Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vị thuốc cóc mẳn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUẾ
GÓP PHẦN XÂY DỤNG TIÊU CHUẨN cơ sở
CHO VỊ THUỐC CÓC MAN
(Centipeda minỉma L. Asteraceae)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2000-2005
Người hướng dẫn : PGS. TS. Phạm Xuân Sinh
Nơi thực hiện : Bộ môn Dược học cổ truyền
Thời gian thực hiện : 11/2004- 05/2005
HÀ NỘI, 05/2005
£Ờa® cÀM Ơ Qt
Trong thời gian thực hiện đề tài: “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
cho vị thuốc Cóc mẩn” tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của
PGS.TS. Phạm Xuân Sinh
Cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô bộ môn Dược học cổ truyền, Dược
liệu, Thực vật, kĩ thuật viên bộ môn Dược học cổ truyền đã giúp đỡ tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó.
Nhân dịp này cho phép tôi gửi lòi cảm ơn sâu sắc tói Ban giám hiệu nhà
trường, Phòng đào tạo, Phòng giáo tài, Phòng quản lí khoa học, cùng toàn thể các
thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức và tạo điều kiện thuận
lọi cho tôi có được kết quả như ngày hôm nay.
Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2005
)
Sinh viên
NGUYỄN THỊ HUẾ
MỤC LỤC
Đặt vấn đề 1
Phần 1: Tổng quan 2
1.1 . VỊ trí phân loại 2

1.2 . Tên vị thuốc 2
1.3 . Đặc điểm thực vật cây Cóc mẳn 2
1.4 . Phân bố 3
1.5 . Bộ phận dùng 3
1.6 . Thành phần hoá học 3
1.7. Tác dụng dược lí 4
1.7.1. Tác dụng giảm ho trên chuột nhắt trắng

4
1.7.2. Tác dụng long đờm trên chuột nhắt trắng 5
1.7.3. Tác dụng giãn khí quản trên chuột lang cô lập

5
1.7.4. Tác dụng kháng khuẩn 5
1.8. Công nâng chủ trị 6
1.9. Cách dùng, liều dùng ố
1.9.1. Chữa ho


6
1.9.2. Chữa viêm mũi

6
1.9.3. Chữa mẩn ngứa 6
1.9.4. Chữa chàm, chốc, lở 7
1.9.5. Chữa đau mắt 7
1.9.6. Một số bệnh khác 7
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả
8
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 8

2.1.1. Nguyên vật liệu

8
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm 9
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 13
2.2.1. Mô tả thực vật 13
2.2.2. Đặc điểm giải phẫu thân 14
2.2.3. Đặc điểm bột
.

14
2.2.4. Nghiên cứu thành phần hoá học

14
2.2.5. Xác định một số chỉ số của dược liệu Cóc mẳn 24
2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vị thuốc Cóc mẳn
31
2.4. Bàn luận 37
Phần 3: Kết luận và đề xuất 38
3.1. Kết luận 38
3.2. Đề xuất
.

39
Tàỉ liệu tham khảo
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Dd
Dung dịch
Gr
Gram

Mxro
Khối lượng tro
Mc
Khối lượng cắn
Meốc
Khối lượng cốc
Mdl
Khối lượng dược liệu
Me
'LVASau nung
Khối lượng sau nung
Mtc
Khối lượng tạp chất
Mvn
Khối lượng vụn nát
TT
Thuốc thử
RSD
Relative Standard Deviation
uv
Ultra Violet
ĐẶT VẤN ĐỂ
Việt Nam- một nước có khí hậu nhiệt đói, nóng ẩm cộng vói tình trạng ô
nhiễm môi trường trầm trọng đã làm gia tăng tỉ lệ mắc bệnh viêm nhiễm: viêm
mũi mãn tính, viêm mũi dị ứng, viêm xoang. Theo kinh nghiệm dân gian có thể
sử dụng Cóc mẳn để chữa trị.
Cóc mẳn là một nguyên liệu sẩn có và có trữ lượng khá nhiều ở Việt Nam
với nhu cầu sử dụng ngày càng cao. Đã có ghi trong Dược điển Trung Quốc bằng
tiếng Anh, tiếng Trung Quốc nhưng chưa có trong danh lục Dược điển Việt Nam
ở các lần xuất bản trước đây. Mặt khác, Cóc mẳn còn là một vị thuốc có trong

thành phần của phương Nhị trần thang gia giảm Lá hen, một đề tài cấp Bộ đã
được nghiệm thu, đánh giá xuất sắc của PGS.TS. Phạm Xuân Sinh. Xuất phát từ
thực tế đó, chúng tôi tiến hành khoá luận: “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
cho vị thuốc Cóc mẳn” để góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phương Nhị
trần thang gia giảm Lá hen, cho Dược điển Việt Nam sau này.
Đề tài tiến hành với nội dung sau:
• Về thực vật: Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học.
• Về hoá học : + Định tính một số thành phần hoá học chính
saponin, coumarin.
+ Sắc kí lớp mỏng saponin.
+ Định lượng saponin, coumarin trong Cóc mẳn.
• Xác định một số chỉ số có ghi trong Dược điển đối vói các vị thuốc thảo
mộc.
1
Phần 1 : TỔNG QUAN
1.1. Vị trí phân loại [8 ]
Cóc mẳn ( Centipeda minima L.) thuộc:
Họ Cúc
Bộ Cúc
Liên bộ Cúc
Phân lớp Cúc
Lớp Ngọc Lan
Ngành Ngọc Lan
Asteraceae
Asterales
Asteranae
Asteralae
Magnoliopsida
Magnoliophyta
1.2. Tên vị thuốc

Cóc mẳn (Centipeda minima L. Asteraceae) còn được gọi là Cúc mẳn, cỏ
the, Thạch hồ tuy, Nga bất thực thảo, Địa hồ tiêu, cẩu tử thảo [8 ], Cóc ngồi, Cầy
thuốc mộng [7].
1 .3 . Đặc điểm thực vật cây Cóc mẳn
Cóc mẳn là cây thuộc thảo, mọc hàng năm, cao 5-20cm, có mùi hôi, mọc
lan trên mặt đất, phân nhánh nhiều. Ngọn có lông mịn, màu trắng nhạt, toàn thân
nhẩn.
Lá đơn nhỏ, không cuống, mọc so le, đầu tù, phía cuống hẹp lại, mép lá có
răng cưa, lá dài từ 10-18mm, rộng 6 -1 0 mm, gân chính hoi nổi ở mặt dưới lá, gân
phụ không rõ.
Cụm hoa hình đầu màu vàng nhạt, mọc ở ngọn hay ở bên đối diện với một
lá, rất bé. Trong đầu có 5 dãy hoa cái ở phía ngoài, ở giữa là hoa lưỡng tính. Hoa
2
cái hình ống, màu trắng, trên có răng cưa. Hoa lưỡng tính ít hơn, tràng hình
chuông, có 4 răng, hình trứng rộng, màu tím.
Mùa ra hoa vào tháng 2-5.
Quả bế có 4 cạnh, có lông mịn.
Mùa ra quả vào tháng 4-7 [7], [8 ].
1.4. Phân bố
Cây mọc hoang ở các vùng đất ẩm (bãi cỏ, ruộng ẩm sau gặt, bờ ao ) trên
nước ta như Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nội, Hà Nam và các nước
có khí hậu nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia .thường vào
tháng 12 năm trước đến tháng 5 năm sau [7].
1.5. Bộ phận dùng
Dùng cả cây, thu hái vào mùa khô, rửa sạch, dùng tưoi hay phơi khô, sấy
khô [8 ].
1.6. Thành phần hoá học
ở Nhật, người ta đã xác định được Cóc mẳn chứa hoạt chất taraxasterol,
taraxasteryl acetate, amidiol [14] có công thức cấu tạo như sau:
Arnidỉol Taraxasterol

3
Ở Trung Quốc, người ta đã xác định trong cây có tinh dầu, acid hữu cơ,
acid amin, sterol, flavonoid, saponin triterpenic trong đó stigmasterol và P-
sitosterol đã xác định được công thức cấu tạo như sau [25] :
P-Sistosterol Stigmasterol
Ấn Độ cũng là nước có Cóc mẳn, khi nghiên cứu về thành phần hoá học
người ta đã xác định trong cây có saponin triterpenic [26], trong đó có 4 loại đã
xác định được công thức, ngoài ra còn thấy có sitosterol.
Ở nước ta, trong các nghiên cứu của các tác giả, sơ bộ thấy trong toàn cây
Cóc mẳn có tinh dầu 0,11%; saponin triterpenic 3,1%; coumarin 0,34%.
1.7. Tác dụng dược lý
1.7.1. Tác dụng giảm ho trên chuột nhắt trắng
Tác dụng giảm ho thể hiện rõ ờ nhiều dạng chế phẩm khác nhau: dịch ép
cây tươi, dịch sắc trong nước (1 :1 ), dịch chiết trong cồn, dịch saponin toàn phần
(1:1). Kết quả cho thấy Cóc mẳn có tác dụng giảm ho ở các dạng chế phẩm và
liều thử (P<0,01), song dưới dạng nước ép và dịch saponin toàn phần có tác
dụng giảm ho tốt hơn cả so với các dạng chế phẩm còn lại ở liều 0 ,5 g/kg thể
trọng (chuột) và tác dụng giảm ho của 2 dạng chế phẩm này ở liều 0,25g/kg thể
trọng (chuột) và 0,50g/kg thể trọng (chuột) có tác dụng giảm ho tốt hơn cả
Codein phosphat ở liều 0,25g/kg thể trọng (chuột) [13].
4
1.7.2. Tác dụng long đờm trên chuột nhắt trắng
Tác dụng long đờm của Cốc mẳn đã được thử ở nhiều dạng chế phẩm:
nước ép cây tươi, nước sắc, dịch chiết cồn, dịch saponin toàn phần (1 :1 ) trong đó
dịch chiết trong cồn và dịch saponin toàn phần ở liều 0,25g/kg thể trọng (chuột)
có tác dụng tốt hơn natribenzoat ở liều l,25g/kg thể trọng [15].
1.7.3. Tác dụng giãn khí quản trên chuột lang cô lập
Ở điều kiện bình thường, Cóc mẳn có tác dụng giãn khí quản nhẹ và yêu
trên khí quản chuột lang cô lập.
Trên khí quản bị co thắt bởi acetylcholin thì cao lỏng Cóc mẳn (1:1) có

tác dụng giãn khí quản rõ rệt với tỷ lệ giãn bằng 74,5%.
Khi khí quản bị giãn bởi adrenalin thì Cóc mẳn vẫn tiếp tục gây giãn
nhưng yếu.
1.7.4. Tác dụng kháng khuẩn
Cây Cóc mẳn đã được thử tác dụng kháng khuẩn ở nhiều dạng chế phẩm
khác nhau: dạng nước ép (1 :1 ), dịch saponin toàn phần, dịch chiết coumarin
toàn phần ở các nồng độ khác nhau, trên các chủng khác nhau [15].
Gr{+): Bacillus subtilis 958, Bacillus pulminis ATCC10241, Bacillus ceveus
ATCC 9946, Sarcina lutca ATCC 9341, Staphylocccus aureus ATCC 12228.
Gr(-): Echrichia coli 1026B6, Proteus mirabilis, Shigella ílexneri 11,
Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa 27853 [15].
Kết quả cho thấy dịch chiết coumarin toàn phần có tác dụng trên hầu hết
các chủng vi khuẩn, đặc biệt là ức chế sự phát triển của trực khuẩn mủ xanh.
Bên cạnh những tác dụng dược lý như đã kể trên, Cóc mẳn còn là cây ít
độc tính, không độc ở liều 125g/kg thể trọng.
5
1.8. Công năng, chủ trị
Cóc mẳn có vị đắng, tính ấm [7].
Theo kinh nghiệm y học cổ truyền phương Đông, Cóc mẳn có tác dụng
nhuận phế, chỉ ho, bình suyễn, điều trung, ích khí, khử phong, trừ thấp, lương
huyết, hạ huyết dùng để điều trị viêm khí quản mạn tính, ho suyễn, phong thấp,
đau nhức, cao huyết áp [7], [8 ].
1.9. Cách dùng, liều dùng
1.9.1. Chữa ho
Ở nước ta, nhân dân hay sử dụng Cóc mẳn với mục đích chữa ho đặc biệt
là ho ở trẻ em. Khi bị ho có thể dùng Cóc mẳn 20g khô hoặc 30g tưoi sắc vói
500ml nước rồi uống. Đối vói trẻ ho gà dùng Cóc mẳn phối hợp với Chua me
đất mỗi vị 12g đem giã nhỏ rồi chế vói nước chín, vắt lấy nước cho uống [14].
Khi bị cảm sốt, ho khan: dùng Cóc mẳn phối hợp với lá xương sông và
râu ngô mỗi vị 40g sắc với 300ml nước đến khi còn 200ml thì chia thành 2 phần

uống trong ngày [14].
1.9.2. Chữa viêm mũi
Dùng Cóc mẳn để chữa viêm mũi dị ứng, hay viêm mũi mạn tính bằng
cách vò nát Cóc mẳn tưoi và nút vào lỗ mũi. Hoặc dùng chữa bị thương bong
gân hay bị rắn cắn, giã cây Cóc mẳn rồi xoa đắp [21].
1.9.3. Chữa mẩn ngứa (eczema)
Dùng Cóc mẳn 2 phần, đậu xanh 1 phần, muối vài hạt, giã nhỏ cả 3 thứ
rồi đắp lên chỗ bị eczema đã rửa sạch [8 ].
6
1.9.4. Chữa chàm, chốc, lở
Dùng 20-30g cây tưoi đem giã nát rồi bôi trong ngày. Cũng có thể phối
hợp vói hạt cây Lai và ít rượu [14].
1.9.5. Chữa đau mắt
Để điều trị đau mắt đỏ có màng che do viêm loét giác mạc: dùng riêng Cóc
mẳn hay phối hợp với Tỳ giải hoặc Núc nác (Hoàng bá nam), mỗi vị 40g sắc
uống cho kết quả tốt [ 1 1 ].
1.9.6. Một số bệnh khác
Ngoài ra, Cóc mẳn còn có tác dụng lợi tiểu tiện, chữa bệnh giun đũa, bệnh
lị amip, bệnh sốt rét, gãy xương [8 ].
7
Phần 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu
a. Nguyên liệu
- Cây Cóc mẳn dùng để nghiên cứu được thu hái vào tháng 1-2 khi ra hoa tại
Hưng Yên, Thái Bình.
- Cây tươi dùng để mô tả thực vật, làm tiêu bản.
- Sau khi thu hái, làm sạch, phơi khô tự nhiên rồi sấy để xác định tỉ lệ tạp
chất, tỉ lệ vụn nát. Sau đó nghiền nhỏ để soi bột, chiết xuất, phân tích hoá
học và xác định một số chỉ số như: độ ẩm, độ trương nở, tỉ lệ các chất chiết

được trong nước và trong cồn, độ tro toàn phần.
b. Dung môi và hoá chất.
• Dung môi.
-Cồn
- Ether dầu hoả
- n-Butanol
- Cloroform
- Ethylacetate
- Ether ethylic
• Hoá chất
- TT vanilin 1% trong cồn
- TT Diazo
- Dd NaOH 0,1N; 5%
8
- Dd H2S04 đặc, 10%, 2N
c. Dụng cụ
- Cân phân tích
- Cân kĩ thuật
- Nồi cách thuỷ
- Máy đo độ ẩm Precisa
- Bình Soxhlet
- Tủ sấy
- Các dụng cụ thuỷ tinh
- Máy cất quay dưới áp lực giảm
- Kính hiển vi
- Máy ảnh kĩ thuật số
- Lò nung
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm
a.Thu mẫu và bảo quản.
Dược liệu một phần để cây tươi và ngâm trong cồn, một phần được sấy khô

bảo quản trong túi polymer, để nơi khô ráo.
b. Quan sát đặc điểm hình thái.
Dược liệu được quan sát bằng mắt thường về hình dạng, kích thước, màu
sắc, thể chất.
c. Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu
Bằng phương pháp soi dưới kính hiển vi với vật kính 10,40,100.
9
• Vi phẫu
- Chọn phần dược liệu đặc trưng.
- Tiến hành cắt bằng máy vi phẫu cầm tay.
- Xử lý lát cắt theo trình tự.
Tẩy sáns
Ngâm các lát cắt trong dung dịch Qoramin 10% khoảng 30 phút. Rửa
bằng nước cất nhiều lần cho đến khi hết Cloramin.
Ngâm trong dung dịch acid acetic 10% trong 5 phút.
Rửa lại bằng nước cất.
Nhuôm kép
Nhuộm bằng đỏ son phèn và xanh metylen.
Tiếp tục ngâm trong đỏ son phèn. Rửa bằng nước cất nhiều lần cho đến khi
nước rửa không còn màu hồng.
Nhuộm màu xanh bằng xanh metylen. Rửa lại bằng nước cất cho đến khi
nước rửa không còn màu xanh. Thòi gian nhuộm tuỳ thuộc vào khả năng bắt màu
của từng loại vi phẫu.
Loai nước
Vi phẫu phải được loại sạch nước trước khi cố định. Các lát cắt được khử
nước từ từ với độ cồn tăng dần 10°, 20°, 30°, 80°, 90°, cồn tuyệt, đối. Rửa bằng
xylen nguyên chất 3 lần.
Lên kính
Nhỏ lên phiến kính một giọt bôm/xylen.
Đặt vi phẫu vào giữa giọt bôm và đậy lamen.

Để tiêu bản ở nơi thoáng mát độ 1-2 tuần.
Tiêu bản khô, được đưa lên kính hiển vi, quan sát đặc điểm giải phẫu.
10
Chup ảnh
Sử dụng kính hiển vi có lắp thêm hệ thống video camera chuyển hình ảnh
trực tiếp từ kính hiển vi lên file ảnh vói sự trợ giúp của phần mềm thích hợp để
xử lý, sắp xếp hình ảnh.
Ảnh được in bằng máy in màu.
• Soi bột
- Dược liệu được rửa sạch, sấy khô, nghiền thành bột. Quan sát bằng mắt
thường màu sắc của bột, nếm, ngửi để nhận biết mùi vị từng bột.
- Lên tiêu bản bằng nước hoặc glycerin.
- Quan sát đặc điểm bột bằng kính hiển vi.
- Mô tả các đặc điểm bột như vói vi phẫu.
d. Nghiên cứu thành phần hoá học
• Định tính saponin, coumarin
- Chiết xuất saponin, coumarin.
- Làm các phản ứng thường quy ống nghiệm đối với saponin, coumarin
• Sắc kí saponin Ị
- Phân tích saponin trên sắc kí lớp mỏng Silicagel G2 5 4 hoạt hoá ờ 120°c
trong lgiờ.
Các hệ sắc kí:
+ Hệ 1 n-butanol: acid acetic: nước (4:1:1)
+ Hệ 2
cloroform: methanol (8 :2 )
+ Hệ 3 n-butanol: ethylacetate: nước (4:1:5)
+ Hệ 4 cyclohexan: ethyl acetate (4:6)
+ Hệ 5
cloroform: methanol: nước (65:35:10)
- Thuốc thử phun hiện màu

11
+ Dung dịch H2 S04 20% trong MeOH
+ Dung dịch vanilin 1%/ cồn/ H2 S04 đặc
+ SbCl3 20% trong CHCI3
+ SoiUV
• Định lượng saponin, coumarin theo phương pháp cân.
e. Xác định một số chỉ số theo Dược điển Việt Nam III
• Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy.
• Xác định tro toàn phần theo phương pháp cân.
• Xác định chỉ số trương nở.
• Xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu bằng mắt thường.
• Xác định tỉ lệ vụn nát trong dược liệu bằng rây.
• Xác định các chất chiết được bằng nước và ethanol theo phương pháp
chiết lạnh.
/. Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê [1], [13'].
• Loại bỏ giá trị nghi ngờ:
Tiến hành N phép thử song song, giá trị của các phép thử thu được là
Xj (i=l,2, .N). Sắp xếp các giá tri này theo thứ tự tăng dần Xị, x 2, .XN.
X, là giá tậ nghi ngờ. Để xét xem có phải loại bỏ giá tậ này hay không, dùng
tiêu chuẩn Q
o - X ,-X 2
Vm V -V
yv i A n
So sánh giá trị Qtn với Q tới hạn cho trong bảng (phụ lục 1, trang 37, phân
tích I) nếu Qtn>Q thì loại bỏ kết quả nghi ngờ.
• Giá trị trung bình:
12
N
l xi
1=1

X = J=L_
N
• Độ lệch chuẩn:
s =
ỉ(Xi-X )2
1=1
________
_
___________
N - l
Độ lệch chuẩn tương đối:
Khoảng tin cậy:
RSD% = = . 100
X
|X = X ± 8
<Với ■=& >
Trong đó X: là giá trị trung bình của mẫu
J U : là giá trị thực
s: là độ lệch chuẩn
n: số lượng mẫu
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1. Mô tả thực vật
• Cây tươi (xem hình 2.1)
Đã tiến hành lấy mẫu cây Cóc mẳn ở Hưng Yên và Thái Bình.
Cóc mẳn là loại cây thảo, nhỏ mềm, cành phân nhánh nhiều, mọc sát mặt
đất. Rễ nhiều rễ con, màu vàng nâu. Thân mảnh, dễ gãy, màu xanh nhạt, lá nhỏ
không có cuống, mọc so le, mép lá có răng cưa (3-5), gân chính nổi rõ ở mặt
13
dưói lá, gân phụ không rõ, khi vò có mùi hắc khó chịu. Cụm hoa hình đầu, màu
vàng nhạt, mọc ở ngọn hay ở bên đối diện với một lá.

• Cây khô (xem hình 2.2)
Toàn cây màu nâu, nhăn nheo, lá giòn dễ gãy. Hoa màu vàng nhạt, dễ bị
vụn nát.
2.2.2. Đặc điểm giải phẫu thân (xem hình 2.3)
Ngoài cùng là lớp biểu bì gồm các tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn. Tiếp
theo là mô mềm vỏ gồm các tế bào hình cầu có màng tế bào mỏng, to nhỏ khác
nhau, rải rác trong mô mềm vỏ là các túi tiết tinh dầu. Sát với libe là mô cứng, bó
libe-gỗ, trong cùng là mô mềm ruột.
2.2.3. Đặc điểm bột (xem hình 2.4)
Bột có màu xanh nhạt, có mùi hắc, quan sát dưới kính hiển vi thấy: mảnh
biểu bì có chứa lỗ khí (2), mảnh mô mềm có chứa tế bào lớn (1), bó sọi (4), mảnh
mạch xoắn & mảnh mạch điểm (6 ), mảnh mô mang ống tiết (3), các dạng hạt
phấn (5).
2.2.4. Nghiên cứu thành phần hoá học
a. Saponin
• Định tính
Cân khoảng 20g bột thô dược liệu cho vào cốc có mỏ 250mỊ. Thêm 100ml
cồn 80°. Đun cách thuỷ đến sôi được chừng 10 phút. Lọc, lấy dịch lọc, rồi tiến
hành định tính.
- Quan sát hiện tượng tạo bọt
14
Hình 2.1: Cây Cóc mẳn tươi
Hình 2.2: Cây Cóc mẳn khô
15
Hình 2.3: Yỉ phẫu thân Cóc mẳn
Hình 2.4: Đặc điểm vi học bột cây Cóc mẳn
Cho vào hai ống nghiệm có kích thước bằng nhau mỗi ống 0,5ml dịch
chiết cồn; ống thứ nhất cho thêm 5ml HC1 0,1N; ống thứ hai cho thêm 5ml
NaOH 0,1N. Lắc cả hai ống nghiệm trong 5 phút, để yên trong 15 phút, thấy bọt
bền vững và chiều cao cột bọt ở hai ống bằng nhau. Hiện tượng dương tính vói

saponin triterpenic.
- Quan sát hiện tượng phá huyết
Xử lí máu: Lấy máu thỏ cho vào ống nghiệm đã có sẵn Heparin. Rồi pha
với NaCl 0,9% để có nồng độ 2%.
Xử lí dịch chiết: Cô cạn 20ml dịch chiết cồn rồi hoà tan vào lml NaCl
0,9% (dịch A).
Lấy hai ống nghiệm mỗi ống cho lml dung dịch máu đã pha loãng:
ống 1: cho thêm 1 ml dịch A
ống 2: cho thêm 1 mi NaQ 0,9%
Lắc nhẹ trong 1 phút. Sau đó để yên 3 tiếng. Quan sát thấy:
ống 1 : không có tế bào máu lắng đọng dưới đáy ống nghiệm,
ống 2 : có tế bào máu lắng đọng dưói đáy ống nghiệm.
Hiện tượng dương tính với saponin.
- Phản ứng màu
Cô cạn phần còn lại dịch chiết cồn đến hết mùi cồn, thêm vào 10ml nước
cất, cho vào bình gạn, lắc với ether dầu hoả để loại chlorophyl (làm 3 lần, mỗi
lần 5ml ether dầu hoả), gạn lấy lớp nước. Gộp dịch chiết nước. Đun cách thuỷ
đến khi đuổi hết ether dầu hoả. Dịch chiết nước đem tiến hành làm phản ứng
màu.
+ Phản ứng Rosenthaler: Lấy lml dịch chiết nước cho tác dụng với lml
valinin 1 %/cồn, cho thêm một vài giọt H2 S04 đặc. Xuất hiện màu tím hoa cà.
Phản ứng dương tính vói saponin.
+ Phản ứng Lỉbermann-Buchardt: Lấy ỉượng dịch chiết nước còn lại thêm
lOml H2S04 10%, đun cách thuỷ sôi 30 phút. Lấy sapogenin bằng cách lắc với
CHCI3 3 lần (mỗi lần 5ml). Chia đồi ỉượng dịch chiết CHCI3 vào hai ống
nghiệm, cô đến cạn 1 ống, hoà tan trong 2ml anhydric acetỉc, thêm 2-3 giọt
H2SO4 đặc xuất hiện màu đỏ tía. Phản ứng dương tính vói saponỉn.
+ Phản ứng Saỉkowskỉ: Lượng dịch chiết CHC13 trong ống 2, thêm vài giọt
H2S04đặc thấy xuất hiện màu đỏ tía. Phản ứng dương tính vóỉ saponin.
- Sắc kí lóp mỏng

Dịch chấm sắc kí: Hoà tan cắn được chiết theo hình 2.6 trong cồn cao
độ.
Pha tĩnh: Bản mỏng sỉỉỉcagen G254
Pha động: Hệ n-Butanol: ethyỉacetate : HzO (4:1:5)
Thu được bốn vết (xem hình 2.5)
Bảng 2.1: Màu sắc và Rf các vết
phân tích saponin
í : 3
* 2
MỂÊÊ 1
Hình 2.5: Sắc ký đồ phân tích saponin
Công thức: Rf = -
STT Rf Màu
1
0,15 Tím đậm
2
0,37
Vàng đậm
3
0,48 Vàng nhạt
4
0,59 Vàng nhạt
18
• Định lượng
Hình 2.6: Quá trình chiết xuất saponin toàn phần.
Lấy chính xác một lượng khoảng lOg bột thô dược liệu, loại chlorophyl
bằng ether dầu hoả trong bình soxhlet đến khi hết màu xanh. Tãi khô, dùng
ethanol 80° để chiết saponin bằng soxhlet đến khi hết màu. Dịch chiết được cất
thu hồi dung môi cho đến cao đặc. Hoà tan trong nước, cho vào bình gạn rồi lắc
kĩ vói n-butanol (làm 5 lần, mỗi lần khoảng 5ml), lấy lớp n-butanol, gộp dịch

chiết n-butanol rồi cô đến cắn để định lượng và sắc kí lớp mỏng.
19
Lấy cắn thu được bằng cách chiết xuất theo hình 2.6, sấy ở 80° trong 3
giờ. Rồi xác định khối lượng cắn đó.
Tiến hành làm 5 mẫu.
Kết quả định lượng saponin toàn phần được ghi trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Hàm lượng % Saponỉn toàn phần trong Cóc mẳn
Mẫu
b(g)
c(%)
a(g)
X(%)
1 10,05
5,78
0,3171
3,35
2
10,03
6,82
0,3018 3,23
3
10,04 3,68
0,3162 3,27
4 10,03
5,70 0,3249
3,44
5
10,09
4,94 0,3396
3,54

Số liệu thống kê

X = 3,36
S = 0,11
RSD (%) = 3,36 %
£ = 0,14
Công thức tính: X (%) =—— .104
b.ạ-c)
Trong đó: a: khối lượng cắn (g)
b: khối lượng bột thô dược liệu (g)
c: độ ẩm (%)
X: hàm lượng saponin (%)
Nhận xét: Hàm lượng saponin nằm trong khoảng 3,36% ± 0,14% (độ tin cậy
95%). Vậy hàm lượng saponin tối thiểu phải có trong dược liệu sẽ là: 2,95%.
20