phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lõ giết mổ heo tại huyện vũng liêm tỉnh vĩnh long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
PHÂN GIẢI KERATIN TỪ CHẤT THẢI
LÕ GIẾT MỔ HEO TẠI HUYỆN VŨNG LIÊM
TỈNH VĨNH LONG



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN THÙY LINH
MSSV: 3102826
LỚP: CNSH K36



Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT


CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SNH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)


Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Thùy Linh


DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
− Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện Nghiên Cứu và
Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và
rèn luyện trong bốn năm qua.
− Ban Giám Đốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.
− Cô Bùi Thị Minh Diệu và tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 36 đã đồng hành

cùng tôi trong suốt quảng đường đại học. Cảm ơn cô đã tận tình chỉ bảo, hướng
dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Cảm ơn tất cả các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực
vật đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện luận văn.


Nguyễn Thùy Linh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM TẮT
Keratin là một protein khó phân hủy trong tự nhiên nhưng lại chứa những acid
amin quan trọng có thể sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thức ăn gia súc, phân
hữu cơ, gas sinh học. Phân hủy keratin bằng phương pháp vật lý hay hóa học dễ làm
phá hủy những acid amin này, cần tốn nhiều năng lượng và tạo ra những chất gây ô
nhiễm môi trường. Trong những năm gần đây, phân giải keratin bằng biện pháp sinh
học rất được các nhà nghiên cứu quan tâm và chú trọng. Đề tài “ Phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lò giết mổ heo tại huyện Vũng Liêm,
tỉnh Vĩnh Long” được tiến hành với mục tiêu phân lập được một số dòng vi khuẩn có
khả năng phân giải keratin và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải
keratin mạnh. Kết quả đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn trong đó có 7 dòng được
phân lập từ mẫu đất, 9 dòng từ mẫu lông và 4 dòng từ mẫu nước. Qua khảo sát ghi
nhận hai dòng K13 và K5 có hoạt độ enzyme keratinase cao nhất. Tiến hành khảo sát
khả năng phân giải keratin trên cơ chất bột lông heo và bột lông gia cầm của 20 dòng
vi khuẩn, sau 7 ngày ủ lắc đã chọn được hai dòng có tỉ lệ phân giải bột lông heo cao
tương đương nhau là K13 và K18, 4 dòng có tỉ lệ phân giải bột lông gia cầm cao nhất
và không khác biệt ý nghĩa là dòng K11, K13, K18 và K20. Từ kết quả các thí nghiệm
cũng cho thấy rằng vi khuẩn phân giải keratin từ lông gia cầm tốt hơn nguồn keratin
lông heo và khả năng phân giải keratin của vi khuẩn không hoàn toàn phụ thuộc vào
hoạt tính enzyme keratinase của chúng.
Từ khóa: keratin, phân lập, bột lông heo, hoạt độ keratinase

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
TỪ VIẾT TẮT vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lƣợc về keratin và chất thải chứa keratin 3
2.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn phân giải keratin 5
2.3. Sơ lƣợc về enzyme keratinase 6
2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn phân giải keratin 7
2.4.1 Một số nghiên cứu trong nước 7
2.4.2 Một số nghiên cứu ngoài nước 7
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 9
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu: 9
3.1.2. Thời gian nghiên cứu: 9
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 9
3.1.4. Vật liệu thí nghiệm 9
3.1.5. Hóa chất 10
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 11

3.2.1. Phương pháp thu mẫu 11
3.2.2. Thí nghiệm 1: phân lập các dòng vi khuẩn phân giải keratin 11
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh . 12
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
4.1. Phân lập các dòng vi khuẩn phân giải keratin 17
4.1.1. Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn 17
4.1.2. Hình thái khuẩn lạc 17
4.2. Đánh giá hoạt độ enzyme keratinase các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 19
4.3. Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh 20
4.3.1. Khả năng phân giải cơ chất chứa keratin của các dòng vi khuẩn phân lập
được 20
4.3.2 Hình dạng tế bào và đặc tính Gram những dòng vi khuẩn tuyển chọn 25
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27
5.1. Kết luận 27
5.2. Kiến nghị 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO 28
PHỤ LỤC

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn phân lập được 18
Bảng 2. Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn 19
Bảng 3. Tỷ lệ phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn 21
Bảng 4. Tỷ lệ phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn 23
Bảng 5. Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng tế bào và đặc tính Gram những dòng vi khuẩn
tuyển chọn 26
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. α – keratin và β – keratin 3
Hình 2. Lông heo sau khi cắt nhuyễn 8
Hình 3. Quy trình xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống 13
Hình 4. Ảnh khuẩn lạc một số dòng vi khuẩn phân lập được 17
Hình 5. Tỷ lệ phân giải keratin từ hai nguồn cơ chất khác nhau và hoạt độ keratinase
của các dòng vi khuẩn 24
Hình 6. Ảnh các khuẩn lạc tuyển chọn 26



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TỪ VIẾT TẮT
CFU Colony Forming Unit
g gram

l lít
OD Optical Density
rpm revolutions per minute
STT Số thứ tự
TCA Trichloroacetic acid

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
1
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi trên thế giới đang trên đà phát triển, đáp ứng nhu cầu tăng cao
về thực phẩm đồng thời mang lại lợi nhuận cho nhiều quốc gia đặc biệt là những nước
có nền nông nghiệp lâu đời như Việt Nam. Theo Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông
thôn, tổng sản lượng thịt cung cấp ra thị trường của nước ta 6 tháng đầu năm 2013 đạt
2,62 triệu tấn
(*)
. Cùng với sự gia tăng đàn vật nuôi thì tình trạng ô nhiễm môi trường
do chất thải chăn nuôi cũng đang ở chiều hướng báo động, đáng chú ý là lông gia súc,
gia cầm với thành phần keratin khó phân hủy đang góp phần gây nên ô nhiễm đất, ô
nhiễm nguồn nước,… khi chúng được thải trực tiếp ra môi trường mà không qua xử lý.
Vĩnh Long là một trong những tỉnh thành ở Đồng bằng sông Cửu Long có nhiều cơ sở
giết mổ gia súc gia cầm nhất, trong đó huyện Vũng Liêm là huyện có đàn gia súc lớn
nhất. Những cơ sở giết mổ gia súc gia cầm tại đây hầu hết không có biện pháp xử lý
các chất thải giết mổ nên thải trực tiếp xuống sông, gây ô nhiểm nghiêm trọng.
Sự phân giải các chất thải có chứa keratin có ý nghĩa thiết thực trong ngành công
- nông nghiệp như chế biến thức ăn thủy sản, gia súc gia cầm và sản xuất phân bón
(Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010). Việc xử lý chất thải keratin bằng các phương pháp
chôn và đốt gây ô nhiễm nước, đất và không khí. Trong keratin lại chứa những acid
amin quan trọng có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Bên cạnh đó, keratin còn

được dùng như một nguyên liệu cho sản xuất phân hữu cơ, gas sinh học. Do đó, tìm ra
một phương pháp hiệu quả để xử lý chất thải keratin là một vấn đề có ý nghĩa quan
trọng trong ngành chăn nuôi, vừa có thể xử lý hiệu quả chất thải lông gia súc, gia cầm
và vừa có thể tạo ra những sản phẩm có giá trị kinh tế. Phân hủy keratin bằng phương
pháp vật lý hay hóa học dễ làm phá hủy những acid amin, cần sử dụng rất nhiều năng
lượng và tạo ra những chất gây ô nhiễm cho môi trường (Matikevičienė et al., 2009).
Trong những năm gần đây, biện pháp xử lý lông gia súc, gia cầm bằng phương pháp
sinh học rất được quan tâm và chú trọng.
Việc ứng dụng biện pháp sinh học sử dụng các vi khuẩn có khả năng phân giải
keratin đạt được được hai ưu thế quan trọng là không gây hại với môi trường và nâng
cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm protein. Chính vì vậy, việc phân lập và tuyển
chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin từ chất thải tại các cơ sở giết mổ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
heo không những bổ sung được các dòng vi khuẩn có hoạt tính keratinase cao để đưa
vào ứng dụng mà còn giải quyết được bài toán về việc xử lý nguồn chất thải lông gia
súc, gia cầm theo chiều hướng vừa không gây ô nhiễm môi trường vừa đạt hiệu quả
cao.
(*)
Thông tin số liệu từ

1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn được ít nhất hai dòng vi khuẩn có khả năng phân giải
keratin mạnh từ chất thải tại một số cơ sở giết mổ heo ở huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh
Long.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
3
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về keratin và chất thải chứa keratin
Keratin thuộc họ protein cấu trúc dạng sợi, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên
biểu bì, tóc, móng, lông, sừng,… Cấu trúc cơ bản bậc hai của keratin phân thành hai
dạng α-helix của tóc, len và β-sheets của lông vũ (Akhtar và Edwards, 1997). Các sợi
keratin xoắn song song với nhau đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Zerdani et al.,
2004). Dựa vào hàm lượng lưu huỳnh, keratin được phân loại thành keratin cứng và
mềm. Keratin cứng ở lông, tóc, móng guốc và móng với hàm lượng cầu nối disulfide
cao, bền và không thể kéo dài. Keratin mềm ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối
disulfide thấp và mềm dẻo hơn (Voet and Voet, 1995). Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ
các cầu nối disulfide, các liên kết hidro và tương tác kỵ nước tạo nên cấu trúc keratin
bền vững, kháng lại sự phân giải bởi các enzyme thủy phân protein thông thường như
trysin, pepsin, papain… Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm vẫn có thể
phân giải keratin hiệu quả nhờ hoạt tính enzyme keratinase (Onifade et al., 1998).

Hình 1. α – keratin và β – keratin
(Nguồn: protein,
ngày 15/07/2013)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
4
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Lông chứa khoảng 90% protein, trong đó thành phần chính là keratin. Keratin là
thành phần cấu tạo chủ yếu trong lông, tóc, móng tay, móng vuốt, da,… (Onifade et
al., 1998). Đối với gia súc như heo thì lông chiếm từ 0,5-0,8% trọng lượng cơ thể. Đối
với gà trưởng thành thì lông chiếm 5-7% trọng lượng (Lê Thị Thu Huyền, 2012). Tuy
nhiên, lông rất khó bị phân giải nên không được xem là nguồn cung cấp protein chủ
yếu.
Lông gia súc có cấu tạo chủ yếu từ protein keratin dạng α – helix, cấu trúc này
bền vững, tương tự cấu trúc β – sheets của keratin có trong lông gia cầm cũng hết sức
chặt chẽ và khó phân giải. Trong tự nhiên, thời gian thật sự để keratin (từ lông gà) tự

phân là 5 – 7 năm (Lê Thị Thu Huyền, 2012).
Các chất thải giàu keratin khó phân hủy và ngày càng gia tăng tích lũy trong tự
nhiên chủ yếu ở dạng lông gia súc, gia cầm, tóc, móng, sừng góp phần gây ra vấn đề
ô nhiễm môi trường (Gupta and Ramnani, 2006). Tuy nhiên, sự phân giải các chất thải
chứa keratin vẫn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công - nông nghiệp như
chế biến thức ăn thủy sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón. Ở Việt Nam, chỉ một
phần rất nhỏ trong số các vật liệu chứa keratin như lông, tóc, móng, được sử dụng
chủ yếu trong sản xuất một số sản phẩm thủ công, may mặc, phần lớn còn lại chỉ được
loại bỏ và xử lý đơn giản như đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các đống rác lớn chưa
có biện pháp xử lý gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng.
Ước tính hàng năm, trên thế giới thải ra hàng triệu tấn chất thải chứa keratin từ
ngành chăn nuôi gia cầm, thuộc da, công nghiệp chế biến thịt và tỷ lệ này tăng khoảng
4,5% mỗi năm (C.A.S.T., 1995 và Freeman et al., 2009). Các phế phẩm của gia súc và
gia cầm sau khi bị giết mổ đều thải ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng như lông
heo, lông bò, sừng bò, móng trâu, móng bò, lông gà, lông vịt,… Việc xử lý các chất
này thành thức ăn gia súc bằng các phương pháp hóa, lý tốn khá nhiều năng lượng
(nhiệt độ và áp suất cao); đồng thời, làm mất đi các acid amin thiết yếu (Onifade et al.,
1998), quá trình phân giải sinh học các chất thải chứa keratin đã được đề xuất như một
giải pháp hiệu quả, ít tốn kém (Ignatova et al., 1999 và Xie et al., 2010).



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
5
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn phân giải keratin
Các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin chủ yếu thuộc chi Bacillus và
Streptomyces. Trong số các chủng Bacillus sp., B. licheniformis và B. subtilis được mô
tả là có khả năng thủy phân keratin tốt (Balaji et al., 2008; Cai et al., 2008;
Manczinger et al., 2003; Suh and Lee, 2001; Zhang et al., 2009), gen kerA của

Bacillus licheniformis đã được nhân dòng và giải mã trình tự (Lin et al.,1995). Các
chủng B. pumilus và B. cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase (Ghosh et al.,
2008; Kim et al., 2001; Kumar et al., 2008; Werlang và Brandelli, 2005).
Những dòng vi khuẩn chịu nhiệt hứa hẹn khả năng thủy phân các protein không
tan trong nước như keratin, vì những protein này dễ phân hủy hơn ở nhiệt độ cao
(Suzuki et al., 2006). Một số dòng Streptomyces chịu nhiệt phân lập từ đất có thể phát
triển và phân giải keratin ở nhiệt độ trên 50
o
C (Chitte et al., 1999; Mohamedin, 1999),
ngoài ra còn có các vi khuẩn chịu nhiệt có hoạt tính keratinase như Fervidobacterium
pennavorans (Friedrich and Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus
(Riessen and Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandicum (Nam et al., 2002).
Một số dòng vi khuẩn ưa ấm như Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al.,
1995) và Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999) cũng được mô tả
cho thấy khả năng phân giải keratin. Khả năng thủy phân keratin ở các vi khuẩn
Streptomyces có thể liên quan đến việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các
protease phổ rộng như pronase, đã được sản xuất thương mại từ vi khuẩn Streptomyces
griseus (Jurasek et al., 1974). Bên cạnh đó, Streptomyces pactum có thể làm giảm
lượng cầu nối disulfide khi phát triển trên cơ chất lông vũ (Böckle and Müller, 1997)
cho thấy loài vi khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide reductase để phục vụ sự phân
giải keratin.
Hoạt tính keratinase còn được biểu hiện ở các dòng vi khuẩn ưa kiềm như
Nesternkonia sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp. TOA-1 (Mitsuiki
et al., 2004). Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata
IMBAS-11A được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho thấy khả năng tạo
keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu (Gushterova et al., 2005).
Các dòng vi khuẩn Gram dương như Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003),
Microbacterium sp. (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006) cũng có
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
6

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
khả năng phân giải keratin. Các vi khuẩn Gram âm cũng được báo cáo cho thấy có khả
năng phân giải protein nhưng tài liệu còn khá hạn chế và hoạt động phân hủy lông vũ
chỉ được mô tả gần đây ở các loài Vibrio sp. (Sangali et al., 2000), Chryseobacterium
sp. (Riffel et al., 2003) và Xanthomonas sp. (De Toni et al., 2002).
2.3. Sơ lƣợc về enzyme keratinase
Keratinase là một loại enzyme ngoại bào, thuộc họ protease có khả năng phân
giải cơ chất keratin không tan. Keratinase chỉ được tạo ra khi có sự hiện diện của cơ
chất keratin. Một số loài vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn phân lập từ đất chôn chất thải giàu
keratin cho thấy có khả năng tổng hợp keratinase (Riffel and Brandelli, 2006).
Keratinase phân hủy keratin bằng cách tấn công vào các cầu nối disulfide (Prasad et
al., 2010). Cho đến nay, hầu hết các keratinase được mô tả đều thuộc loại
serineprotease. Chỉ có một vài metalloprotease cho thấy có hoạt tính phân giải keratin,
các metalloprotease này thường được thấy ở các vi khuẩn Gram âm (Brandelli, 2007).
Keratinases sản xuất bởi Microsporum, Trychophyton, và Microsporum Doratomyces
đã được mô tả (Kushwaha, 1983; Grzywnowicz et al., 1989; Gradisar et al., 2000).
Việc sản xuất keratinase từ chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus đã được
Santos et al. (1996) nghiên cứu.
Các enzyme phân giải protein là một trong những nhóm enzyme thương mại
quan trọng được ứng dụng nhiều trong các quy trình công nghiệp, chế biến thực phẩm
hay công nghệ thuộc da (Gupta et al., 2002). Keratinase từ vi khuẩn có ứng dụng quan
trọng trong các quy trình sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ các ngành
công nghiệp gia súc gia cầm. Keratin lông không hòa tan có thể được chuyển đổi sau
khi thủy phân bằng keratinase tạo thức ăn gia súc, phân bón, chất keo hay được sử
dụng cho sản xuất các acid amin hiếm như serine, cysteine và proline (Papadopoulos
et al., 1986; Onifade et al., 1998; Gupta and Ramnani, 2006).
Từ những năm 90 của thế kỷ XX, các kiến thức về keratin và enzyme keratinase
dần được khám phá.Tuy nhiên, đến nay cơ chế phân giải sinh học keratin vẫn chưa
hoàn toàn được hiểu rõ. Noval và Nickerson (1959) đã mô tả sự phân giải keratin bởi
enzyme của vi khuẩn. Sự phá hủy các cầu nối disulfide có thể là yếu tố quan trọng

trong sự phân giải keratin (Kunert and Stransky, 1988; Kunert, 1992; Böckle and
Müller, 1997).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
7
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn phân giải keratin
2.4.1 Một số nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đã được phân
lập từ đất và lông vũ tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông vũ.
Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) đã tiến hành phân lập được từ
đất 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có khả năng phân giải casein rõ rệt. Trong
đó có 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh mẽ.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn
Bacillus, Chryseobacterium,… từ một số vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam.
Điều kiện thích hợp cho các chủng vi khuẩn này phát triển là ở 30 - 40
o
C trên môi
trường có bổ sung bột lông vũ. Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn
này đạt từ 75 - 90% sau 3 ngày nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn đã được phân loại định
danh bằng các nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh kit API 50CHB, API 20NE và
trình tự gen mã hóa 16S rRNA.
Nguyễn Thị Hồng Thẩm (2011) phân lập được 21 dòng vi khuẩn phân giải lông
vũ từ lông và đất. Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng phân
giải lông gà hiệu quả nhất. Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng
với dòng Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15
tương đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91với độ tương đồng 99%.
2.4.2 Một số nghiên cứu ngoài nước
Geun-Tae Park et al. (2006) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện
môi trường đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus
megaterium F7-1. Vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng 7 ngày. Nhiệt

độ 25 - 40
o
C và pH 7-11 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinase của
chúng. Hoạt tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữa không béo là 468
U/ml, cao gấp 9,4 lần trong môi trường không bổ sung sữa. Lượng keratinase tạo ra
phụ thuộc vào hàm lượng lông vũ.
Riffel et al. (2002) đã nghiên cứu và cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium sp.
dòng kr6 có khả năng phân hủy hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy. Dòng vi
khuẩn này có nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển là 30
o
C và pH 8. Dưới điều kiện
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
8
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
này, hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa. Nghiên cứu cũng cho thấy hoạt
tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg
2+
, Cu
2+
và được kích hoạt bởi Ca
2+
.
Sangali et al. (1999) phân lập được các vi khuẩn có khả năng phân giải keratin
thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil. Nghiên cứu cho thấy
nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 30
o
C và cũng tại nhiệt độ này,
lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại.
Riffel và Brandelli (2006) tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ chất
thải lông gia cầm. Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông vũ và

kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa. Trong đó có ba dòng Gram
âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng Gram
dương (Microbacterium sp.). Những vi khuẩn này có thể phát triển trên đa dạng các
chất thải chứa keratin như bột lông vũ, lông vũ thô, móng gà, tóc và len. Hoạt tính
phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểm tra
với hai cơ chất azokeratin và azocasein. Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạt động
trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương với các enzyme phân
gải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường.
Daroit et al. (2009) phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. P45 biểu hiện khả
năng phân giải protein trên môi trường sữa không béo và môi trường bột lông vũ.
Dòng Bacillus sp. P45 có khả năng phân hủy 90% lông gà sau 72 giờ nuôi cấy trong
môi trường lỏng có bổ sung lông gà. Sự hình thành nhóm thiol cũng được ghi nhận
trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, cho thấy sự đóng góp của quá trình phá hủy
cầu nối disulfide trong sự phân giải keratin lông vũ.
Theo kết quả nghiên cứu của Agrahari et al. (2010), ba dòng vi khuẩn B.
megaterium SN1, B. thuringenesis SN2, B. Pumilis SN3 phân lập từ bãi đất chôn lông
gia cầm có khả năng phân giải lông gà và lông bồ câu sau 120 giờ nuôi cấy.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
9
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu:
Thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Thực vật, thuộc
Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Thời gian nghiên cứu:
Đề tài thực hiện từ tháng 08/2013 đến 11/2013.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Tủ cấy vi sinh vật TELSTAR (Spain), tủ ủ vi sinh vật BINDER (USA). Nồi khử

trùng nhiệt ướt PBINTERNATIONAL (Italy), tủ lạnh trữ mẫu SANYO (Japan), máy
lắc mẫu NEW BRUNSWICH SCIENTIFIC (USA), pH kế EUTECH (Malaysia), cân
điện tử SARTORIUS TEG101 (Germany), bộ micropipette NICHIPET EX (Japan),
- Đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, eppendorf, đèn cồn, que cấy, đầu cône,
- Giấy lọc được đánh dấu và sấy khô ở 60
o
C đến khi khối lượng không đổi. Sau
khi sấy, xác định khối lượng từng miếng giấy lọc.
3.1.4. Vật liệu thí nghiệm
Mẫu được thu tại năm cơ sở giết mổ heo huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long.
Lông heo dùng làm cơ chất thu tại một
số cơ sở giết mổ gia súc trên địa bàn tỉnh
Vĩnh Long, rửa sạch bằng nước máy, phơi
dưới ánh nắng mặt trời cho khô nước, sấy
khô đến khối lượng không đổi. Sau đó cắt
nhuyễn (như hình 2), trữ lại dùng pha môi
trường bột lông. Hình 2. lông heo sau khi cắt nhuyễn
Lông gia cầm (tỉ lệ lông gà và lông vịt là 1:1) thu tại một số cơ sở giết mổ gia
cầm trên địa bàn tỉnh Vĩnh Long, rửa sạch bằng nước máy, phơi dưới ánh nắng mặt
trời cho khô nước, sấy khô đến khối lượng không đổi. Sau đó nghiền thật mịn, bảo
quản nơi khô ráo đến khi sử dụng.


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3.1.5. Hóa chất
a) Hóa chất pha môi trường:
Môi trường sử dụng gồm môi trường tăng sinh khối và môi trường thạch agar.
Các môi trường đều có thành phần bột lông heo, đây là nguồn cung cấp carbon, nitơ

duy nhất cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
 Môi trường tăng sinh khối
Thành phần môi trường tăng sinh khối (dựa theo môi trường tăng sinh bột lông
gia cầm của Matikevičienė et al., 2009) 1 lít gồm:
Bột lông heo 10g
NaCl 0,5g
K
2
HPO
4
0,3g
KH
2
PO
4
0,4g
MgSO
4
0,1g
Nước cất thêm vào đủ 1 lít
 Môi trường thạch agar (môi trường bột lông heo)
Thành phần môi trường bột lông heo (dựa theo môi trường bột lông gia cầm
FMA của Daniel et al., 2009) 1 lít gồm:
Bột lông heo 10g
NaCl 0,5g
K
2
HPO
4
0,3g

KH
2
PO
4
0,4g
Agar 20g
Nước cất thêm vào đủ 1 lít
b) Nhuộm Gram
Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn gồm: Iod, KI, Fushin, Crystal violet, ethanol
70% và nước cất hai lần vô trùng.



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
11
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp thu mẫu
 Mẫu đất: lấy khoảng 10gram mẫu ở ngay cơ sở giết mổ và chuồng nuôi gia súc
(đào sâu khoảng 20cm).
 Mẫu nước: lấy khoảng 10ml nước tại nơi nguồn nước thải của cơ sở giết mổ đổ
ra trực tiếp (nơi nước tĩnh, đọng).
 Mẫu lông: lấy khoảng 10gram lông heo đang phân hủy trong đất ngay tại cơ sở
giết mổ.
Mỗi mẫu đất, nước và lông cho vào một túi nilon sạch loại dùng một lần, ghi
nhãn, đem về phòng thí nghiệm và trữ ở nơi mát đến khi tiến hành thí nghiệm.
3.2.2. Thí nghiệm 1: phân lập các dòng vi khuẩn phân giải keratin
a) Phương pháp phân lập
Cân 1gram mẫu đối với mẫu đất, lông hoặc hút 10ml nước đối với mẫu nước cho
vào bình tam giác 250ml chứa 99ml môi trường lỏng có bổ sung bột lông heo (90ml

đối với mẫu nước), ủ ở 30
o
C trên máy lắc (120rpm) trong vòng 24 giờ nhằm tăng sinh
khối các vi khuẩn trong mẫu.
Pha loãng dịch môi trường từ nồng độ 10
0
đến nồng độ 10
-10
, trải lên môi trường
bột lông heo, ủ ở 30
0
C trong 2 ngày. Những dòng có khả năng phát triển trên môi
trường bột lông heo tiếp tục được cấy chuyển trên môi trường này đến khi ròng. Các
mẫu ròng trữ trong ống môi trường thạch nghiêng có cùng thành phần ở 4
o
C.
b) Kiểm tra hoạt độ enzyme keratinase bằng cơ chất azokeratin
Phương pháp này thực hiện đầu tiên bởi Lin et al. (1992) sử dụng azokeratin
kiểm tra hoạt độ của enzyme keratinase sinh ra từ vi sinh vật.
 Chuẩn bị cơ chất azokeratin: Azokeratin tổng hợp từ lông gà theo phương pháp
tổng hợp của Joshi et al. (2007).
 Chuẩn bị enzyme keratinase thô: enzyme keratinase thô dùng để xác định hoạt độ
enzyme của các nghiệm thức. Các bước chuẩn bị như sau:
- Nuôi vi khuẩn trong môi trường bột lông heo.
- Lọc dung dịch nuôi vi khuẩn bằng giấy lọc, loại bỏ phần bột lông chưa bị phân
giải.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
12
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Cho 1ml dịch lọc vào eppendorf 1,5ml, ly tâm ở 12000rpm trong 5 phút (Park

và Son, 2009), loại bỏ vi khuẩn (phần rắn phía dưới) trong dung dịch.
- Phần dung dịch lỏng phía trên eppendorf sử dụng như enzyme keratinase thô
để đo hoạt độ của enzyme trong các thí nghiệm.
 Xác định hoạt độ enzyme keratinase thô với cơ chất azokeratin (Areeb el al.,
2012)
Mục đích: Xác định hoạt độ enzyme keratinase do các dòng vi khuẩn tạo ra bằng
cơ chất azokeratin.
Phương pháp thực hiện:
- Lấy 5mg azokeratin cho vào eppendorf 1,5ml, thêm 0,8ml dung dịch đệm
potassium phosphate 50mM, pH 7,5. Lắc đều hỗn hợp bằng máy vortex đến khi
azokeratin hòa vào dung dịch hoàn toàn.
- Cho 0,2ml dịch enzyme thô vào eppendorf, trộn đều hỗn hợp và ủ lắc 50
o
C
trong 15 phút.
- Thêm 0,2ml trichloroacetic acid (TCA) 10% (mẫu đối chứng thêm TCA trước
khi cho dung dịch enzyme keratinase thô vào).
- Lọc hỗn hợp, dung dịch lọc đo ở bước sóng 450nm để xác định hoạt tính
keratinase của vi khuẩn.
Một đơn vị hoạt độ của enzyme xác định bằng sự gia tăng 0,01 đơn vị hấp thụ
quang phổ ở 450nm so với mẫu đối chứng sau 15 phút phản ứng. Những dòng có hoạt
tính keratinase được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh
a) Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố, 3 lần lặp
lại đối với mỗi loại dịch nuôi cấy vi khuẩn.
b) Tiến hành thí nghiệm:
 Nuôi, đếm và đồng nhất mật số tế bào dòng vi khuẩn ở các nghiệm thức.
 Phương pháp đếm sống (Hoben and Somasegaran, 1982):
 Tăng sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập được: lấy từ 1-2 khuẩn lạc vi
khuẩn cho vào môi trường tăng sinh khối ủ lắc 120rpm ở 30

0
C trong 48 giờ.
 Đếm mật số vi khuẩn: dùng phương pháp đếm sống:
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
13
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
− Mục đích: đếm mật số vi khuẩn đảm bảo cân bằng mật độ vi khuẩn chủng
vào môi trường. Kết quả so sánh khả năng phân giải keratin giữa các dòng
vi khuẩn sẽ chính xác và đáng tin cậy.
− Phương pháp đếm sống: Quy trình xác định mật số vi sinh vật bằng phương
pháp đếm sống:
+ Pha loãng mẫu ở độ pha loãng 10
-6
,10
-7
, 10
-8
, 10
-9
lần.
+ Mỗi đĩa môi trường phân làm 4 phần cho 4 mức độ pha loãng khác
nhau.
+ Mỗi độ pha loãng hút 3 giọt (mỗi giọt là 5µl) nhỏ lên môi trường
thạch ở 3 điểm riêng biệt trên 1 phần đĩa như hình 3.
+ Ủ ở nhiệt độ 30
0
C, sau 24 giờ tiến hành đếm khuẩn lạc. Chọn mức
pha loãng có khuẩn lạc rời tốt để đếm số khuẩn lạc. Mỗi khuẩn lạc được
hình thành từ một tế bào vi khuẩn, thông qua đếm số khuẩn lạc xác định mật
số vi khuẩn tương ứng với độ pha loãng, từ đó tính mật số vi khuẩn trong

mẫu ban đầu.













Hình 3. Quy trình xác định mật số vi khuẩn bằng phƣơng pháp đếm sống
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
14
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Công thức tính mật số vi khuẩn:
Số tế bào/ml = A x 200 x B
Trong đó:
A: số khuẩn lạc trung bình của 3 giọt (số khuẩn lạc/5µl)
B: mức độ pha loãng
200: hệ số chuyển từ 5µl đến 1ml
 Khảo sát và tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân giải keratin mạnh:
 Khảo sát khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn:
Đối với mỗi dòng vi khuẩn, chuẩn bị một bình yaourt 75ml chứa 30ml môi
trường gồm NaCl 0,5g/l, K
2
HPO

4
0,3g/l và KH
2
PO
4
0,4g/l và 0,5g bột lông heo, môi
trường khử trùng ở 121
o
C trong 20 phút. Lần lượt chủng vào mỗi bình yaourt 1,5ml
dịch nuôi vi khuẩn (đã đồng nhất mật số ở 10
8
CFU/ml) của các dòng vi khuẩn phân
lập được, ủ ở 30
o
C trên máy lắc (120rpm). Một bình yaourt với cùng thể tích môi
trường nhưng không chủng vi khuẩn sử dụng làm mẫu đối chứng. Sau 7 ngày nuôi lắc,
tiến hành lọc và rửa môi trường qua giấy lọc Whatman No.1 đã được cân khối lượng
trước đó. Cân lượng bột lông heo còn lại sau khi đã lọc và sấy khô ở 60
o
C đến khối
lượng không đổi, tính khối lượng bột lông heo bị phân giải trong quá trình nuôi cấy.
Khả năng phân giải bột lông heo của vi khuẩn tính theo công thức sau (Nguyễn
Huy Hoàng et al., 2010):
A (%) = (m
BĐ
- m
C
) x 100 / m
BĐ

Trong đó: A (%): tỷ lệ bột lông heo bị phân giải bởi vi khuẩn.
m
BĐ
: khối lượng bột lông heo ban đầu.
m
C
: khối lượng bột lông heo còn lại sau khi bị phân giải.
Chỉ tiêu theo dõi: khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn.
 Khảo sát khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn:
Thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn
tiến hành tương tự như khảo sát khả năng phân giải bột lông heo, nhưng với cơ chất là
bột lông gia cầm.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
15
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
 Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và nhuộm Gram những dòng vi
khuẩn phân giải keratin mạnh.
 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động
Sau khi chọn hai dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin mạnh, tiến hành
quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của tế bào vi khuẩn trong môi trường
nước cất vô trùng. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Dùng kim cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc, trải đều lên giọt nước
vô trùng đã nhỏ sẳn trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật
tiếp xúc với kính mang vật một góc 45º, hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ
nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Tiến hành quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu x100, ghi
nhận hình dạng và khả năng chuyển động của tế bào vi khuẩn.
 Xác định đặc tính Gram vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

Sau khi quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn, tiến hành
nhuộm Gram vi khuẩn theo các bước:
- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn, trải đều lên giọt nước cất vô trùng
trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet, để hai phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod, để một phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70% thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin, để một phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu x100 và ghi nhận Gram
của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram
dương; có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
16
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
 Xử lý số liệu: kết quả khả năng phân giải keratin của các dòng vi khuẩn xử lý
thống kê bằng phần mềm Excel và Minitab để tuyển chọn ít nhất hai dòng vi
khuẩn phân giải keratin mạnh.