LUẬN văn đề tài NGHIÊN cứu xác ĐỊNH cây NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ BẰNG kĩ THUẬT PCR và ĐÁNH GIÁ đa DẠNG DI TRUYỀN tập đoàn NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ

Bộ Giáo dục và đào tạo
Khoa công nghệ sinh học
F G







KHểA LUN TT NGHIP


Đề tài: Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng
thuốc trừ cỏ bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di
truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ











H NI - 2008
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

Phần I: Mở đầu

1.1. Đặt vấn đề
Đầu những năm 80 thế kỷ XX xuất hiện những công bố đầu tiên về cây
chuyển gen và từ đó mở ra một ra chân trời mới, chứa đựng một tơng lai đầy
hứa hẹn về cải tiến cây trồng. Nhiều giống cây trồng đã đợc chuyển gen để tạo
ra các đặc tính u việt, giúp cải thiện năng suất, chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn,
lạnh, tăng chất lợng và cải thiện môi trờng. Từ đó kỹ thuật gen trở thành công
cụ hữu hiệu đợc ứng dụng trong cải tiến giống cây trồng.
Sự phát triển nhanh chóng của Công nghệ Sinh học đã đa các thực vật
chuyển gen và các sản phẩm của chúng đến với thị trờng tiêu dùng. Và kể từ
khi kỹ thuật gen thực vật đợc thiết lập, thử nghiệm thành công thì những ứng
dụng của nó đã đợc đầu t và đợc tiến hành một cách rộng rãi để giải quyết
các vấn đề còn tồn tại của Nông nghiệp. Vì vậy thực vật chuyển gen đã đợc
trồng phổ biến trên đồng ruộng để làm tăng tính kháng bệnh, kháng sâu, kháng
thuốc trừ cỏ trong hệ thống canh tác. Từ cuối năm 1997, các cây trồng biến đổi
gen và các sản phẩm của chúng đã đợc chấp nhận thơng mại hoá ở một số
quốc gia. Ngày nay việc sản xuất và sử dụng cây trồng chuyển gen đang ngày
một gia tăng, và khẳng định tầm quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp và
một số nghành khác. Năm 2007 diện tích trồng tiếp tục tăng 2 con số, đạt 12%
tơng đơng với 12,3 triệu hecta (30 triệu mẫu. Trong đó tổng diện tích trồng
trong 12 năm (1996-2007) đạt 690 triệu héc-ta (1,7 tỷ mẫu). Với mức tăng cha
từng thấy gấp 67 lần từ 1996-2007, trở thành công nghệ cây trồng đợc áp dụng
nhanh nhất trong thời gian gần đây.
Ngày nay, cây chuyển gen đợc trồng ngày càng rộng rãi ở rất nhiều nớc
trên thế giới. Nhng câu hỏi về sự an toàn trong việc sử dụng các sản phẩm của
cây chuyển gen cũng đồng thời đợc đặt ra và trở thành một vấn đề nóng bỏng
với hàng loạt các vấn đề liên quan xoay quanh nó, liệu chúng đợc sử dụng dới

-2-
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

dạng nào và khả năng rủi ro đến với sức khoẻ con ngời, với sự đa dạng sinh
học, tiềm ẩn ô nhiễm môi trờng ở Việt Nam, đến nay vẫn đang trong thời
gian xây dựng và hoàn thiện các quy chế về quản lý an toàn sinh học các cây
chuyển gen và kiểm soát các sản phẩm biến đổi gen. Tuy nhiên, để đa nhanh
các cây chuyển gen vào sản xuất tại Việt Nam thì việc nghiên cứu tạo cây
chuyển gen, trồng thử nghiệm và kiểm soát cây trồng biến đổi gen cần phải tiến
hành trớc một bớc. Trong số các cây trồng biến đổi gen đang thử nghiệm thì
cây ngô đang rất đợc quan tâm nhất đặc biệt là ngô chuyển gen kháng thuốc
trừ cỏ.
Để đáp ứng các chỉ tiêu kỹ thuật trong việc phát hiện chính xác ngô
chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và nhanh chóng sử dụng các dòng ngô này phục
vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc diệt cỏ của Việt Nam. Chúng tôi đã
thực hiện đề tài Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ
bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen
kháng thuốc trừ cỏ.
1.2. Mục đích
Thu thập dữ liệu về cây trồng biến đổi gen và tìm hiểu một cách tổng
quan về cây ngô chuyển gen .
Bớc đầu làm quen với các kỹ thuật nghiên cứu về cây chuyển gen
Xác định đoạn trình tự đặc trng của promoter CaMV-35S (195bp) có
trong ngô chuyển gen.
Xác định gen PAT (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) là gen kháng
thuốc trừ cỏ glufosinate có trong ngô chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Đánh giá đặc điểm hình thái, chỉ tiêu nông sinh học chính và đa dạng di
truyền ở mức phân tử bằng kĩ thuật PCR-RAPD của một số dòng ngô thuần
mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô u
việt mang gen gen kháng thuốc trừ cỏ.

-3-
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

Phần II: Tổng QUAN Ti Liệu
2.1. Giới thiệu về cây ngô
2.1.1. Vài nét sơ lợc về cây ngô
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ
Gramineae. Từ thế kỷ 16 khi Colombus mang hạt giống từ châu Mỹ về thì sản
xuất ngô đã lan tràn khắp thế giới và trở thành loại cây ngũ cốc quan trọng cung
cấp lơng thực cho loài ngời. Hiện trên thế giới đang tồn tại hai hệ thống phân
loại đối với loại Zea.
Wilkes (1967) Iltis & Doebly (1984)
Nhóm Euchleana
Z. penrennis (Hitch) Reeves & Mangelsdorf
Z. mexicana (Schrader) Kuntze
Nòi Guatemala


Nòi Huchuetenango
Nòi Balsas

Nòi Chalco
Nòi Cao nguyên trung phần
Nòi Nobogame
Nhóm Zea
Z. mays L.
Nhóm Luxuriantes
Z. diploperennis Iltis Doebly & Guzman
Z. perennis Hitch Reeves & Mangelsdorf

Nhóm Zea
Z. mays subsp. Parviglumis Iltis & Doebly

Var. Huchuetenangensis Iltis & Doebly
Var. Parviglumis Iltis & Doebly subsp
Mexicana (Schrader) Iltis
Nòi Chalco
Nòi Cao nguyên trung phần
Nòi Nobogame

Z. mays subsp. mays

Từ loài Zea mays L, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt đợc phân thành
các loài phụ, sau đó dựa vào màu hạt và màu lõi để phân các thứ (varieta).
Những loài phụ chính bao gồm:
Zea mays Subsp. indurata
- ngô đá
Zea mays Subsp. indentata
- ngô răng ngựa

-4-
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-5-
Zea mays Subsp. ceratina
- ngô nếp
Zea mays Subsp. saccharata
- ngô nếp
Zea mays Subsp. everta
- ngô bột
Zea mays Subsp. amylacea
- ngô bột

Zea mays Subsp. tunecata
- ngô bọc
Ngô có nguồn gốc từ Trung Mỹ song cây ngô đã thích nghi nhanh với
những điều kiện sinh thái rất khác nhau. ở Bắc bán cầu, ngô có thể trồng ở Đan
Mạch đến vĩ tuyến 55
P
o
P
-56P
o
P
, còn ở Liên Xô cũ và Canada tới vỹ tuyến 58P
o
P
. ở
Nam bán cầu, ngô đợc trồng ở New Zealand đến vĩ tuyến 42
P
o
P
-43P
o
P
(Humlam
John, 1942, Necula GH. và cs, 1957). Ngô cũng là cây trồng thích ứng rộng.
Theo Necula G. H. (1957) ngô có thể trồng ở độ cao 3900m. Tuy nhiên càng xa
khỏi xích đạo thì độ cao càng giảm. Ví dụ nh Peru (16
P
o
P
nam) ngô trồng đợc ở

độ cao 3900m, ở Bắc Carolia (34
P
o
P
-37P
o
P
bắc) trồng đợc ở 1200m, ở Châu á nh
thung lũng Kasmir ở 2000m, còn ở Châu Âu (khoảng 45
P
o
P
-48P
o
P
bắc) ở độ cao
500-800m.
Trên phạm vi thế giới, các nhà khoa học đã chia sinh thái cây ngô thành 4
vùng chính:
Ôn đới
Cận nhiệt đới
Nhiệt đới cao (trên độ cao 2000m so với mặt biển)
Nhiệt đới thấp (dới 2000m)
Theo phân loại này, Việt Nam nằm trong vùng sinh thái nhiệt đới thấp.
Các bộ giống từ vùng nhiệt đới thấp biểu hiện sự thích ứng hơn cả thông qua
khả năng chống chịu và năng suất, kể cả ở các thảo nguyên cao phía Bắc hoặc
vụ đông ở Đồng bằng Bắc Bộ.
2.1.2. Nguồn gen và đa dạng di truyền cây ngô
Ngô là cây trồng đợc thu thập, mô tả và bảo tồn rất tốt từ các trung tâm
đa dạng di truyền. Từ năm 1943, quỹ Rockefeller hợp tác với các nớc Mỹ La

tinh đã thu thập nguồn gen ngô từ những trung tâm đa dạng chính, tạo cơ sở cho
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-6-
các tập đoàn ngô ở Mexico, Colombia và Brazil. Ngày nay có khoảng 15.000
mẫu giống ngô đã đợc thu thập từ các nớc khác nhau trên thế giới.
ở Việt Nam, nguồn gen ngô đợc bảo tồn tại Viện nghiên cứu ngô với
khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự do và 3.000 dòng [10].
Tập đoàn ngô Mexico trung tâm xuất của ngô có sự đa dạng tối đa. ở
đây có bốn nòi chính đợc xác lập đó là:
A. Nhóm nòi bản địa cổ đại: Ngời ta cho rằng nhóm này xuất phát từ
ngô bọc nguyên thuỷ ở Mexico. Các nòi ở nhóm này khác nhau bởi sự phát triển
độc lập ở những địa bàn và môi trờng khác nhau tuy chúng cùng một tổ tiên.
Bốn nòi chính trong nhóm này là Palomero toluqueno, Arrocillo amarillo,
Chapalote và Nal-tel.
B. Nhóm nhập nội tiền Columbus: Các nòi của nhóm này đợc nhập vào
Mexico từ Trung và Nam Mỹ vào thời tiền sử. Bốn nòi này là: Cacahuacintle,
Harinoso de Ocho, Oloton và ngô ngọt.
C. Nhóm con lai tiền sử: Nhóm này bao gồm các nòi đợc coi là tạo ra từ
việc lai tạp giữa các nòi bản địa cổ đại với các nòi nhập nội tiền Columbus, hoặc
giữa hai nhóm trên với Teosinte. Hiện nay còn tám nòi là: Conico, Reventador,
Tablonicillo, Tehua, Tepecintla, Comiteco, Jala và Zapalote chico.
D. Nhóm hiện đại: Bao gồm các nòi phát triển gần đây và cha đạt đến
trạng thái ổn định, tuy nhiên có những đặc điểm phân biệt xác định. Có bốn nòi
đợc gọi là: Chalqueno, Celaya, Conico Norteno và Bolita.
Từ đây ta thấy rõ sự biến dị to lớn đã đợc xảy ra nh thế nào. Đó là
những nòi giống cơ bản sản sinh ra nguồn gen ngô thế giới và sự đa dạng di
truyền của nó.
Sự đa dạng di truyền của ngô đợc thể hiện ở tất cả các tính trạng của cây

bông cờ và bắp. ở các đặc điểm của cây, sự biến động thể hiện ở chiều cao cây,
chiều cao đóng bắp và đặc điểm của lá (dài lá, chiều rộng lá, số lá trên cây, số lá
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-7-
trên bắp), màu thân và dạng lóng. Sự biến động ở cờ thể hiện ở độ dài bông cờ,
cuống bông cờ, độ nhánh dài, số nhánh cấp hai và ba, đờng kính bắp và số
hàng hạt. Đặc biệt sự biến động rất đa dạng ở nội nhũ hạt, từ đây ta phân biệt
các dạng răng ngựa, đá rắn, bột, đờng, nếp, nổ và bọc. Sự biến động còn thể
hiện ở kích thớc hạt, màu hạt và chất lợng hạt.
ở Việt Nam ngô là cây trồng nhập nội do vậy sự phong phú về nguồn gen
có hạn hẹp. Theo các nghiên cứu phân loại ngô địa phơng Việt Nam (GS.TS
Ngô Hữu Tình, 1995) từ những năm 60 đến nay cho thấy, ngô Việt Nam tập
trung chủ yếu vào hai loài phụ là đá rắn và nếp.
Ngày nay để đánh giá sự đa dạng di truyền của một loài, ngời ta không
chỉ dựa vào các đặc điểm thực vật học dễ nhận biết và riêng rẽ mà cần phân tích
trên cơ sở nhiều tính trạng để phân biệt các nhóm cách biệt di truyền thông qua
khoảng cách Ơclit hoặc khoảng cách Mahalanobis Gần đây công nghệ sinh
học đã góp phần rất đắc lực trong việc xác định đa dạng di truyền thông qua kỹ
thuật Isozyme hoặc sự đa hình độ dài các phân đoạn cắt hạn chế (RFLP
Restriction Flagment Length Polymorphis), RAPD (Đa hình các đoạn khuếch
đại ngẫu nhiên)
2.1.3. Đặc điểm hình thái cây ngô
Rễ: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ hòa thảo. Ngô có
ba loại rễ chính: Rễ mầm, Rễ đốt (rễ phụ cố định), Rễ chân kiềng, chúng giúp
cây ngô hút nớc và các chất dinh dỡng từ đất.
Thân, lá: Ngô thuộc họ hòa thảo, song có thân khá chắc, có đờng kính
từ 2-4cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc. Thân có chiều
cao khoảng 1,5-4m. Thân ngô trởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm

giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Lá ngô đợc mọc từ các đốt của thân
ngô, bẹ lá ôm chặt lấy thân và lỡi lá (thìa lìa).
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-8-
Bông cờ và bắp: Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Hai cơ quan
sinh sản đực (bông cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây, song ở các vị trí
khác nhau. Hoa đực thờng đợc gọi là bông cờ nằm ở đỉnh cây. Hoa cái (bắp
ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1-3 chồi khoảng giữa thân mới tạo
thành bắp.
Hạt: Hạt ngô thuộc loại quả dính gồm năm phần chính: vỏ hạt, lớp
alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt bao quanh hạt, là một màng nhẵn. Lớp
alơron nằm dới vỏ hạt, bao lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là phần chính của hạt
chứa các tế bào dự trữ chất dinh dỡng. Nội nhũ có hai phần: nội nhũ bột và nội
nhũ sừng. Tỷ lệ này phục thuộc vào chủng ngô và các giống ngô khác nhau.
2.1.4. Tình hình và định hớng phát triển cây ngô ở Việt Nam
ở Việt Nam, ngô là cây lơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, có sự
phát triển rộng khắp, liên tục và đạt đỉnh điểm vào năm 2005. Theo tổng quan
nông nghiệp năm 2005 của Nguyễn Sinh Cúc (NN và PTNT 1/2006) thì sản
xuất ngô năm 2005 có tiến bộ vợt bậc: Diện tích đạt 1039 nghìn ha, năng suất
đạt 35,5 tạ/ha và sản lợng đạt 3,69 triệu tấn, đã làm thay đổi tỷ trọng cơ cấu
sản lợng thực từ 5,7% năm 2000 lên 9% năm 2005 [1].
Những tiến bộ về sản xuất ngô Việt nam thể hiện rất rõ nét trong giai
đoạn 20 năm thực hiện đờng lối đổi mới của Đảng. Trong suất 20 năm qua
(1985-2004) diện tích, năng suất và sản lợng ngô Việt Nam tăng liên tục với
tốc độ rất cao. Tỷ lệ tăng trởng bình quân hàng năm trong suốt 20 năm về diện
tích là 7,5%/năm, năng suất 6,7%/năm và sản lợng là 24,5%/năm, cao hơn
nhiều 10 năm trớc đó khi đất nớc ta thống nhất 1975-1985 (các tỷ lệ tơng
ứng giai đoạn này là 4,2%; 3,9% và 10,0%). Nếu chúng ta lấy số liệu tuyệt đối

của 2 năm (1985) và sau 20 năm đổi mới (2004) thấy rằng diện tích ngô tăng
2,5 lần, năng suất 2,3 lần và sản lợng 5,9 lần [1].
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-9-
Tuy nhiên, năng suất ngô của Việt Nam năm 2004 (34,9 tạ/ha) vẫn còn
thấp hơn năng suất bình trung bình thế giới (48,5 tạ/ha), vẫn thấp hơn nhiều so
với Mỹ (100,0 tạ/ha) và Trung Quốc (51,1 tạ/ha) song đã vợt đợc năng suất
bình quân khối các nớc đang phát triển (31,3 tạ/ha). Mặc dầu vậy, khách quan
mà nói: Sản xuất ngô Việt Nam trong thời kỳ đổi mới đã có sự phát triển vợt
bậc, toàn diện và đáng trân trọng.
2.2. Cây trồng biến đổi gen
2.2.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen hoặc cây trồng công nghệ sinh học là các cây
trồng đã đợc biến đổi về mặt di truyền nhằm làm cho cây trồng mang một số
đặc tính quý giá mà cây trồng tự nhiên không có. Công nghệ này cho phép các
gen riêng biệt đã chọn lọc đợc chuyển từ một cơ thể này sang một cơ thể khác
cũng nh giữa các loài không có liên quan với nhau. Các tính trạng thờng đợc
chuyển vào cây trồng nh tính kháng côn trùng, kháng nấm bệnh, kháng vi
khuẩn, kháng thuốc trừ cỏ, kháng mặn, cho năng suất cao, chất lợng sản phẩm
tốt. Đây là một phơng hớng quan trọng giải quyết vấn đề an toàn lơng thực
cho nhân loại góp phần giảm thiểu các loại nông dợc và phân bón hoá học, bảo
vệ môi trờng sinh thái bền vững.
Sự biến đổi về mặt di truyền thờng bao gồm sự chèn đoạn ADN, tái tổ
hợp những mảnh ADN nhỏ hơn vào trong hệ gen của cây trồng bị biến đổi. Cấu
trúc của gen chèn điển hình trong GMC (Genetically Modified Crops) đợc tạo
nên bởi 3 bộ phận:
1. Đoạn promoter (đoạn khởi động) có chức năng điều khiển hoạt động
của gen cấu trúc, nó đợc ví nh chiếc công tắc bật/mở để đọc gen chèn vào.

2. Gen đã đợc chèn (gen đã bị biến đổi) đây thực chất là một gen cấu
trúc mã hoá cho đặc điểm đã chọn lọc riêng biệt.
3. Đoạn terminator (đoạn kết thúc) có chức năng nh một tín hiệu dừng
để đọc gen đã chèn .
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-10-
Ngoài ra một vài yếu tố khác có thể có mặt trong cấu trúc của đoạn ADN
chèn và chức năng của chúng thờng là để điều chỉnh và ổn định chức năng của
gen hoặc là để chứng minh sự có mặt của cấu trúc ADN chèn trong GMC hoặc
để có sự kết hợp dễ dàng của các thành phần khác nhau trong cấu trúc đoạn
ADN chèn. Cấu trúc của đoạn ADN chèn phải tơng hợp với hệ gen của cơ thể
nhận để nó có sự di truyền ổn định.
2.2.2. Những vấn đề liên quan đến cây trồng biến đổi gen
2.2.2.1. Lợi ích của cây trồng biến đổi gen
Thực trạng phát triển nhanh chóng của cây trồng biến đổi gen trong
những năm qua đã chứng tỏ chúng có những mặt mạnh nổi trội hơn hẳn những
cây trồng không biến đổi gen. Sau đây là những lợi ích mà chúng đem lại cho
con ngời trong thời gian kể từ khi cây trồng biến đổi gen đầu tiên xuất hiện cho
đến nay:
Lợi ích trong nghiên cứu cơ bản: Việc sử dụng GMC đã góp phần to lớn
trong việc phát hiện các gen quan trọng, xác định đợc chức năng của một gen
bất kỳ.
Lợi ích trong cải tạo giống cây trồng: Nhờ có công nghệ gen mà nhiều
giống cây trồng mới đợc tạo ra với các đặc tính không có ở cây trồng tự nhiên
nh khả năng chống chịu các điều kiện ngoại cảnh, chống chịu sâu bệnh, chống
chịu thuốc diệt cỏ nhằm nâng cao sản lợng và chất lợng cây trồng.
Lợi ích trong chăn nuôi gia súc: Công nghệ chuyển gen thực vật đã tạo ra
các loại thức ăn gia súc chứa các kháng thể đặc hiệu hay văcxin tái tổ hợp, làm

tăng sức đề kháng của vật nuôi đối với bệnh tật, tạo ra các loại thức ăn có chất
lợng dinh dỡng cao.
Lợi ích trong công nghệ thực phẩm: Rất nhiều loại thực phẩm mới có chất
lợng dinh dỡng cao, mẫu mã đẹp, thời gian bảo quản lâu, hay làm thay đổi
hàm lợng acid béo trong dầu thực vật nhằm làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim
mạch đã đợc tạo ra nhờ công nghệ chuyển gen thực vật.
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-11-
Lợi ích trong công nghệ dợc phẩm: Nhờ kỹ thuật ADN tái tổ hợp, ngời
ta có thể sản xuất ra các sản phẩm nh các kháng nguyên, các protein ngời,
hemoglobin, một số kháng thể từ cây trồng biến đổi gen.
Lợi ích về môi trờng: Năng suất của cây trồng biến đổi gen cao hơn rất
nhiều so với các cây trồng tự nhiên do đó sự phát triển của GMC sẽ làm giảm
nhu cầu chuyển đổi đất rừng và đất ở thành đất nông nghiệp. Làm giảm nhu cầu
sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc trừ cỏ, bón đạm nh vậy sẽ làm giảm ô nhiễm
nguồn nớc và nguy cơ gây hại cho sức khoẻ con ngời.
Lợi ích về kinh tế: GMC đã và đang mang lại cho ngời nông dân nhiều
lợi ích về kinh tế, nó làm giảm chi phí sản xuất, giảm sức lao động và tăng giá
trị sản phẩm. Năm 2007, doanh thu từ GMC đạt 6,9 tỷ USD và dự định năm
2008 là 7,5 tỷ USD [42].
Lợi ích ngời tiêu dùng: Nhờ có công nghệ chuyển gen thực vật mà ngời
tiêu dùng có thể có đợc các sản phẩm thực phẩm có lợi hơn đối với con ngời
nh các sản phẩm có chất lợng dinh dỡng cao, có hơng vị, có thời gian bảo
quản lâu, hay đợc bổ sung một số chất nh vitamin A, vitamin E [12, 20].
Ngoài những lợi ích to lớn kể trên, khi đa GMC ra ngoài môi trờng
ngời ta đặc biệt quan tâm đến những ảnh hởng của nó đối với môi trờng và
sự cân bằng hệ sinh thái Thực tế đã cho thấy cây trồng biến đổi gen có ích lợi
tiềm tàng đối với môi trờng. Chúng giúp bảo tồn các nguồn lợi tự nhiên, sinh

cảnh và các nguồn lợi bản địa, chúng góp phần giảm xói mòn đất, cải thiện chất
lợng nớc, cải thiện rừng và nơi c ngụ của động vật hoang dại.
2.2.2.2. Những rủi ro có thể có của cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính đã đ
ợc cải biến nhằm mang
lại những lợi ích tối đa cho con ngời nhng khi đa chúng ra môi trờng tự
nhiên và thơng mại hoá chúng thì không thể không đánh giá những rủi ro có
thể xảy ra. Những rủi ro này thờng đợc xem xét ở một số khía cạnh chính sau:
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-12-
Hiểm hoạ cỏ dại: Khả năng xảy ra là các gen mới trong GMC có thể
chuyển sang cây họ hàng sống hoang dã ngoài tự nhiên theo phơng thức lan
truyền hạt phấn, cũng nh khả năng tao ra những loại cỏ mới, kháng thuốc trừ
cỏ hay kháng côn trùng [5].
Khả năng kháng sâu: Cây trồng kháng sâu có khả năng tiêu diệt các loài
sinh vật không phải là sinh vật cần diệt làm ảnh hởng đến chuỗi thức ăn tự
nhiên, ảnh hởng đến sự đa dạng sinh học.
Nguy cơ phát sinh các mầm bệnh: Một nguy cơ tiềm tàng khác là khả
năng tái tổ hợp của một gen virus sẵn có trong GMC với các gen từ một virus
khác nhiễm vào cây đó và tạo ra một virus mới [5].
Sự kháng kháng sinh: Do các GMC thờng đợc chuyển các gen quy định
tính trạng kháng kháng sinh, vì thế gây ra mối lo lắng rằng liệu các gen này có
thể đợc phát tán từ GMC sang các vi sinh vật c trú trong ruột ngời và làm
chúng tăng khả năng đề kháng đối với kháng sinh. Tuy nhiên ngời ta thấy rằng
mối nguy cơ này xảy ra với xác suất vô cùng nhỏ và nếu có xảy ra thì tác động
này cũng không đáng kể vì gen chỉ thị đợc sử dụng trong GMC đợc ứng dụng
rất ít trong thú y và y học [12].
2.2.2.3. Vấn đề an toàn và những quy định về quản lý cây trồng biến đổi

gen
Mặc dù GMC đang đợc thơng mại hoá có nhiều đặc tính u việt hơn so
với các cây trồng cùng loại nhng do mới xuất hiện nên ngời ta cha đánh giá
hết đợc những ảnh hởng bất lợi của chúng. Vì vậy yêu cầu đặt ra khi thơng
mại hóa GMC và sản phẩm của chúng là chúng ta phải đặt vấn đề xem xét về
mức độ an toàn của các sản phẩm này lên hàng đầu. Vì thế bất kỳ một sản phẩm
chuyển gen nào trớc khi đợc đa ra thị trờng phải đ
ợc thử nghiệm toàn
diện, đợc các nhà khoa học và giám định viên đánh giá độc lập xem có an toàn
hay không về mặt dinh dỡng, độc tính, khả năng gây dị ứng và các khía cạnh
khoa học thực phẩm khác. Những đánh giá về an toàn thực phẩm này dựa trên
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-13-
những quy định của từng quốc gia. Chúng bao gồm: một hớng dẫn sử dụng sản
phẩm, một thông tin chi tiết về mục đích sử dụng sản phẩm, các thông tin về
phân tử, hoá sinh, độc tính, dinh dỡng, khả năng gây dị ứng
Do những rủi ro và những lo ngại bất thờng xung quanh quá trình biến
đổi di truyền mà việc bắt buộc dán nhãn các sản phẩm GMC đã trở thành một
yêu cầu và là quy định của nhiều quốc gia. Việc dán nhãn GMC cho phép ngời
tiêu dùng lựa chọn sản phẩm theo phong tục, tôn giáo, chế độ ăn hàng ngày của
họ vì nhiều tôn giáo không thích sử dụng các sản phẩm đợc tạo ra nhờ sự biến
đổi di truyền.
2.2.3. Tình hình sản xuất, sử dụng cây trồng biến đổi gen trên thế giới
Sau khi những kết quả nghiên cứu đầu tiên về cây trồng biến đổi gen đợc
công bố những năm 80 thế kỷ XX, sự phát triển của cây trông biến đổi gen có
những bớc đột phá quan trọng về những kết quả nghiên cứu và ứng dụng chúng
vào sản xuất:
Năm 1994, lần đầu tiên FDA (Cơ quan quản lý thực phẩm và dợc phẩm

Mỹ) chấp nhận thực phẩm đợc tạo ra bằng CNSH là cà chua. Năm 1996, cây
trồng biến đổi gen thực sự bùng nổ với sự ứng dụng rộng rãi trong sản xuất.
Năm 1997, cây trồng biến đổi gen lần đầu tiên đợc thơng mại hóa, diện tích
cây trồng biến đổi gen thơng mại hoá đạt gần 11 triệu hecta (chủ yếu là Mỹ,
Achentina, Auxtralia, Canada, Trung Quốc và Mehico). Năm 2000, diện tích
cây trồng biến đổi gen đạt 44,2 triệu ha trên 13 nớc. Năm 2001, chèn thành
công gen đơn từ Arabidopsis vào cây cà chua để tạo ra cây trồng đầu tiên có thể
trồng trên đất và nớc mặn. Năm 2002, tổng giá trị thị trờng toàn cầu của cây
trồng biến đổi gen ớc tính đạt khoảng 4,5 tỷ USD. Năm 2004, diện tích cây
trồng biến đổi gen đạt con số 81 triệu hecta. Năm 2005 diện tích cây biến đổi
gen đã đạt 90 triệu hecta, diện tích cây trồng biến đổi gen đã tăng hơn 50 lần
trong thập kỷ đầu tiên cây biến đổi gen đợc trồng đại trà, số nớc trồng cây
biến đổi gen tăng lên tới 21 nớc. Năm 2007 diện tích cây CNSH tiếp tục tăng 2
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-14-
con số, đạt 12% tơng đơng với 12,3 triệu hecta (30 triệu mẫu). Diện tích đất
canh tác cây CNSH lên tới 114, 3 triệu hecta [42].
Tổng diện tích đất trồng cây CNSH từ năm 1996 đến năm 2007 đạt 690
triệu hecta (1,7 tỷ mẫu), tăng 67 lần so với năm 1996, đa CNSH trở thành
thành tựu đợc ứng dụng nhanh nhất trong nông nghiệp. Năm 2007 cũng là
năm đầu tiên tổng luỹ kế số nông dân quyết định canh tác cây trồng CNSH vợt
con số 50 triệu ngời [42].

Hình 1: Diện tích cây trồng CNSH trên toàn cầu 1996-2007 (triệu ha)
Từ năm 1996 đến năm 2007, tỉ trọng diện tích trồng cây CNSH của các
nớc đang phát triển so với diện tích trồng trên toàn thế giới tăng đều mỗi năm.
Năm 2007, 43% diện tích cây trồng CNSH trên toàn cầu là ở các nớc đang phát
triển (tăng 3% so với tỷ trọng 40% năm 2006), tơng đơng với 49,4 triệu hecta.

Trong khoảng thời gian từ 2006 đến 2007, diện tích trồng cây CNSH ở các nớc
đang phát triển (8,5 triệu ha hay 21%) tăng cao hơn so với các nớc công nghiệp
(3,8 triệu ha hay 6%). Đáng chú ý là có 5 nớc lớn và đang phát triển đa cây
trồng CNSH vào canh tác, nằm ở 3 châu lục: Trung Quốc và ấn Độ ở Châu á,
Achentina và Braxin ở châu Mỹ Latinh, Nam Phi ở châu Phi; tổng dân số ở cả 5
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-15-
quốc gia này là 2,6 tỉ ngời, chiếm 40% dân số thế giới, trong đó có 1,3 tỉ ngời
sống hoàn toàn dựa vào nông nghiệp.
Bảng 1: Diện tích trồng cây CNSH năm 2007 phân theo nớc (đ/v: triệu ha)
TT Nớc trồng Diện tích trồng Loại cây biến đổi gen
1*

Hoa Kỳ
57.7
Đậu tơng, ngô, bông, cải, đu đủ, cỏ alfalfa
2*

Achentina* 19.1 Đậu tơng, ngô, bông
3*

Brazin*
15.0
Đậu tơng, ngô
4*

Canada* 7.0 Cải canola, ngô, đậu tơng
5*

ấn Độ*
6.2
Bông
6*

Trung quốc* 3.8 Bông, cà chua, thuốc lá, đu đủ, hạt tiêu
7*

Paraguay* 2.6 Đậu tơng
8*

Nam phi* 1.8 Ngô, đậu tơng, bông
9*

Urugoay* 0.5 Đậu tơng, ngô
10*

Philippin* 0.3 Ngô
11*

Australia* 0.1 Bông
12*

Spain* 0.1 Ngô
13*

Mexico*
0.1
Bông, đậu tơng

14

Colombia 0.1 Bông, cẩm chớng
15 Chile <0.1 Ngô, đậu tơng, cải canola
16 Pháp <0.1 Ngô
17 Honduras <0.1 Ngô
18 Cộng Hoà Séc <0.1 Ngô
19 Bồ Đào Nha <0.1 Ngô
20 Đức
<0.1
Ngô
21 Slovakia <0.1 Ngô
22 Romania <0.1 Ngô
23 Phần Lan <0.1 Ngô
* 13 nớc đợc coi là có diện tích trồng lớn, từ 50,000 héc-ta trở lên
Trong số các cây trồng CNSH đợc đa vào thơng mại hoá từ năm 1996
đến năm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội. Năm 2007,
tính trạng chịu đợc thuốc trừ cỏ đợc triển khai trên cây đậu tơng, ngô, cải
canola, cỏ alfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích
đất trồng cây CNSH toàn cầu). Năm 2007, Hoa Kỳ, Achentina, Braxin, Canada,
ấn Độ và Trung Quốc tiếp tục là các nớc đa cây trồng CNSH vào canh tác
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-16-
nhiều nhất. Hoa Kỳ vẫn dẫn đầu thế giới với 57,7 triệu hecta (chiếm 50% diện
tích đất trồng cây CNSH trên thế giới), do nhu cầu ngày càng tăng của thị trờng
ngô dùng trong sản xuất cồn ethanol, diện tích trồng ngô CNSH tăng tới 40% -
mức tăng này đã phần nào bù lại mức giảm đôi chút đối với diện tích trồng đậu
tơng và bông CNSH. Đáng chú ý là 63% ngô CNSH, 78% bông CNSH và 37%

các loại cây CNSH khác ở Hoa Kỳ là các sản phẩm mang gien độn (các sản
phẩm tập hợp nhiều đặc tính) có chứa hai hay ba đặc tính và đem lại nhiều lợi
ích trên một cây trồng. Xu thế của tơng lai là sử dụng những loại cây trồng
CNSH mang gien độn kiểu này nhằm đáp ứng nhu cầu của nông dân và ngời
tiêu dùng.
Nh vậy, trên thế giới tình hình phát triển của cây trồng biến đổi gen rất
mạnh mẽ, nó đã đem lại rất nhiều lợi ích cho con ngời, đặc biệt trong lĩnh vực
nông nghiệp: cây trồng biến đổi gen cho phép tạo ra nhng cây trồng cho năng
suất cao, chất lợng tốt, có khả năng chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn
2.2.4. Tình hình sản xuất và sử dụng cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam
Hiện nay ở nớc ta lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, đặc biệt
là cây trồng biến đổi gen đang đợc tiếp cận, đầu t và triển khai nghiên cứu,
ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt. Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng nh năng
suất cao, chất lợng tốt, có khả năng chống chịu đã đợc phân lập và nghiên cứu
nhằm chuyển vào cây trồng để tạo nên những giống lý tởng. CNSH Việt Nam
nói chung và lĩnh vực cây trồng biến đổi gen nói riêng đã có những bớc phát
triển đáng chú ý:
Đã thành công trong việc phân lập đoạn promoter đặc trng hạt của gen
Gluteline lúa và thiết kế các gen Cry Xa21 vào Plasmid pCAMBIA nhằm làm
chủ nguồn gen có giá trị để tạo ra chủng vi khuẩn Agrobacterium cho việc
chuyển gen vào thực vật. Hoàn thiện quy trình chuyển gen CryIA(b), CryIA(c)
kháng côn trùng, gen Chitinase kháng bệnh nấm, gen Xa21 kháng bệnh bạc lá
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-17-
vi khuẩn và gen Bar kháng thuốc diệt cỏ thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào
cây lúa giống C71, giống DT10 và DT13, cây cải dầu và bắp cải.
Đối với cây lúa, đã tạo đợc lúa biến đổi gen giống Nàng Hơng Chợ Đào
và 2 dòng cây biến đổi gen GUS A và hph.

Kết quả đã thu đợc những cây trồng biến đổi gen và lu giữ chúng trong
điều kiện invitro và trong điều kiện nhà kính.
2.3. Cây ngô biến đổi gen
2.3.2. Tình hình sản xuất cây ngô biến đổi gen trên thế giới
Trên thế giới thì diện tích cây ngô biến đổi gen là lớn thứ 2 sau đậu tơng
với diện tích 25,2 triệu ha chiếm 25% diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế
giới. Cây ngô biến đổi gen đợc trồng nhiều nhất ở Mỹ, Achentina, Brazin,
Canada, China, Nam Phi, Uruguay, PhilippinCây ngô chủ yếu đợc nghiên
cứu, sản xuất và sử dụng giống có tính trạng chống chịu thuốc trừ cỏ, kháng sâu,
chịu hạn.
Năm 2006, thêm một số nớc thuộc liên minh Châu Âu (EU) lần đầu tiên
đa ngô Bt vào trồng đại trà. Tổng diện tích trồng ngô Bt ở 5 nớc (Pháp, Cộng
Hoà Séc, Bồ Đào Nha, Đức và Slovakia) đã tăng trên 5 lần từ xấp xỉ 1.500 ha
năm 2005 lên gần 8.500 ha năm 2006, diện tích này còn tăng lên rất nhiều trong
năm 2007.
Ngô là cây trồng đợc các quốc gia trên thề giới cấp phép sử dụng làm
thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nhiều nhất với tổng số 35 giống khác nhau, vợt
hẳn cây trồng đứng thứ 2 là bông (với 19 giống khác nhau). Giống ngô đợc cấp
phép nhiều nhất là ngô kháng sâu bệnh (MON 810) và ngô kháng thuốc trừ cỏ
(NK603), cả hai giống ngô đợc 18 nớc cấp phép.
Năm 2006, theo ớc tính của hãng phân tích thị trờng Cropnosis, thị
trờng cây trồng biến đổi gen toàn cầu trị giá khoảng 6,15 tỷ đô la, chiếm 16%
thị trờng cây trồng đợc bảo hộ trên toàn cầu và chiếm 21% thị trờng hạt
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-18-
giống toàn cầu. Trong đó giá trị của ngô biến đổi gen chiếm 39% tơng đơng
khoảng 2,39 tỷ đô la.
Do đặc tính sinh lý của cây ngô nên tỷ lệ đạt kết quả nghiên cứu chuyển

gen trong cây ngô trên thế giới là rất cao và đạt độ an toàn cao nhất so với các
loại cây trồng biến đổi gen trên thế giới. Nh vậy, với việc đa cây ngô biến đổi
gen vào sản xuất đã góp phần ổn định lơng thực trên thế giới trong hiện tại và
trong tơng lai.
2.3.3. Tình hình sản xuất và sử dụng cây ngô biến đổi gen tại Việt Nam
Việt Nam là một quốc gia với nền kinh tế nông nghiệp chủ yếu. Ngô là
một trong những cây lơng thực đóng vai trò quan trọng. Vì vậy, việc nghiên
cứu cây ngô biến đổi gen đang đợc đầu t mạnh mẽ.
Vào ngày 5/09/2005 thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành trồng thử
nghiệm hai loại bắp chuyển gen trên diện tích 1.000 m
P
2
P
đất ở Q.12. Hai loại ngô
chuyển gen nói trên là hai loại ngô đã đợc chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và
kháng sâu [41].
Kết quả từ việc trồng thử nghiệm bắp chuyển gen sẽ đợc so sánh với các
giống bắp thông thờng hiện đang đợc trồng tại thành phố Hồ Chí Minh. Trên
cơ sở đó, các nhà khoa học sẽ đề xuất nên hay không nên ứng dụng trồng ngô
chuyển gen ở Việt Nam.
Đặc biệt mới đây, đề tài/dự án tạo ngô biến đổi gen kháng sâu và kháng
thuốc diệt cỏ đợc nghiên cứu tại viện Di Truyền Nông Nghiệp do TS. Nguyễn
Văn Đồng chủ nhiệm đề tài, mục tiêu là tạo dòng ngô kháng sâu và kháng thuốc
diệt cỏ có năng suất cao và thích nghi tốt với các vùng sinh thái khác nhau. Đây
là đề tài/dự án thuộc chơng trình trọng điểm Phát triển ứng dụng công nghệ
sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp thực hiện từ tháng 10 năm 2006.
2.4. Những vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ cỏ và một số
dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ
2.4.1. Một số vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ cỏ
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

-19-
Khi đợc hỏi, bất cứ ngời nông dân nào cũng trả lời rằng cỏ dại luôn là
một vấn đề gây lo lắng cho họ. Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy
nớc, chất dinh dỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để mọc mà còn là nơi
c trú cho côn trùng và các loại sâu bọ gây bệnh, gây tắc nghẽn hệ thống tới
tiêu, làm giảm sút chất lợng mùa màng, và còn đem theo cả hạt giống cỏ vào
cây trồng đợc thu hoạch.
Thông thờng, nông dân sẽ cày bừa trớc khi trồng trọt nhằm làm giảm
số lợng cỏ dại trên cánh đồng. Sau đó họ phun thuốc diệt cỏ theo diện rộng để
làm cho cỏ dại không thể mọc đợc ngay trớc khi geo hạt. Biện pháp diệt cỏ
này rất tốn kém và việc cày xới đất sẽ khiến gió và nớc làm xói mòn lớp đất
phía trên bề mặt gây hậu quả nghiêm trọng kéo dài cho môi trờng. Ngoài ra,
một số thuốc diệt cỏ lại tồn tại dai dẳng trong môi trờng. Sự tạo thành các cây
trồng kháng thuốc diệt cỏ là một cách để khắc phục các yếu điểm đó.
Một số cải biến sinh học khác nhau có thể làm cho cây trồng trở nên
kháng thuốc diệt cỏ có thể nêu ra là:
Tạo ra một loại protein mới giải độc thuốc diệt cỏ.
Thay đổi protein mục tiêu của thuốc diệt cỏ do vậy mà protein này sẽ
không bị tác động bởi thuốc diệt cỏ.
Sản xuất quá mức protein mục tiêu nhạy cảm thuốc diệt cỏ sao cho vẫn có
d để duy trì các chức năng tế bào bất chấp sự có mặt của thuốc diệt cỏ.
Cho cây khả năng bất hoạt về mặt chuyển hoá thuốc diệt cỏ.
Ba cách đầu tiên là những cách phổ biến nhất mà các nhà khoa học dùng
để phát triển loại cây trồng chịu đợc thuốc diệt cỏ (bảng 2).
Trong số các cây trồng CNSH đợc đa vào thơng mại hóa từ năm 1996
đến năm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội. Năm 2007,
tính trạng chịu đợc thuốc trừ cỏ đợc triển khai trên cây đậu tơng, ngô, cải
canola, cỏ alfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích đất

trồng cây CNSH toàn cầu). Các giống phổ biến nhất là chịu đ
ợc thuốc
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-20-
glyphosate và glufosinate [42]. Bảng dới đây cho thấy các nớc đã chuẩn y các
loại cây trồng chịu đợc thuốc diệt cỏ chính dùng làm thực phẩm
Bảng 2: Một số ví dụ về sự kháng thuốc diệt cỏ
Thuốc diệt cỏ Cơ chế phát triển tính kháng thuốc diệt cỏ
Triazin

Sulfonylure


Imidazolimon

Aryloxphenoxypropio
nat
xyclohexanedion


Glyphosat




Axit
phenoxycarboxylic
(nh 2,4-D và 2,4,5-T)

Glufosinat
(phosphinothrixin)

Tính kháng thuốc là do sự thay đổi gen psbA mã hoá
cho đích của thuốc diệt cỏ, protein lục nạp D-1.
Các gen mã hoá các dạng kháng của enzym axetolactat
synthetaza đã đợc đa vào lúa, cây dơng, cây lanh,
cây cải dầu
Các giống có các dạng enzym axetolactat synthetaza
kháng đã đợc chọn lọc trong nuôi cấy mô.
Các thuốc diệt cỏ này kìm hãm enzym axetyl coenzym
A carboxylaza. Sự kháng đợc chọn lọc trong nuôi cấy
mô, có đợc là do enzym thay đổi không nhạy cảm
thuốc diệt cỏ hoặc phân huỷ thuốc diệt cỏ.
Tính kháng do sản xuất quá mức EPSPS, đích của thuốc
diệt cỏ này. Tính kháng thuốc đợc cải biến bằng biến
nạp đặc trng với gen EPSPS kháng glyphosat và thuốc
lá với gen glyphosat oxidoreductaza mã hoá enzym phân
huỷ glyphosat.
Cây bông và thuốc lá có tính kháng đợc tạo thành bằng
biến nạp với gen tfdA từ Alcaligenes mã hoá
dioxygenaza phân huỷ chất diệt cỏ này.
Hơn 20 loại cây khác nhau đã đợc biến nạp với gen bar
từ Streptomyces hygroscopicus hoặc gen pat từ S.
Viridochromogenes. Phosphinothrixin axetyltransferaza
mà các gen này mã hoá khử độc thuốc diệt cỏ này.

Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

-21-
Cây trồng Nớc
Canola Ôxtralia, Canađa, Nhật bản, Hoa kỳ, Achentina
Bông Achentina, Ôxtralia, Canađa, Nhật Bản, Hoa kỳ
Ngô Achentina, Ôxtralia, Canađa, Liên minh Châu âu, Nhật
Bản, Thuỵ sỹ, Anh, Hoa kỳ
Lúa Hoa kỳ
Đậu tơng Achentina, Ôxtralia, Braxin, Canađa, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Mêxicô, Hà Lan, Nga, Nam Phi, Thuỵ sỹ, Hoa
kỳ, Uruguay
Củ cải đờng Ôxtralia, Canađa, Nhật Bản, Hoa kỳ

2.4.2. Một số gen kháng thuốc trừ cỏ Phosphinothricin-N-acetyltransferase
(PAT), Bar
Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT)
Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) là một trong những gen
kháng thuốc trừ cỏ đã đợc chuyển vào một số cây trồng nh ngô và đậu tơng.
Gen này chống chịu đợc với thuốc trừ cỏ glufosinate, đợc phân lập từ một loại
xạ khuẩn đất Streptomycesviridochromogenes. Gen PAT cho phép sản sinh ra
enzyme phosphinothricine N-acetyltransferase (PAT), enzym này có khả năng
chống chịu đợc glufosinate.
Gen Bar
Gen Bar là một trong các gen kháng thuốc trừ cỏ ammonium-glufosinate
(hay phosphinothricin). Ammonium-glufosinate là thành phần hoạt tính của
thuốc diệt cỏ Basta, Finale, Buster, Harvest và Liberty, đây là loại thuốc trừ cỏ
có hệ thống phân loại rõ nét mà nó đã đợc sử dụng rộng rãi để kiểm soát không
chọn lọc đối với các loài cỏ dại 1 năm và lâu năm, là chất diệt cỏ có phổ rộng và
đợc sử dụng để kiểm soát vùng cỏ dại rộng lớn trong quá trình canh tác.
Glufosinate là hợp chất tự nhiên đợc phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức

Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-22-
chế hoạt tính của enzym tổng hợp glutamin, enzym cần thiết cho sự tạo thành
glutamin và độc tính ammonia. Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm
lợng glutamin và làm tăng ammonia trong mô thực vật. Điều này làm cho quá
trình quang hợp ngừng và cây chết sau vài ngày.
Gen Bar mã hoá cho enzym phosphinothricin- N- acetyltransferase (PAT)
đợc phân lập từ chủng Streptomyces hygroscopicus HP632. Ngoài việc cung
cấp tính trạng kháng thuốc trừ cỏ, gen mã hoá enzym PAT còn đợc sử dụng
nh marker chọn lọc để xác định các cây đã chuyển gen trong suốt quá trình tái
sinh nuôi cấy mô. làm cho thành phần hoạt tính trong thuốc trừ cỏ glufosinate là
phosphinothricin không hoạt động, cho phép các cây trồng sống sót trong khi
mà ứng dụng khác của glufosinate có thể gây chết.
2.4.3. Một số dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ
Event Bt16
Phơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.
Dòng Bt16 đợc cải biến di truyền để kháng thuốc trừ cỏ ammonium-
glufosinate (hay phosphinothricin), thnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ
Basta, Finale, Buster, Harvest v Liberty. Ammonium-glufosinate l một chất
diệt cỏ có phổ rộng, không chọn lọc. Nó đợc sử dụng để kiểm soát cỏ dại sau
khi cây mọc hoặc kiểm soát thảm thực vật mọc trên đất m chúng không sử
dụng cho mục đích gieo trồng. Nó có thể bị vi khuẩn phân huỷ ở mức độ cao,
không có hoạt tính d thừa, v mức độ độc tính đối với con ngời v động vật
rất thấp. Khả năng chống chịu glufosinate trong dòng ny l do gen bar, gen
ny mã hoá cho enzym phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) m cho
phép các cây trồng ny sống sót trong khi m ứng dụng khác của glufosinate có
thể gây chết.
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

-23-

Hình 2: Cấu trúc pDPG165 sử dụng trong biến nạp event Bt16
Event GA21
Phơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.
Dòng GA21 l ngô Roundup Ready, chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate.
Glyphosate l 1 loại thuốc trừ cỏ đợc biết sau ny, đây l loại thuốc trừ cỏ có
hệ thống phân loại rõ nét m nó đã đợc sử dụng rộng rãi để kiểm soát không
chọn lọc đối với các loi cỏ dại 1 năm v lâu năm. Dòng GA21 có khả năng
kháng thuốc trừ cỏ nhờ chuyển gen EPSPS nội sinh của ngô vo genome của
cây, enzym mã hoá của gen ny không nhạy với sự khử hoạt tính bởi
glyphosate.

Hình 3: Đoạn ADN của cấu trúc pDPG434 sử dụng trong biến nạp để tạo
ra event GA21
Event T14, T25
Phơng pháp chuyển nạp: Chuyển ADN trực tiếp vo genome của cây.
T14 v T25 đã đợc cải biến di truyền để chống chịu ammonium
glufosinate (phosphinothricin), thnh phần hoạt tính của các loại thuốc trừ cỏ
của các hãng Basta, Finale, Buster, Harvest v Liberty. Tính kháng thuốc trừ cỏ
ammonium glufosinate có đợc l do gen PAT.
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-24-

Hình 4: Plasmid p35S/Ac đã đợc sử dụng để tạo ra event T14, T25
Event TC1507

Phơng pháp biến nạp: Chuyển nạp nhờ súng bắn gen.
TC1507 đợc cải tiến di truyền để kháng côn trùng v thuốc trừ cỏ
glufosinate. Dòng ny chứa gen cry1F - l protein cry1F của côn trùng có nguồn
gốc từ B. thuringiensis var. aizawai. Protein ny có hiệu quả trong việc kiểm
soát ấu trùng của nhiều loi sâu bọ phổ biến ở ngô chẳng hạn nh sâu đục thân
ngô Châu Âu, sâu đục thân ngô Tây Bắc, sâu ngi đen, sâu cắn gié. Dòng
TC1507 có khả năng chống chịu ammonium glufosinate l do chuyển gen PAT
vo genome của dòng ny.

Hình 5: Plasmid PHI8999A đã đợc sử dụng để tạo ra event TC1507
2.5. Các phơng pháp phát hiện cây trồng biến đổi gen
Việc nhận biết GMC có rất nhiều ứng dụng nh để đánh giá mức độ sạch
của Cây giống hay đối với việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm ở một số quốc gia.
Có rất nhiều kỹ thuật đã và đang đợc phát triển để đáp ứng nhu cầu này. Nhận
biết GMC và dẫn xuất của nó có thể đợc thực hiện nhờ sự nhận biết phân tử mà
những phân tử này có nguồn gốc từ gen đợc chèn [13, 14]. Có 3 phơng pháp
để xác định GMC đó là:

Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


-25-
1. Phơng pháp khuếch đại dựa trên cơ sở nucleotit:
Bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP
(Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleic (NASBA),
các kỹ thuật RFLP, AFLP, RAPD
- Dựa trên cơ sở ARN: Nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa phân tử ARN và
phân tử ADN hoặc ARN tổng hợp (gọi là primer). Thờng thì sự liên kết giữa
ARN và primer sẽ dẫn đến sự chuyển hoá phân tử ARN thành ADN thông qua
quá trình sao chép ngợc. Cuối cùng ADN có thể đợc nhân lên nhờ kỹ thuật

PCR. Hoặc ARN đợc phiên mã thành hàng trăm bản coppy nh là một mẫu
chuẩn trong kỹ thuật NASBA [13].
- Dựa trên cơ sở ADN: Chủ yếu là nhờ vào sự nhận đôi của ADN đặc
hiệu với kỹ thuật PCR. Đây là kỹ thuật đợc sử dụng phổ biến ở các phòng thí
nghiệm bởi đó là một phơng pháp nhạy và có tính đặc hiệu cao, có thể phát
hiện đợc ADN ngay ở hàm lợng rất thấp. Kỹ thuật PCR không những đợc sử
dụng để xác định GMC mà còn đợc sử dụng vào mục đích định lợng.
2. Phơng pháp dựa trên cơ sở protein:
Bao gồm điện di SDS một chiều, điện di SDS hai chiều, phân tích
Western-blot, kỹ thuật ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assays). Là
phơng pháp nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa protein và kháng thể. Kháng thể
chính là tác nhân bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và virus, khi
kháng thể nhận ra phân tử lạ thì nó sẽ liên kết với phân tử này và trong các phân
tích nhận biết GMC thì sự phức tạp của mối liên kết lần lợt đợc nhận biết nhờ
phản ứng hình thành sắc tố. Đây chính là kỹ thuật ELISA. Tuy nhiên kháng thể
có thể không đợc sinh ra nếu không nhận đợc protein sạch. Protein này phải
đợc làm sạch ngay từ bản thân GMC hoặc có thể đợc tổng hợp trong th viện
nếu nh biết thành phần của acid amin của protein. Phơng pháp này thích hợp
với việc phân tích đối với nguyên liệu thô [13, 19].