Nghiên cứu định lượng paracetamol và ibuprophene trong thuốc đa thành phần

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
— m = ^ —
NGUYỄN THÀNH ĐẠT
NGHIÊN CỨU ĐịNH LƯỢNG
PARACETAMOL VÀ IBUPROPHENE
TRONG THUỐC ĐA THẰNH PHẦN
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1997-2002)
Người hướng dẫn: TS. THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS. THÁI DUY THÌN
Nơi thực hiện: Phòng Hoá Lý I - Viện Kiểm nghiệm
Bộ môn Hoá Dược
Thời gian thực hiện: 9/2001 đến 5/2002
Hà N ộ i 5-2 0 02 \ 4 , jo^:ì4
, £ Ờ 5 i ũ f x
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá Lý I - Viện
Kiểm nghiệm - Bộ Y tế và Bộ môn Hoá Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự hướng
dẫn tận tình của các thầy cô hướng dẫn, các giảng viên, cán bộ của bộ môn
Hoá Dược và các cán bộ của phòng Hoá Lý I - Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế.
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của
TS. Thái Phan Quỳnh Như - Trưởng phòng Hoá Lý ỉ - Viện Kiểm nghiệm và
TS. Thái Duy Thìn - Bộ môn Hoá Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã
giúp tôi cố những tài liệu và kỹ năng cần thiết trong quá trình thực hiện khoá
luận. Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các kỹ thuật
viên khác trong bộ môn Hoá Dược và các cán bộ phòng Hoá Lý I - Viện Kiểm
nghiệm đã giúp tôi hoàn thành khoá luận của mình trong thời gian ngắn nhất.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội
đã cung cấp những tài liệu Hên quan, phòng Thí nghiệm trung tâm trường Đại
học Dược đã giúp xử lý một số mẫu mà điều kiện máy móc ở phòng thí nghiệm
Bộ môn Hoá Dược chưa cho phép thực hiện được.

SVNguụển Thành Dọt
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề 1.
Phần 1: Tổng quan 2.
1.1. Paracetamol 2.
1.2. Ibuproíene 4.
1.3. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại

5.
1.3.1. Khái quát về phương pháp 5.
1.3.2. Một số kỹ thuật định lượng 6 .
1.4. Phương pháp HPLC 7.
1.4.1. Khái quát phương pháp HPLC 7.
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng trong kỹ thuật HPLC 7.
1.4.3. Hệ thống HPLC 11.
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC 11.
1.4.5. Pha động trong HPLC 13.
1.4.6. Cách đánh giá pic 15.
1.4.7. Cách tính kết quả 16.
Phần 2: Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu

17.
2.1. Nội dung nghiên cứu 17.
2.2. Đối tượng nghiên cứu 17.
2.2.1. Các hoá chất thí nghiệm 17.
2.2.2. Viên nén Alaxan 17.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17.
Phần 3: Thực nghiệm và kết quả
18.

3.1. Thiết bị, hoá chất, dung môi
18.
3.2. Định lượng Paracetamol và Ibuproíene trong hỗn hợp thuốc
theo tiêu chuẩn cơ sở
18.
3.2.1. Định lượng Paracetamol trong hỗn hợp bằng phương pháp
đo quang phổ hấp thụ tử ngoại: 18.
3.2.2. Định lượng Ibuproíene trong hỗn hợp bằng phương pháp
chuẩn độ acid - base: 25.
3.3. Định lượng đồng thời hỗn hợp bằng phưoíng pháp HPLC

29.
3.3.1. Điều kiện sắc ký: 29.
3.3.2. Khảo sát độ tuyến tính: 31.
3.3.3. Khảo sát độ lặp lại: 34.
3.3.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp 36.
3.4. So sánh hai phương pháp
37.
3.4.1. So sánh về kết quả định lượng của hai phương pháp

37.
3.4.2. So sánh về độ chính xác của hai phương pháp

37.
3.4.3. So sánh về hai giá trị trung bình 38.
3.4.4. Đánh giá ưu nhược điểm của phương pháp:

38.
3.4.5. Lựa chọn phương pháp:
40.

Phần 4: Kết luận và đê xuất 41.
Tài liêu tham khảo 43.
ĐẶT VẤN ĐỂ
Công tác đảm bảo chất lượng thuốc đang là một trong những vấn đề hàng
đầu của ngành Dược. Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng các phưoỉng pháp
khác nhau để định lượng các thành phần trong các công thức thuốc ở dạng
phối hợp đã và đang được quan tâm tới nhiều hơn.
Vói tác dụng hạ nhiệt nhanh, giảm đau mạnh và đặc biệt là tương đối an
toàn cho người bệnh, Paracetamol là một dược chất có mặt rất nhiều trong các
biệt dược có tác dụng hạ nhiệt giảm đau ở dạng phối hợp. Việc phối hợp các
thành phần trong công thức rất đa dạng và phức tạp, thông thường phối hợp từ
2 đến 3 thành phần trong đó có Paracetamol. Một trong những dạng thông
dụng trên thị trường hiện nay là hỗn hợp Paracetamol và Ibuprofen ( ví dụ:
viên nén Alaxan của xí nghiệp United Pharma Việt Nam, viên nén Pi-Antalvic
của Công ty Dược vật tư y tế Trà Vinh, viên nén MK protamol của công ty cổ
phần Dược phẩm Mê Kông ).
Tuy được lưu hành và sử dụng phổ biến nhưng cho đến nay, dược điển
Việt Nam chưa có chuyên luận cho các dạng bào chế này. Việc định lượng các
thành phần trong dạng phối hợp nêu trên chỉ được tiến hành theo các tiêu
chuẩn cơ sở, trong đó các phưoỉng pháp được đề cập đến chưa có sự thống
nhất. Trong dược điển các nước khác cũng chỉ có Dược điển Mỹ [17] có
chuyên luận về các dạng thuốc phối hợp, nhưng với hỗn hợp chứa Paracetamol
và Ibuprofen thì Dược điển Mỹ vẫn chưa đề cập tới.
Mục tiêu của khoá luận này là nghiên cứu một số phương pháp định
lượng Paracetamol và Ibuprofen có trong thành phần một dạng thuốc với mục
đích làm phong phú thêm và đánh giá các phương pháp cho các cơ sở lựa chọn
áp dụng. Đồng thời mong được góp phần xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng
của ngành cũng như của Quốc gia cho các dạng thuốc có thành phần tưoỉng tự.
PHẦNl
TỔNG QUAN

Trong khoá luận này, chúng tôi sử dụng các phương pháp định lượng đo
quang phổ hấp thụ tử ngoại, phưoỉng pháp chuẩn độ acid - base, và phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng Paracetamol và Ibuprofen trong
hỗn hợp thuốc. Vì vậy, trong phần này, tôi xin tổng quan một số nét về hai
chất nghiến cứu là Paracetamol và Ibuprofen đồng thòi về hai phương pháp
định lượng là phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại và phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC).
1.1. PARACETAMOL [1][8][12][14]
• Công thức phân tử: C8ÍỈ9NO2
• Cổng thức cấu tao:
N H -C 0 -C H 3
• Tên khoa hoc: N - Acetyl - p - Aminophenol; p - Hydroxyacetanilid;
Acetamidophenol.
• Tên khác: Acetaminophen.
• Tính chất:
- Bột kết tinh trắng, không màu, dễ tan trong ethanol, khó tan trong nước,
không tan trong cloroform, tan trong kiềm do tạo muối phenolat.
- Nhiệt độ nóng chảy từ 168 - 172°c.
- Cho phản ứng của - OH phenol tự do: vói cho màu lam tím.
- Dễ bị thuỷ phân do chức amid không bền.
• Cống dung: có tác dụng hạ nhiệt, giảm đau tốt. Đây là một thuốc tương
đối an toàn do có ít tác dụng không mong muốn.
Các phưoíng pháp đinh lương:
- Phương pháp chuẩn độ nitrit [11][12]: thuỷ phân Paracetamol trong môi
trường acid ( dung dịch HQ 10 % ) và nhiệt độ tạo thành amin thơm bậc
một, rồi chuẩn độ bằng dung dịch natri nitrit trong môi trường acid tạo
hợp chất diazoni ( phản ứng diazo hoá).
- Phương pháp đo quang [12]: dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân
tử Paracetamol trong methanol có cực đại hấp thụ tại 245nm và trong môi
trường kiềm có cực đại hấp thụ tại 257nm.

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3] [6 ]: sử dụng chương
trình sắc ký pha đảo đẳng dòng với cột Lichrosorb RP18 (250 X 4mm;
lOịLim), detector u v phát hiện ở bước sóng 257nm, dung môi pha động là
hỗn hợp methanol: nước (50 : 50 ), tốc độ dòng Iml/phút.
- Định lượng Nitơ bằng phương pháp Kendal [16]; phương pháp này dựa
t r ê n s ự p h â n h u ỷ c á c p h â n t ử h ữ u c ơ c ó c h ứ a n it ơ k h i đ u n v ớ i H 2S O 4 đ ặ c
vói sự có mặt của kali hay natrisuníat, Khi đó nitơ chuyển thành NH3, kết
h ợ p v ớ i H 2 S O 4 t ạ o t h à n h ( ^ 4 ) 2 8 0 4 . T h ê m N a O H v à o h ỗ n h ợ p p h ả n ứ n g
r ồ i c ấ t k é o N H 3 g iả i p h ó n g ra b ằ n g h ơ i nư ớ c v à o d u n g d ịc h ch u ẩ n H2SO 4
O.IN, chuẩn độ acid dư bằng dung dịch NaOH 0,1N.
- Định lượng theo phương pháp đo Cerỉ [2] [13] [15]: trong dung dịch acid
có mặt một chất khử, Ceri IV chuyển thành Ceri III, phát hiện điểm kết
thúc bằng íeroin, phức chất sắt của 0-phenatrolin. Phức sắt II có màu đỏ,
phức sắt III có màu xanh. Đến điểm tương đương, lượng Ceri IV thừa oxy
hoá phức sắt II thành sắt III và chỉ thị sẽ chuyển màu.
(C,2H8N2)3Fe j - e-

>
Màu đỏ Màu xanh
1.2. IBUPROFEN [1][8][14]
Cồng thức phân tử: CjjHigOj
• Cổng thức cấu tao:
CH3
CH -C O O H
o
C H 2-C H -C H 3
CH3
• Tên khoa hoc: acid 2 - ( p.isobutylphenyl) propionic.
• Tính chất:
- Chất kết tinh trắng.

- Nhiệt độ nóng chảy: 75 - iT C .
- Tan ít trong nước, tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ.
• Cổng dung: Ibuprofen có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm.
• Các phương pháp đinh lương:
- Phương pháp chuẩn độ acid - base [8][13][15][16]: hoà Ibuprofen vào
trong ethanol 96° đã trung tính hoá trước với chỉ thị phenolphtalein.
Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1N với chỉ thị là
phenolphtalein đến màu hồng nhạt bền vững.
- Phương pháp HPLC [17]: sử dụng chương trình sắc ký pha đảo đẳng
dòng với cột Lichrosorb RP18 ( 250 X 4,6mm; lOịxm ), detector tử ngoại
phát hiện ở bước sóng 254nm, với dung môi pha động là hỗn hợp acid
cloroacetic trong nước ; acetonitril (40 : 60).
1.3. PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ HẤP THU TỬ NGOAI [4][17
1.3.1. Khái quát về phương pháp:
• Nguvẽn tác: Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng X và cường độ
Iq qua dung dịch đồng nhất có nồng độ c, bề dày lớp dung dịch là /. Khi đi
qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần
còn lại ( / ) đi qua dung dịch. Sự liên quan giữa các đại lượng được biểu thị
qua phương trình sau:
\ 1
log^=logY=k.C.l = E
Trong đó: - k: hệ số hấp thụ. - C: nồng độ dung dịch đo.
- T = IHg : độ truyền qua. - £■: độ hấp thụ.
Độ hấp thụ E có giá trị lớn nhất khi đo ở bước sóng hấp thụ cực đại.
Định luật Lambert - Beer cho phép xác định nồng độ của các dung dịch
hấp thụ bức xạ điện tử bằng cách đo độ hấp thụ:
c = JL.E
k.l
Dựa vào định luật Lambert - Beer cho phép chúng ta định lượng được
các chất có cấu tạo đặc biệt (ví dụ : hợp chất thơm, hợp chất có liên kết chưa

bão hoà, các chất có màu ) bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở một
bước sóng xác định thường là ở bước sóng có hấp thụ cực đại ( X max ). Ngoài
ra, phương pháp này còn được dùng để định tính và thử tinh khiết các chất
trên.
Để tính hệ số hấp thụ k, ta đo độ hấp thụ của các dung dịch có nồng độ
đã biết rồi tính theo công thức:
Nếu nồng độ được tính bằng molA và chiều dày lớp dung dịch đo bằng
cm, thì hệ số đó được gọi là độ hấp thụ phân tử gam và được ký hiệu là 8.
Nếu nồng độ được biểu thị bằng số gam trong lOOml ( nồng độ% ) và
chiều dày lớp dung dịch bằng 1 cm thì hệ số đó được gọi là độ hấp thụ riêng
và được ký hiệu là E (1%, Icm) hay eỊ .
1.3.2. Một sô kỹ thuật định lượng:
• Dưa vào hê số hấp thu riêng: đo độ hấp thụ E của dung dịch thử tại cực đại
hấp thụ. Nồng độ c của dung dịch thử được tính dựa vào e Ị đã biết trước.
E
E= E \.l.C => c = ^ (vớil=\cm)
• Phương pháp so sánh: đo độ hấp thụ Ex, Ec của dung dịch thử được pha từ
mẫu thử có nồng độ Cx ( chưa b iết) và dung dịch chuẩn được pha từ chất
chuẩn có nồng độ Cc ( đã biết).
'X 'X
Cx = Ì i x C c
c
Phương pháp đường chuẩn: pha một loạt dung dịch chuẩn có các nồng độ
khác nhau từ chất chuẩn hay chất đối chiếu. Đo E của chúng ở bước sóng
đã chọn, lập đồ thị E-C, Đo Ex của dung dịch cần tìm và xác định Cx dựa
trên đường chuẩn. Tìm phương trình hồi quy. Trong định lượng, nếu khảo
sát một đoạn đường chuẩn, hệ số tương quan r > 0,9995 là tốt.
Hình 1: Ví dụ một đường chuẩn
1.4.1. Khái quát phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) là phương pháp phân tích hoá lý

dùng để phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau
của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không hoà tan nhau.
Trong quá trình sắc ký luôn xảy ra quá trình cân bằng động về sự phân bố của
chất tan vào pha tĩnh và pha động khi pha động luôn luôn chảy qua cột với
một tốc độ nhất định.
Các chất cần phân tách trong dung dịch của hỗn hợp khi được đưa vào
cột sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột
và kiểu sắc ký áp dụng. Dung môi pha động được bơm vào cột sắc ký dưói áp
suất cao. Các chất tan sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào
cấu trúc và tính chất của mỗi chất. Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được
quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của các chất
tan, bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột.
Kết quả là các chất được phân tách khỏi nhau. Sau khi ra khỏi cột, các chất sẽ
được phát hiện bằng detector và được chuyển qua bộ phận xử lý kết quả, Kết
quả sau khi được xử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình.
Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian
lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tưofng ứng trên sắc ký đồ, còn tín
hiệu phân tích định lượng là diện tích pic ( hoặc chiều cao pic ) thu được, phụ
thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC.
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng trong kỹ thuật HPLC
• Thời gian ĩưu ( tp ì và thể tích lưu:
Thòi gian lưu là thời gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tói detector và cho pic trên sắc đồ ( tính từ lúc tiêm
tới khi xuất hiện đỉnh của pic ). Dựa vào thời gian lưu có thể phát hiện định
tính chất đó là chất gì. Nếu gọi tjỊ là thời gian lưu của chất tan thì ta có:
“ ^0 t R
Trong đó: - to¡ thời gian chết hay thời gian không lưu giữ
- t\: thời gian lưu giữ thực của chất tan.
Thời gian lưu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất sắc ký của pha
tĩnh; bản chất, thành phần, tốc độ của pha động; cấu tạo và bản chất của phân

tử chất tan; pH của pha động, nồng độ chất tạo phức.
Tương ứng vói thời gian lưu, đại lượng thể tích lưu của một chất là thể
tích của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu
vào cột cho đến khi chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại.
tÌỊiial
C«np0(w4i ữũOỆÍtiỆlịÌ
Hình 2: Các đại lượng đặc trưng trên sắc ký đồ định lượng bằng HPLC
• Hẽ số phân bỏ ( K ):
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất
tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bỏi hệ số phân
bố, nó được tính theo công thức:
M
Trong đó: Cs và Cm lần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Khi nồng độ chất tan không cao quá thì K là một hằng số chỉ phụ thuộc
vào bản chất các pha và chất tan, vào nhiệt độ.
• Thừa số dung lương ( k’ ):
Đây là một đại lượng quan trọng được dùng để mô tả tốc độ di chuyển
của một chất. Nó cho ta biết khả năng phân bố của chất tan trong mỗi pha như
thế nào. Thừa số dung lượng được tính theo công thức:
Qs
Trong đó: Qs và Qj^ là lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động.
Quan hệ giữa hệ số phân bố và thừa số dung lượng;
Vc
k’ = K
v „
Trong đó: Vs và là thể tích pha tĩnh và pha động.
Ngoài ra có thể định nghĩa k’ theo một cách khác:
T -T
k’ = ^ »
T

^ M
• Hẽ số chon loc ( ạ ):
Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất được đặc trưng bỏi hệ số chọn lọc:
K V t'
_ _ ^R,B
A ^R,A
Theo quy ước, chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy a >1.
a càng lớn thì hai chất tách ra khỏi nhau càng xa, thường dùng a trong
khoảng 1,05 đến 2,0 để thời gian phân tích không quá dài.
• Số đĩa lý thuyết ( N ) và chiểu cao của đĩa ( H ):
Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết và
chiều cao đĩa lý thuyết. Cột sắc ký được coi như có n tầng lý thuyết, ở mỗi
tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới.
Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H. Ta có thể
tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:
N=16
w
B
= 5,54
/
R
w
1/2
y
Trong đó:
- Wg là chiều rộng pic ở đáy pic
- Wy2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, chiều cao của đĩa lý thuyết được
tính bằng công thức:
• Đỏ phân giải ( Rc ì:

Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
Độ phân giải được định nghĩa như sau:
khoả ng cách gi ữ a hai pic
R,A
1/2
độ rộng trung b ì nh gi ữ a hai pic
• Phương trình Van - Deemter:
Phương trình Van - Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha
động và các thông số động học khác đến hiệu lực của cột sắc khí:
B
Trong đó:
H = A + :^ + CU
H: chiều cao đĩa lý thuyết.
U: tốc độ dòng pha động.
- A,B,C: các hệ số thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc ký và
do các yếu tố sau quyết định:
+ Sự khuy ếch tán xoáy.
+ Sự khuyếch tán phân tử.
+ Tốc độ trao đổi chất khác nhau của các chất.
1.4.3. Hệ thống HPLC:
Theo thứ tự từ đầu đến cuối hệ thống, có các bộ phận chính như sau:
• Bình chứa dung môi.
• Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc ký.
• Van bơm mẫu: bơm vào cột một thể tích mẫu nhất định.
• Cột tách.
• Detector.
• Máy ghi sắc ký hoặc máy vi tính.
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC:
Cũng như sắc ký cột ở áp suất thường, pha tĩnh (stationenary phase)
trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất

phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ
hạt từ 3 -10 micromet, diện tích bề mặt riêng thường từ 50 - 500 mVg.
• Phân loai pha tĩnh:
Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.
- Căn cứ vào trạng thái là rắn hay lỏng thì pha tĩnh được chia làm 2 loại:
nếu pha tĩnh là chất rắn, người ta có sắc ký lỏng rắn LSC (Liquid Solid
Chromatography), nếu pha tĩnh là chất lỏng thì chúng ta có sắc ký lỏng
lỏng LLC ( Liquid Liquid Chromatography).
- Xét về cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có 2 kiểu
xốp; xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài ( xốp bề mặt).
Điều kiên đối với mốt pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.
- Tính chất bề mặt phải ổn định.
- Cân bằng động học của sự tách phải xẩy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
Chế tao pha tĩnh: pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:
- Pha tĩnh trên nền Silicagel.
- Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm.
- Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ.
- Pha tĩnh trên nền mạch carbon,
Trong các loại trên thì pha tĩnh trên nền Silicagle ưu việt hơn và được sử
dụng nhiều nhất.
Pha tĩnh trẽn nén Silicagel: Trên nền Silicagel, có 2 loại Silicagel hấp phụ
cho sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
- Silicagel trung tính: sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha thuận. Loại này
trên bề mặt của nó có chứa các nhóm -OH. Đó là các nhóm hoạt động
có tính chất phân cực và ái nước. Loại chất nhồi cột này dùng để tách

các chất không phân cực và ít phân cực. Pha động của loại này là những
chất không phân cực hoặc ít phân cực.
- Silicagel đã alkyl hoá: được sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha đảo. Nhóm
-OH của silicael trung tính được alkyl hoá bằng các gốc alkyl của mạch
carbon thẳng hay các gốc carbon vòng như nhân phenyl. Qiính vì bị thế
mất nhóm -OH nên bề mặt của chất nhồi loại này không phân cực hay ít
phân cực. Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực,
ít phân cực, các chất phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp ion. Pha động
cho loại này là các chất hữu cơ phân cực như methanol, acetonnitril
hay nước hoặc là hỗn hợp của các chất này với nhau theo những tỉ lệ
nhất định.
- Silicagel đã được Sunfonic hoá hay nỉtro hoá: được sử dụng cho sắc ký
trao đổi ion ( cation ). Đây là sản phẩm của sự sunfonic hoá hay nitro
hoá các silicagel trung tính để thay các nhóm -OH trên bề mặt Silicagel
trung tính bằng các nhóm -SO3H hay -NO2H. Các nhóm chức này có
ion có thể trao đổi được với các cation kim loại khác. Đây là các pha
tĩnh trao đổi cation mạnh, còn nếu thay thế nhóm -OH bằng nhóm
-R-COOH thì ta có loại pha tĩnh trao đổi cation acid yếu. Pha tĩnh loại
này được dùng để tách các chất có cấu tạo ion như ion các kim loại và
hợp chất của chúng, hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly
thành ion như các acid, base.
- Các Silicagel được amin hoá: được sử dụng cho sắc ký trao đổi anion.
Các Silicagel này được chế tạo bằng các thay thế nhóm OH bằng các
nhóm -NH2, -NH, -NRj, -NR3, -CHjCOH). Pha tĩnh loại này sử dụng để
tách các anion trong hợp chất có cấu trúc ion hay các chất khi tan trong
pha động thì phân ly thành các ion như các base, acid. Pha động của
loại này cũng giống như trên.
1.4.5. Pha động trong HPLC:
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất cần phân
tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố hết

sức linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là 1 dung môi hoặc có thể là một
hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Nó
cũng có thể là dung dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức Nói
chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu
quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả và hiệu suất
tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thòi gian lưu giữ các chất
mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến:
- Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu giữ của chất tan.
- Hiệu lực của cột tách.
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh.
- Độ rộng của pic sắc ký.
• Trong HPLC, pha đống phải thoã mãn mồt số điều kiên sau:
- Trơ đối với pha tĩnh.
- Hoà tan được chất cần phân tích.
- Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phù hợp với loại detector được lựa chọn để phát hiện các chất phân tích.
- Có tính kinh tế, dễ kiếm.
• Trong sắc kv hấp phu pha thuân: pha động phải là các dung môi hữu cơ
không phân cực hoặc ít phân cực như n - hexan, n - heptan, cloroform,
tetraclorocarbon Trong quá trình chạy sắc ký, để cho quá trình tách được
ổn định, độ lặp lại cao, phải bão hoà pha động trước khi chạy sắc ký bằng
nước.
• Trong sác kv hấp phu pha đảo: pha động là hệ dung môi của những dung
môi đồng tan với nước, có khi nước lại là thành phần chính trong pha động
ví dụ như methanol, acetonitril Trong nhiều trưòfng hợp, thành phần pha
động còn có thêm các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký,

chất tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để sử dụng
trong sắc ký cặp ion.
• Trong sắc ký trao đổi ion: pha động là dung dịch nước của các acid hay
base, hoặc là dung dịch nước của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có
chứa chất đệm pH, chất tạo cặp ion, chất tạo phức. Trong loại sắc ký này
thì pH pha động và chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn.
• Cổ 4 yếu tố quan trong cán chú V trong lưa chon pha đỏng:
- Bản chất của dung môi để pha chế pha động.
- Thành phần các chất tạo ra pha động.
- Tốc độ của pha động.
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và cặp ion ).
1.4.6. Cách đánh giá pic:
• Đánh giá diên tích pic:
Diện tích pic của một chất là tương ứng với tổng lượng chất đó.
Để tính diện tích pic, hiện nay ngưòi ta thường dùng máy tích phân điện
tử gắn với máy vi tính ( sai số khoảng 0,5% ) hoặc máy tích phân cơ học ( sai
số khoảng 1,3% )• Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi
đưòfng nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu
và cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt đối với nồng độ
trung bình vừa và cao.
• Đánh giá chiều cao pic:
Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic ( khoảng cách giữa đường
nền và đỉnh pic ) là một đại lượng tỷ lệ vói diện tích pic và nó cũng có thể
được dùng để đánh giá sắc phổ. Một điều kiện để áp dụng cho việc đánh giá
bằng chiều cao pic là các chỉ số k’ hằng định.
Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp, đối xứng thì việc xác định
chiều cao pic sẽ dễ dàng hơn và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.4.7. Cách tính kết quả:
• Phương pháp ngoai chuán: là phưong pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu
chuẩn và mẫu thử được phân tích trong cùng điều kiện. Kết quả của chất

chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy
ra từ đường chuẩn.
• Phương pháp nối chuán: là phưoíng pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu
thử một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời
gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. Nó được
phân tách hoàn toàn và có nồng độ gần bằng nồng độ của chất phân tích
và có cấu trúc hoá học tương ứng.
• Phương pháp thêm: chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn
đề ảnh hưỏỉng của các chất phụ ( ví dụ: tá dược ). Dung dịch mẫu thử được
thêm một lượng xác định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai dung
dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một
điều kiện sắc ký.
PHẦN 2
NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1. NỐI DUNG NGHIÊN cứu
Tiến hành nghiên cứu khảo sát 2 phương pháp định lượng Paracetamol
và Ibuprofen trong hỗn hợp thuốc, so sánh hai phương pháp, rút ra nhận xét.
2.2. ĐỔI TƯƠNG NGHIỀN cứ u
2.2.1. Các hoá chất thí nghiệm:
• Paracetamol và Ibuprofen do phòng giáo tài trưòỉng đại học Dược Hà Nội
cung cấp.
• Các chất chuẩn Paracetamol và Ibuprofen do viện kiểm nghiệm cung cấp.
2.2.2. Viên nén Alaxan:
• Cổng thức:
Paracetamol 325 mg
Ibuprofen 200 mg
Tá dược vđ 1 viên
• Nơi sản xuất: United Pharma
• Số kiểm soát: 003501

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
• Bằng thực nghiệm, dựa vào các kết quả thu được, xử lý thống kê và rút ra
kết luận.
• Phương pháp được sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, đo quang phổ hấp
thụ tử ngoại, chuẩn độ acid - base.
PHẦN 3
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. THIẾT BI. HOÁ CHẤT. DUNG MỎI
- Máy đo quang phổ UV-VIS Jenway 6045.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao MERCK - HITACHI 655A - 12 với
Detector u v - VIS 655A - 22.
- Cột Lichrosorb RP 18 (250 X 4 mm ; 10 ỊLim ).
- Bộ lọc dung môi vói màng lọc 0,45 Ịim.
- Máy lắc siêu âm, cân kỹ thuật, nồi cách thuỷ.
- Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh khác.
- Paracetamol và Ibuprofen nguyên liệu do phòng giáo tài - trường đại
học Dược cung cấp.
- Các chất chuẩn Paracetamol và Ibuprofen do viện kiểm nghiệm cung
cấp.
- Viên nén Alaxan của United Pharma, SKS: 003501.
- Diethyl ether, ethanol 96°, natri sulfat khan, dung dịch NaOH 0,1N,
dung dịch NaOH 0,0 IN.
3.2. ĐINH LƯƠNG PARACETAMOL VẢ IBUPROFEN TRONG
HỖN HOP THUỐC THEO TIÊU CHUẨN c ơ s ở [11][12][13]
3.2.1. Định lượng Paracetamol trong hỗn hợp bằng phương pháp đo
quang phổ hấp thụ tử ngoại:
• Khảo sát khả nâng chiết tách Paracetamol ra khỏi hỗn hơp:
Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chiết Paracetamol ra khỏi hỗn
hợp hai chất Paracetamol và Ibuprofen dựa vào độ tan khác nhau của hai chất

trong nước. Paracetamol tan trong nước lạnh với tỷ lệ 1/70 còn Ibuprofen hầu
như không tan trong nước. Để khảo sát hệ số chiết tách, chúng tôi tiến hành
trên các hoá chất: Paracetamol ( 97,0% ) và Ibuprofen ( 99,2% ). Các dung
dịch thử và dung dịch chuẩn được pha theo quy trình sau:
- Dung dịch thử. cân chính xác khoảng 75mg Paracetamol và 45mg
Ibuprofen cho vào một bình định mức dung tích lOOml, thêm vào 50ml
nước cất, lắc kỹ trong vòng 5 phút, thêm nước tới vạch, lắc đều. Lọc,
loại bỏ 20ml dịch lọc đầu. Hút chính xác Iml dịch lọc trên cho vào bình
định mức lOOml thứ 2. Thêm dung dịch NaOH 0,0IN ( TT ) vừa đủ tới
vạch, lắc đều.
- Dung dịch chuẩn', cân chính xác khoảng 75mg Paracetamol cho vào
bình định mức lOOml, thêm vào 50ml nước cất, lắc kỹ trong vòng 5
phút, thêm nước tói vạch, lắc đều. Lọc, loại bỏ 20ml dịch lọc đầu. Hút
chính xác Iml dịch lọc trên cho vào bình định mức lOOml thứ 2. Thêm
dung dịch NaOH 0,0IN ( TT ) vừa đủ tới vạch, lắc đều.
Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn ở
bước sóng 257nm, trong cuvet Icm, mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,0IN.
Tỷ lệ phần trăm Paracetamol chiết được được tính theo công thức:
% = z ^
Trong đó:
- Mc và Mp lần lượt là khối lượng cân Paracetamol trong mẫu chuẩn và
mẫu thử ( mg ).
- D c và Dc lần lượt là độ hấp thụ đo được của mẫu chuẩn và mẫu thử.
Kết quả khảo sát được ghi trong bảng 1:
s n
Chuẩn
Thử % chiết
được
Mc ( mg)
D c

Mp ( mg) Mi ( mg)
Dt
1 75,6 0,524
75,3 49,4 0,518
99,25
2 74,9
0,518 74,3
49,2 0,513 99,83
3
74,9
0,518 75,3 48,5 0,515 98,89
4 74,9
0,518 75,0
47,2 0,516
99,48
5
73,8 0,512 74,8 47,9
0,517
99,63
6
73,8 0,512
75,2 47,3
0,520 99,67
7 73,8
0,512 75,8 48,8
0,523 99,45
Tính thống kê
Giá trị trung bình: Xọ'
99,46
Đô lêch chuẩn

Ề(Xị-X)2
\ n-l
0,31
Sai số chuẩn C
0 ,1 2
Sai số tưcmg đối
s t -1 0 0
A% =

Ì-

X
0,29 %
n = 7; p = 0,95; ta = 2,45
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy khả năng chiết tách Paracetamol ra
khỏi hỗn hợp bằng phương pháp là rất tốt, tỷ lệ phần trăm Paracetamol chiết
được là 99,46 ± 0,29% với độ tin cậy 95%.
• Khảo sát đồ lăp lai:
Chúng tôi sử dụng viên nén Alaxan, SKS: 003501 để khảo sát độ lặp lại
và độ đúng của phương pháp. Các dung dịch thử và dung dịch chuẩn được tiến
hành theo quy trình sau:
- Dung dịch thừ. Cân 20 viên xác định khối lượng trung bình của viên rồi
nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương đương
với khoảng 75mg Paracetamol ( khoảng 0,17 g bột viên ) cho vào bình
định mức lOOml, thêm vào 50ml nước cất, lắc kỹ trong vòng 5 phút,
thêm nước tới vạch, lắc đều. Lọc, loại bỏ 20ml dịch lọc đầu. Hút chính
xác Iml dịch lọc cho vào bình định mức lOOml. Thêm dung dịch NaOH
0,0IN (TT) vừa đủ tới vạch, lắc đều.
- Dung dịch chuẩn: tương tự như phần khảo sát khả năng chiết tách.
Tiến hành đo tương tự như trên. Hàm lượng Paracetamol trong viên

được tính theo công thức sau:
_ PTxPxrtĩc
niT^ Dc
Trong đó:
- nic và niT là khối lượng chất chuẩn và chất thử đem định lượng (g).
- Dc và là độ hấp thụ đo được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
- p là khối lượng trung bình của một viên Alaxan ( p = 0,7355 g ).
Kết quả được ghi trong bảng 2,