Khoá luận tốt nghiệp đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC46 NSC68) bằng chỉ thị phân tử SSR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH-KTNN
===£0lGũlGa===
KHƯƠNG THỊ BÍCH
■
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG
LÚA ƯU TÚ (NSC46 - NSC68) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
SSR
KHÓA LUÂN TỐT NGHIÊP ĐAI HOC • • • •
Chuyên ngành: Dỉ truyền phân tử
Ngưòi hướng dẫn khoa học TS.
KHUẤT HỮU TRUNG
HÀ NỘI – 2015
■
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của
TS. Khuất Hữu Trung, viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam. Nội dung nghiên cứu, các
trích dẫn đều có nguồn gốc rõ ràng, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực, không sao chép từ bất cứ tài liệu nào, toàn bộ đều là công trình nghiên cứu của
cá nhân tôi qua quá trình tìm tòi, học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chịu trách nhiệm
về đề tài nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên
Khương Thị Bích
Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn, sự cảm kích sâu sắc đến TS. Khuất Hữu Trung
đã dành nhiều thòi gian, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình
học tập nghiên cứu đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thảnh tới đội ngũ cán bộ Bộ môn Kỹ thuật di truyền -
viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn kỹ thuật, cung cấp cho tôi
những thông tin và tài liệu bổ ích giúp tôi hoàn thành luận văn này.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tói quý thầy giáo, cô giáo khoa Sinh - KTNN Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình giảng dạy, tâm huyết, truyền đạt kiến thức và kinh
nghiệm của mình cho tôi trong suốt 4 năm học qua.

Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tói những người thân trong gia đình luôn ở bên
cạnh tôi, giúp đỡ, động viên tôi; cảm ơn những người bạn đã giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên
Khương Thị Bích
LỜI CẢM ƠN
DANH MUC CÂC CHCTVIÉT TÂT
DANH MỤC BẢNG BIẺU& HÌNH ẢNH Danh mục bảng
Bảng 1.1: Sản lượng gạo xuất khẩu và dự trữ gạo tại một số nước trên thế giới.
8
MỤC LỤC
AFLP: Amplified fragment length polymorphism
CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat
FAO: The World FoodOrganization
IRRI: International Research Ricelnstitute
PCR: Polymerase chain reaction
PIC: Polymorphic Information Content
QTL: Quantitative trait loci
RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
RNA: Ribonucleic acid
SSR: Simple sequence repeats
TAE: Tris-acetat-acid EDTA
TE: Tris EDTA
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là cây lương thực lâu đời nhất có tầm quan trọng đặc biệt đối vói

hơn một nửa dân số thế giói. Lúa gạo được trồng ở nhiều nơi ừên thế giới, có diện
tích gieo trồng đứng thứ hai sau lúa mì. Tổng sản lượng lúa đứng thứ ba sau lúa
mì và ngô. Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm 1/10 diện tích đất trồng của cả thế
thế giới phân bố chủ yếu ở khu vực Châu Á (chiếm 13 nước trong tổng số 15
nước trồng lúa với diện tích hơn 1 triệu ha).
Ở Việt Nam, vói vị trí địa lí và điều kiện khí hậu thuận lọi nước ta là một
trong những nước có truyền thống về lúa nước cổ xưa nhất thế giới. Dân số nước
ta hiện có hơn 80 triệu người và 100% người Việt sử dụng lúa gạo làm lương thực
chính. Nông nghiệp trồng lúa nước vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa
là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Vì vậy, lúa có vai trò vô cùng quan trọng
trong nền kinh tế quốc dân.
Với lịch sử lâu đời về trồng lúa, nước ta có một nguồn gen lúa tự nhiên YÔ
cùng phong phú và đa dạng từ các loài lúa trồng và lúa hoang dại (Trần Thị Hòa,
Triest, 1999)[3]. Để có thể khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả nguồn gen
này, trong chọn giống càn phải có những hiểu biết cơ bản và thiết yếu về mức độ
đa dạng di truyền giữa các giống. Sự phát triển và những thành tựu đạt được trong
sinh học phân tử đã cung cấp những công cụ thích họp cho nghiên cứu đa dạng di
truyền, cho phép ta xác định khoảng cách di truyền một cách nhanh chóng và
chính xác.
Trong số các chỉ thị thì chỉ thị SSR được đánh giá là có nhiều ưu điểm hơn
so với các chỉ thị khác, đơn giản ữong phân tích di truyền, có khả năng cho đa
hình cao, có bản chất đồng trội, có độ chính xác cao, di truyền theo quy luật
Menden.
5
Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa có ý nghĩa to lớn trong việc đánh giá,
phân loại và sử dụng nguồn gen trong chọn tạo giống lúa. Do vậy, xuất phát từ
những hiểu biết về đa dạng di truyền, để khai thác được nguồn gen quý phục vụ
cho chọn giống chúng tôi tiến hành thực nghiệm đề tài nghiên cứu: “Đánh giá đa
dạng dì truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC46 - NSC68) bằng chỉ thị phân tửSSR”.
2. Mục đích nghiền cứu

Nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu,xác định các
alen đặc trưng, alen hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ
cho nghiên cứu chọn và lai tạo giống và định hướng phát triển giống lúa thuần
năng suất cao, chất lượng tốt. Đánh giá đa dạng di truyền kết họp với phân tích di
truyền các giống lúa về chức năng gen, các đặc tính sinh lý, sinh hóa, trao đổi
chất .nhằm mục đích bảo tồn, duy trì nguồn gen quý, phục vụ cho chọn tạo
giống mới ưu tú có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu với các
điều kiện bất lợi của môi trường, sẵn sàng đối phó với mọi biến đổi của điều kiện
khí hậu.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú NSC46 -
NSC68 bằng chỉ thị phân tử SSR.
- Thu mẫu lúa NSC
- Xử lí mẫu, tách chiết DNA
- Phản ứng PCR
- Điện di sản phẩm PCR
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ỷ nghĩa khoa học
Cung cấp thêm nhiều dữ liệu, thông tin khoa học hữu ích cho công tác
nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền của giống lúa ưu tú.
6
Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa tạo cơ sở lý luận cho
việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa trong
việc chọn tạo giống mới.
Phân tích đa dạng di truyền có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các
alen hiếm, alen đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ
nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng
nguồn gen lúa ở mức phân tử.
4.2. Ỷ nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua các chỉ thị phân tử

góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo
giống lúa có phẩm chất tốt, năng suất cao, phù hợp với điều
kiện khí hậu, môi trường sống và cơ cấu sản xuất lúa trong
các vùng ở Việt Nam.
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc cây lúa
Cây lúa là một trong những cây trồng có lịch sử lâu đời nhất thế giói, là
một trong năm loại cây lương thực chính của thế giói, cùng với ngô (Zea maysL.),
lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz) và khoai tây ị Solanum
tuberosum L.). Người ta cho rằng lúa là một cây trồng cổ, có vai trò quan trọng
trong đòi sống và lịch sử phát triển của hàng ngàn triệu người trên thế giới. Căn
cứ vào các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam cây lúa đã có mặt
từ 3.000-2.000 năm TCN. Ở Trung Quốc, vùng Triết Giang đã xuất hiện cây lúa
5.000 năm, ở hạ lưu sông Dương Tử 4.000 năm. Tuy nhiên trên thực tế vẫn còn
nhiều ý kiến cụ thể khác nhau về nguồn gốc xuất xứ của cây lúa, nhưng xét về
phương diện sinh thái, sinh học thì cây lúa và nghề trồng lúa đã có từ lâu đòi gắn
liền với lịch sử phát triển của loài người, nhất là ở Châu Á.
về nguồn gốc thực vật, trên thế giới có hai loài lúa trồng được xác định tò
thời cổ đại cho đến ngày nay. Thứ nhất là lúa trồng Châu Á (Oryza sativa), nguồn
7
gốc xuất phát ở nơi nào vẫn là đề tài tranh luận của các nhà khoa học trên thế giới
và ngày càng sáng tỏ với những khai quật khảo cổ học có tính đột phá và những
phương pháp phân tích hiện đại dựa trên cơ sở phân tích phóng xạ. Thứ hai là loài
lúa trồng Châu Phi(Oryza glaberrỉma), được xác định có nguồn gốc ở thung lũng
thượng nguồn sông Niger (nay thuộc Mali).
Trước đây có 4 giả thuyết về xuất xứ đàu tiên của giống cây trồng Châu Á,
đó là: nguồn gốc Trung Quốc, nguồn gốc Ấn Độ, nguồn gốc Đông Nam Á và giả
thuyết đa trung tâm phát sinh. Tuy nhiên, các giả thuyết phần lớn đều bị bác bỏ.
Chang (1985)[11], chuyên gia di truyền lúa của IRRI, xem xét lại tất cả tài liệu và

các dữ kiện từ khoa học, khảo cổ, sinh học tiến hóa, hệ thống sinh học và lịch sử
nông nghiệp để đưa ra kết luậnrằng lúa ữồng ở Châu Á có thể bắt nguồn từ nhiều
địa điểm một cách độc lập và đồng bộ, vì những nơi này có nhiều loài lúa dại và
lúa ữồng cùng sống trong một môi trường.
Mặc dù có nhiều tranh luận về nguồn gốc ban đàu của loài lúa trồng Châu
Á, mỗi bước dựa vào tư liệu truyền thuyết hay những tư liệu khảo cổ về niên đại
xuất hiện cây lúa hay hạt lúa để cho rằng nước mình là cái nôi xuất phát của nghề
trồng lúa. Những nguồn gốc truyền thuyết dần bị loại bỏ và những khám phá
khoa học mới nhất của thế giới đã khẳng định lại nguồn gốc xuất phát của cây lúa
dựa vào công nghệ phân tích phóng xạ và sinh học phân tử xác định DNA.
Nếu cho rằng cây lúa ữồng Châu Á xuất phát từ một nguồn gốc thì Trung
Quốc là nơi xuất phát của cây lúa trồng đầu tiên của Châu Á. Trong năm 2011,
một nỗ lực kết hợp của Đại học Stanford (Mỹ), Đại học New York (Mỹ), Đại học
Washington (Mỹ) và Đại học Purdue (Mỹ) đã cung cấp bằng chứng để kết luận
rằng lúa thuần ở Châu Á có nguồn gốc duy nhất ở thung lũng sông Dương Tử của
Trung Quốc. Nhưng tùy thuộc vào đồng hồ phân tử được sử dụng bởi các nhà
khoa học, thời gian xuất hiện cây lúa trồng đầu tiên ở Châu Á cách nay từ 8.200
8
năm đến 13.500 năm. Điều này phù hợp với các dữ liệu khảo cổ học nổi tiếng về
đề tài này.
Nguồn gốc cây lúa trồng ở 'Việt Nam.
Ở Việt Nam, cây lúa rất phong phú và hiện diện rải rác khắp các vùng miền
trong cả nước. Lúa dại đa niên o. rufipogon và lúa dại hàng niên o. Nivara là những
loài nguyên thủy, tổ tiên của các giống lúa trồng ngày nay Indica và Japonica, đã
hiện diện lâu đòi ở nước ta. Đó là một trong những yếu tố quan ữọng xác định
cây lúa có nguồn gốc ở Việt Nam. Giáo sư Phạm Hoàng Hộ cũng tin tưởng miền
Bắc Việt Nam là một trung tâm nguồn gốc lúa trồng của thế giới (2000) (theo
Trần Văn Đạt 2005)[1].
9
1.1.2. Phân loại cây lúa

về phân loại thực vật,
Giới (kìngdom/regnum):
Ngành (phyla):
Lớp (class):
Bộ ịordo):
Họ (familia):
Chi (genus):
Loài (species):
Phân loài/thứ (subspecies):
cây lúa thuộc:
Thực vật
(Plantae)
Thực vật có
hoa
(Angiosperm
ae) Thực vật
một lá mầm
ịMonocots)
Hòa thảo
(Poales)
Hòa thảo
(Poaceae)
Lúa (Oryza)
Lúa Châu Á
(oryza sativa)
Lúa Châu Phi (oryza glaberima)
Lúa nhiệt đới: oryza sativa var ỉndỉca
Lúa ôn đới: oryza sativa var japonica
Lúa rẫy : oryza sativa var javanica
Đối với lúa trồng có nhiều cách phân loại khác

nhau :
- Theo điều kiện sinh thái, Kato (1930) chia lúa
trồng thành 2 nhóm lớn là Japonica (lúa cánh)
và Indỉca (lúa tiên). Đinh Dĩnh (1958) cho
rằng lúa cánh bắt nguồn từ Trung Quốc nên
gọi là Suno-Japonica. Gout lại chia lúa làm 3
loài phụ : Indica,Japonica và Brevis.
- Theo thời gian sinh trưởng, Roxburg chia ra
các giống lúa ữồng ở Ấn Độ thành 2 nhóm
chín sớm và chín muộn mà không quan tâm
về hình thái. Watt, căn cứ vào vụ trồng ở Ấn
Độ chia thành lúa thu và lúa đông.
- Theo mùa vụ gieo cấy trong năm và thời gian
sinh trưởng, người Trung Quốc chia lúa ưồng
thành lúa sớm và lúa muộn hoặc lúa xuân và
lúa mùa.
- Theo điều kiện tưới và gieo cấy, chia lúa trồng
thành 2 nhóm là lúa nước và lúa cạn.
- Dựa vào cấu tạo hạt, Komik và Atefeld chia
lúa ở Indonesia thành lúa tẻ và lúa nếp.
1.2. Giá trị kinh tế của cây
lúa ở Việt Nam
Ở Việt Nam, lúa gạo
đóng vai trò quyết định vấn
đề cung cấp lương thực cho
cả nước và chi phối sâu sắc
sự phát triển kinh tế quốc
dân. Từ đó, Chính phủ đã
đề ra các chính sách phát
triển nông nghiệp nói chung

và lúa gạo nói riêng như:
chính sách đầu tư vật chất
kỹ thuật thích đáng về thuỷ
lợi, giống lúa, thâm canh,
quảng canh lúa qua từng
thời kỳ. Lúa gạo đã được
đưa vào 2 trong 3 chương
trình kinh tế lớn của quốc
gia (như văn kiện Đại hội
Đảng toàn quốc tháng
12/1986 đã nêu). Nhờ đó,
từ năm 1989 đến nay kim
ngạch xuất khẩu gạo đã
không ngừng tăng, mang lại
nguồn thu ngoại tệ lớn góp
phần không nhỏ cho công
cuộc đổi mới và xây dựng
đất nước. Cũng do thực
hiện thực hiện chương trình lương thực, Việt
Nam từ nước nhập lương thực hàng năm khoảng
1 triệu tấn thành nước xuất khẩu 3-4 triệu tấn
gạo hàng năm[20].
1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và
Việt Nam
1.3.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới
Theo Tổ chức Lương nông Quốc tế FAO,
năm 2012 sản lượng lúa thế giới đạt 721 triệu tấn
(tương đương 480 triệu tấn gạo) so với 700 triệu
tấn năm 2010, tăng 3%. Sản lượng tăng cao do
mở rộng diện tích canh tác lên đến 164 triệu ha,

chủ yếu diễn ra ở các nước Châu Á, đặc biệt là ở
Trung Quốc, Ân Độ và Indonesia là 3 nước
chiếm 2/3 sản lượng gạo thế giói ữên thị trường.
Nguyên nhân do giá lúa tăng vọt đã khiến nông
dân mạnh dạn đầu tư vượt qua trở ngại bất lợi
thời tiết ở nhiều nơi và giá cả đầu vào tăng vọt.
Tại châu Á sản lượng lúa đạt 653 triệu tấn,
tăng 10% so với năm 2010 do trúng mùa diễn ra
ở Pakistan, Kampuchia, Nepal, Philippines và
Việt Nam hoặc mở rộng diện tích canh tác ở
Bangladesh, Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan và
Việt Nam. Nhưng cũng có nước mất mùa như
Indonesia, Hàn Quốc, Miến Điện, Sri Lanka và
Thái Lan.
Tại châu Phi sản lượng cũng đạt 25,5 triệu
tấn, tăng 1% so vói năm 2010 do được mùa ở Ai
Cập, Guinea, Nigeria a Sierra Leone. Nhưng mất
mùa cũng diễn ra ở Mali và Madagascar. Châu
Mỹ La-tinh và vịnh Caribea
cũng được mùa ở các nước
ngoại trừ Ecuador và Peru.
Những châu lục khác như
úc, Nga và Mỹ sản lượng
giảm chút ít.
Năm 2014, thương
mại lúa gạo thế giới tương
đối bình ổn, không có
những xáo trộn đáng kể xảy
ra do mùa màng hoặc biến
cố chính trị. Do nhu cầu của

một số nước gia tăng và số
lượng lúa gạo thặng dư tại
các nước xuất khẩu, sự trao
đổi lúa gạo thể giới đạt mức kỷ lục 40,2 triệu tấn
gạo hay 8% cao hơn
2013.
Tháng 2/2014, Chính phủ quân nhân Thái
Lan hủy bỏ chương trình trợ giá gạo lớn lao của
Chính phủ trước, thúc đẩy xuất khẩu gạo tồn
kho, hạ thấp giá để giúp nước này phục hồi
ngành xuất khẩu truyền thống và đã trở lại ngôi
vị xuất khẩu gạo hạng nhất trong 2014 (bảng
1.1).
Bảng 1.1: Sản lượng gạo xuất khẩu và dự trữ
gạo tại một số nước trên thế giói
Theo thống kê của FAO năm 2014, trong 2
năm 2013 và 2014 sản lượng gạo trên thế giới
Quốc gia
Sản lượng gạo
(triệu tấn)
Xuât khâu gạo (triệu
tấn)
Gạo tôn trữ
(triệu tấn)
Năm 2013 2014 2013 2014 2014
Thê giói 497,5 496,6 37,3 40,2 177,5
Trung Quôc 140,7 141,7 0,5 0,3 99,9
An Độ 106,5 103,5 10,5 9,5 23,5
Indonesia 44,9 44,0
- -

6,4
Việt Nam 29,3 29,7 6,7 6,2 5,2
Thái Lan 25,2 24,8 6,6 10,5 17,0
Brazil 7,9 8,1 0,8 0,9 1,0
Hoa Kỳ 6,8 6,7 3,6 3,5 0,7
Pakistan 6,1 7,0 3,5 3,3 1,0
(Nguôn: Tiên đoán FAO Tháng 12-2014)
giảm (0,9 triệu tấn) nhưng
xuất khẩu gạo tăng (2,9
triệu tấn). Lượng gạo tồn
trữ của thế giới tính đến
năm 2014 là 177,5 triệu tấn.
Trong một số quốc gia
trồng lúa quan trong trên
thế giới thì Trung Quốc
hiện là nước dẫn đầu về sản
lượng gạo (141,7 triệu tấn),
và Thái Lan là nước dẫn
đầu về xuất khẩu gạo (10,5
triệu tấn).
Theo dự đoán của Cơ
quan FAO, ừao đổi lúa gạo
sẽ giảm bớt 0,7% trong
2015. Giá gạo thế giới thấp
nhất kể từ 2008. Các nước
nhập khẩu chính vẫn là
Trung Quốc, Indonesia,
Philippines, Bangladesh, Sri
Lanka và Châu Phi.
Mặc dù sản lượng lúa

của thế giới không ngừng
tăng lên trong những năm
vừa qua nhưng năng suất và
chất lượng gạo còn thấp,
chưa đảm bảo được an ninh
lương thực toàn cầu. Ở Châu Phi, có rất nhiều
nước đang trong tình trạng thiếu lương thực
nghiêm trọng. Bên cạnh đó, diễn biến thời tiết
khí hậu có tính chất rất phức tạp như lũ lụt, hạn
hán làm ảnh hưởng đến nền sản xuất nông
nghiệp, nhất là ngành sản xuất lúa gạo. Vì vậy,
việc lựa chọn những giống lúa phù hợp với từng
vùng, từng địa phương là rất quan trọng.
1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Viêt Nam
Ở Việt Nam, sản xuất lúa gạo giữ vai trò
quan ữọng trong nền sản xuất nông nghiệp,
chiếm gần 50% GDP. Gần đây diện tích đất trồng
lúa có xu hướng giảm xuống nhưng sản lượng
lúa gạo không ngừng tăng lên, bởi hiện nay năng
suất lúa tăng cao. Năng suất lúa bình quân của
Việt Nam vào khoảng 48,9 tạ/ha xếp thứ hai sau
Indonesia. Diện tích trồng lúa Việt Nam là
7326,2 nghìn ha xếp thứ hai sau Trung Quốc.
Từ năm 1990 đến nay, sản lượng lúa gạo
Việt Nam liên tục tăng trưởng nhờ có các giống
lúa mới, ngắn ngày đáp ứng cho nhu càu mở
rộng diện tích canh tác hàng năm. Các biện pháp
kỹ thuật canh tác tốt được áp dụng trên phạm vi
rộng, sản lượng và năng suất/đơn vị diện tích
(ha) tăng đáng kể Tất cả những yếu tố trên đã

làm nên sản lượng lúa đứng vào thứ hạng của thế
giới. Sản lượng lúa nước ta có 19,23 triệu tấn
(năm 1990) nhưng đến năm 2000 đã đạt 32,51
triệu tấn. Năng suất và diện
tích canh tác tăng liên tục
hàng năm đã giúp Việt Nam
lần đầu tiên đạt sản lượng ở
mức 42,31 triệu tấn vào
năm 2011; 43,7 triệu tấn
vào năm 2012 (Bảng 1.2).
Năm 2014, Việt Nam
xuống yị trí thứ ba xuất
khẩu gạo thế giói, sau Thái
Lan và Ấn Độ (Bảng 1.1).
Năm 2014, thị trường lúa
gạo Việt Nam có một số sự
kiện nổi bật. Chính phủ cho
phép bổ sung Vinafood 1
(Tổng công ty Lương thực
miền Bắc) cùng Vinafood 2
(Tổng công ty Lương thực
miền Nam) làm đầu mối
giao dịch hợp đồng tập
trung tại các thị trường
Philippines, Indonesia và
Malaysia. Cạnh tranh xuất
khẩu gạo vào Trung Quốc ngày càng tăng thêm,
Việt Nam chiếm hơn nửa thị trường này, bên
cạnh Pakistan, Thái Lan và Myanmar.Theo FAO
dự đoán, sau khi xuất khẩu được 6,2 triệu tấn

gạo trong
2014, Việt Nam có thể xuất khẩu 6,9 triệu
tấngạo trong 2015 do được mùa năm qua, mà
phần lớn đến các nước nhập khẩu chủ yếu:
Trung Quốc, Philippines và Đông Nam Á. Thái
Lan sẽ tiếp tục vai trò dẫn đầu xuất khẩu gạo thế
giới ở tầm mức cao hơn, khoảng 11 triệu tấn gạo,
do họ còn gạo tồn kho khá lớn.
1.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua
chỉ thị phân tử SSR ( Simple Sequence
Repeats).
SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những
đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và
chỉ gồm 1 - 6bp. Trong cấu trúc gen của sinh vật
nhân chuẩn, có những đoạn DNA gồm những
đoạn trình tự giống nhau và lặp lại.
Có các trình tự lặp lại:
Bảng 1.2: Diện tích trồng lúa và tổng sản lượng lúa từ 1990-2012
Năm 1990 1995 2000 2005 2010 2011 2012
Diện tích(triệu ha) 6,04 6,77 6,67 7,33 7,49 7,65 7,75
Sản lượng(triệu tân) 19,23 24,97 32,51 35,64 39,99 42,31 43,7
Năng suât(tạ/ha) 31,8 36,9 42,4 48,9 53,4 55,3 56,0
(Nguồn: Báo điện tử Đảng Cộng Sản Việt Nam tháng 4/2014)
- Lặp lại hoàn toàn: các đơn
vị lặp lại xếp nối tiếp nhau
[13],[14].
- Lặp lại không hoàn toàn:
xen kẽ vào các đơn vị lặp
lại là một hoặc một số
nucleotide khác.

- Lặp lại phức tạp: xen kẽ
giữa các đơn vị lặp lại khác
nhau.
Thông thường, các
SSR có mặt chủ yếu ở các
vùng dị nhiễm sắc của
nhiễm sắc thể như vùng
tâm động hoặc các đầu mút,
chúng giữ vai trò quan
trọng trong việc điều hoà
phiên mã đối với các gen
hoạt động ở vùng nguyên
nhiễm sắc, góp phần làm
tăng tính ổn định cơ học
của nhiễm sắc thể trong các
quá trình phân bào và có
thể chứa đựng những thông
tin di truyền liên quan đến
sự xác định giới tính ở cả
động vật và thực vật.
Bản chất đa hình của SSR có thể được
sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ
gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự
gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về
độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân
đoạn DNA nhờ phản ứng PCR. Kích thước của
sản phẩm PCR được xác định một cách chính
xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel
polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có
thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá

đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của
cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính
trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây
lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số
lượng (DTL). ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR
Thuận lợi to lớn của việc phân tích chỉ thị
SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn
sự đa hình.
SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử
có thể dễ dàng được xác định trong quá trình
thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng
sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính
toán di truyền quàn thể dựa trên những marker
này so vói những marker khác như AFLP và
RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế
hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai
giống, dòng chảy gen ữở nên dễ dàng hơn
(Schlotterer et al., 1994). SSR là công cụ hữu
hiệu để chọn lọc giống, đa
dạng hóa về các vật liệu di
truyền và dùng ữong thiết
lập bản đồ di truyền.
Hạn chế của chỉ thị
này là cần nhiều bước tiến
hành, cần thiết kế các cặp
mồi chính xác và tương ứng
với hai đầu của đoạn DNA
chứa trình tự lặp lại. Bên
cạnh đó, quá trình thiết kế
primer quá đắt, mỗi loại

primer chỉ đặc trưng cho
một loài và không thể áp
dụng phân tích trên một hệ
thống lớn bao gồm nhiều
loài có quan hệ di truyền xa
nhau.
Trong nghiên cứu
này chúng tôi chọn chỉ thị
SSR cho nghiên cứu đánh
giá đa dạng di truyền của
giống lúa ưu tú để lựa chọn
và tạo ra giống có năng suất
cao, phẩm chất tốt nhất
phục vụ cho chọn giống.
1.5. Tình hình
nghiên cứu đa dạng
di truyền lúa trên thế giới và ở Việt
Nam
1.5.1. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền
lúa trên thế giới
Tác giả Olufowote et «/.,(1997),đã nghiên
cứu biến động di truyền trong giống của 71
giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP.
Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có
mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn
các giống lúa cải tiến. Cả hai phương pháp đều
cho thấy số lượng các alen ở các giống lúa địa
phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến. Chỉ
thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan
hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các alen

cao hơn chỉ thị AFLP. Các tác giả cũng chỉ ra
rằng chỉ cần chọn chính xác 4 chỉ thị SSR là có
thể nghiên cứu các alen dị hợp tử ở lúa[15].
Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của
38 giống lúa thơm bản địa Basmati bằng chỉ thị
SSR của tác giả Raj (Raj et ah, 2006). Tác giả đã
sử dụng 32 cặp mồi, kết quả nghiên cứu cho
thấy, có 26 cặp mồi đa hình (81,25%), hệ số PIC
dao động từ 0,00 (RM259 và RM230) đến 0,83
(RM420)[16].
Năm 2009, Kibria K và cộng sự đã đánh
giá đa dạng di truyền các giống lúa thơm bằng
cách sử dụng các marker SSR và RAPD. Ba mồi
SSR là RM223, RM342A và RM515 đã thu được
46 băng, trong đó số alen
trung bình dao động từ 1,78
đến 2,49. Mồi RM223 cho
thấy mức độ đa hình cao
nhất là 66,67%.
Ngoài ra tác giả còn sử
dụng 15 mồi RAPD, ừong
đó có 3 mồi OPA-O2, OPA-
10 và 67AB10G7 tạo ra 32
băng đa hình và 2 băng đơn
hình, riêng mồi OPA-02 và
67AB10G7 thu được tất cả
các băng đa hình. Kết quả
phân tích SSR cho thấy
khoảng cách di truyền cao
nhất giữa các giống lúa

thơm là 2,306 và khoảng
cách di truyền cao nhất khi
dùng các marker RAPD là
0,7634. Kết quả của nghiên
cứu này sẽ là công cụ hữu
ích để chọn dòng bố mẹ cho
việc phát triển công tác
chọn giống[13].
Tác giả Malik Ashiq
(2010), đã tiến hành đánh
giá đa dạng di truyền giữa
các giống lúa truyền thống
và giống lúa đã được cải tiến ở Pakistan. Nghiên
cứu được thực hiện trên hai giống lúa Basmati
thơm và không thơm thuộc nhóm lúa Indicẫ.Tổng
số 41 dòng được đưa vào đánh giá bởi 30 marker
SSR được phân bố trên khắp bộ gen của lúa. Kết
quả phân tích thu được tổng số 104 alen và tất cả
đều đa hình, hệ số alen dao động 2-6 alen, trung
bình 3,5 alen/marker, hệ số PIC dao động từ
0,259-0,782 (trung bình là 0,571). Sau khi số
liệu được phân tích bằng phàn mềm UPGMA, 41
giống lúa đã được chia thành 2 nhóm chính:
Nhóm I gồm có 22 giống (15 giống lúa
thơmBasmati và 5 giống không thơm, hai giống
lúa Japonỉca). Nhóm II bao gồm 19 giống lúa
không thơm. Kết quả nghiên cứu này cũng cho
thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng
để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác
biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa

Basmati không thơm. Hơn nữa, việc xác định
giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker
SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn
các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả
người nông dân và người tiêu dùng. Theo
SinghBalwant (2011), nghiên cứu đa dạng di
truyền của 50 giống lúa thơm bằng chỉ thị SSR,
hình thái, đánh dấu hóa lý. Kết quả SSR marker
phân tích cho thấy đa hình khác biệt giữa các
giống với 28 mồi và hệ số PIC có giá trị dao
động từ 0,139-0,99 với
trung bình 0,589 cho mỗi
mồi[19].
Theo Shahid Masood
Shah (2013), Sử dụng
marker phân tử đánh giá đa
dạng di truyền của 40 giống
lúa thơm và không thơm
bằng chỉ thị SSR, 40 giống
lúa này được đánh giá bởi
24 mồi. Kết quả cho thấy
có tổng cộng 66 alen và hệ
số alen dao động từ 2-4,
trung bình là 2,75
alen/marker, hệ số PIC dao
động từ
1, 4250 (RM252) đến
0,9750 (RM315). Hệ số PIC
trung bình của 24 cặp mồi
nghiên cứu trên 40 giống

lúa là 0,6472. Kết quả phân
tích đa dạng di truyền với
hệ số tương đồng, 40 giống
lúa được chia thành 3nhóm
khác biệt. Kết quả này được
sử dụng hữu ích cho việc
theo dõi, xác định kiểu gen
và bảo vệ giống lúa[18].
Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân
tử đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa
(được thu thập từ phòng di truyền học, Viện
nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị
RAPD và chỉ thị SSR. Sử dụng 20 mồi RAPD
thu được 116 băng ừong đó có 114 băng đa hình.
Sản phẩm sau khi khuếch đại thu được 4-7 băng,
trung bình 5,8 băng/marker, hệ số PIC dao động
từ 0,33-0,88. Sử dụng 20 mồi SSR tạo ra 65 alen,
trung bình 3,2 alen/marker, hệ số PIC dao động
từ 0,62-0,97. Kết quả phân tích hệ số tương đồng
di truyền được chia thành hai nhóm là Nhóm I và
nhóm II (được chia thành 2 nhóm phụ: Nhóm
phụ I: gồm 17 giống trong khi nhóm phụ II: Gồm
có 2 giống). Dựa vào những kết quả được tạo ra
từ nghiên cứu này được sử dụng để tối ưu hóa để
lựa chọn bố mẹ đa dạng và mở rộng cơ sở giống
cây cho các chương trình nhân giống lúa trong
tương lai[12].
1.5.2. Tĩnh hình nghiên cứu đa dạng di truyền
lúa ở Việt Nam
Lịch sử hàng ngàn năm của người Việt

Nam gắn với nền văn minh lúa nước nên được
coi là trung tâm khởi nguyên của cây lúa. Tài
nguyên di truyền lúa nước Việt Nam được đánh
giá là phong phú cả về số lượng và chất lượng.
Những công trình nghiên cứu về đa dạng di
truyền và phân loại một cách có hệ thống lúa
trồng ở Việt Nam còn hạn
chế. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây các nhà khoa
học đã tập trung nghiên cứu
quan tâm nhiều hơn đến vấn
đề đánh giá đa dạng tài
nguyên lúa để phục vụ cho
việc chọn lai tạo ra các
giống mới có năng suất chất
lượng cao và khả năng
chống chịu tốt.
Kết quả nghiên cứu đa dạng
di truyền của 101 giống lúa
địa phương bằng 9 locus
thuộc 5 enzim. Kết quả cho
thấy, trong số các giống thu
từ huyện Nho Quan - Ninh
Bình và huyện Đà Bắc -
Hòa Bình thì có 44 giống
(chiếm 43,6%) thuộc lúa
Indỉca và 57 giống (56,4%)
thuộc lúa Japonica (Trần
Danh Sửu và cộng sự,
2004) [5].

Năm 2004, Nguyễn
Đức Thành và cộng sự đã
sử dụng 9 mồi RAPD
(OPB8, OPB9, OPB11,
OPB12, OPB13, OPC4, OPC6, OPC19, 0PC20)
chạy PCR với DNA genome của 15 dòng lúa thu
được 341 băng đa hình. Trong đó dòng Japonica
thể hiện sự khác nhau rất rõ đối với các dòng
Indicacòn lại. Do đó hệ số tương đồng rất thấp ở
mức độ 0,03. Các dòng Indỉca có hệ số có hệ số
tương đồng di truyền là 0,35. Dựa vào các kết
quả của thí nghiệm ừên có thể thiết lập được các
cặp lai cho ưu thế lai cao phục vụ cho công tác
chọn tạo giống[6].
Theo tác giả Lưu Ngọc Trình (2007), trong
tổng số 6.083 giống lúa đang bảo quản tại Ngân
hàng gen cây trồng Quốc gia, Trung tâm Tài
nguyên thực vật đã tiến hành đánh giá đầy đủ 60
tính trạng hình thái nông học của 1.819 giống,
đánh giá 40 - 50 tính ừạng của 1.385 giống và từ
20 - 30 tính trạng của 2.066 giống[8].
Năm 2010, tác giả Khuất Hữu Trung và
Nguyễn Thị Phương Đoài đã sử dụng chỉ thị
SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn
nguồn gen lúa Tám đặc sản bản địa của Việt
Nam. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tập đoàn
lúa Tám nghiên cứu khá đa dạng: phân tích 36
cặp mồi SSR trên 26 giống lúa Tám thu được
tổng số 938 băng ADN thuộc 88 loại alen khác
nhau (trung bình 2,44 alen/cặp mồi). Hệ số PIC

dao động từ 0 đến 0,65 (trung bình 0,27). Các
giống lúa Tám nghiên cứu có độ thuần di truyền
khá cao, tỉ lệ dị hợp tử trung
bình của cả tập đoàn là 0,86.
Hệ số tương đồng di truyền
của các giống trong tập
đoàn nghiên cứu dao động
trong khoảng 0,14-1,00. Ở
mức tương đồng di truyền
40%, tập đoàn 26 giống lúa
Tám thơm được chia thành
3 nhóm lớn. Trong đó, hai
giống Tám Nghĩa Hồng và
Tám con có kiểu gen giống
nhau ở cả 36 locus nghiên
cứu. Kết quả nghiên cứu rất
có ý nghĩa phục vụ công tác
nghiên cứu lai, chọn tạo
giống lúa chất lượng (Khuất
Hữu Trung và Nguyễn Thị
Phương Đoài, 2010).
Tiếp đó, Khuất Hữu
Trung và cộng sự cũng đã
sử dụng 29 cặp mồi SSR để
nghiên cứu đa dạng di
truyền tập đoàn 27 nguồn
gen lúa nếp, lúa nương bản
địa ở Việt Nam. Kết quả thu
được 96 loại alen, hệ số PIC
dao động từ 0 đến

1, 808. Trong số 96 alen thu được, xuất hiện
8 alen hiếm (trung bình 0,27 alen hiếm trên mỗi
locut) ở 5 cặp mồi khác nhau: cặp mồi RM241
xác định được 3 alen hiếm nhân dạng được các
giống Ka tiêu, Plẩu tâu đằng dạng 2 và Nếp cẩm
đen; cặp mồi RM229 xác định được 2 alen hiếm
nhận dạng được giống Nếp lùn và Kháu căm pị;
các cặp mồi RM13, RM172 và RM318, xác định
được 1 alen hiếm trên mỗi locut nhận dạng được
các giống Lia tón, Tan lanh và Nếp cẩm tương
ứng. Các kết quả thu được rất hữu ích ữong việc
xác định nguồn gen phục vụ cho công tác bảo
tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn
gen lúa nếp, lúa nương của Việt Nam (Khuất
Hữu Trung và cộng sự., 2010)[9].
Năm 2011, Trần Danh Sửu và cộng sự đã
sử dụng 50 chỉ thị SSR sử dụng trong nghiên cứu
đa dạng di truyền của 45 giống lúa nếp ở các tỉnh
đồng bằng miền Bắc Việt Nam. Kết quả phân
tích cho thấy 45 chỉ thị cho các băng DNA đa
hình tại 46 locut. Trong đó, 18 locut SSR cho
nhận dạng đặc trưng với 28 alen duy nhất của 16
giống trong số 45 giống lúa nếp nghiên cứu. Hệ
số tương đồng di truyền giữa các giống lúa nếp
dao động từ 0,10 đến 0,98. Thấp nhất (0,10) là
giữa giống Nếp bà lão (6195) và giống Nếp hạt
chanh (7055) và cao nhất (0,98) là giữa giống
Nếp sấp (6236) vàNếp quắn (7060). Trong số 45
giống lúa nếp được nghiên
cứu, 43 giống thuộc loài

phụ Japonỉca và 2 giống
(Nếp nõn tre và Nếp hạt
chanh) thuộc loài phụ
Indica dựa trên DNA lục
lạp[6].
Năm 2012, Vũ Thị
Thu Hiền và Phạm Văn
Cường đã phân tích đa dạng
di truyền của 64 dòng/giống
lúa đang canh tác trong điều
kiện nhờ nước trời thông
qua sự có mặt và mức độ đa
hình của các chỉ thị phân tử
SSR. Bằng việc sử dụng 34
chỉ thị phân tử SSR, có 8
chỉ thị không cho xuất hiện
vạch ở tất cả các
dòng/giống; 2 chỉ thị xuất
hiện yạch đơn hình; 24 chỉ
thị còn lại xuất hiện đa hình
với tổng số 90 alen chiếm tỷ
lệ trung bình 3,75 alen trên
một locus. Kết quả phân
tích đa dạng di truyền với
hệ số tương đồng là 0,65 đã
phân chia nguồn vật liệu
thành 7 nhóm chính, số lượng lớn các
dòng/giống thuộc hai nhóm có hai giống đối
chứng chịu hạn là CH5 và LC93-l.Kết quả này
bước đàu cho thấy các dòng/giống có khả năng

chịu hạn tương tự như hai giống đối chứng thông
qua biểu hiện ở cấp độ phân tử DNA. Thông tin
các chỉ thị SSR đa hình giữa các dòng/giống rất
có giá trị trong chọn giống lúa chịu hạn nhờ chỉ
thị phân tử[2].
Tràn Thị Lương và cộng sự (2013).
Nghiên cứu quan hệ di truyền các giống lúa đặc
sản, chất lượng ở Việt Nam là vấn đề rất
quantrọng ưong việc quản lý, bảo tồn nguồn gen,
xác định giống cây trồng mới. Trong nghiên cứu
này, 60 giống lúa đã được chọn lựa để nghiên
cứu với 40 chỉ thị SSR.
Tổng cộng có 180 alen được phát hiện
bỏi33 chỉ thị cho đa hình với trung bình 5,45
alen/locut. Trong số 33 locus đa hình, tìm thấy
61 alen hiếmvà 14 alen đặc trưng ở 11 locus. Kết
quả cho thấy, các alen đặc trưng có thể nhận
dạng đặc điểm phân tử, DNA của 12 giống lúa
nghiên cứu. Hệ số đa hình di truyền (PIC) dao
động từ 0,06 đến 0,83 vói giá ưị trang bình là
0,6. Hệ số tương đồng di truyền của 60 giống lúa
nghiên cứu dao động từ 0,056 đến 0,77; hai
giống có hệ số tương đồng di truyền thấp nhất là
Jamin 85 (DS28) và LC93-1; hai giống có hệ số
tương đồng di truyền cao
nhất là Q5ĐB (DS42) và
KDĐB (DS43). Các số liệu
thu được trong nghiên cứu
nàycung cấp những thông
Vật liệu nghiên cứu là 23 dòng/giống lúa ưu

tú được chọn tạo và nhập nội do Công ty Giống
cây trồng Trung Ương cung cấp (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Danh sách 23 mẫu giống lúa ưu tú
nghiên cứu
STT Tên
mẫu
Kí hiệu
mẫu
STT Tên
mẫu
Kí hiệu
mẫu
1 NSC46 S46 13 NSC58 S58
2 NSC47 S47 14 NSC59 S59
3 NSC48 S48 15 NSC60 S60
4 NSC49 S49 16 NSC61 S61
5 NSC50 S50 17 NSC62 S62
6 NSC51 S51 18 NSC63 S63
7 NSC52 S52 19 NSC64 S64
8 NSC53 S53 20 NSC65 S65
9 NSC54 S54 21 NSC66 S66
10 NSC55 S55 22 NSC67 S67
11 NSC56 S56 23 NSC68 S68
12 NSC57 S57
TT Tên
mồi
Trình tự mồi NST
Kích
thước
(bp)

1 RM592
6
F:AATTACTGTAGGTCCATCCA
R:AGATAGTATAGCGTAGCAGC
11 100-180
2 AROl
F: GGCGGCGTCATATCCAACA
R:CATCTATCCTCCTCGGGCAA
8 173
3 RM13
F: TCC A AC ATGGC A
AGAGAGAG R:
5 141
4 RM21
F:ACAGTATTCCGTAGGCACGG
R:
11 132-157
5 RM190
F: CTTTGTCTATCTCAAGCAC
R:
6 124
6 RM208
F:
TCTGCAAGCCTTGTCTGATG
2 166-173
7 RM212
F: cc ACTTTC AGCTACTACC
AG R: CACCC
ATTTGTCTCTCATTATG
1 244

8 RM224 F:ATCGATCGATCTTCACGAGG
R:TGCTATAAAAGGCATTCGGG
11 120-152
9 RM585
F:
CAGTCTTGCTCCGTTTGTTG
R:
6 171-233
10 RM372
6
F: CAC AC AC ATCGCTCGGTC
R: GATGTGGAGGTCGATGGC
12 193
11 RM630
8
F:
TCGACCTGGCTCTCCTCTAG
3 104
12 RM699
7
F: CA ACGCGGCAGTA
AATTTGC R:
4 154
13 RM821
3
F:AGCCCAGTGATACAAAGATG
R:
4 177
14 RM313
4

F: GC AGGC AC AA A AGC A A
AGAG
3 178
R:AGGTGAAGGTGCATTGTGT
G
15 RM6506
F: GTCCTTC AGGTGATTCGCC
R:
GTCGCTCGAAGCCAATTAAG
8 219
16 RM1942
9
F:
TATGTGGTTGGCTTGCCTAGT
6 180-220
17 RM2856
1
F: CTTC A AGACTGGCCC AAT
ATTACTG R:
CTGACTGAAGCCTTCTTCACT
12 259
18 RM463
F: rrCCCCTCCTTTTATGGTGC
R:TGTTCTCCTCAGTCACTGCG
12 192
19 RM515
F: TAGGACGACC
AAAGGGTGAG
8 205-231
20 RM527

F: GGCTCGATCTAGA
AAATCCG
R:TTGCACAGGTTGCGATAGA
6 215-221
21 RM1233
F: TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG
R:ATTGGCTCCTGAAGAAGG
11 175
22 RM7102 F:TTGAGAGCGTTTTTAGGATG
R:TCGGTTTACTTGGTTACTCG
12 168
23 RM261
F:
CTACTTCTCCCCTTGTGTCG
10 125
24 PTA248 F:AGACGCGGAAGGGTGGTTC
CCGGA
R:AGACGCGGTAATCGAAAGA
11 500-1000
25 RM6320
F: GAGCTGGACCTCCTCGAC
AC R:
5 164
26 MP1-
MP2
F:ATCGATCGATCTTCACGAGG
R:TCGTATAAAAGGCATTCGGG
8 150
Mẩu lá của từng
dòng được thu riêng rẽ và

tách chiết DNA tổng số theo
phương pháp CTAB của
Obara và Kako (1998) có
cải tiến. Chuẩn bị sẵn dung
dịch đệm chiết CTAB ở
60°c.
1. Nghiền 0,3 gam mẫu lá
bằng chày cối sứ vô
trùng trong nitơ lỏng
đến khi thành dạng bột
mịn.
2. Hoà tan mẫu đã nghiền
nhỏ trong 800|il CTAB
buffer và 60|J,1 SDS
10%.
3. ủ mẫu ở 65°c trong bể ổn
nhiệt, thòi gian 60 phút.
4. Bổ sung hỗn hợp CHCl
3
-
IsoA (24:1) vói tỷ lệ 1:1
về thể tích so với dịch
mẫu. Lắc nhẹ cho tói
khi thành dạng nhũ sữa.
Ly tâm 12000
vòng/phút ữong 10 phút
ở nhiệt độ phòng. Hút
dung dịch phía trên
chuyển sang ống mới.
5. Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCI3-

IS0A (24:1). Thu được dịch chiết chứa DNA.
6. Tủa DNA bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở
-20°c trong 1 giờ.
7. Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút
ở 4°c.
8. Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm
khô và hoà tan trong đệm TE.
9. Độ tính sạch và nồng độ DNA tổng số được
kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose
1%.
2.2.2. Phản ứng PCR đánh giá đa dạng dì
truyền bằng chỉ thị SSR
Tổng thể tích của phản ứng PCR là 15|xl bao
gồm: 1,5)0.1 đệm PCR10X;
l,2fxl MgCl
2
25mM; 0,3ỊXỈ dNTPs lOmM; 0,2|
il Taq DNA polymerase 5U/|il;
lịil mồi xuôi 10|iM; lịil mồi ngược 10|iM; lp.1
DNA (30ngẠil); 3,8|il nước cất 2
lần khử ion.
2.2.3. Chu ừình PCR
Bảng 2.3: Chu kỳ nhiệt
cho phản ứng PCR sử
dụng mồi SSR
2.2.4. Điện di kiểm tra sản
phẩm PCR
Sản phẩm PCR được
điện di trên gel
polyacrulamide 6,0% và

được phát hiện dưới tia cực
tím bằng phương pháp
nhuộm ethidium bromide.
+ Gel
polyacrylamide
bao gồm các
thành phần sau:
Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và
dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính.
+ Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn.
Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm
PCR cùng với thang marker 20bp ở điều kiện
150V.
Thời gian điện di khoảng 3-4 giờ. Lấy gel
ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15
phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel
bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.
2.2.5. Phân tích kết quả và xử lí số liệu
Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất
hiện hay không xuất hiện các băng DNA (các
alen). số liệu được xử lý, phân tích bằng chương
Các bước Nhiệt độ(°C) Thời gian Số chu kỳ
I 94 5 phút 1
II 94 1 phút 35
Tm 45 giây
72 1 phút
III 72 7 phút 1
Giữ mẫu ở 4°c
Nước cât khử ion 55,5ml
TBE10X 3,5ml

Dung dịch acrylamide 40% 10,5ml
Dung dịch APS 10% 700|il
Dung dịch TEMED 58,4|il
Tông thê tích gel 70ml
trình Exel version 5.0 và
phần mềm NTSYSpc 2.1
(Rohlf FJ, 2000).
Hệ số PIC
(Polymorphic Information
Content) được tính theo
công thức
sau:
PIC =1 - ZPj
2
(trong đó Pi là
tần số xuất hiện của alen
thứ i).
Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi
mẫu được tính theo công
thức:
H % =
———
Trong đó: X: là
Trong đó: z là tổng
số mồi không xuất hiện
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ
NGHIÊN cứu
3.1. Kết quả tách chiết DNA
Tách chiết DNA là công việc đầu tiên
đóng vai trò quan ừọng trong công nghệ DNA.

Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết
DNA tổng số của mẫu thực vật. Mỗi đối tượng
DNA được tách chiết thì có phương pháp khác
nhau phù hợp với chúng.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa
chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako
(1998) có bổ sung Natribisuníit và PVP để tiến
hành tách chiết DNA tổng số của 23 mẫu lá lúa
nghiên cứu. Kết quả tách chiết DNA tổng số của
23 mẫu lúa được kiểm ứa bằng phương pháp
điện di trên gel agarose 1%.
3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị SSR trong phân
tích đa dạng di truyền
Để nghiên cứu đa dạng di truyền của các
dòng/giống lúa ưu tú chúng tôi tiến hành sử