phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic ứng dụng trong lên men thủy sâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC










LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC






PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC
ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN THỦY SÂM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
CN. PHẠM HỒNG QUANG LÊ THỊ MỸ XUYÊN
MSSV: 3104008
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36







Cần Thơ, Tháng 12/2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC











LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC
ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN THỦY SÂM





















Cần Thơ, Tháng 12/2013
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
CN. PHẠM HỒNG QUANG
SINH VIÊN THỰC HIỆN

LÊ THỊ MỸ XUYÊN
MSSV: 3104008
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36
PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)



CN. Phạm Hồng Quang Lê Thị Mỹ Xuyên


DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

LỜI CẢM TẠ
Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã
nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận
tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được
luận văn tốt nghiệp này tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học
Cần Thơ đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn.
Thầy Phạm Hồng Quang là cán bộ hướng dẫn đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Thầy Huỳnh Xuân Phong và anh Nguyễn Ngọc Thạnh cán bộ phụ trách phòng
thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện
tốt nhất về dụng cụ cũng như trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành đề tài này.
Cô Nguyễn Thị Pha, cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học Khóa 36 đã động viên và
kích lệ tinh thần trong suốt thời gian học tập tại trường.
Thân gửi đến tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 lời cảm ơn chân thành, đặc biệt
là các bạn, các anh chị trong phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm đã
luôn sát cánh bên tôi.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về
mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống và hoàn
thành luận văn tốt nghiệp.

Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn
thành công.

Lê Thị Mỹ Xuyên
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƢỢC
Thủy sâm là sản phẩm lên men với sự kết hợp của nấm men và vi khuẩn acid
acetic với nhiều công dụng cho sức khỏe, trong đó vi khuẩn acid acetic có vai trò đặc
biệt quan trọng tác động đến chất lượng sản phẩm. Đề tài này được thực hiện nhằm
phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic có khả năng sinh acid cao và bước
đầu khảo sát các điều kiện lên men thích hợp cho việc sản xuất thủy sâm. Nghiên cứu
được tiến hành qua hai bước: (i) phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic
trong 5 mẫu thủy sâm thu thập từ các địa điểm khác nhau; và (ii) khảo sát các điều
kiện thích hợp cho lên men acid acetic với mật số nấm men 10
5
tế bào/mL, bao gồm
mật số giống chủng, nồng độ đường, pH, nhiệt độ và thời gian lên men. Kết quả thu
được 33 dòng vi khuẩn acid acetic, trong đó dòng HG 3.1 có khả năng sinh acid cao
nhất với tỷ lệ đường kính vòng halo/đường kính khuẩn lạc là 1,57. Điều kiện thích hợp
cho quá trình lên men acid acetic trong môi trường nước trà được xác định là mật số
giống chủng 10
5
tế bào/mL, nồng độ đường 15ºBrix, pH môi trường dịch trà (5,23) và
thời gian lên men 7 ngày ở nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32ºC). Lượng acid
sinh ra đạt 0,23% w/v.
Từ khóa: Giấm, lên men, thủy sâm, vi khuẩn acid acetic.

Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT ix
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Giới thiệu chung về acid acetic 2
2.1.1. Khái niệm 2
2.1.2. Tính chất hóa học 3
2.1.3. Ứng dụng 3

2.1.4. Phương pháp sản xuất 4
2.2. Giới thiệu lên men acid acetic 6
2.2.1. Bản chất của quá trình lên men acid acetic 6
2.2.2. Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic 7
2.2.3. Các phương pháp lên men acid acetic 7
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men acid acetic 12
2.3. Vi khuẩn acid acetic 15
2.3.1. Đặc điểm chung 15
2.3.2. Phân loại 16
2.4. Giới thiệu về trà 20
2.4.1. Giới thiệu chung 20
2.4.2. Thành phần 22
2.4.3. Công dụng 23
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2.5. Giới thiệu thủy sâm 23
2.5.1. Nguồn gốc 23
2.5.2. Giá trị dinh dưỡng 24
2.5.3. Công dụng 27
2.5.4. Quy trình lên men thủy sâm 28
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 29
3.1.1. Địa điểm 29
3.1.1. Thời gian nghiên cứu 29
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 29
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 29
3.2.2. Nguyên vật liệu 29
3.2.3. Hóa chất 29
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 30
3.3.1. Các phương pháp phân tích lý hóa 30

3.2.3. Xử lý số liệu, phân tích thống kê 30
3.4. Nội dung và bố trí thí nghiệm 30
3.4.1. Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy
sâm 30
3.4.2. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh 31
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men 32
3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và pH đến quá trình lên men 32
3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men 33
3.4.6. Thử nghiệm quy trình sản xuất thủy sâm 33
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 35
4.1. Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy
sâm 35
4.2. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh 41
4.3. Ảnh hƣởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men 43
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng và pH đến quá trình lên men 46
4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian lên men 49
4.6. Thử nghiệm quy trình sản xuất thủy sâm 51
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 53
5.1. Kết luận 53
5.2. Đề nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các phương pháp phân tích
Phụ lục 2: Các hình ảnh
Phụ lục 3: Số liệu thí nghiệm
Phụ lục 4: Kết quả phân tích thống kê

Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Các thuộc tính của acid acetic 2
Bảng 2. Phân loại khoa học của trà (chè) 21

Bảng 3. Thành phần chất khô của thủy sâm 25
Bảng 4. Thành phần acid amin của thủy sâm 26
Bảng 5. Thành phần cho 1000mL môi trường YPGD 30
Bảng 6. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường YPGD 35
Bảng 7. Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn AAB ủ ở 30ºC sau 72 giờ 38
Bảng 8. Sự chuyển màu môi trường của các dòng vi khuẩn AAB 41
Bảng 9. Kết quả đánh giá cảm quan ở các mật số giống chủng khác nhau 45
Bảng 10. Kết quả đánh giá cảm quan ở các nồng độ đường và pH khác nhau 48
Bảng 11. Kết quả đánh giá cảm quan ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau 51
Bảng 12. Kết quả chỉ tiêu theo dõi sản phẩm sau lên men 52
Bảng 13. Chỉ tiêu đánh giá cảm quan
Bảng 14. Kích thước khuẩn lạc, tỉ lệ đường kính vòng halo/đường kính khuẩn lạc ủ ở
30ºC sau 72 giờ
Bảng 15. Sự thay đổi hàm lượng acid theo mật số giống chủng
Bảng 16. Sự thay đổi hàm lượng acid theo độ Brix và pH
Bảng 17. Sự thay đổi hàm lượng acid theo nhiệt độ và thời gian


Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Ba cách miêu tả của cấu trúc acid acetic 3
Hình 2. Thiết bị lên men acid aceti theo phương pháp chậm 8
Hình 3. Thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh 9
Hình 4. Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp chìm 11
Hình 5. Thiết bị lên men acid theo phương pháp hỗn hợp 12
Hình 6. Acetobacter aceti 18
Hình 7. Acetobacter pasteurianum 18
Hình 8. Acetobacter xylinum 19

Hình 9. Acetobacter suboxydans 20
Hình 10. Lá trà Camellia sinensis 21
Hình 11. Sản phẩm thủy sâm trên thị trường 24
Hình 12. Quy trình sản xuất thủy sâm 28
Hình 13. Quy trình sản xuất thủy sâm 34
Hình 14. Vùng sáng do vi khuẩn AAB sinh ra trên môi trường YPGD 36
Hình 15. Hình dạng tế bào vi khuẩn AAB trên kính hiển vi với độ phóng đại X100
37
Hình 16. Tế bào bắt màu đỏ sau khi nhuộm Gram 37
Hình 17. Một số dạng khuẩn lạc của dòng vi khuẩn AAB 39
Hình 18. Sự chuyển màu môi trường của dòng BT 3.1 40
Hình 19. Sự chuyển màu môi trường của dòng TN 1.1 40
Hình 20. Biểu đồ tỉ lệ đường kính vòng halo/đường kính khuẩn lạc 42
Hình 21. Sự biến đổi nồng độ acid ở các mật số giống chủng khác nhau 44
Hình 22. Nồng độ acid sau 7 ngày lên men ở các mật số giống chủng khác nhau 45
Hình 23. Sự biến đổi nồng độ acid ở các nồng độ đường và pH khác nhau 46
Hình 24. Nồng độ acid sau 7 ngày lên men ở các nồng độ đường và pH khác nhau
47
Hình 25. Sự biến đổi nồng độ acid ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau 49
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Hình 26. Nồng độ acid ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau 50
Hình 27. Mẫu thủy sâm khi lên men và thủy sâm thành phẩm 52
Hình 28. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 2.1
Hình 29. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng TN 2
Hình 30. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng HG 3.1
Hình 31. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng HG 1
Hình 32. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 3.2
Hình 33. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 3.3.2
Hình 34. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng HG 3.3.2

Hình 35. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BTh 2.2
Hình 36. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 1.3.1
Hình 37. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 1.2
Hình 38. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng HG 1.1
Hình 39. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng TN 3
Hình 40. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 1
Hình 41. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 2.2
Hình 42. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 3.1
Hình 43. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 4.1
Hình 44. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 4.2
Hình 45. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 4.3.1
Hình 46. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 4.3.2
Hình 47. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BTh 1.1
Hình 48. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BTh 1.2
Hình 49. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 1.1
Hình 50. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 1.2.1
Hình 51. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 1.3
Hình 52. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 1.4
Hình 53. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 2.1
Hình 54. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 2.2
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Hình 55. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 3.1.1
Hình 56. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng CD 3.1.2
Hình 57. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng HG 3.2
Hình 58. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng HG 3.3.1
Hình 59. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng TN 1.1
Hình 60. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng TN 1.2

Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ix Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TỪ VIẾT TẮT
AAB: Acid acetic bacteria
A.: Acetobacter
NADH
2
: Methylenetetrahydrofoate reductase
NADP: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate
YPGD: Yeast extract-Polypeptone-Glycerol-D glucose
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Trà là một loại thức uống phổ biến có từ rất lâu đời. Uống trà không đơn giản chỉ
là một thói quen thường ngày trong những giây phút rãnh rỗi hoặc ngồi thư giãn. Cứ
mỗi tách trà lại mang đến nhiều lợi ích cho cơ thể nhờ vào hàm lượng chất chống oxy
hóa cực kỳ dồi dào có trong loại đồ uống này với nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe
như thanh lọc cơ thể, giảm cholesterol, chống lại các cơn bệnh về tăng huyết áp, bệnh
về đường tiêu hóa, mất ngủ,…
Ngoài các loại thức uống thì thực phẩm cũng là một phần không thể thiếu trong
việc hỗ trợ bảo vệ sức khỏe của con người. Đối với Việt Nam cũng như các nước trên
thế giới, việc sử dụng các loại thực phẩm từ lên men rất được chú trọng với nhiều sản
phẩm đa dạng từ truyền thống đến hiện đại từ trong nước đến du nhập từ nước ngoài
như: tương, chao, rau cải muối chua, nem, chả, sữa chua, yoghurt, thủy sâm,…
Thủy sâm là sự kết hợp tuyệt vời giữa thức uống và thực phẩm. Qua quá trình lên
men hỗn hợp trà đường của nấm men và vi khuẩn acid acetic tạo ra sản phẩm có vị
chua chua ngọt ngọt phù hợp với khẩu vị của nhiều nguời, trong đó vi khuẩn acid
acetic là một nhân tố quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm lên men. Tuy nhiên
tình hình sản xuất thủy sâm hiện nay còn rất nhiều hạn chế, chủ yếu thực hiện ở quy
mô hộ gia đình, thực hiện thủ công nên không đồng đều về chất lượng ảnh hưởng đến
sức khỏe người tiêu dùng.
Do đó, việc tìm ra các dòng vi khuẩn acid acetic và nấm men cùng với những
điều kiện tốt cho quá trình lên men thủy sâm là vô cùng quan trọng. Với mục đích
tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic sinh acid cao và bước đầu khảo sát một số
điều kiện thích hợp cho quá trình lên men nhằm tạo ra sản phẩm thủy sâm an toàn cho
người sử dụng mà đề tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic ứng dụng
trong lên men thủy sâm” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic sinh acid cao, xác định các

điều kiện thích hợp để lên men thủy sâm với dòng vi khuẩn đã tuyển chọn.

Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về acid acetic
2.1.1. Khái niệm
Acid acetic có công thức phân tử là CH
3
COOH hay còn gọi là ethanoic acid, là
một acid hữu cơ (acid cacboxylic), mạnh hơn acid carbonic. Phân tử gồm có nhóm
methyl (-CH
3
) liên kết với nhóm cacboxyl (-COOH), khối lượng phân tử 60,5 g/mol.
Acid acetic là một chất lỏng không màu, có mùi sốc, vị chua, có khả năng hút ẩm từ
không khí (Nguồn: ngày 27/06/2013).
Trong dung dịch acid acetic tồn tại các dạng (CH
3
COOH)
2
, (CH
3
COOH)
3
, sự tồn
tại các phân tử kép như trên là do các liên kết hydro giữa các phân tử với nhau.
Acid acetic tan tốt trong nước, ethanol, eter, benzene, acetone và chloroform; không
tan trong CS
2

. Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic và
permanganate. Có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose, phân
hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim loại (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Ngoài ra nó
cũng là dung môi tốt cho nhiều hợp chất hữu cơ (nhựa, tinh dầu, ).
Bảng 1. Các thuộc tính của acid acetic
Thuộc tính
Công thức phân tử
C
2
H
4
O
2

Trọng lượng phân tử
60,05 g mol
-1

Bề ngoài
Lỏng không màu
Tỷ trọng
1,049 g/cm
3
(L)
1,266 g/cm
3
(s)
Điểm nóng chảy
16,5ºC, 290ºK, 6ºF
Điểm sôi

118,1ºC, 391ºK, 245ºF
Độ hòa tan trongnước
Có thể hòa tan hoàn toàn
Độ acid (pK
a
)
4,76 ở 25ºC
Độ nhớt
1,22 mPa.s ở 25ºC
(*Nguồn: ngày 27/06/2013)


Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

2.1.2. Tính chất hóa học
Nguyên tử hydro (H) trong nhóm carboxyl (−COOH) trong các acid cacboxylic
như acid acetic có thể cung cấp một ion H
+
(proton), làm cho chúng có tính chất acid.
Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid monoprotic, có K
a
bằng 4,75. Nó tạo ra
gốc liên kết là acetate (CH
3
COO
−
). Dung dịch 1,0 M (tương đương nồng độ giấm gia
đình) có pH là 2,4, cho thấy chỉ 0,44% các phân tử acid acetic bị phân ly.

Acid acetic lỏng là dung môi protic dính ướt (phân tử phân cực), tương tự
như ethanol và nước. Với hằng số điện môi trung bình khoảng 6,2 nó có thể hoà tan
không chỉ trong các hợp chất phân cực như các muối vô cơ và các loại đường mà nó
còn có khả năng hòa tan trong các hợp chất không phân cực như dầu, các nguyên
tố như lưu huỳnh và iod. Nó cũng có thể hòa trộn với các dung môi phân cực và không
phân cực khác như nước, chloroform và hexan. Đối với các ankan cao phân tử
(từ octan trở lên) acid acetic không có khả năng trộn lẫn một cách hoàn toàn và khả
năng trộn lẫn tiếp tục giảm khi số n-ankan càng lớn. Tính chất hòa tan và độ trộn lẫn
của acid acetic làm cho nó được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp.
2.1.3. Ứng dụng
Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và
trong sản xuất công nghiệp. Những ứng dụng quan trọng của acid acetic bao gồm:
 Ứng dụng trong chế biến mủ cao su
Trong ngành công nghiệp sản xuất mủ cao su, người ta rất sợ hiện tượng đông
đặc của mủ trước khi về đến nhà máy chế biến. Để chống đông mủ cao su, người ta
cho thêm vào mủ nước những chất chống đông. Thường người ta dùng dung dịch NH
3

3%. Thời điểm cho dung dịch NH
3
vào mủ là lúc trút mủ vào xô, thùng,….
Khi đông tụ mủ, người ta pha loãng và khuấy trộn đều, sau đó cho thêm vào
dung dịch acid acetic 2,5% với lượng là 3,5-10 kg/tấn dung dịch mủ cao su.
Hình 1. Ba cách miêu tả cấu trúc của acid acetic
(*Nguồn: ngày 27/06/2013)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Ở Việt Nam hiện nay, mỗi năm sản xuất khoảng 800000 tấn cao su (50% trong
đó được sử dụng trong nước, còn 50% thì xuất khẩu). Như vậy lượng acid acetic sử
dụng trong chế biến mủ cao su là rất lớn. Mặc dù vậy, nước ta vẫn phải nhập acid
acetic từ nước ngoài (chủ yếu là từ Trung Quốc).
 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Với hàm lượng acid acetic từ 2-5%, người ta gọi dung dịch này là giấm ăn. Giấm
ăn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để chế biến đồ hộp, rau, quả, gia vị trong
các bữa ăn gia đình. Lượng giấm ăn sử dụng trong công nghiệp thực phẩm là rất lớn,
do đó, việc sản xuất giấm ăn không thể mang tính chất thủ công truyền thống mà đã
trở thành một ngành sản xuất theo quy mô công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới.
 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác
Acid acetic được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: công
nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ (ethyl acetate, butyl acetate, cellulose,
acetate, acetone,…). Tổng hợp chất dẻo, tơ sợi, nhựa PVA, trong dược phẩm (điều chế
aspirine). Ngày nay, acid acetic và các dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu và ứng
dụng cho các ngành công nghệ cao như sản xuất phim ảnh không cháy, thủy tinh
không vỡ…
Những ngành sản xuất này đòi hỏi lượng acid acetic nhiều và có chất lượng cao
hơn dung dịch acid acetic dùng trong công nghệ thực phẩm và trong công nghệ chế
biến mủ cao su (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.1.4. Phƣơng pháp sản xuất
Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và từ rất lâu. Do đó,
loài người đã phát minh ra nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất acid acetic,
những phương pháp sản xuất acid acetic bao gồm:
- Phương pháp hóa gỗ

- Phương pháp hóa học
- Phương pháp sinh học
- Phương pháp kết hợp


Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

 Phương pháp hóa gỗ
Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp khai thác và chế biến gỗ, con
người đã biết cách sản xuất ra acid acetic từ dạng nguyên liệu này.
Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men (giấm gỗ, bột gỗ, tách acid acetic trực tiếp từ
nước ngưng khi chưng gỗ). Người ta thu được nhiều chất khác nhau, trong đó có acid
acetic có hàm lượng rất lớn. Hiện nay phương pháp này không còn được sử dụng.
 Phương pháp hóa học
Từ C
2
H
2
, C
2
H
5
OH hay C
2
H
4
tiến hành tổng hợp có xúc tác sẽ thu được
acetaldehyde, oxy hóa acetaldehyde nhờ có xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao sẽ thu
được acid acetic.

Giai đoạn oxy hóa acetaldehyde thành acid, dùng xúc tác magan, rồi sau đó
chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50-80ºC để thu được acid có hiệu suất cao.
Phương pháp này có giá trị thực tế khá cao, nhưng do tạo nhiều sản phẩm phụ
nên làm giảm hiệu suất phản ứng.
Phương pháp mới nhất hiện nay là tổng hợp từ metanol và CO bằng phản ứng
cacbonyl hóa:
CH
3
OH + CO  CH
3
COOH
 Phương pháp sinh học
Hiện nay người ta sản xuất acid acetic chủ yếu bằng phương pháp lên men (sản
phẩm là giấm ăn). So với những phương pháp khác, phương pháp lên men có những
ưu điểm:
- Công nghệ sản xuất acid acetic hoàn toàn không gây ô nhiễm môi trường.
- Quá trình chuyển hóa (hay quá trình lên men) được thực hiện ở điều kiện rất ôn
hòa, không cần nhiệt độ cao, áp suất cao hay máy móc thiết bị phức tạp.
- Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm. Có
thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước ép dứa, nước ép mía ),
có thể sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và có thể sử dụng cồn công nghiệp.
 Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua 3 giai đoạn chuyển hóa:
 Giai đoạn chuyển hóa tinh bột thành đường.
 Giai đoạn chuyển đường thành cồn.
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

 Giai đoạn chuyển cồn thành acid.
 Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì chỉ cần qua 2 giai đoạn:
 Giai đoạn chuyển hóa đường thành cồn.

 Giai đoạn chuyển cồn thành acid.
 Nếu sản xuất từ nguyên liệu đã chứa cồn thì ta chỉ cần tạo điều kiện thuận lợi
để vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acid acetic.
Sản xuất acid acetic theo phương pháp sinh hóa thực chất là quá trình oxy hóa
rượu ethylic thành acid acetic nhờ một số vi khuẩn acetic khi có mặt của oxy. Từ trước
đến nay đã xuất hiện 4 phương pháp:
 Phương pháp chậm
 Phương pháp nhanh
 Phương pháp chìm
 Phương pháp hỗn hợp
2.2. Giới thiệu lên men acid acetic
2.2.1. Bản chất của quá trình lên men acid acetic
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu ethylic thành acid acetic, nhờ vi
khuẩn acetic trong điều kiện hiếu khí.
Mọi quá trình muốn hoạt động được đòi hỏi phải có năng lượng. Để thực hiện
được các hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và phát triển của mình thì vi sinh
vật cần phải có năng lượng.
Quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học để thu năng lượng và các
hợp chất trung gian cho tế bào sinh vật. Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng
dưới dạng hóa năng tàng trữ trong mạch carbon và được phóng ra do sự chuyển
electron từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác.
Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong các quá trình lên men là những phản ứng
chuyển hydro. Nhưng sự chuyển hydro cũng tương đương với sự chuyển electron, vì
nguyên tử hydro có thể tách thành proton H
+
và electron. Các enzyme xúc tác quá trình
tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất gọi là enzyme dehydrogenase.
Trong quá trình lên men giấm, rượu ethylic được oxy hóa thành acid acetic. Ở
đây sự chuyển hydro được thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP (dạng oxy hóa).
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

NADP nhận hydro trở thành NADPH
2
được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu năng
lượng. Song cơ chất không bị phân giải hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa
không hoàn toàn.
2.2.2. Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic
Lên men acid acetic là quá trình oxy hoá rượu ethylic thành acid acetic nhờ có
enzyme alcohol oxydase xúc tác trong điều kiện hiếu khí:
CH
3
CH
2
OH + O
2
 CH
3
OOH +H
2
O + 117 kcal
Để chuyển hoá thành acid acetic, rượu và oxy phải thâm nhập vào tế bào vi
khuẩn, ở đây nhờ có enzyme của vi khuẩn xúc tác, rượu được chuyển hoá thành acid
acetic để nhận năng lượng dùng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng theo quá
trình sau:
CH
3
CH
2
OH + 1/2O

2
 CH
3
CHO + H
2
O
CH
3
CHO + H
2
O  CH
3
CH(OH)
2

CH
3
CH(OH)
2
+ 1/2O
2
 CH
3
COOH + H
2
O
Acid acetic tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào của vi khuẩn và đi vào môi trường.
Khi môi trường hết rượu thì vi khuẩn acid acetic sẽ oxy hoá acid acetic thành CO
2
và

H
2
O theo phương trình sau:
CH
3
COOH + 2O
2
 2CO
2
+ 2H
2
O
Chính vì thế, sau khi lên men luôn duy trì lượng ethanol khoảng 0,3-0,5% để vi
khuẩn có thể sử dụng nguồn cơ chất này mà không sử dụng acid acetic như một nguồn
năng lượng (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.2.3. Các phƣơng pháp lên men acid acetic
Yếu tố quan trọng nhất quyết định năng suất và hiệu suất của một phương pháp
sản xuất giấm đó chính là bề mặt tiếp xúc giữa oxy của không khí và hợp chất. Từ đó
con người không ngừng cải tiến, hoàn thiện các phương pháp cũ, tìm ra các phương
pháp mới để sản xuất giấm có hiệu quả và kinh tế hơn. Đến thời điểm hiện tại, đã có 4
phương pháp sản xuất acid acetic bằng cách lên men:
 Phương pháp chậm
 Phương pháp nhanh
 Phương pháp chìm
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

 Phương pháp hỗn hợp
 Phương pháp chậm (phương pháp Pháp)
Đây là phương pháp thủ công đã có từ lâu đời, quá trình lên men giấm diễn ra ở

bề mặt tiếp xúc giữa khối dịch lên men và không khí (bề mặt thoáng) trong thùng lên
men đặt nằm ngang. Rượu vang được acid hóa bằng acid acetic, dịch sản xuất phải
đảm bảo 2% acid acetic và 4% rượu hay 3% acid acetic và 3% rượu.
Người ta đóng các thùng lên men bằng gỗ có dung tích khoảng 250-300 lít bằng
gỗ sồi hình tang trống (giống các thùng sản xuất bia và rượu vang).
Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho. Giống vi khuẩn được sử
dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse (Nguyễn Đức Lượng, 2002).






Để tiến hành sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta làm như sau: đổ vào
thùng 1/5 thể tích giấm tươi chất lượng cao để acid hóa, sau đó đổ thêm dịch lên men
vào cho đến khoảng 1/2 thể tích thùng. Tiếp theo cứ mỗi chu kỳ đổ thêm dịch lên men
vào cho đến khi đầy. Khi nào nhận thấy rượu đã được oxy hóa gần hết (còn lại 0,3-
0,5% rượu) thì lấy giấm ra để đem chế biến và bảo quản, đồng thời cho tiếp dịch lên
men vào để lên men tiếp.
Khi lên men, vi khuẩn giấm phát triển tạo thành màng vi sinh vật trên bề mặt
thoáng, khi bị chấn động (do va chạm hay do quá trình đổ dịch lên men vào và tháo
sản phẩm ra) nó sẽ bị phá vỡ, chìm xuống tiêu thụ cơ chất mà không tạo thành acid
acetic. Dần dần trên mặt thoáng lại hình thành màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá
trình lên men tiếp tục.
Do hạn chế của bề mặt thoáng nên phương pháp này có nhược điểm:
 Thời gian lên men dài.
 Nồng độ acid thấp.
Hình 2. Thiết bị lên men acid acetic theo phƣơng pháp chậm
(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

 Năng suất thấp.
 Thiết bị cồng kềnh.
Nhưng bù lại phương pháp này có ưu điểm là giấm có mùi thơm đặc trưng, dễ
thực hiện.
 Phương pháp nhanh (phương pháp Đức)
Phương pháp này tạo được bề mặt tiếp xúc pha giữa lỏng và khí lớn nhờ bổ sung
vật liệu bám trong thiết bị lên men nên năng suất và hiệu suất cao hơn. Đã khắc phục
được nhược điểm của phương pháp lên men chậm do người Pháp thực hiện.
Người ta thiết kế những thùng lên men rất lớn, hình trụ, thường có kích thước
như sau:
Chiều cao thùng 2,5-6 m.
Có dường kính đáy thùng d = 1,2-3 m.
Tỷ lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng 1/2 là thích hợp nhất.
Trong thùng được chất đầy phoi bào hay lõi ngô (bắp). Phoi bào hay lõi ngô
được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men. Nhờ đó mà vi sinh
vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng. Ngoài ra, ở đáy thiết bị người ta lắp một hệ
thống phân phối không khí đưa từ dưới lên. Môi trường lên men được đưa từ trên
xuống. Toàn bộ thiết bị được thiết kế như Hình 3.

Hình 3. Thiết bị lên men acid acetic bằng phƣơng pháp nhanh
(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)


Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Quá trình vận hành thiết bị được thực hiện như sau:
Đầu tiên dùng acid acetic có nồng độ 3-5% chảy qua lớp phoi bào hay lõi ngô để
vừa có tác dụng acid hóa vật liệu chất mang để vi sinh vật giống dễ thích nghi trong
quá trình lên men. Sau đó dùng nước vô trùng rửa qua và cho giống vi khuẩn acid
acetic vào. Vi khuẩn acid acetic sẽ bám vào phoi bào hay lõi ngô. Tiếp đó cho dòng
môi trường từ trên xuống qua hệ thống phân phối. Môi trường sẽ được phân phối đều
khắp vật liệu phoi bào hay lõi ngô, cùng lúc sẽ thổi khí từ dưới lên.
Môi trường được đưa từ trên xuống, chảy qua lớp chất mang có chứa vi khuẩn.
Vi khuẩn sẽ hấp thụ ethanol, không khí được đưa từ đáy thiết bị lên trên sẽ thẩm thấu
vào trong tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn tiến hành oxy hóa ethanol thành acid sẽ thấm qua
màng tế bào đi ra ngoài và theo dung dịch xuống đáy thiết bị lên men thu nhận sản
phẩm ở đáy thiết bị lên men.
Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24-37ºC. Thời gian lên men kéo dài
8-10 ngày. Trong trường hợp dịch lên men cuối cùng chứa hàm lượng acid acetic thấp,
tiến hành tái lên men bằng cách bơm chúng ngược lại từ trên xuống.
Ưu điểm của phương pháp:
 Thời gian lên men ngắn.
 Thiết bị tương đối đơn giản, năng suất cao, ổn định.
 Giấm thu được có nồng độ cao (có thể đến 10-11%).
Nhược điểm của phương pháp:
 Hiệu suất không cao do mất mát rượu và acid.
 Dùng vật liệu bám phải phù hợp.

 Phương pháp chìm (phương pháp sục khí)
Cho không khí sục qua khối dịch lên men mãnh liệt sẽ tạo thành một thể huyền
phù có pha rắn là các vi khuẩn giấm, pha lỏng là dịch lên men trong các thiết bị lên
men có tên là acetator, dịch rượu được chuyển hóa thành giấm rất nhanh.
Phương pháp này có hiệu suất cao, tối thiểu là 91-92%, nếu khống chế tốt ở điều
kiện vận hành có thể đạt 98-99%. Nó được ra đời từ những kết quả của phương pháp
nuôi cấy chìm để sản xuất thuốc kháng sinh, sản xuất men bánh mì.
Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Tuy có được ưu điểm lớn nhưng mãi đến gần đây, phương pháp này mới được
ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, nguyên nhân là do nhu cầu phức tạp của thiết bị, tính
ổn định không cao và quan trọng là yêu cầu nghiêm ngặt về việc cấp oxy liên tục.









 Phương pháp hỗn hợp (phương pháp lai)
Đây là phương pháp lai giữa hai phương pháp nhanh và chìm. Hệ thống lên men
để sản xuất được thiết kế như sau:
Phần trên như generator có đổ đầy đệm, hoạt động theo nguyên tắc lên men
nhanh.
Ở giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống.
Phần cuối cùng là hệ thống thổi khí mạnh tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như
một acetator của phương pháp chìm.

Phương pháp kết hợp này có rất nhiều ưu điểm, trong đó ưu điểm nhất là hiệu
suất lên men rất cao, nồng độ acid acetic thu được thường nằm trong khoảng 10-12%.
Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả hai phương pháp nhanh và chìm,
nhưng thiết bị yêu cầu quá phức tạp, cồng kềnh, giống vi khuẩn phải phù hợp với cả
hai phương pháp.





Hình 4. Thiết bị lên men acid acetic theo phƣơng pháp chìm
(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)



Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 12 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học











2.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men acid acetic
 Ảnh hưởng của oxy (sự thoáng khí)

Theo cơ chế phản ứng nhận thấy quá trình lên men acid acetic là phản ứng oxy
hóa, trong đó oxy đóng vai trò chất nhận hydro, nên sự có mặt của oxy đóng vai trò
quan trọng trong quá trình lên men.
Phương trình tổng quát:
C
2
H
5
OH + O
2
 CH
3
COOH + H
2
O + 117Kcal
Về mặt lý thuyết, để oxy hóa hết 1 mol rượu thì cần 1 mol oxy tự do, tức là để
oxy hóa hết 1kg rượu khan cần 2,3 m
3
không khí ở điều kiện tiêu chuẩn. Trong sản
xuất, độ thoáng khí càng cao thì quá trình oxy hóa càng tốt, năng suất cao (Nguyễn
Đức Lượng, 2003). Trong phương pháp chậm, dịch lên men tiếp xúc với không khí và
hấp thụ oxy qua bề mặt thoáng. Do hạn chế của bề mặt tiếp xúc nên phương pháp này
chậm, năng suất thấp.
Trong phương pháp nhanh, do được bổ sung các vật liệu xốp (vỏ bào, than gỗ,
cốc…) nên làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa môi trường dinh dưỡng và không khí, cải
thiện điều kiện không khí do đó thúc đẩy quá trình lên men.
Ở phương pháp chìm thì người ta sục khí mạnh liên tục qua dung dịch lên men
nhờ đó đã phân tán đều không khí vào môi trường lên men, tạo nên bề mặt tiếp xúc lớn
làm tăng quá trình lên men.
Hình 5. Thiết bị lên men acid acetic theo phƣơng pháp hỗn hợp

(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)