
(tendril/dendric cell) do: (i) virus cản trở chức năng của bộ khung xương tế
bào (cytoskeleton), là thành phần quan trọng duy trì hình thái tế bào và/ hoặc
(ii) virus cảm ứng quá trình apoptosis của tế bào bị nhiễm.
Môi trƣờng D’MEM
(
Môi trƣờng MEM
( />og/product/11095080#)
Môi trƣờng E’MEM
(
products/?id=1269908974-900746)
Hình 2.5. Các môi trƣờng nuôi cấy tế bào
6

Bong tách khỏi lớp nền nuôi cấy (detachment from the subtrate): do sự phá vỡ

bộ xương tế bào.
Ly giải (lysis): một khi tính toàn vẹn tế bào bị mất, tế bào có thể hấp thụ dịch
ngoại bào (extracellular fluid), trương phòng rồi vở ra, giải phóng các hạt
viron và tiếp tục xâm nhiễm, phá vở các tế bào lân cận cho đến khi tạo vệt tan
(plaque) trên thảm tế bào.
Dung hợp màng (membrane fusion): tạo tế bào khổng lồ đa nhân – hợp bào
(syncytia or polykaryocyte, multinucleated giant cell). Các tế bào này chỉ sống
trong thời gian ngắn (short - lived) rồi bị ly giải.
Thể bao hàm (inclusion body): là vùng trong tế bào tập trung các virion.
2.1.8. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Nghiên cứu về sinh lý sinh hóa của tế bào động vật, tương tác giữa tác nhân
gây bệnh và tế bào và những nghiên cứu về dinh dưỡng.
Nuôi cấy tế bào ứng dụng trong định danh và phân lập virus, cách thức xâm
nhập và phát triển trong cơ thể.
Đánh giá hiệu quả sử dụng của các loại thuốc: các tế bào nuôi cấy được sử
dụng riêng và kết hợp với xét nghiệm in vitro để nghiên cứu hiệu quả của thực
phẩm, hóa chất tồn tại và phát triển các loại tế bào khác nhau.
Cung cấp các hệ thống xét nghiệm để xác định phương pháp và thuốc thích
hợp trong điều trị ung thư.
Ứng dụng trong điều chế vaccine như: vaccine bại liệt, sởi, dại, trên người.
Vaccine gumburo, đậu gà, dịch tả vịt, trong chăn nuôi.
2.1.9. Đánh giá tình trạng nuôi cấy
Đánh giá sự phát triển tốt của tế bào thường dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ
lệ phát triển, năng suất che phủ và biểu hiện chức năng đặc biệt.
Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) là dễ xác định nhất và được theo dõi
thường xuyên khi nuôi cấy nhưng rất khó đưa ra kết luận dựa vào những quan
sát này. Ngoài ra, đặc điểm này không thể hiện một số lượng hay đo lường
chính xác nào.
Khi quan sát dưới kính hiển vi và vi trường xấu thì thỉnh thoảng cho kết quả
sai, nếu có nghi ngờ, có thể nhuộm bằng các thuốc nhuộm như neutral red (bắt

màu lysosome)(Finter, 1969), crystal violet (bắt màu DNA trong nhân tế
bào)(Renault et al., 1991) (trích dẫn Hiến Thị Mỹ Trang, 2011).
7

Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển –
tỷ lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy. Dựa vào
đó để thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyết
thanh…) tốt hơn cho tế bào.
Năng suất che phủ là phương pháp kiểm tra dựa trên số lượng nhỏ tế bào (từ
20 – 200) bám trên bình nuôi cấy và số lượng các cụm tế bào đặc trưng được
xác định. Phần trăm các cụm tế bào đặc trưng biểu hiện cho khả năng tồn tại,
trong khi kích thước cụm tế bào đặc trưng cho tỷ lệ phát triển. Phương pháp
này tương tự phương pháp phân tích tỷ lệ phát triển, nhưng nhạy cảm hơn với
sự khác biệt nhỏ.
2.1.10. Các vấn đề cần nuôi cấy trong tế bào động vật
Sự tạp nhiễm: có hai loại chính trong nuôi cấy tế bào là nhiễm hóa học và
nhiễm sinh học. Nhiễm hóa học gây ra bởi các tác nhân như: endotoxin, ion
kim loại hay thuốc tẩy hóa học rất khó phát hiện. Nhiễm sinh học: nấm, vi
khuẩn phát triển nhanh và thường có thể thấy trong nuôi cấy.
Yêu cầu tránh sự tạp nhiễm: là đảm bảo vô trùng tốt ở nơi làm việc, môi
trường dụng cụ phải được tiệt trùng, cất giữ và sắp xếp hợp lý. Sử dụng kháng
sinh cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy mô để tránh tạp nhiễm.
2.2. Virus viêm gan vịt
2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus
Virus viêm gan vịt (DHV – Duck Hepatitis Virus) là một ARN virus rất nhỏ,
xuyên qua được màng lọc Beckfeld và Seitz (Levine và Fabricant, 1950); Theo
Reuss (1959) dưới kính hiển vi điện tử virus là những hạt tròn bề mặt xù xì,
không có vỏ bọc, kích thước từ 20 – 40nm, có 32 capxome.
Có 3 type khác nhau: Virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1), 2 và 3. Các type 2
và 3 được công nhận tồn tại riêng biệt và nó gây bệnh cho vịt con đã miễn dịch

với type 1 (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002).
Virus viêm gan vịt type 1: là một ARN virus không vỏ bao được xếp loại là
một Picornavirus, có kích thước khoảng 20-40nm. Richter et al. quan sát
mảnh gan dưới kính hiển vi điện tử khoảng 30nm (Woolcock và Fabricant,
1997).
Virus không gây ngưng kết hồng cầu gà, vịt, cừu, ngựa, chuột, rắn, heo
(Nguyễn Đức Hiền, 2012).
8

Virus viêm gan vịt type 2: là một Astrovirus và có đường kính khoảng 28-
30nm khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Theo Tauraso et al. đã nhận định
virus có kích thước dưới 50nm.
Virus viêm gan vịt type 2 cũng được so sánh với Atrovirus phân lập từ gà và
gà tây bởi những nghiên cứu sự lây nhiễm và bảo vệ chéo cho thấy sự khác
biệt kháng nguyên rõ ràng (Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Virus viêm gan vịt type 3: chứa ARN, có đường kính 30nm, virus được phân
loại là Picornavirus nhưng không liên quan đến type 1 vì không có kháng
nguyên chung qua kiểm tra bằng kỹ thuật trung hòa virus và kháng thể quỳnh
quang (Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Virus kháng với chlorofrorm và pH = 3, nhưng cảm nhiễm khi nhiệt độ đến
50
0
C khi có mặt của MgCl
2
1M (Woolcock và Fabricant, 1997).
2.2.2. Sức đề kháng của virus viêm gan vịt type 1
Virus viêm gan vịt có sức đề kháng cao, không bị bất hoạt khi xử lý bằng ether
hoặc fluorocarbon, chlorofrorm, trypsin và 30% methanol hoặc ammonium
sulfate (Woolcock và Faricant, 1997).
Virus có thể tồn tại ở pH = 3 đến 9 giờ. DHV tương đối ổn định ở nhiệt độ

dưới 40 – 45
0
C nhưng dể bị bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn (Davis, 1987). Với
nhiệt độ: Ở 50
0
C virus chết sau 1 giờ, 60
0
C chịu được 30 phút. Ở 37
0
C virus
tồn tại 48 giờ, 4
0
C trong 2 năm và -20
0
C có thể tồn tại tới 9 năm.
Trong chuồng trại ẩm ướt, trong phân vịt, virus có thể tồn tại 10 tuần. Các chất
sát trùng phải pha ở nồng độ cao và xử lý trong thời gian dài mới tiêu diệt
được virus (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007).
2.2.3. Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1
Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hóa, đường hô hấp hoặc
qua vết thương rồi vào máu. Virus theo máu đến các phủ tạng và tập trung
nhiều nhất ở gan. Dưới tác động của virus, quá trình trao đổi chất ở gan bị rối
loạn, lượng glycogen ở gan giảm thấp, lượng lipit tăng do quá trình chuyển
quá mỡ bị đình trệ. Bởi vậy, vịt con mắc bệnh bị thiếu năng lượng và sức đề
kháng bị giảm sút. Virus phát triển trong gan, trực tiếp phá hoại tế bào gan và
các tế bào nội mô huyết quản gây nên xuất huyết đặc hiệu. Virus nhân lên
trong gan, tại các tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kupffer, hình
thành các thể bao hàm đặc trưng. Tổ chức gan bị phá hoại, gan không giải độc
được và con vật bị chết do bị ngộ độc (Phạm Sỹ Lăng và ctv, 2005).
9

2.2.4. Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1
Nuôi cấy trên phôi trứng
Trên phôi vịt: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10-14
ngày tuổi, 24 – 72 giờ sau khi gây nhiễm phôi chết với bệnh tích: phôi còi cọc,
xuất huyết dưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có
màu đỏ hoặc hơi vàng, có thể có điểm hoại tử. Ở những phôi chết muộn nước
xoang niệu mô có màu xanh nhạt, bệnh tích rõ hơn.
Trên phôi gà: Tiêm virus vào xoang niệu mô của phôi gà 9-10 ngày tuổi. Ở lần
cấy chuyển virus đầu tiên, sau khi gây nhiễm 5-6 ngày cho tỷ lệ phôi chết 10-
60%, phôi có bệnh tích còi cọc, phù phôi, xuất huyết dưới da (Levine và
Fabricant, 1950).
Nuôi cấy trên môi trường tổ chức tế bào
Nuôi cấy virus trên tổ chức tế bào là một thành tựu lớn trong ngành virus học.
Phương pháp này là lấy một nhóm tế bào của người, hoặc động vật thích hợp,
các tế bào sẽ sống và đang phân cắt. Nếu cứ sau một thời gian lại rửa và thêm
dung dịch dinh dưỡng mới thì tế bào sẽ phân cắt không ngừng và người ta
dùng tế bào đó để nuôi cấy virus (Phạm Văn Kim, 2000).
Muốn có tế bào lớp đơn để nuôi cấy trước hết phải dùng trypsin phá vở mô
liên kết gắn giữa các tế bào và tách chúng ra thành các tế bào riêng lẻ. Sau đó
ly tâm với dung dịch muối đệm để loại trypsin, rồi đổ môi trường dinh dưỡng
vào để nuôi tế bào. Đem ủ ở nhiệt độ 37
0
C, sau từ 3-7 ngày các tế bào sẽ mọc
và dính chặt vào đáy bình và tạo thành một lớp tế bào.
Tùy thuộc vào từng loại virus, số lượng virus được cấy và loại virus tế bào
nuôi cấy mà thời gian nhân lên của virus có khác nhau, nói chung là 2-10
ngày. Có thể dùng kính hiển vi quan sát các bệnh tích tế bào (CPE) do virus
gây ra để phát hiện sự nhân lên của virus trong tế bào (Phạm Văn Ty, 2005).
Có thể nuôi cấy DHV trên môi trường tế bào xơ phôi gà, xơ phôi vịt và thận

phôi vịt. Virus gây bệnh tích tế bào, thể hiện ở một số điểm: nhân tế bào co
tròn, nguyên sinh chất đông đặc, tế bào tan vỡ hoàn toàn (Nguyễn Bá Hiên và
Nguyễn Minh Tâm, 2007).
Nuôi cấy trên động vật cảm thụ
Ngày nay tùy từng loại virus mà người ta chọn các động vật thích hợp để nuôi
cấy virus. Tùy thuộc vào tính chất gây bệnh của virus và mục đích nghiên cứu
mà ta lựa chọn đường tiêm vào cơ quan của con vật cho thích hợp (Nguyễn
Văn Kim, 2000).
10

Đối với virus viêm gan vịt có thể nhân lên tốt trên cơ thể vịt 6 - 7 ngày tuổi.
Tiêm vịt con ở lứa tuổi này sẽ phát ra giống như bệnh có trong tự nhiên
(Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007).
2.2.5. Nuôi cấy tế bào phôi vịt
Theo Maiboroda (1972), sự xuất hiện CPE đầu tiên là các tế bào co tròn sau 8
giờ gây nhiễm DHV-1.
Trên tế bào xơ phôi vịt và thận phôi vịt khi gây nhiễm DHV sự thay đổi bệnh
lý cũng được quan sát bởi Hwang (1965; 1966). Các bệnh tích đặc trưng bởi
sự thoái hóa và hoại tử của tế bào lớp đơn. Các bệnh lý thường thấy rõ từ 24
đến 36 giờ sau khi gây nhiễm (Fitzgerald el al., 1963).
Theo Hwang (1966), tế bào gan được lấy từ phôi vịt 20 ngày tuổi và mật độ
nuôi cấy là 5.10
5
tế bào/ml. Sự nhân giống DHV trên nuôi cấy tế bào thận phôi
vịt đã được kiểm tra trong một nghiên cứu cho phù hợp trong hệ thống in
vitro, trong đó DHV cho hiệu giá cao kèm với thay đổi bệnh lý tế bào quan sát
được trong chuẩn độ virus và kháng huyết thanh. Theo Woolcock (1989), khi
gây nhiễm trên tế bào gan phôi vịt xảy ra các bệnh tích tế bào co tròn và hoại
tử.
11

Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm
3.1.1. Thời gian
Từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2. Vật liệu và hóa chất
3.2.1. Đối thƣợng thí nghiệm
Trứng vịt có phôi 16 – 20 ngày tuổi (từ đàn vịt không tiêm vaccine viêm gan
vịt và được xác định không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt).
Nguồn virus viêm gan vịt type 1 phân lập từ tỉnh Kiên Giang (chủng virus này
được định type 1 tại Viện Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ).
Huyết thanh miễn dịch kháng virus viêm gan vịt type 1 (thu được từ vịt gây
nhiễm nhưng không chết).
Huyết thanh điều tra (thu từ các đàn vịt trên địa bàn tỉnh Trà Vinh).
Huyết thanh âm tính (Navetco).
3.2.2. Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ
Kéo lớn, kéo nhỏ, kẹp
Phểu lọc thủy tinh, vải gạc
Đĩa petri đường kính 9-10cm
Becher nhỏ 20-50ml, 250ml
Ống đong các loại
Ống ly tâm falcon loại 15ml
Lame và lamelle, các tube nhỏ (Eppendorf)
Đầu lọc 0,22µm, 0,45µm (Milipore filter)
Ống nghiệm, cá từ
Pipette 1ml, 2ml, 5ml, pipetteman, micropipette, pipette-aid

12

Đầu cone 100µl, 1ml
Đĩa nuôi cấy microplate 96 giếng (Nunc A/S, Denmark)
Buồng đếm Neubauer (Haematocytometer, Marienfeld, Germany)
Thiết bị
Máy ảnh kỹ thuật số SONY
Máy ấp trứng (Dengenkiki Co., Ltd)
Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd)
Water bath (As One, Japan)
Cân phân tích (Sartorius AG, Germany)
Máy hấp autoclave (Sturdy Industrial Co., Ltd)
Tủ sấy (Memmert GmbH + Co.KG)
Tủ lạnh -20
0
C, -80
0
C, 4
0
C
Kính hiển vi soi ngược (Inverted microcope, OLYMPUS Tokyo, Japan)
Máy ly tâm lạnh (Hermle Labortechnik GmbH)
Máy khuấy từ (Corning stirrer)
3.2.3. Các hóa chất và môi trƣờng
Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý
Trypsine (Difco, USA)
EDTA (Dojindo Co., Ltd)
Đệm DPBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)
Trypan blue (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)
Neutral red (Division of the Matheson Company, Inc.)

Crystal violet (Kanto Chemical Co,. Inc.)
Formalin
Môi trường MEM (Gibco BRL., Grand Land, NY, USA)
Penicillin và Streptomycin (Invitrogen, UK)
Kháng nấm Amphotericin-B (Sigma)
Glutamine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)
HEPES 1M
13

NaHCO
3
7%
Môi trường tăng trưởng: môi trường EMEM + 10%FBS + Glutamine 3% +
HEPES 1M + NaHCO
3
7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin
+ Amphotericin-B 2,5µg/ml.
Môi trường duy trì: môi trường EMEM + 5% FBS + Glutamine 3% + HEPES
1M + NaHCO
3
7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin +
Amphotericin-B 2,5µg/ml.
Môi trường pha loãng virus: EMEM + Glutamine 3% + HEPES 1M +
NaHCO
3
7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin +
Amphotericin-B 2,5µg/ml.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Chuẩn độ và xác định chỉ số TCID
50

trên tế bào DEF.
So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp.
Xác định hiệu giá kháng thể kháng DHV-1 qua phản ứng vi trung hòa trên môi
trường tế bào.
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy
Nguyên tắc: Dựa trên đặc tính gây bệnh tích của virus cho tế bào, chuẩn độ
virus được xác định qua chỉ số TCID
50
/0,1ml, là sự pha loãng virus tới nồng
độ thấp nhất tạo bệnh tích cho 50% giếng tế bào nuôi cấy trong môi trường.
Quy trình chuẩn độ virus được thực hiện qua 3 bước:
- Thu nhận virus từ huyễn dịch bệnh phẩm (phụ chương 1.3).
- Hoạt hóa, nhân số lượng virus qua cấy truyền virus 3-5 lần trên tế bào DEF
(phụ chương 1.4).
- Chuẩn độ virus (phụ chương 1.5).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên 2 đĩa 96 giếng. Virus viêm
gan vịt type 1 được pha loãng theo log10 từ 10
-1
đến 10
-8
. Mỗi độ pha loãng
được lặp lại 24 lần trên 24 giếng tế bào.

14

Hình 3.1. Bố trí thí nghiệm chuẩn độ virus
Với 2 độ pha loãng cho tỷ lệ trên 50% và dưới 50% giếng DEF, ta tiến hành
xác định chỉ số TCID
50
/ml theo phương pháp Reed và Muench (1938):
Khoảng cách tỷ lệ PD (Proportional distance) (khoảng cách tỷ lệ giữa 2 độ pha
loãng cho tỷ lệ xuất hiện CPE>50% và tỷ lệ xuất hiện CPE<50%)

PD =

lg TCID
50
/0,1ml = lg CPE<50% + PD
3.4.2. So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của DHV-1 gây bệnh tích trên ba loại tế bào qua
thời gian và mật độ CPE trên từng loại tế bào. Tế bào nào có mật độ CPE cao
thì tính thích ứng của DHV-1 đối với tế bào đó cao.
3.4.2.1. Phương pháp nhuộm bằng neutral red
- Dùng micropipette hút bỏ môi trường duy trì trong các giếng chứa tế bào đã
nhiễm virus viêm gan vịt và cho biểu hiện bệnh lý tế bào ổn định.
- Rửa tế bào có virus bằng đệm DPBS (đĩa 96 giếng: 100µl).
- Rút đệm ra, cho vào 0,4ml dung dịch neutral red (32µg/ml) 1:2000 ở các

giếng.
- Ủ đĩa mocroplate 2 giờ trong tủ ấm CO
2
(37
0
C, 5%CO
2
).
- Đem đĩa đã ủ và rửa 2 lần với nước muối 0,85%.
- Úp ngược đĩa để khô và quan sát kết quả (Finter, 1969).