phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lò giết mổ gia cầm ở tỉnh vĩnh long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC






PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN
TỪ CHẤT THẢI LÒ GIẾT MỔ GIA CẦM
Ở TỈNH VĨNH LONG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN VĂN CƯỜNG
MSSV: 3102805
LỚP: CNSH K36



Cần Thơ, Tháng 11/2013
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN
TỪ CHẤT THẢI LÒ GIẾT MỔ GIA CẦM
Ở TỈNH VĨNH LONG









CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN VĂN CƯỜNG
MSSV: 3102805
LỚP: CNSH K36



Cần Thơ, Tháng 11/2013


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN



Ts. Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Văn Cường



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 201
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG





Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh

đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Xin chân thành
cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền
đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, bổ sung
kiến thức và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp này.
Xin gửi lời chân thành cảm ơn đến các Thầy cô, cán bộ của Viện và các anh chị
cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Phòng thí nghiệm Hóa sinh Thực
phẩm - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài.
Xin cảm ơn ba mẹ, anh chị và tất cả các bạn lớp công nghệ sinh học khóa 36,
cùng các em lớp công nghệ sinh học khóa 37 đã động viên, khuyến khích, hỗ trợ tôi
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin chân thành cám ơn!

Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 20113



Nguyễn Văn Cường

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
i

TÓM LƯỢC
Keratin là thành phần cấu tạo chính của lông gia súc, gia cầm. Đây là hợp chất
rất khó bị phân giải trong tự nhiên và được thải ra với khối lượng lớn từ ngành chăn
nuôi và chế biến gia cầm. Sự phân giải các chất thải chứa keratin này có ý nghĩa thiết
thực trong ngành công nghiệp, nông nghiệp như chế biến thức ăn gia súc, gia cầm và
sản xuất phân bón. Do đó, việc phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân giải
keratin mạnh là rất cần thiết và để góp phần cải thiện môi trường bị ô nhiễm từ nguồn
chất thải này. Từ tám mẫu đất, nước và lông thu tại các lò giết mổ gia cầm đã phân
lập được 39 dòng vi khuẩn. Trong đó, 20/39 dòng có khuẩn lạc không đều, 19/39 dòng
có khuẩn lạc tròn. Các khuẩn lạc các dòng vi khuẩn chủ yếu có màu trắng đục chiếm
58,97%, trắng trong chiếm 25,64%, màu vàng chiếm 12,82% và 2,56% màu hồng
nhạt. Kết quả khảo sát cho thấy cả 39 dòng đều có khả năng phân giải lông gia súc,
gia cầm và thể hiện hoạt tính keratinase từ 0,5 đến 16,67 U/ml. Tất cả các dòng vi
khuẩn đều có khả năng làm giảm khối lượng bột lông gia cầm trong môi trường lỏng
từ 20,87 đến 67,23%; và 18,19 đến 26,90% khối lượng bột lông gia súc trong môi
trường lỏng sau bảy ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30
o
C. Trong đó, hai dòng Kc10 và Kc32
được tuyển chọn đều mang đặc tính Gram âm và có hình dạng tế bào lần lượt là hình
que và hình cầu.

Từ khóa: Keratin, keratinase, lông gia súc, lông gia cầm, vi khuẩn phân giải
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
ii

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
CẢM TẠ
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
CÁC TỪ VIẾT TẮT vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Tổng quan về keratin và chất thải lông gia cầm 2
2.1.1. Keratin 2
2.1.2. Chất thải lông gia cầm 2
2.2. Tổng quan về enzyme keratinase 3
2.3. Vi sinh vật phân giải lông gia súc - gia cầm 4
2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân giải keratin 6
2.4.1. Một số nghiên cứu trong nước 6
2.4.2. Một số nghiên cứu ngoài nước 7
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1. Phương tiện nghiên cứu 12
3.3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 12
3.1.2. Vật liệu 12
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ 12

3.1.4. Hóa chất 12
3.1.5. Môi trường 12
3.2. Phương pháp nghiên cứu 13

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
iii

3.2.1. Thu và xử lý mẫu 13
3.2.2. Phân lập các dòng vi khuẩn 13
3.2.3. Đánh giá hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn 13
3.2.4. Đánh giá khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn 16
3.2.5. Đánh giá khả năng phân giải bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn 17
3.2.6. Quan sát hình dạng của tế bào vi khuẩn 17
3.2.7. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 17
3.2.8. Xử lý số liệu 18
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
4.1. Kết quả phân lập và đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn 19
4.2. Hoạt tính Keratinase của các dòng vi khuẩn 22
4.3. Khả năng phân giải bột lông gia cầm (lông gà, vịt) của các dòng vi khuẩn 24
4.4. Khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn 26
4.5. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin cao 29
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30
5.1. Kết luận 30
5.2. Đề nghị 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các hình ảnh thí nghiệm
Hình 8. Một số thiết bị sử dụng thực hiện đề tài
Hình 9. Lông gia cầm nguyên (a) và bột lông đã sây nhuyễn (b)

Hình 10. Một số hình ảnh thí nghiệm
Phụ lục 2. Số liệu thí nghiệm
Phụ lục 3. Kết quả phân tích thống kê
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
iv

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã được phân lập 20
Bảng 2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 21
Bảng 3. Mật số vi khuẩn sau 48 giờ nuôi lắc ở 30
o
C (chuẩn bị cho các thí nghiệm)
Bảng 4. Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn phân lập được
Bảng 5. Khả năng phân giải bột lông gia cầm (lông gà, vịt) của các dòng vi khuẩn
phân lập được
Bảng 6. Khả năng phân giải bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn phân
lập được
Bảng 7. Phân tích thống kê hoạt tính keratinase của 39 dòng vi khuẩn phân lập được
trên cơ chất Azo-keratin
Bảng 8. Phân tích thống kê khả năng phân giải bột lông gà của 39 dòng vi khuẩn phân
lập được
Bảng 9. Phân tích thống kê khả năng phân giải bột lông heo của 39 dòng vi khuẩn
phân lập được

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
v

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. α – keratin và β – keratin 2
Hình 2. Vi khuẩn Bacillus subtilis 5
Hình 3. Vi khuẩn phân lập được phát triển trên môi trường bột lông gia cầm 19
Hình 4. Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn 23
Hình 5. Khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn 25
Hình 6. Khả năng phân giải bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn 26
Hình 7. Khả năng phân giải bột lông gia cầm và bột lông gia súc của các dòng vi
khuẩn 28
Hình 8. Hoạt tính keratinase và khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi
khuẩn 28
Hình 9. Vi khuẩn Gram âm phân lập được 29

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT

B. Bacillus
CFU Colony Forming Unit
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FMA Feather meal agar
rpm Rotation per minute
w/v Weight/volume

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
1

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Dân số thế giới ngày càng gia tăng, để đáp ứng nhu cầu về thực phẩm của con
người, ngành chăn nuôi thế giới đã phát triển rất nhanh và đạt được nhiều thành tựu
đáng kể. Tuy nhiên, bên cạnh việc sản xuất và cung cấp một lượng lớn sản phẩm quan
trọng cho nhu cầu của con người, ngành chăn nuôi cũng đã gây nên nhiều hiện tượng

tiêu cực về môi trường. Một lượng lớn lông gia súc gia cầm hầu như được thải trực
tiếp ra môi trường sau khi giết mổ. Đây là một loại chất thải có hơn 90% là protein,
chủ yếu là keratin. Tuy nhiên, trong tự nhiên có một số vi sinh vật có khả năng phân
giải lông gia súc gia cầm hiệu quả nhờ hoạt tính keratinase.
Vì vậy, việc sử dụng các loài vi sinh vật này để chế biến chất thải lông gia cầm
thành những sản phẩm có giá trị cao là một giải pháp ưu thế, có thể ứng dụng biện
pháp sinh học sử dụng vi khuẩn để chế biến lông gia cầm làm thành phần bổ sung
trong thức ăn gia súc đạt được ba ưu thế quan trọng là không gây hại cho môi trường,
nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm protein và hiệu quả về kinh tế hơn so với
các phương pháp vật lý và hóa học. Do đó, việc phân lập và tuyển chọn các dòng vi
khuẩn có khả năng phân giải lông gia cầm để chế biến nguồn chất thải này sẽ tạo ra
những sản phẩm có giá trị cao, đồng thời góp phần giải quyết hiệu quả bài toán xử lý
môi trường với giá thành thấp.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin từ một số lò giết mổ
gia cầm ở tỉnh Vĩnh Long.
Đánh giá khả năng phân giải lông gia súc gia cầm của các dòng vi khuẩn phân lập
được để chọn ra dòng vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh các chất thải chứa keratin.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về keratin và chất thải lông gia cầm
2.1.1. Keratin
Keratin là protein cấu trúc dạng sợi, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên biểu bì,
tóc, móng, lông, sừng… Cấu trúc cơ bản bậc hai của keratin được phân thành hai dạng
α-helix (ở tóc) và β-sheets (ở lông vũ). Các sợi keratin ở cả hai dạng α-helix và β-sheet
xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Akhtar và Edwards,

1997). Keratin cũng được phân loại thành keratin cứng và mềm dựa vào hàm lượng
lưu huỳnh. Keratin cứng được tìm thấy ở các phần phụ như lông vũ, tóc, móng
guốc,… với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài. Trong khi đó,
keratin mềm ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mềm dẻo hơn
(Voet và Voet, 1995). Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ liên kết hydro, tương tác kỵ nước
và các cầu nối disulfide tạo nên cấu trúc bền vững của keratin và kháng lại sự phân
giải bởi các protease thông thường như trypsin, pepsin hay papain. Tuy nhiên, một số
loài vi khuẩn vẫn có khả năng phân giải keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính của enzyme
keratinase (Onifade et al., 1998).









Hình 1: α – keratin và β – keratin
(Nguồn: Trân Tố và Cù Thị Thúy Nga, 2008)
2.1.2. Chất thải lông gia cầm
Các chất thải giàu keratin khó phân giải và ngày càng tích lũy trong tự nhiên,
chủ yếu ở dạng lông vũ và tóc, góp phần gây ra vấn đề ô nhiễm môi trường (Gupta và
Ramnani, 2006). Tuy nhiên, sự phân giải các chất thải chứa keratin vẫn mang lại
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3

những lợi ích thiết thực trong ngành công - nông nghiệp như chế biến thức ăn thủy
sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón.

Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông gia cầm, trong đó chủ yếu là β-
keratin. Mỗi năm trên thế giới có khoảng hàng tỷ tấn lông gia cầm được thải ra từ
ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm, gây ra vấn đề môi trường đồng thời làm lãng phí
nguồn protein (Gousterova et al., 2005). Với thành phần chủ yếu là keratin khá tinh
khiết đồng thời được thải ra với một số lượng lớn, chất thải lông gia cầm là nguồn
nguyên liệu thay thế tiềm năng cho các thành phần dinh dưỡng đắt tiền trong thức ăn
gia súc. Tuy nhiên, việc sản xuất lông gia cầm làm thành phần bổ sung trong thức ăn
gia súc chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản xuất theo phương pháp vật lý và
hóa học còn nhiều hạn chế. Không những tiêu tốn nhiều năng lượng và không thân
thiện với môi trường, quy trình sản xuất này phá hủy một số acid amin, làm cho sản
phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons, 1997).
2.2. Tổng quan về enzyme keratinase
Các enzyme phân giải protein là một trong những nhóm enzyme thương mại
quan trọng được ứng dụng nhiều trong các quy trình công nghiệp, chế biến thực phẩm
hay công nghệ thuộc da (Gupta et al., 2002). Keratinase thuộc họ protease có khả năng
phân giải cơ chất keratin không tan. Keratinase chủ yếu là enzyme ngoại bào, được tạo
ra khi có sự hiện diện của cơ chất keratin. Đến nay cơ chế phân giải sinh học keratin
vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ. Theo Gupta và Ramnani (2006), cơ chế phân giải
keratin liên quan đến hoạt động phối hợp của hệ thống phân giải protein (proteolytic)
và phân giải sunfit (sulfitolytic). Sự phá hủy các cầu nối disulfide được xem là yếu tố
quan trọng trong sự phân giải keratin (Böckle và Müller, 1997). Hầu hết các keratinase
được mô tả đến nay đều thuộc loại serine protease và chỉ có một vài metalloprotease
cho thấy có hoạt tính phân giải keratin. Các metalloprotease này thường được thấy ở
các vi khuẩn Gram âm (Brandelli, 2007).
Một số loài nấm và vi khuẩn phân lập từ đất chôn chất thải giàu keratin cho
thấy khả năng tổng hợp keratinase (Riffel và Brandelli, 2006). Keratinases sản xuất
bởi Microsporum, Trychophyton và Microsporum Doratomyces đã được mô tả
(Kushwaha, 1983; Grzywnowicz et al., 1989; Gradisar et al., 2000). Việc sản xuất
keratinase từ chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus cũng đã được nghiên
cứu (Santos et al., 1996). Keratinase từ vi khuẩn có ứng dụng quan trọng trong các quy

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
4

trình sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành chăn nuôi và chế biến
gia cầm. Keratin lông không hòa tan có thể được chuyển đổi sau khi bị phân giải bằng
keratinase tạo thức ăn gia súc, phân bón, chất keo hay được sử dụng cho sản xuất của
các axit amin hiếm như serine, cysteine, và proline (Onifade et al., 1998; Gupta and
Ramnani, 2006).
Trong tự nhiên, hoạt tính phân giải keratin khá phổ biến trong giới vi sinh vật.
Tuy nhiên, chỉ một số keratinase đạt được mục đích sử dụng thương mại. Keratinase
tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là vi khuẩn Bacillus licheniformis và
Bacillus subtilis đã được quan tâm nghiên cứu do hoạt tính phân giải lông gia cầm hiệu
quả. Keratinase từ Bacillus licheniformis PWD1 là keratinase thương mại đầu tiên từ
vi khuẩn được phát triển bởi Shih và cộng sự ở BRI (North Carolina) (Manczinger et
al., 2003; Thys et al., 2004).
2.3. Vi sinh vật phân giải lông gia súc - gia cầm
Một số loài nấm, actinomycetes, và vi khuẩn phân lập từ đất chôn chất thải giàu
keratin cho thấy có khả năng tổng hợp keratinase và phân giải lông gia cầm (Riffel và
Brandelli, 2006). Khả năng phân giải lông gia cầm nhờ enzyme keratinase từ một số
chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus đã được nghiên cứu (Santos et al.,
1996). Các dòng vi khuẩn chủ yếu thuộc chi Bacillus và Streptomyces có khả năng
phân giải lông gia cầm cũng đã được phân lập từ mẫu đất và lông gia cầm ở các cơ sở
chế biến gia cầm (Onifade et al., 1998).
Một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia cầm đã được phân lập từ
mẫu đất và lông gia cầm ở các cơ sở chế biến gia cầm. Các dòng vi khuẩn này chủ yếu
thuộc chi Bacillus và Streptomyces (Onifade et al., 1998).
Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham
gia tích cực vào sự phân giải vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme
ngoại bào. Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ

khí không bắt buộc và hình thành nội bào tử. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc
chi Bacillus rất đa dạng; khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám. Trong số các
chủng Bacillus sp., Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis được mô tả có khả năng
phân giải keratin tốt (Balaji et al., 2008; Manczinger et al., 2003). Gen kerA của
Bacillus licheniformis đã được nhân dòng và giải mã trình tự (Lin et al., 1995). Ngoài
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
5

ra, các chủng như Bacillus pumilus và Bacillus cereus cũng có khả năng tổng hợp
keratinase (Ghosh et al., 2008; Kumar et al., 2008).
Một số dòng Streptomyces chịu nhiệt (thermophylic) được phân lập từ đất có
thể phát triển và phân giải keratin ở nhiệt độ trên 50
o
C (Mohamedin, 1999). Ngoài ra,
một số dòng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) cũng được mô tả cho thấy khả năng phân
giải keratin như Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995) và
Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999). Khả năng phân giải keratin
ở các vi khuẩn Streptomyces có thể liên quan đến việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp
được các protease phổ rộng như pronase, đã được sản xuất thương mại từ vi khuẩn
Streptomyces griseus (Jurasek et al., 1974). Bên cạnh đó, Streptomyces pactum có thể
làm giảm lượng cầu nối disulfide khi phát triển trên cơ chất lông gia cầm (Böckle và
Müller, 1997) cho thấy loài vi khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide reductase để
phục vụ sự phân giải keratin.
Mặc dù các dòng vi khuẩn phân giải lông gia cầm được phân lập chủ yếu thuộc
chi Strepomyces và Bacillus, kết quả của một số nghiên cứu cho thấy các dòng vi
khuẩn này đa dạng hơn. Trong số các vi khuẩn Gram dương, một số dòng vi khuẩn
mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được nhận diện là Arthrobacter sp.
(Lucas et al., 2003), Microbacterium sp. (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal
et al., 2006).

Hình 2: Vi khuẩn Bacillus subtilis
(Nguồn: ngày 09/07/2013)

Hoạt tính keratinase còn được biểu hiện ở một số loài vi khuẩn chịu nhiệt như
Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996),
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
6

Thermoanaerobacter keratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001) và các dòng vi
khuẩn ưa kiềm như Nesternkonia sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis
sp. TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004). Những dòng vi khuẩn chịu nhiệt hứa hẹn khả năng
phân giải các protein không tan trong nước như keratin vì những protein này dễ phân
giải hơn ở nhiệt độ cao (Suzuki et al., 2006). Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis
2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực
cũng cho thấy khả năng tổng hợp keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải
lông cừu (Gushterova et al., 2005).
Các vi khuẩn Gram âm cũng được báo cáo cho thấy có khả năng phân giải
protein nhưng tài liệu còn khá hạn chế và hoạt động phân giải lông gia cầm được mô tả
chủ yếu ở các loài Chryseobacterium sp. (Riffel và Brandelli, 2002), Vibrio sp.
(Sangali và Brandelli, 2000) và Xanthomonas maltophilia (De Toni et al., 2002). Các
loài vi khuẩn thuộc chi Chryseobacterium là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, phân
bố rộng trong tự nhiên chủ yếu trong môi trường đất và nước. Đây là những vi khuẩn

hình que, không di động và tạo ra khuẩn lạc với sắc tố vàng đến cam đặc trưng
(Calderón et al., 2011).
2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân giải keratin
2.4.1. Một số nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đã được phân
lập từ đất và lông tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông gia cầm.
Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) đã tiến hành phân lập được từ
đất bảy chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có hoạt tính phân giải casein rõ rệt.
Trong đó năm chủng xạ khuẩn và hai chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà
mạnh mẽ.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn
Bacillus, Chryseobacterium,… từ một số vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam.
Điều kiện thích hợp cho các chủng vi khuẩn này phát triển là ở 30
o
C đến 40
o
C trên
môi trường có bổ sung bột lông vũ và khả năng phân giải lông vũ đạt từ 75% đến 90%
sau một tuần nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn đã được phân loại định danh bằng các
nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh kit API 50CHB, API 20NE và trình tự gen mã
hóa 16S rRNA. Kết quả định danh của bốn dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
7

vũ mạnh nhất cho thấy các dòng này lần lượt tương đồng với vi khuẩn Bacillus
subtilis, Bacillus megaterium và Chryseobacterium spp.
Bùi Thị Minh Diệu et al. (2012) đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn, kết quả đánh
giá khả năng phân giải lông gà cho thấy 21 dòng vi khuẩn đã làm giảm khối lượng bột
lông gà từ 24,43% đến 58,13% sau một tuần lắc ủ ở 37

o
C. Ngoài ra các dòng vi khuẩn
có khả năng làm gãy rụng các sợi lông con trên sợi lông gà lớn sau 10 ngày lắc ủ.
Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng phân giải lông gà hiệu
quả nhất. Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng với dòng
Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15 tương
đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91 với độ tương đồng 99%.
2.4.2. Một số nghiên cứu ngoài nước
Có rất nhiều dòng vi khuẩn phân giải lông gia cầm được phân lập từ đất và nước
thải. Trong đó, Bacillus licheniformis PWD1 (Williams et al., 1990; Lin et al., 1995),
Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996), Kocuria rosea LBP-
3 (Vidal et al., 2000; Bernal et al., 2006), Bacillus subtilis KS1 (Kim et al., 2001; Suh
và Lee, 2001), Bacillus licheniformis K-508 (Rozs et al., 2001; Manczinger et al.,
2003), Xanthomonas maltophila POA-1 (De Toni et al., 2002), Chryseobacterium sp.
kr6 (Riffel et al., 2003), Bacillus licheniformis RG1 (Ramnani và Gupta, 2004),
Microbacterium arborescens kr10 (Thys et al., 2004), Bacillus licheniformis, Bacillus
subtilis ATCC 6633 (Zerdani et al., 2004).
Sangli và Brandelli (2000) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn từ rác thải
chứa chủ yếu là keratin ở Brazil. Trong số đó thì kr2 là dòng có khả năng phân giải
cao nhất khi phát triển trên môi trường chứa 10g/l lông gia cầm (là nguồn năng lượng,
cacbon, nitơ duy nhất). Nhiệt độ tối ưu để nuôi vi khuẩn là 30
o
C và nhiệt độ tối ưu cho
enzyme hoạt động là 55
o
C, pH = 8. Dòng kr2 được xác định là thuộc họ Vibrionaceae.
Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về enzyme keratinase từ vi
khuẩn và ứng dụng của enzyme này. Trong đó, enzyme keratinase chỉ được sinh ra khi
có sự hiện diện của cơ chất là keratin như lông, tóc, móng,… Cơ chế phản ứng phân
giải keatin phức tạp gồm sự kết hợp giữa phản ứng cắt các cầu nối disulfide và thủy

phân protein. Keratinase thuộc loại serine proteinase. Keratine được ứng dụng chế biến
thức ăn gia súc, phân bón, làm sạch và giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
8

Đồng thời, Gupta và Ramnani (2006) cũng đã tổng hợp các đặc điểm của các
dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin được phân lập từ các bài nghiên cứu
trước đó. Kết quả cho thấy, các dòng vi khuẩn phân giải keratin có dòng Gram âm và
có dòng Gram dương. Các dòng vi khuẩn Gram dương đã được phân lập phần lớn
thuộc chi Bacillus: Bacillus licheniformis PWD-1 (Williams et al., 1990), Bacillus
subtilis S14 (Macedo et al., 2005), Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, và
Bacillus cereus (Kim et al., 2001), hoặc chi Streptomyces như: Streptomyces flavus
(Antarctic et al., 2005), Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995),
Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999), Streptomyces
thermoviolaceus (Chitte et al., 1999) và một vài trường hợp khác là các dòng
Fervidobacterium pennavoran (Friedrich và Antranikian, 1996), Microbacterium sp.
kr10 (Thys et al., 2004), Terrabacter terrae (Barrientos et al., 2005) và Kocuria rosea
(Bernal et al., 2006). Các dòng Gram âm chủ yếu thuộc các chi Vibrio (Sangali và
Brandelli, 2000) và chi Chryseobacterium (Riffel et al., 2003)…
Joshi et al. (2007) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. PW-1 có khả
năng phân giải lông vũ từ chất thải gia cầm. Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi
trường cơ bản với lông vũ đóng vai trò là nguồn carbon, nitơ và lưu huỳnh. Theo kết
quả nghiên cứu của Agrahari và Wadhwa (2010), ba dòng vi khuẩn Bacillus
megaterium SN1, Bacillus thuringenesis SN2 và Bacillus pumilus SN3 phân lập từ bãi
đất chôn lông gia cầm có khả năng phân giải lông gà và lông bồ câu sau 120 giờ nuôi
cấy.
Adriane et al. (2007) đã ứng dụng dòng vi khuẩn Vibrio sp. (kr2) để phân giải
lông gia cầm. Dòng vi khuẩn này đã được phân lập và nhận diện bởi Sangali và
Brandelli (2000). Theo kết quả nghiên cứu, khi cho vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn

lần lượt 40, 60, và 80g/l lông gia cầm đã sấy khô. Sau năm ngày thu được một lượng
protein hòa tan, giá trị cao nhất là 2,5 g/l. Nhiệt độ tối ưu để đạt được lượng protein đó
là 30
o
C và pH khoảng 6 - 8. Dòng vi khuẩn Kr2 có hiệu quả phân giải keratin trong
lông gia cầm, bổ sung nguồn protein cho thức ăn gia súc, làm phân hữu cơ, giảm ô
nhiễm môi trường. Veslava et al. (2009) đã chọn ra các dòng vi khuẩn Bacillus
licheniformis 511, B. subtilis 11, B. subtilis 717 và B. subtilis 103 phân lập từ nước
thải tại khu công nghiệp chế biến gia cầm để khảo sát khả năng phân giải lông gia
cầm. Các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường có bổ sung bột lông vũ: NaCl
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
9

(0,5g/l), KH
2
PO
4
(0,4g/l), K
2
HPO
4
(0,3g/l), bột lông vũ (10g/l) và agar (15g/l). Đối với
dòng B. subtilis 103 thì hàm lượng enzyme keratinase tối đa là 152U/ml sau khi nuôi
cấy 24 giờ, trong khi các dòng khác là 148 - 292U/ml sau 48 giờ nuôi cấy.
Daroit et al. (2009) cũng đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. P45 biểu
hiện khả năng phân giải protein trên môi trường sữa không béo và môi trường bột lông
vũ. Dòng Bacillus sp. P45 có khả năng phân giải 90% lông gà sau 72 giờ nuôi cấy
trong môi trường lỏng có bổ sung lông gà. Sự hình thành nhóm thiol cũng được ghi
nhận trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, cho thấy sự đóng góp của quá trình phá

hủy cầu nối disulfide trong sự phân giải keratin lông vũ. Tuy nhiên, dòng vi khuẩn này
không có khả năng phân giải keratin tóc, có thể do sự đa dạng về cấu hình của cơ chất
này so với keratin lông vũ.
Park và Son (2009) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường
đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus megaterium F7-
1. Vi khuẩn này phân giải hoàn toàn lông gà trong vòng bảy ngày. Nhiệt độ 25
o
C -
40
o
C, và pH 7,0 – 11,0 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinase của
dòng vi khuẩn này. Hoạt tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữa không
béo là 468U/ml, cao gấp 9,4 lần so với hoạt tính tạo ra trong môi trường không bổ
sung sữa. Lượng keratinase tạo ra phụ thuộc vào hàm lượng lông vũ.
Daroit et al. (2010) đã khảo sát hoạt tính enzyme của dòng vi khuẩn Bacillus sp.
P45 trên nhiều môi trường cơ chất khác nhau. Dòng vi khuẩn này được Daniel phân
lập tại vùng Amazone. Kết quả cho thấy khi bổ sung bột lông (môi trường feather meal
agar-FMA) làm nguồn chất duy nhất thì ezyme có hoạt tính cao hơn. Và hoạt tính của
enzyme keratinase tăng lên khi bổ sung NH
4
Cl vào môi trường FMA với khối lượng
lần lượt từ 43 - 50g/l và 1,8 - 8,6g/l.
Savitha et al. (2010) đã phân lập hai dòng vi khuẩn phân giải keratin từ đất:
(KI8101 và KI8102) và nhận diện hai dòng này là Bacillus subtilis và B. licheniformis.
Enzyme tinh sạch từ dòng KI8102 có hoạt tính cao (500U/mg), trọng lượng phân tử là
32KDa. Nhiệt độ tối ưu là 50
o
C và pH = 7,5 thì dòng vi khuẩn này có khả năng phân
giải chất thải chứa keratin như tóc, móng, lông gia súc.
Evelise et al. (2010) đã tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn mới được

phân lập từ mẫu đất ở vùng Amazon. Các dòng vi khuẩn này phát triển tốt trên môi
trường FMA (feather meal agar). Các dòng vi khuẩn này được kiểm tra khả năng phân
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
10
giải lông gia cầm và nhận diện bằng đặc điểm sinh hóa. Ngoài ra, chúng còn được định
danh dựa vào trình tự đoạn 16S rRNA. Hầu hết các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus,
ngoài ra còn có Aeromenas, Serratia và Chryseobacterium.
Mazotto et al. (2011) đã phân lập được ba dòng vi khuẩn Bacillus (B. subtilis
LFB-FIOCRUZ 1270, B. subtilis LFB-FIOCRUZ 1273 và B. licheniformis LFB-
FIOCRUZ 1274) từ nguồn chất thải lông gia cầm và tiến hành khảo khả năng tổng hợp
enzyme keratinase khi sử dụng bột lông vũ làm cơ chất. Ba dòng vi khuẩn này sản sinh
ra các enzyme keratinase và peptidase ngoại bào sau bảy ngày. Lông vũ được xác định
là cơ chất tốt nhất cho hoạt động của keratinase và peptidase tạo ra bởi B. subtilis
LFB-FIOCRUZ 1273 và đây cũng là dòng vi khuẩn biểu hiện hoạt động enzyme mạnh
nhất. Cả ba dòng vi khuẩn này có khả năng phân giải bột lông vũ (62% đến 75%) và
lông vũ (40% đến 95%), tạo ra 3,9 đến 4,4mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ
sung bột lông vũ và tạo ra 1,9 đến 3,3mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung
lông vũ.
Một số vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae cũng cho thấy khả năng phân giải
keratin. Sangali và Brandelli (1999) đã phân lập được các vi khuẩn có khả năng phân
giải keratin thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở chế biến gia cầm ở Brazil. Nghiên cứu
cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 30
o
C và cũng tại nhiệt độ
này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại.
Riffel và Brandelli (2006) đã tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ
chất thải lông gia cầm. Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông
vũ được kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa. Trong đó có ba dòng
Gram âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng

Gram dương (Microbacterium sp.). Những vi khuẩn này có thể phát triển trên đa dạng
các chất thải chứa keratin như bột lông vũ, lông vũ thô, móng gà, tóc và len. Hoạt tính
phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểm tra
với hai cơ chất azokeratin và azocasein. Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạt động
trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương với các enzyme phân
giải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường.
Kết quả nhiên cứu của Riffel et al. (2003) cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium
sp. dòng kr6 có khả năng phân giải hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy. Dòng
vi khuẩn này có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30
o
C và pH tối ưu 8,0. Dưới điều
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
11
kiện này, hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa. Nghiên cứu cũng cho thấy
hoạt tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg
2+
, Cu
2+
và được kích hoạt bởi Ca
2+
.


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
12
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian: Từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013.
Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực
vật, Phòng Hóa sinh Thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh
học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Vật liệu
Mẫu nước, mẫu đất và mẫu lông được lấy tại các lò giết mổ ở tỉnh Vĩnh Long
(gồm có 8 mẫu).
Lông gia cầm (bao gồm lông gà và lông vịt được phối trộn theo tỷ lệ 1:1) được
thu từ những địa điểm giết mổ gia cầm ở Thành phố Cần Thơ. Lông gia cầm được rửa
sạch bằng nước máy, phơi dưới ánh nắng mặt trời cho khô, sấy ở 70
o
C đến khi khối
lượng không đổi. Sau đó, lông được nghiền thật mịn, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng
mát cho đến khi sử dụng.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Tủ cấy vi sinh vật Telstar (Tây Ban Nha), tủ ủ vi sinh vật Binder (Mỹ), nồi khử
trùng nhiệt ướt Phinternational (Ý), máy khuấy từ, tủ lạnh -4ºC Sanyo (Nhật Bản), tủ
lạnh -20ºC Electrolux Confor plus, máy lắc mẫu GFL 3005, máy đo OD, pH kế, cân
điện tử Sartorius, lò vi sóng, bộ micropipette Nichipet EX (Nhật Bản),…
Một số dụng cụ khác như đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, đèn
cồn, que cấy, đầu cône (vàng, xanh, trắng), găng tay,
3.1.4. Hóa chất
Hóa chất dùng để phân lập các dòng vi khuẩn: K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4

, NaCl, Yeast
extract, pepton, MgSO
4
, NH
4
Cl,
3.1.5. Môi trường
Thành phần hóa chất môi trường phân lập có bổ sung lông gia cầm (g.l
-1
)
NaCl 0,5; KH
2
PO
4
0,4; K
2
HPO
4
0,3; Bột lông gia cầm 10 (Daniel et al., 2009).
Thành phần hóa chất môi trường tăng sinh khối vi khuẩn có bổ sung lông
gia cầm (g.l
-1
)
NaCl 0,5; KH
2
PO
4
0,4; K
2
HPO

4
0,3; MgSO
4
0,1; Bột lông gia cầm 10 (Veslava
et al., 2009).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
13
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thu và xử lý mẫu
Mẫu lông gà, lông vịt và mẫu đất được thu tại một số cơ sở giết mổ gia cầm ở
tỉnh Vĩnh Long, cho vào bọc nylon đã khử trùng và để ở điều kiện tự nhiên đến khi
tiến hành phân lập.
Lông gà, lông vịt đã hoại mục một phần được thu làm mẫu và mẫu đất được thu ở
lòng đất cách khoảng 20 – 40cm so với mặt, các mẫu nước thu ở các vũng, bồn nước
tĩnh, lâu ngày.
3.2.2. Phân lập các dòng vi khuẩn
Cân 1g mẫu rắn (10ml mẫu lỏng) cho vào bình tam giác 250ml chứa 99ml (90ml
đối với mẫu lỏng) môi trường bột lông gia cầm lỏng, ủ ở 30
o
C trên máy lắc (120rpm)
trong vòng 24 giờ nhằm tăng sinh khối các vi khuẩn cần phân lập trong mẫu.
Dịch môi trường được pha loãng từ nồng độ 10
-1
đến nồng độ 10
-10
, trải lên môi
trường bổ sung bột lông gia cầm và ủ ở 30
o
C trong vòng 48 giờ. Các khuẩn lạc có khả

năng phát triển trên môi trường bột lông gia cầm được tách ròng bằng phương pháp ria
cấy và trữ trong ống môi trường thạch nghiêng ở 4
o
C.
3.2.3. Đánh giá hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn
Chuẩn bị dịch nuôi vi khuẩn và đếm mật số tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi đối
với mỗi dòng vi khuẩn đã được phân lập.
* Chuẩn bị dịch nuôi vi khuẩn
Các dòng vi khuẩn ròng trữ trong ống được cấy chuyển sang đĩa petri, ủ ở 30
o
C
trong vòng hai ngày. Từ đĩa petri, lấy khuẩn lạc đầy đầu que cấy, hòa tan vào 10ml
môi trường bột lông vũ lỏng trong ống nghiệm, ủ ở 30
o
C trên máy lắc (120rpm) trong
vòng hai ngày.
* Đếm mật số tế bào vi khuẩn
Hút 100μl dịch nuôi vi khuẩn cho vào eppendorf chứa 900μl nước cất vô trùng,
lắc đều bằng máy vortex được mẫu có nồng độ pha loãng 10
-1
.
Tiếp tục pha loãng mẫu
đến độ pha loãng 10
10
. Sau khi lắc đều bằng máy vortex, hút 5μl huyền phù tế bào vi
khuẩn ở các độ pha loãng 10
8
, 10
9
và 10

10
nhỏ giọt vào đĩa môi trường bột gia cầm đã
được chuẩn bị trước đó. Mỗi độ pha loãng được lặp lại ba lần. Môi trường được ủ ở
30
o
C trong vòng 24 giờ đến 48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trong mỗi giọt.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
14
Số tế bào vi khuẩn trong 1ml (CFU/ml) trong dịch nuôi ban đầu tính từ số liệu
của độ pha loãng D
i
được tính theo công thức là :
M
i
(CFU/ml) = A
i
x D
i
/V
Trong đó: A
i
là số khuẩn lạc trung bình/ giọt
D
i
là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào trong mỗi giọt (ml)
Mật độ tế bào trung bình M
i
trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của M

i
ở các
độ pha loãng khác nhau.
* Tạo Azo-keratin:
Phương pháp này được thực hiện tương tự như các bước trong quy trình
azoalbumin (Areeb Inamdar et al., 2012).
- Chuẩn bị mẫu bột lông gà được nghiền thật mịn.
- Lấy 1g bột lông gà cho vào bình tam giác 100ml, cẩn thận cho phần bột
lông nằm ở đáy bình.
- Cho vào tiếp 20ml nước đã khử ion, dùng khuấy từ trộn đều hỗn hợp.
- Cho tiếp vào hỗn hợp 2ml NaHCO
3
10% (w/v), khuấy đều.
- Dùng ống nghiệm 10ml, cho vào 174mg sulfanilic acid hòa tan trong 5ml
NaOH 0,2N.
- Tiếp tục cho 69mg NaNO
2
hòa tan vào dung dịch.
- Dung dịch được chuyển đổi thành môi trường acid bằng 0,4ml HCl 5N
- Lắc đều trong 2 phút, sau đó trung hòa bởi 0,4ml NaOH 5N
- Cho tất cả phần dung dịch trong ống nghiệm 10 ml vào bình tam giác 100
ml có bột lông gà đã chuẩn bị ở trên, hỗn hợp dung dịch được trộn đều trong 10 phút.
- Hỗn hợp phản ứng được lọc bằng giấy lọc whatman - số 1, phần azokeratin
không tan sẽ được rửa hoàn toàn với nước khử ion.
- Azokeratin được hòa lơ lửng trong nước, được lắc đều ở 50C trong 2 giờ
và được lọc lại lần nữa.
- Chu kỳ rửa được lập lại cho đến khi pH của dịch rửa 6,0 – 7,0 và sự hấp
thụ quang phổ của dung dịch ở bước sóng 450nm nhỏ hơn 0.01.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

15
- Cuối cùng, chu trình rửa được lặp lại ít nhất hai lần sử dụng dung dịch đệm
potassium phosphate 50mM pH = 7,5. Azokeratin được rửa một lần nữa với nước và
làm khô qua đêm trong chân không ở 50C.
- Trữ lạnh azokeratin (4-10C) để sử dụng trong thời gian dài.
* Chuẩn bị enzyme keratinase thô từ môi trường bột lông
Chuẩn bị enzyme keratinase thô, để xác định hoạt độ enzyme của các dòng vi
khuẩn đã phân lập được.
Cách tiến hành:
− Vi khuẩn được nuôi trong môi trường bột lông.
− Lọc dung dịch nuôi vi khuẩn bằng giấy lọc, loại bỏ phần bột lông gà chưa bị
phân giải.
− Cho 1ml dịch lọc vào eppendorf 1,5ml, ly tâm ở 10.000rpm trong 5 phút (Park
và Son, 2009), loại bỏ vi khuẩn trong dung dịch.
− Phần dung dịch lỏng phía trên eppendorf được sử dụng như enzyme keratinase
thô để đo hoạt độ của enzyme trong thí nghiệm.
* Đo hoạt tính enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn trên cơ chất Azo-
keratin (Areeb et al., 2012)
Azokeratin không hòa tan được sử dụng như một cơ chất chỉ thị màu vì khi ủ
với dung dịch enzyme keratinase sẽ tạo ra sản phẩm có màu (dẫn xuất azopeptide).
Cường độ màu gia tăng của sản phẩm được tạo ra trong dung dịch so với mẫu đối
chứng được thể hiện với độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 450nm được xác định như
hoạt tính enzyme keratinase.
Sử dụng 5mg azokeratin cho vào eppendorf 1,5ml cùng với 0,8ml dung dịch
đệm potassium phosphate 50mM, pH = 7,5. Đảo đều hỗn hợp trên cho đến khi
azokeratin tạo huyền phù.
Dùng 0,2ml dịch enzyme thô (dịch nuôi vi khuẩn) thêm vào dung dịch
azokeratin, trộn và ủ lắc trong 15 phút ở 50
o
C.

Kết thúc phản ứng bằng cách thêm vào ependorf 0,2ml acid trichloroacetic
10%.