LUẤN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN PHƯỚC MINH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN
TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT
NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI
LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
Tp. Hồ Chí Minh năm 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN PHƯỚC MINH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN
TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT
NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI
Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số chuyên ngành: 62.54.02.01
Phản biện độc lập 1:
Phản biện độc lập 2:
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Trần Bích Lam
2. TS. Nguyễn Trọng Giao
Tp. Hồ Chí Minh năm 2012
i
LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả
nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ
một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có)
đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu.

Tác giả luận án
Nguyễn Phước Minh
ii
TÓM TẮT LUẬN ÁN
 Đề tài đã xây dựng được phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm
trong việc phân tích dư lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá đạt được giới hạn
phát hiện (LoD = 0,52 ppb), đáp ứng yêu cầu giới hạn dư lượng cho phép theo tiêu chuẩn
quốc tế (Codex, FAO/WHO, EU, Mỹ, Canada, Úc), rút ngắn thời gian phân tích, đơn giản
hóa kỹ thuật, tiết kiệm chi phí.
 Giải thích được cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin, từ đó khái quát hoá và đưa ra
được giả thuyết dự đoán khả năng nhận danh và định lượng từng họ kháng sinh như
phenicol, nitrofuran, fluoroquinolon (thường gặp trong nuôi trồng thuỷ sản) bằng kỹ thuật
sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.
 Kết quả đề tài đã cho thấy rằng các dẫn xuất erythromycin không chỉ được chuyển hoá
từ Sacchropolyspora erythrea bằng con đường lên men, mà còn erythromycin A khi vào
cơ thể tôm cá, dưới tác dụng của các enzyme oxy hóa khử và enzyme chuyển methyl hóa,
chuyển thành erythromycin C, E, F, sau đó bị đào thải. Đề tài cũng đưa ra được giả thuyết
giải thích cơ chế chuyển hoá erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi.
 Đã đánh giá và rút ra được quy luật thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước
thu hoạch trên đối tượng tôm càng xanh và cá rô phi.
iii
ABSTRACT
 A new sensitive analytical approach for determination of erythromycin A in giant
freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii), tilapia (Oreochromis niloticus) by a fast
scanning stripping square wave voltammetry using the dropping mercury electrode (PSA-
F) was developed and validated to meet requirements of detection limit, low cost and
simple technique .
 Clarify the mechanism of peak appearance of erythromycin on basic of square
wave voltammetry. From that point, a general hypothesis about the identified and
quantified ability for antibiotic groups such as phenicols, nitrofurans, fluoroquinolones (in

aquaculture) by square wave voltammetry at dropping mercury electrode was clearly
introduced.
 Overcome the opinion that derivatives of erythromycins were only metabolized by
Sacchropolyspora erythrea in fermentation. Specifically was an evidence of
biotransformation of erythromycin A to erythromycin C, E, F during prawn and tilapia
aquaculture. From this point, a hypothesis of bio-transformative mechanism in these
species was also established.
 Investigate the elimination and bio-transformation of erythromycin A in giant
freshwater prawn and tilapia so that appropriated withdrawal time periods were outlined
to each specie.
iv
LỜI CÁM ƠN
Nhìn lại những gì đã qua, trước tiên em xin bày tỏ tình thương mến và lòng biết ơn
sâu sắc đến Ba Mẹ đã nuôi dưỡng và lo lắng cho em đến ngày hôm nay, không chỉ là giá
trị vật chất mà còn là những giá trị tinh thần hết sức quý báu không gì so sánh được.
Em xin trân trọng gửi lời cám ơn đến thầy Nguyễn Trọng Giao và cô Trần Bích
Lam những người thầy cô hướng dẫn rất đáng kính, người đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ
em trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Sự biết ơn này cũng xin được chân thành gửi đến quý thầy cô: thầy Lê Văn Việt
Mẫn, thầy Nguyễn Hoàng Dũng, cô Đống Thị Anh Đào, cô Phan Ngọc Hoà tại Bộ Môn
Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hoá Học, ĐH Bách Khoa Tp. HCM; thầy
Nguyễn Phước Thành - Trường ĐH Tôn Đức Thắng; thầy Nguyễn Bá Hoài Anh - Trường
ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM; thầy Nguyễn Như Trí - ĐH Nông Lâm Tp. HCM
cùng bạn bè gần xa đã có những định hướng và góp ý hết sức quý báo cho em trong suốt
thời gian qua.
Sau cùng, em rất tự hào và vinh dự khi được học tập dưới mái trường ĐH Bách
Khoa Tp. HCM, một trong những trường ĐH hàng đầu ở Việt Nam với những điều kiện
học tập thuận lợi nhất.
v
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
TÓM TẮT LUẬN ÁN ii
ABSTRACT iii
LỜI CÁM ƠN iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
DANH MỤC CÁC BẢNG x
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 4
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 6
1.1. Tồn dư kháng sinh đối với an toàn thực phẩm 6
1.1.1 Thực trạng về tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y và chăn nuôi 6
1.1.2 Ảnh hưởng của chất kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm 6
1.1.3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y 7
1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thủy sản 7
1.2.1 Erythromycin 7
1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea 9
1.2.3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên cơ thể thủy sản 11
1.2.4 Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm càng xanh và cá rô phi
14
1.3 Các kỹ thuật dùng để phân tích erythromycin 15
1.3.1 Phương pháp ELISA 15
1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 16
1.3.3 Phương pháp Von-ampe 22
1.4 Những vấn đề tồn tại cần giải quyết 28
CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
vi
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ, hóa chất 29

2.1.1 Nguyên vật liệu 29
2.1.2 Thiết bị dụng cụ 29
2.1.3 Hoá chất 29
2.2 Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 30
2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 32
2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 39
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40
3.1 Các điều kiện phù hợp cho quá trình định lượng erythromycin bằng phương pháp sóng
vuông quét nhanh và stripping sóng vuông quét nhanh 40
3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng và chọn vùng quét thế 40
3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH thích hợp 41
3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền 49
3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hoà tan erythromycin 51
3.1.5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp 53
3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion gây nhiễu 63
3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn 63
3.1.8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫu 66
3.2 Các thông số thẩm định phương pháp 67
3.2.1 Khoảng tuyến tính 67
3.2.2 Giới hạn phát hiện 67
3.2.3 Độ đúng, độ chính xác, hiệu suất thu hồi 67
3.2.4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác 68
3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SWV với LC-MS/MS 76
3.2.6 So sánh hiệu quả kinh tế giữa SWV với các phương pháp khác 78
3.3 Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại các địa phương 78
3.3.1 Tôm càng xanh 79
3.3.2 Cá rô phi 79
vii
3.4 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học và đào thải kháng sinh erythromycin trên cơ

thể thủy sản khi nuôi 81
3.4.1 Đào thải erythromycin A trong cơ thịt thuỷ sản 81
3.4.2 Chuyển hoá sinh học của kháng sinh gốc 85
KẾT LUẬN 91
KIẾN NGHỊ 93
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO 95
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin 8
Hình 1.2: Chuyển hoá sinh học các dẫn xuất erythromycin 10
Hình 1.3: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm. 25
Hình 1.4: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật Stripping sóng vuông trên cực giọt chậm 27
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân tích erythromycin 31
Hình 3.1: Các nhóm chức trong công thức cấu tạo của erythromycin 40
Hình 3.2: Phổ erythromycin ghi 5 lần trong nền đệm Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 41
Hình 3.3: Phổ erythromycin trên nền Natri axetat 0,1M 43
Hình 3.4: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat 0,1M 44
Hình 3.5: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Citrat – Phosphat 0,1M 45
Hình 3.6: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Borax 0,1M 46
Hình 3.7: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Tris 0,1M 46
Hình 3.8: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat pH 8,0 50
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền Amoni axetat đến cường độ dòng của
erythromycin A 50
Hình 3.10: Phổ erythromycin ghi 5 lần khi dùng dung môi hòa tan 52
Hình 3.11: Phổ erythromycin theo chiều quét 53
Hình 3.12: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V
start
54
Hình 3.13: Ảnh hưởng của V

start
đến cường độ dòng của erythromycin A 55
Hình 3.14: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V
step
56
Hình 3.15: Ảnh hưởng của V
step
đến cường độ dòng của erythromycin A 56
Hình 3.16: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V
pulse
57
Hình 3.17: Ảnh hưởng của V
pulse
đến cường độ dòng của erythromycin A 58
Hình 3.18: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở T
drop
= 1.000 ms 59
Hình 3.19: Ảnh hưởng của T
drop
đến cường độ dòng của erythromycin A 59
Hình 3.20: Phổ erythromycin ghi 5 lần với T
electrolise
60
Hình 3.21: Ảnh hưởng của T
electrolise
đến cường độ dòng của erythromycin A 61
Hình 3.22: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V
electrolise
62
ix

Hình 3.23: Ảnh hưởng của V
electrolise
đến cường độ dòng của erythromycin A 62
Hình 3.24: Đường chuẩn erythromycin A trên dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M, pH 8,0
65
Hình 3.25: Hiệu suất trích ly erythromycin trên tôm càng xanh khi so sánh các quy trình
66
Hình 3.26: Hiệu suất trích ly erythromycin trên cá rô phi khi so sánh các quy trình 66
Hình 3.27: Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu tôm càng xanh ở các thời điểm
và mức nồng độ khác nhau 67
Hình 3.28: Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu cá rô phi ở các thời điểm và
mức nồng độ khác nhau 68
Hình 3.29: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh 76
Hình 3.30: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu cá rô phi 76
Hình 3.31: Thực trạng nhiễm erythromycin ở tôm càng xanh tại các tỉnh ĐBSCL 79
Hình 3.32: Thực trạng nhiễm erythromycin ở cá rô phi tại các tỉnh ĐBSCL 79
Hình 3.33: Đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã được cho
ăn 50 và 100 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
trong 7 ngày 81
Hình 3.34: Đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn 50 và
100 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
trong 7 ngày 82
Hình 3.35: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy
95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã cho ăn erythromycin

trong 7 ngày (100 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
) 83
Hình 3.36: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy
95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn erythromycin trong 7
ngày (50 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
) 83
Hình 3.37: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy
95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn erythromycin trong 7
ngày (100 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
). 84
Hình 3.38: Con đường chuyển hoá sinh học các dạng erythromycin 89
x
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Công thức phân tử và nhóm thế của các erythromycin 8
Bảng 1.2: Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của erythromycin trong sản phẩm thực
phẩm theo quy định của từng thị trường nhập khẩu 9
Bảng 1.3: Diễn biến đào thải erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi ở các thời điểm, đo mẫu
cơ thịt + da cá (giá trị trung bình  độ lệch chuẩn, n=10) 12
Bảng 1.4: Một số công trình nghiên cứu erythromycin trên thế giới 21
Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn trên dung dịch nền 33
Bảng 3.1: Sự biến đổi cường độ dòng của erythromycin A theo loại dung dịch nền, và pH

47
Bảng 3.2: Giá trị thế bán sóng E
1/2
và cường độ dòng của erythromycin trong dung dịch
đệm Amoni axetat pH 8,0 47
Bảng 3.3: Thế bán sóng đặc trưng của một số kháng sinh 69
Bảng 3.4: So sánh kết quả phân tích mẫu tôm càng xanh bởi 2 phương pháp 77
Bảng 3.5: So sánh kết quả phân tích mẫu cá rô phi bởi 2 phương pháp 77
Bảng 3.6: So sánh hiệu quả kinh tế giữa phương pháp SWV với một số phương pháp khác
khi định lượng erythromycin 78
Bảng 3.7: Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt tôm
càng xanh đã được cho ăn ở liều 50 &100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày 87
Bảng 3.8: Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt cá
rô phi đã được cho ăn ở liều 50 & 100 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
trong 7 ngày 88
xi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AdSV: Adsorptive Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping hấp phụ)
APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Ion hóa bằng hóa học ở áp suất khí
quyển)
APPI: Atmospheric Pressure Photoionization (Ion hóa quang ở áp suất không khí)
ASC: Aquaculture Stewardship Council (Hội đồng quản lý nuôi trồng thuỷ sản)
ASV: Anodic Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping anod)
ASV-PGCE: Adsorptive Stripping Voltammetric - Pretreated Glassy Carbon Electrode
(Von-ampe stripping hấp phụ - điện cực tiền xử lý thuỷ tinh carbon)
BAP: Best Aquaculture Practices (Thực hành thuỷ sản tốt nhất)
CSV: Cathodic Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping cathod)

CV: Cyclic Voltammetry (Von-ampe tuần hoàn)
DME: Dropping Mercury Electrode (Cực giọt thủy ngân rơi)
DPV: Differential Pulse Voltammetry (Von-ampe xung vi phân)
ECL: Capillary Electrophoresis Coupled With End-Column Electrochemiluminescence
(ECL) (Điện di mao quản - đầu dò quang điện hóa)
EIA: Enzyme ImmunoAssay (Phân tích miễn dịch enzyme)
ESI: Electrospray Ionization (Ion hóa phun điện tử)
EI-GC-MS: Electron Impact – Gas chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký khí –
Khối phổ sử dụng ion hóa điện tử)
ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phân tích miễn dịch hấp phụ enzyme)
GC: Gas Chromatography (Sắc ký khí)
GC-MS: Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)
Global GAP: Global Good Agriculture Practice (Thực hành nông nghiệp tốt toàn cầu)
HLB: Hydrophilic-Lipophilic Balanced (Cân bằng dầu nước)
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
HPLC-ICPMS: High Performance Liquid Chromatography - Inductively Coupled
Plasma Mass Spectroscopy (Sắc ký lỏng hiệu năng cao – ghép khối phổ cảm ứng plasma)
xii
KPH: Không phát hiện
LC: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)
LC-ESI/MS: Liquid Chromatography – Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry (Sắc
ký lỏng ghép khối phổ nguồn ion hóa phun điện tử)
LC-MS/MS: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ghép khối phổ - Khối phổ)
LLE: Liquid–Liquid Extraction (Chiết lỏng – lỏng)
LoD: Limit Of Detection (Giới hạn phát hiện)
LoQ: Limit Of Quantification (Giới hạn định lượng)
MDL: Method Detection Limit (Giới hạn phát hiện của phương pháp)
MSPD: Matrix Solid-Phase Dispersion (Phân tán nền phase rắn)
PLE: Pressure Liquid Extraction (Chiết lỏng áp suất)
RE: Relevant Error (Sai số liên quan)

RSD: Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) = CV (Coefficient of
Variation)
SD: Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)
SPME: Solid-Phase Micro-Extraction (Vi chiết phase rắn)
SPE: Solid-Phase Extraction (Chiết phase rắn)
SWV: Square Wave Voltammetry (Von-ampe sóng vuông)
UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu năng)
UV/VIS: Ultra Violet / Visible (Tử ngoại / khả kiến)
Viet GAP: Viet Nam Good Agriculture Practice (Thực hành nông nghiệp tốt Việt Nam)
1
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Một trong những vấn đề bức xúc về vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta hiện
nay là dư lượng kháng sinh trong vật nuôi, dư lượng kháng sinh trong thực phẩm vượt
quá mức cho phép ảnh hưởng tới sức khỏe của người tiêu dùng và uy tín hàng xuất
khẩu của chúng ta.
Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), cá rô phi (Oreochromis niloticus)
được xem là 2 trong số các loài thủy sản nước ngọt có giá trị kinh tế cao và quan trọng
ở Việt Nam, đặc biệt là ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Chúng được nuôi ở dạng thâm
canh, luân canh, xen canh trong ruộng lúa, trong mương vườn, kênh rạch ven sông,
nuôi bán công nghiệp hoặc công nghiệp. Nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu ngày
càng cao đã thúc đẩy người nuôi nuôi với quy mô lớn, mật độ dày và thức ăn công
nghiệp được tăng cường sử dụng. Vì lẽ đó mà dịch bệnh là điều không thể tránh khỏi ở
những mô hình không được kiểm soát như thế.
Do tính chất kháng khuẩn mạnh của erythromycin từ lâu nó đã được dùng để
phòng và trị bệnh trên tôm cá. Do nông dân trong quá trình nuôi tôm càng xanh và cá
rô phi có sử dụng erythromycin và không tuân thủ thời gian ngưng thuốc trước thu
hoạch nên để lại sản phẩm có dư lượng vượt mức cho phép.
Theo quy định của Codex, WHO/FAO, EU, Mỹ, Canada, Australia, v.v thì dư
lượng erythromycin trong sản phẩm thủy sản nhìn chung phải nhỏ hơn 30 ppb. Theo
thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển

Nông Thôn Việt Nam, erythromycin thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức
dư lượng tối đa cho phép là 200 ppb.
Hiện đã có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinh erythromycin trong
các sản phẩm thủy sản như ELISA, LC-MS/MS. Tuy nhiên các phương pháp này đòi
hỏi trang thiết bị đắt tiền, thời gian phân tích kéo dài, chi phí hóa chất dùng trong
chuẩn bị mẫu đo khá tốn kém…Mục tiêu và nội dung thứ nhất đặt ra là phải tìm được
phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản với chi phí thấp,
nhanh, độ tin cậy và tính chính xác cao, có khả năng tái khẳng định erythromycin.
2
Việc lấy mẫu phân tích dư lượng xem có đạt hay không đạt giới hạn cho phép chỉ
là giải pháp tình thế (bị động). Việc hướng đến một nguồn nguyên liệu thực phẩm an
toàn là phải chủ động kiểm soát ngay từ đầu trong khi nuôi, cụ thể là sử dụng kháng
sinh mức liều lượng nào và thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch bao lâu là phù hợp.
Xét thấy chưa có bất kỳ nghiên cứu nào được công bố về quá trình đào thải, chuyển
hóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu hoạch trên đối tượng tôm
càng xanh, cá rô phi. Vậy nên mục tiêu và nội dung thứ hai trong đề tài này sẽ tiến
hành là nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ thịt tôm
càng xanh và cá rô phi nhằm rút ra được quy luật và ước lượng được thời gian ngưng
thuốc trước thu hoạch an toàn.
Từ hai yêu cầu trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng kháng sinh
Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt
chậm và khả năng đào thải” nhằm tìm 1 hướng đi mới trong kiểm soát dư lượng
kháng sinh góp phần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.
3
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Một là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất xây dựng
được phương pháp phân tích erythromycin bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên
cực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế đồng thời đạt yêu cầu
phân tích nhanh, đơn giản và giảm chi phí phân tích.
Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ thịt thủy sản

(tôm càng xanh, cá rô phi), từ đó xác định được quy luật về thời gian thu hoạch an toàn
khi sử dụng erythromycin.
4
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
 Ý nghĩa khoa học:
1. Lần đầu tiên ở Việt nam và trên thế giới tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ
thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích định tính và định
lượng kháng sinh eythromycin trong các đối tượng mẫu thủy sản là cá rô phi và
tôm càng xanh.
2. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng trong dung dịch đệm vùng kiềm nhẹ,
erythromycin cho một sóng khử rõ và ổn định ở vùng thế khoảng -1,4 V. Có thể
dùng sóng này cho mục đích phân tích định tính và định lượng erythromycin trong
các đối tượng mẫu khác nhau. Sự xuất hiện của sóng này là do sự khử của nhóm C
= O thứ hai trong phân tử erythromycin liên kết với nhóm ái điện tử chứa nguyên
tử oxi bên cạnh. Quá trình khử là không hoàn toàn thuận nghịch với sự trao đổi hai
điện tử.
3. Phát hiện trong điều kiện thích hợp có sự hấp phụ của erythromycin trên bề mặt
giọt thủy ngân. Có thể dùng hiệu ứng này để tiến hành phân tích erythromycin ở
các nồng độ rất thấp bằng kỹ thuật stripping hấp phụ trên cực giọt chậm hay cực
ngồi, cực treo.
4. Đã nghiên cứu và chọn được dung dịch nền thích hợp, các thông số chạy máy tối
ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tích erythromycin trong các mẫu tôm
càng xanh, cá rô phi có kết quả tin cậy. Các số liệu đã được so sánh với kỹ thuật
phân tích truyền thống LC-MS là có sự tương đồng.
5. Erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá có sự chuyển hoá sinh học sang các dẫn
xuất khác như erythromycin C, E, F. Từ đây đưa ra được giả thuyết giải thích cơ
chế chuyển hoá sinh học erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi.
 Ý nghĩa thực tiễn:
1. Đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân tích định tính và định lượng
erythromycin trong tôm càng xanh và cá rô phi bằng kỹ thuật sóng vuông quét

nhanh trên cực giọt chậm với máy ANALYZER SQF-505 do Việt Nam sản xuất
với chi phí phân tích rẻ hơn, thao tác dễ dàng hơn các kỹ thuật khác của nước
5
ngoài. Các số liệu đã được kiểm chứng với các kết quả phân tích bằng các phương
pháp hiện đại khác.
2. Kết quả này có thể giúp các nhà sản xuất kinh doanh ở các địa phương có phương
tiện để kiểm soát kháng sinh từ gốc (thức ăn, môi trường, hóa chất, tôm cá trong
quá trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo ra các sản phẩm có uy tín quốc tế.
3. Sự thành công bước đầu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới sử dụng kỹ
thuật sóng vuông quét nhanh đơn giản, không quá tốn kém để phân tích nhiều
kháng sinh khác trong các đối tượng thủy sản khác nhau nhằm giúp các địa
phương tự giám sát tốt vấn đề này.
4. Cũng nhờ kỹ thuật này chúng tôi có thể nghiên cứu được quá trình đào thải của
erythromycin của tôm càng xanh và cá rô phi, từ đó rút ra thời gian ngưng thuốc
thích hợp trước khi thu hoạch để bảo đảm có được sản phẩm an toàn.
6
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 Tồn dư kháng sinh đối với an toàn thực phẩm
1.1.1 Thực trạng tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y, chăn nuôi, thuỷ sản
a) Dùng kháng sinh để điều trị và phòng bệnh cho gia súc, gia cầm và thuỷ sản.
b) Những kháng sinh được bán trên thị trường không ít loại không đảm bảo hàm lượng
và chất lượng cho nên việc điều trị và phòng bệnh ít hiệu quả. Người chăn nuôi phải
dùng nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng và chữa bệnh. Phần lớn phác đồ trị
liệu là do kinh nghiệm hoặc do sự quảng cáo của các nhà sản xuất và nhà phân phối.
Người nuôi đã biết cách chuyển hướng sử dụng kháng sinh, từ kháng sinh cấm sử
dụng sang kháng sinh hạn chế sử dụng. Vì vậy đã gây nên sự lạm dụng kháng sinh và
do đó dễ dẫn đến sự kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh .
Trên thị trường thuốc thú y, thuỷ sản hiện nay đang lưu hành rất nhiều loại kháng
sinh được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau như thuốc tiêm, thuốc uống, thuốc bột
bổ sung vào thức ăn và nước uống. Phần lớn các cơ sở chăn nuôi đều sử dụng kháng

sinh trong một thời gian tương đối ngắn trong một liệu trình từ 2-5 ngày, nhưng cũng
có cơ sở sử dụng kháng sinh liên tục trong một thời gian khá dài. Điều này do ý thức
tự phát, hoàn toàn không có những qui định ràng buộc nào về thời gian sử dụng và loại
kháng sinh sử dụng .
1.1.2 Ảnh hưởng của kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm
Do việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi, bản thân một số loại kháng sinh
có thể gây những hậu quả xấu cho năng suất chăn nuôi trong việc sử dụng kháng sinh
lâu dài hoặc sử dụng quá liều lượng qui định có thể gây ra cho vật nuôi những ảnh
hưởng như sau:
- Gây kháng thuốc đối với một số loài vi khuẩn gây bệnh. Những nghiên cứu gần đây
cho thấy hầu hết các vi khuẩn như E.coli, Staphylococcus, Salmonella đều đề kháng
với các loại kháng sinh thông thường với mức độ khác nhau.
- Sự tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi ảnh hưởng đến sức khỏe người
dân. Ở các nước tiên tiến người ta nghiêm cấm sử dụng một số loại kháng sinh dùng
7
để trị bệnh cho người để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Lý do nếu cho phép sử dụng
các loại kháng sinh này và nếu nó còn tồn dư trong thực phẩm nó dễ gây kháng thuốc
nếu dùng các loại kháng sinh này trong trị liệu cho con người. Giới hạn tối đa cho
phép dư lượng kháng sinh (MRL, Maximum Residue Limit) được áp dụng nhằm
không gây ảnh hưởng lên người sử dụng.
1.1.3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y
- Ở nước ta có qui định có tính chất pháp lý đối với việc sử dụng kháng sinh nhằm
mục đích như: kích thích sinh trưởng vật nuôi, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cũng như
sử dụng kháng sinh nhằm phòng và chống một số bệnh trên gia súc, gia cầm, thuỷ sản
theo các chương trình quản lý chất lượng thực hành nông nghiệp tốt toàn cầu (Global
GAP) và thực hành nông nghiệp tốt Việt Nam (Viet GAP). Tuy nhiên việc giám sát
còn thiếu kiên quyết nên việc sử dụng kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho thuỷ sản
còn có nơi, có lúc rất tuỳ tiện làm cho dư lượng vượt mức cho phép.
- Ở nước ngoài: Tổ chức FAO, WHO thường xuyên tư vấn và khuyến cáo các nước về
hàm lượng kháng sinh cho phép tồn dư trong thịt, sữa và các sản phẩm có nguồn gốc

động vật. Khối Cộng Đồng Châu Âu cũng có những qui định về các loại thuốc kháng
sinh được phép sử dụng và không được phép sử dụng.
Tóm lại, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi là khó tránh khỏi và
cần thiết trong phòng, trị bệnh cho vật nuôi. Tuy nhiên, phải sử dụng những kháng
sinh được phép và phải tuân thủ liều lượng, thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch
nhằm bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước và đáp ứng
tiêu chuẩn xuất khẩu.
1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thuỷ sản
1.2.1 Erythromycin
Erythromycin là nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B, C, D, E,
F. Tất cả được tạo ra từ Sacchropolyspora erythraea bằng con đường lên men. Sản
phẩm chính của quá trình lên men này là erythromycin A, còn lại là các erythromycin
khác (≤ 5%). Cấu tạo của erythromycin chứa 2 phân tử đường là desosamin và
8
cladinose gắn vào erythronolide. Nó dễ dàng hút ẩm và tan ít trong nước (0,2%).
Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn là pH trung tính và không bền ở pH acid.
Bảng 1.1: Công thức phân tử và nhóm thế của các erythromycin
Erythromycin
Công thức
phân tử
Phân tử
lượng
R
1
R
2
R
3
R
4

R
5
A
C
37
H
57
NO
13
734
OH
H
H
OCH
3
CH
3
B
C
37
H
57
NO
12
718
H
H
H
OCH
3

CH
3
C
C
38
H
55
NO
13
720
OH
H
H
OH
CH
3
D
C
36
H
65
NO
12
704
H
H
H
OH
CH
3

E
C
37
H
67
NO
13
748
OH
-O-
OCH
3
CH
3
F
C
37
H
67
NO
14
750
OH
OH
H
CH
3
CH
3
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin

Erythromycin còn tồn tại ở các dẫn xuất dạng muối và ester như: erythromycin
stearate (ES), erythromycin ethylsuccinate (EESC), propionyl erythromycin (PE),
erythromycin estolate (EES), erythromycin lactobionate (EL), erythromycin
glucoheptonate (EG), erythromycin ethyl carbonate (EEC) và erythromycin acistrate.
Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn bởi quá trình ức chế tổng hợp protein. Nó
tác động lên quá trình dịch mã bằng cách dính kết với tiểu đơn vị ribosom 50S.
Erythromycin có thể dẫn đến xuất hiện các vi khuẩn đề kháng thông qua quá trình
methyl hóa hoặc đột biến ở tiểu đơn vị 23S của RNA ribosom, hoặc protein của
ribosom hoặc thông qua quá trình làm sai lệch các gen mef ở các loài vi khuẩn Gram
[+] [1].
Theo nghiên cứu của Tardre và cộng sự (1969) thì erythromycin có tác dụng
diệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+] và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm
khuẩn Staphylococcus mà đã kháng lại Penicillin. Mycoplasma, Staphylococcus,
Streptococcus, Neisseria, Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella
multocida, Brucella, Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin [2].
Erythromycin được sử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn ở người và động vật.
9
Erythromycin thường dùng ở dạng estolate, ethylsuccinate, gluceptate, lactobionate và
stearate. Trong thú y, erythromycin được dùng chữa lâm sàng và cận lâm sàng cho
chứng viêm vú bò; chữa các bệnh liên quan đến tiêu hóa và hô hấp ở trâu bò, gia cầm.
Erythromycin có thể được sử dụng riêng lẻ, hoặc kết hợp với các kháng sinh khác như
penicillin, colistin sulfate, sulfonamides và tylosin. Erythromycin được đưa vào cơ thể
qua nước uống, thức ăn, tiêm vào cơ thịt. Liều sử dụng tối đa trong thú y là 100 mg/kg
thể trọng/ngày [3].
Bảng 1.2: Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của erythromycin trong sản phẩm thực phẩm
theo quy định của từng thị trường nhập khẩu
Mẫu
MRL (ppb)
Codex
(2008)

*
FAO/WHO
(2006)
**
EU
(2008)
***
US
(2005)
****
Canada
(2009)
*****
Australia
(2009)
******
Cơ thịt
100
100
200
100
30
300
Gan
100
100
200
100
30
300

Thận
100
100
200
100
30
300
Mỡ
100
100
200
100
30
300
Trứng
50
50
150
25
30
300
* />** />*** />**** />***** Fish products standards and methods manual, amended No.14, 17/11/2009, Canadian Food Inspection Agency.
****** www.foodstandards.gov.au/foodstandard
Năm 1985 Kibwage đã nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế trên vi khuẩn
gram [+] và gram [-] của erythromycins A, B, C, và D. Thí nghiệm được tiến hành trên
21 loài vi khuẩn gram [+] và 15 loài vi khuẩn gram [-]. Kết quả thấy erythromycin B
có khả năng ức chế vi khuẩn kém hơn so với erythromycin A, khả năng ức chế vi
khuẩn của erythromycin C và D chỉ bằng 50% erythromycin A [4].
1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea
Mironov và cộng sự (2004) có nghiên cứu cơ chế chuyển hoá sinh học

erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea. Erythromycin A (ErA) trong thành
phần cấu trúc gồm có 3 phần: 1 vòng lactone và 2 phân tử đường deoxy là D-
10
desosamine và L-cladinose (CH
3
-O-3-mycarose), bám vào vòng lactone. Con đường
chuyển hoá sinh học erythromycin A qua 2 giai đoạn (hình 1.2).
Hình 1.2: Chuyển hoá sinh học các dẫn xuất erythromycin EryA, EryF, EryB, EryC, EryG, và
EryK là các protein (enzymes)
Giai đoạn thứ nhất, polyketide synthase (PKS) xúc tác quá trình trùng ngưng
phần đoạn khởi đầu propionyl-CoA, với [S]-methylmalonyl-CoA, để tạo nên β-
ketoester. 6 phân tử methyl-malonyl-CoA sẽ thêm vào phân tử ketoester. Trong suốt
quá trình thiết lập mạch polyketide, các nhóm carboxyl tự do của methylmalonyl-CoA
sẽ trải qua quá trình khử carboxyl; kết quả là chỉ có các phân tử propionate được tạo ra
ở mạch cuối cùng. Tại cuối mỗi chu kỳ bổ sung methylmalonyl-CoA, nhóm keto sẽ bị
khử thành 1 nhóm hydroxy (ngoại trừ nhóm keto của nhóm propionate thứ 3). Khung
carbon của đơn vị propionate thứ 4 sẽ trải qua quá trình khử triệt để, với sự tham gia
của 3 enzyme khác nhau để cấu thành PKS module 4, hoạt động theo thứ tự
(dehydratase, enoyl reductase, và ketoreductase). Việc hình thành mạch polyketide
được kết thúc bằng quá trình khép vòng (được xúc tác bởi thioesterase), với việc tạo
11
nên 6-deoxyerythronolide B (dE-B), sản phẩm trung gian này sẽ không bám vào phức
đa enzyme của PKS.
Giai đoạn thứ hai, dE-B được chuyển hoá theo 1 loạt các phản ứng được xúc
tác bởi stereospecific hydroxylases, glycosyltransferases và methyltransferases.
Quá trình hydroxyl hoá các tiền chất ErA bị tác động bởi 2 hệ enzyme
cytochrome P-450 monooxigenase, đó là P450 eryF và P450 eryK. P450 eryF là 1
protein hoà tan xúc tác đặc hiệu 6-[S]-hydroxylation của dE-B thành erythronolide B
(E-B). Hai phân tử đường được thêm vào E-B: thêm vào L-mycarose để hình thành 3-
α-mycarosylerythronolide B (ME-B), và việc thêm vào D-desosamine để thành ME-B

tham gia sản sinh sinh ra erythromycin D (ErD).
ErD chuyển hoá thành ErA bởi 2 đường hướng. Đường hướng đầu tiên bao gồm
quá trình O-methylation ở C-3 của mycarose, hình thành nên erythromycin B (ErB),
sau đó là quá trình hydroxyl hoá ở C-12 của vòng lactone, tạo thành ErA. Đường
hướng thứ hai, ErD được hydroxyl hoá đầu tiên thành erythromycin C (ErC), sau đó là
methyl hoá thành ErA. Cả 2 phản ứng methyl hoá được xúc tác bởi cùng enzyme, O-
methyltransferase. Các phản ứng hydroxyl hoá được xúc tác bởi protein EryK [5].
1.2.3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên thủy sản
1.2.3.1 Ở loài cá hồi vân (Trout) - Oncorhynchus mykiss
Nhóm nghiên cứu của Esposito (2006) đã đánh giá quá trình đào thải
erythromycin trên cá hồi vân dòng Oncorhynchus mykiss sau khi ăn thức ăn có chứa
100 mg erythromycin/kg trọng lượng/ ngày trong vòng 21 ngày, ở nhiệt độ 11,5
o
C.
Dư lượng erythromycin trong cơ thịt và da cá được phân tích bằng phương pháp sắc ký
lỏng ghép khối phổ LC-ESI-MS/MS. Kết quả cho thấy động học đào thải
erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi Oncorhynchus mykiss ở các thời điểm khác nhau
(bảng 1.3). Trên cơ sở đó các tác giả đã rút ra được thời gian ngưng thuốc là 255
°C_ngày sau khi được cho ăn 21 ngày với liều 100 mg erythromycin/ kg trọng
lượng/ngày [6].