Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn AGROBACTERIUM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
TRẦN THỊ THANH DIỆP
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ KHẢNG THUỐC TRỪ CỎ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM
KHÓA LUÂN TÓT NGHIÊP ĐAI HOC • • • •
Chuyên ngành: Di truyền học
Người hướng dẫn khoa học TS. PHẠM
THỊ LÝ THU
HÀ NỘI - 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, có sự hỗ trợ từ giáo viên hướng
dẫn là TS. Phạm Thị Lý Thu. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa
từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây. Những số liệu trong các bảng
phục vụ cho việc phân tích , nhận xét, đánh giá được chính tác giả nghiên cứu có ghi trong nhật kí thí
nghiệm và bảng theo dõi thí nghiệm hàng ngày trong quá trình thực tập. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng
một số nghiên cứu, nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan, tổ chức khác được thể
hiện trong phần tài liệu tham khảo.
Nếu phát hiện có bất kì sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng
như kết quả luận văn của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả
Trần Thị Thanh Diệp
LỜI CẢM ƠN
Qua thời gian học tập tại Viện Di truyền Nông nghiệp, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức
chuyên môn, kĩ năng thực hành và làm việc.
Để có những kiến thức và kết quả như ngày hôm nay, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
tế bào thực vật, đặc biệt là TS. Phạm Thị Lý Thu là người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi những
kiến thức chuyên môn, kĩ năng thực tế, mở mang và nâng cao kiến thức để tôi hoàn thành khóa luận này
một cách tốt nhất.
Cùng với sự giúp đỡ tận tình của các cán bộ khoa học Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế

bào thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có môi trường học tập và làm việc tốt.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô khoa Sinh- KTNN, trường Đại học sư phạm Hà
Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập.
Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những người đã động viên giúp
đỡ tôi trong quá trình thực tập vừa qua.
Trong quá trình thực tập và viết khóa luận, do thời gian thực hiện đề tài hạn chế nên không tránh
khỏi những sai sót. Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự đóng góp của các thày cô giáo, bạn bè để giúp tôi
hoàn thành tốt khóa luận này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả
Tràn Thị Thanh Diệp
Hình 1.1. Phản ứng tổng hợp EPSP từ S3P và PEP dưới sự xúc tác của enzyme
Bảng 1.1. Các gen sử dụng trong tạo cây ngô chuyển gen mang đặc tính chống
2,4-D :Dichlophenoxy acetic acid
DNA :Deoxiribonucleic acid
AS :Acetosyringone
CIMMYT : The International Maize and Wheat Improvement Center - Trung tâm cải
tiến ngô và lúa mỳ quốc tế cs : Cộng sự
CTAB : Cetyl trimetylammonium bromua
EPSP : 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate
EPSPS : Enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate
synthase
Hpt :Hygromycin phosphotransferase
L-PPT :L-phosphinothricin
Pat/bar :Gen mã hoá cho enzym phosphinothricin acetyl transferase
(PAT).
PCR : Polymerase Chain Reaction- phản ứng PCR
PEP : Phosphoenolpyruvate
S3P : 3-phosphate-shikimate
T-DNA : Tumor indosing plasmid= Plasmid gây khối u ở thực vật
TCN : Trước công nguyên

DANH MỤC
Vir : Virulence Region= Vùng gây độc
DANH MỤC
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Ngô là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới (cùng với lúa mì
và gạo) và là cây lương thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất. Tính đến năm 2012
diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 159 triệu ha (FAO, 2013). Theo dự đoán vào năm
2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 852 triệu tấn một năm và có thể vượt qua cả
gạo và lúa mì (Pingali và Padney, 2010).
Hiện nay ngành sản xuất ngô thế giới nói chung và nước ta nói riêng đang phải đối
mặt với rất nhiều vấn đề như: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày càng nặng
nề hơn, đặc biệt cỏ dại cũng là một vấn đề lớn nhất trong nông nghiệp đã làm giảm năng
suất cây trồng từ 10 - 15%. Do đó, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã được áp
dụng như: sử dụng các thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không chọn lọc. Đặc biệt ở những
vùng có hiện tượng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ được sử dụng như một giải pháp duy nhất
để loại trừ cỏ dại. Tuy nhiên, việc lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc tính cao đã và
đang gây ra các hậu quả nghiêm trọng đối với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con
người. Điều này đặt ra nhiệm vụ to lớn cho các nhà chọn giống, các nhà nghiên cứu công
nghệ sinh học chọn tạo ra các giống ngô cho năng suất cao, mang đặc tính kháng thuốc
diệt cỏ.
Các giống cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính khác nhau đã được nghiên cứu
và áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng, tăng thu nhập cho người lao
động. Hàng năm, số lượng nông dân và các quốc gia trồng cây trồng biến đổi gen liên tục
gia tăng. Cây ngô chuyển gen đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996, đến năm
2012 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 55,1 triệu ha tại 11 nước, trong đó có 5 nước
trồng hơn 1 triệu ha bao gồm: Hoa Kỳ (34,1 triệu ha), Brazil (12,1 triệu ha), Argentina
(3,3 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) và Canada (1,6 triệu ha). Nước có sản lượng tăng
cao nhất vào năm 2012 là Brazil (3 triệu ha). Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ luôn là

giống cây trồng ưu thế, chiếm 7,8 triệu ha tương đương với 5% diện tích cây trồng
chuyển gen toàn cầu và được trồng tại 9 nước.
Ở Việt Nam, mặc dù trong thời gian gần đây, các nghiên cứu về biến nạp gen vào
các loài cây trồng đã được quan tâm, chú ý nhiều hơn, nhưng với đối tượng cây ngô, có
thể nói đây là loài cây trồng tương đối khó tính trong quá trình nuôi cấy invitro cũng như
chuyển nạp gen, hiệu quả biến nạp gen còn rất thấp. Mặt khác, việc tạo ra cây trồng
7
chuyển gen có khả năng áp dụng vào sản xuất từ những nghiên cứu trong nước đang là
đòi hỏi cấp thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học và ngành nông nghiệp
của Việt Nam. Mặt khác, kháng thuốc diệt cỏ nhân tạo là đặc điểm thường được sử dụng
nhiều nhất cho đến nay ở thực vật biến đổi gen, do đó cây ngô chuyển gen mang đặc tính
kháng thuốc diệt cỏ đang được quan tâm nghiên cứu. Việc chuyển các gen này vào cây
ngô sẽ nâng cao tính chọn lọc và hiệu quả kinh tế của thuốc diệt cỏ cũng như làm giảm
ảnh hưởng của thuốc đối với quần thể sinh vật trong đất.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn và dựa trên các cơ sở lý luận khoa học nêu trên,
chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ bằng phương
pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
2. Mục đích nghiên cứu
- Biến nạp gen kháng thuốc trừ cỏ CP4 EPSPS vào một số dòng ngô chọn lọc.
- Phân tích sinh học phân tử PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ CP4 EPSPS trong
các dòng ngô chuyển gen tái sinh.
- Đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dòng ngô chuyển gen CP4
EPSPS trong điều kiện nhà lưới.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng tiếp nhận
gen kháng thuốc trừ cỏ của một số dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterỉum.
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu đề tài tạo cơ sở cho nghiên cứu tạo dòng/ giống
ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ áp dụng vào thực tiễn sản xuất.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Nguồn gốcphân loại và vai trò của cây ngố

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô
Phân loại khoa học: Ngô thuộc:
Loài: Zea mays .L
Chi : Maydeae
Họ: Poaceae (hòa thảo)
Bộ: Poaỉes (Hòa thảo)
Lớp: Monocotyledons (Một lá mầm)
Ngành: Angiospermatophyta (Hạt kín)
8
Ngô, trong tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) là thuật ngữ
trong tiếng Taino để chỉ loài cây này, là từ thông dụng Vương quốc Anh để chỉ cây ngô.
Tại Hoa Kỳ, Canada và Australia, thuật ngữ hay được sử dụng là corn, là từ trước đây
dùng để gọi cho một loại cây lương thực. Hiện nay, thuật ngữ này dùng để chỉ cây ngô, là
dạng rút gọn của "Indian com" là “cây lương thực của người Anh điêng”.
Lịch sử nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khảo cổ, di truyền
học, thực vật học, dân tộc học và địa lý học quan tâm
và đưa ra nhiều giả thuyết. Có giả thuyết cho là nguồn
gốc cây ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trước công nguyên
(TCN). Những nghiên cứu về di truyền học gần đây cho rằng
quá trình thuần hóa ngô diễn ra vào khoảng năm 7000 TCN
tại miền trung Mexico và tổ tiên của nó là loại cỏ
teosinte hoang dại gần giống nhất với ngô ngày nay vẫn
còn mọc trong lưu vực sông Balsas. Liên quan đến khảo cổ
học, người ta cũng đã phát hiện các bắp ngô có sớm nhất
tại hang Güila Naquitz trong thung lũng Oaxaca, có niên
đại vào khoảng năm 4.250 TCN, các bắp ngô cổ nhất trong
các hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào
khoảng 2750 TCN. Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm
nhất khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và
nhanh. Ngô là lương thực chính của phần lớn các nền văn

hóa tiền Columbus tại Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ và khu vực
Caribe (Ganinat, 1997).
9
1.1.2. Vai frò của cây ngô
Cây ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba trên thế giới (sau lúa mỳ và lúa
gạo) và đứng thứ hai ở Việt Nam (sau lúa). Ngô được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, với
tổng sản lượng hàng năm lớn hơn bất kỳ loại ngũ cốc nào khác. Hoa Kỳ sản xuất khoảng
40% tổng sản lượng ngô trên thế giới, sau Hoa Kỳ là các nước Trung Quốc, Brazil,
Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp và Argentina. Chỉ tính riêng trong năm 2009, tổng diện
tích trồng ngô toàn cầu là hơn 159 triệu ha, đạt sản lượng 817 triệu tấn, nhiều hơn gạo
(678 triệu tấn) hoặc lúa mì (682 triệu tấn) (FAO, 2009). Ngô là loại cây lương thực nuôi
sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới. Ngô có một số vai trò chính:
- Là nguồn có giá trị dinh dưỡng: Ngô có chứa các chất như protein (10,6%), lipid (4-5%),
glucid (69%), ngoài ra hàm lượng vitamin trong ngô cũng khá cao, tập chung chủ yếu ở
lớp ngoài hạt ngô và ở mầm.
- Làm lương thực, thực phẩm cho con người:
Cây ngô là một trong ba cây trồng quan trọng nhất được sử dụng làm thức ăn cho
người và gia súc. Toàn thế giới sử dụng 17% sản lượng ngô làm lương thực cho người
trong đó ở các nước đang phát triển là 30%, các nước phát triển khoảng 40%. Các nước ở
Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Khẩu phàn ăn ở các
nước châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt giống như các nước châu Á sử dụng cơm
(gạo), cá, rau xanh và các nước châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa.
- Ngô làm thức ăn chăn nuôi:
Theo số liệu thống kê của CIMMYT, giai đoạn 1997 - 1999, thế giới dùng ngô làm
thức ăn chăn nuôi là 66% - khoảng 400 triệu tấn/năm. Các nước phát triển có tỷ lệ dùng
ngô làm thức ăn nuôi cao, thường trên 70%.
Hiện nay, Việt Nam cũng dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là chính (khoảng 90%)
song tỷ lệ ngô trong tổng số chất tinh chỉ khoảng 50%, vì ta còn dùng thêm gạo gẫy, cám,
bột sắn
Từ ngô hạt có thể xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngồng ), nghiền thành bột và

chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn và gia cầm, chế biến thức ăn cho cá. Thân lá ngô có
thể cho trâu bò ăn tươi, sau khi thu hoạch (nhất là ngô thu bắp non) băm nhỏ ủ chua làm
thức ăn cho gia súc.
1
Giá trị dinh dưỡng của thân, lá ngô khá lớn, phụ thuộc vào giống ngô và thời vụ thu
hoạch. Trong 1 kg thân cây ngô có 600 - 700 g chất khô, 60 - 70 g protein, 280 - 300 g xơ.
Do vậy, thân, lá ngô là nguồn thức ăn thô quan trọng cho trâu bò ở nhiều vùng. Giá trị
dinh dưỡng thân, lá ngô còn tăng lên nếu được chế biến theo cách lên men ủ chua.
- Làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp:
Ngô được sử dụng làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp: sản xuất thức ăn
gia súc, sản xuất rượu cồn, tinh bột dầu, glucose, bánh kẹo Trong thành phàn khối lượng
của hạt ngô, tinh bột chiếm tỷ lệ 65-83% là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công
nghiệp gia công tinh bột. Nguồn tinh bột này được sử dụng phổ biến trong công nghiệp
chế biến các loại đường: sản xuất glucose dùng trong sản xuất bánh kẹo, công nghiệp keo
dán, sản xuất xăng sinh học, chế biến đồ giải khát, bia, rượu.
1.2.Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng hai phương pháp chính được
áp dụng rộng rãi và có giá ừị thực tiễn, có thể chuyển các gen vào hàng loạt các cây trồng
khác nhau, đó là:
- Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tume/aciens
- Chuyển gen trực tiếp
1.2.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tume/aciens
1.2.1.1 Hệ thong chuyển gen in vitro
Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải có được
sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của A. tume/aciens và khả năng tái sinh của các tế bào sau
khi lây nhiễm với vi khuẩn.
Một số trợ giúp kỹ thuật trong quá trình biến nạp đã cải thiện hiệu quả của hệ thống
chuyển gen in vỉtro nhờ A. tume/aciens bao gồm:
• Xử lỷ sóng siêu âm
Xử lý mô thực vật với A. tumefaciens trong điều kiện sóng siêu âm tạo ra các tổn

thương nhỏ, đồng nhất ở mô thực vật, cho phép Agrobacterium dễ dàng xâm nhập vào tế
bào thực vật. Bằng phương pháp này đã cải thiện rõ rệt hiệu quả chuyển gen, biểu hiện
1
gus tạm thời đã tăng từ 100-1400 lần ở các tế bào đậu tương, đậu đũa, cây vân sam trắng,
lúa mỳ và ngô.
• Ly tâm tế bào
Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp với ly tâm đã được áp
dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hoá nhận được từ hoa chuối đực
nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger. Tần số
chuyển gen đã được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng chế độ ly tâm tế bào thực vật
trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna & cs., 2004).
1.2.1.2 Hệ thong chuyển gen in vivo
Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in planta) và
rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một trong những loài cây mô hình đối với các nghiên
cứu về hệ gen học. Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công đoạn nuôi
cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số lượng cây
chuyển gen thu được lớn hơn. Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng khác nhau như:
đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, hoa rum và cây lạc.
1.2.2. Chuyển gen trực tiếp
1.2.2.1. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm.
Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào các tế bào trần. Sau khi tách tế bào trần,
tạo huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn
lọc. cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong huyền phù tế bào trần 3mm. Cho
máy phát siêu âm với tần số 20kHz theo từng nhịp ngắn 110 mili giây. Tổng thời gian tác
động khoảng 500 - 900 mili giây. Sau đó đem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích
hợp hoặc môi trường chọn lọc để tách các tế bào trần đã nhận được DNA.
1.2.2.2. Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation )
Kỹ thuật này được sử dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần. Tạo một điện thế
cao, trong một thời gian ngắn thì có thể tạo nên các lỗ trên màng tế bào tràn làm cho DNA
bên ngoài có thể thâm nhập vào bộ gen của tế bào. Người ta chuẩn bị một huyền phù tế

bào tràn với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị
điện xung tạo điện thế cao 200 - 600 v/cm trong khoảng thời gian 4-5 phàn nghìn giây.
Ket quả sẽ làm cho màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời giúp cho DNA
1
ngoại lai có thể xâm nhập. Quá trình được thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc
các “buồng xung điện” có các tấm cực bằng kim loại đặt cách nhau 1-4 mm. Sau quá trình
điện xung đem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc
để tách các tế bào trần đã nhận được DNA. Nuôi cấy tái sinh và tiếp tục chọn lọc.
1.2.2.3. Kỹ thuật chuyển gen nhờ Silicon Carbide
Silicon Carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất. Sợi
Silicon Carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0.6 micromet và dài khoảng 10-80
micromet. Khi lắc một huyền phù tế bào đơn và plasmid tái tổ hợp mang gen mong
muốn, gen chọn lọc với Silicon Carbide trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các tế
bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập. Nuôi cấy tế bào, tái sinh thảnh mô sẹo
và cây, chọn lọc để tách ra những cây đã chuyển gen.
Thông thường, huyền phù tế bào đơn được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau
khi cấy chuyển là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen.
1.2.2.4. Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phẩn
Phương pháp chuyển gen này được gọi là phương pháp chuyển gen không qua nuôi
cấy mô. Theo phương pháp này thì DNA chuyển vào, có thể theo đường ống phấn chui
vào bầu nhụy cái và chuyển gen ngay sau khi hạt phấn mọc qua vòi nhụy và bắt đầu đưa
tinh tử vào thụ tinh. Theo nghiên cứu thì chuyển gen qua ống phấn tốt nhất ngay sau khi
quá trình thụ tinh xảy ra ở noãn nhưng tế bào sinh dục cái chưa phân chia. Như vậy, sự
chuyển gen chỉ xảy ra đối với một tế bào sinh sản cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ
không xuất hiện thể khảm.
1.2.2.5. Chuyển gen bằng sủng bẳn gen
Chuyển gen bằng súng bắn gen là một trong những kỹ thuật đưa gen ngoại lai vào tế
bào. Nguyên tắc chung của phương pháp là sử dụng những viên đạn có kích thước nhỏ
nhưng có tỉ trọng cao để đạt gia tốc cao, dưới tác dụng của một lực nén chúng có thể
xuyên qua các lớp vỏ và màng tế bào, đưa một lớp bọc ngoài (DNA càn chuyển) vào tế

bào và tiếp cận bộ gen của tế bào. Người ta thường xử dụng hạt tungsten hoặc vàng có
đường kính từ 1-1.5 micromet làm các hạt vi đạn. Việc chuyển gen bằng súng bắn gen có
nhiều thuận lợi do dễ dàng tiến hành và đặc biệt đối tượng nhận gen rất đa dạng (ở dạng
mô, phôi, tế bào trần, tế bào). Người ta sử dụng thảnh công súng bắn gen vào callus để
1
chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, gen kháng rầy, kháng nấm cho nhiều đối tượng cây trồng
không kể cây hai hay một lá mầm.
Phương pháp này được áp dụng với các cây trồng mà việc chuyển gen thông qua
Agrobacterium khó thực hiện được. Phương pháp này được sử dụng tương đối rộng rãi
với các ưu, nhược điểm sau: ưu điểm:
- Có thể áp dụng hàu hết với các loại mô, tế bào.
- Chuyển DNA ngoại lai và tế bào nhanh.
- Dễ sử dụng: quy ừình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể được xử lí trong thời gian
ngắn.
- Các vector được thiết kế đơn giản: không đòi hỏi các trình tự DNA cho đoạn T-DNA như
chuyển gen bằng Agrobacterium.
- Cần một lượng nhỏ plasmid DNA.
- Biểu hiện gen tạm thời có thể được quan sát sau vài ngày.
Nhược điểm:
- Nhiều bản sao được chuyển vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu
hiện gen đã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không bền vững.
- Hiệu quả chuyển gen thấp.
- Thiết bị đắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có thể mua được, giá thành
vật tư đắt.
1.3.Nghiên cứu chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vỉ khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu
tố như tàn số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển
gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp. Đối với phương pháp chuyển
gen thông qua Agrobacterium thì tàn số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến

vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật. Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm:
chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm
nhập vào các cây chủ và loại vectơ. Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm loại cây, kiểu
gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của các tế bào đích, thành phần môi trường
(Nguyễn Đức Thành, 2003; Cheng & cs„ 2004).
1
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
ở các cây một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc đã được nghiên cứu và đánh giá bởi các
tác giả (Cheng & cs., 2004). Sau đây là một số yếu tố chính:
1.3.1. Ảnh hưởng của kiểu gen
Nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài.
Đa số các báo cáo về chuyển gen chỉ đề cập ảnh hưởng của kiểu gen đến tần số chuyển
gen bền vững, vì thế người ta không biết được kiểu gen có ảnh hưởng đến khả năng
chuyển T-DNA hay phản ứng nuôi cấy in vitro. Trong số các loài cây một lá mầm đã được
chuyển gen, cây lúa là đối tượng chuyển gen ít phụ thuộc vào kiểu gen nhất. Hơn 40 kiểu
gen của các giống lúa indica, japónica và javanica đã được chuyển gen. Đối với ngô, lúa
mỳ, lúa mạch và mía, các dòng mô hình được sử dụng cho chuyển gen bằng súng bắn gen
đều có phản ứng tốt trong chuyển gen thông qua Agrobacterium. Các dòng mô hình đó là:
ngô: AI88 và các dòng lai với AI88; lúa mỳ: Bobwhite và Fielder; Lúa mạch: Golden
Promise và Igri; Mía: Ja 60- 5 (Cheng & cs., 2004).
Xây dựng được quy trình biến nạp không phụ thuộc vào kiểu gen của một loài cây
trồng nhất định là một yêu cầu đối với các nhà nghiên cứu. Gần đây, các cây chuyển gen
đã được tạo ra từ các dòng/giống chọn lọc của nhiều loài cây ngũ cốc như: giống lúa miến
PHI391; giống ngô PHP38 và PHN46; giống lúa mạch Schooner. Tuy nhiên, tần số
chuyển gen của các dòng chọn lọc này thấp hơn so với các dòng mô hình tương ứng
(Cheng & cs., 2004).
1.3.2. Dạng mẫu mô đích
- Mô sẹo phôi hoá:
Mô sẹo phôi hoá tạo thành từ phôi trưởng thảnh của các giống lúa japónica được cho
là dạng mô thích hợp nhất cho biến nạp gen thông qua Agrobacterium (Hiei & cs., 1997).

Tiếp đó, dạng tế bào này đã được sử dụng để chuyển gen vào các giống lúa và lúa mỳ có
kiểu gen khác nhau. Các nghiên cứu chuyển gen vào cây măng tây A.Officinalis, cây hẹ
tây, tỏi, và các loài hoa Lily cũng sử dụng hệ thống tế bào đích này. Mô sẹo phôi hoá tạo
thành từ mô phân sinh hoặc từ cây mía in vitro, từ lá của hai loài cây cảnh Agapanthus
praecox ssp. Orientalis L. và Muscari armenỉacum Leichtl. Ex Bak., cũng đã được
chuyển gen thành công.
1
- Phôi non mới tách:
Phôi non mới tách đã được tìm thấy là dạng mẫu mô đích tốt nhất, có khả năng tái
sinh cao, thích hợp cho lây nhiễm với Agrobacterium của các kiểu gen của giống lúa
indica (Aldemita & Hodges, 1996), ngô (Frame & cs., 2002) và lúa mạch (Tingay & cs.,
1997).
- Huyền phù tế bào:
Huyền phù tế bào là dạng tế bào đầu tiên được lựa chọn cho các nghiên cứu biến nạp
ở lúa (Hiei & cs., 1994). Các nghiên cứu sau này cho thấy huyền phù tế bào là các tế bào
đích tuyệt vời không chỉ đối với chuyển gen ở cây lúa mà còn rất thích hợp cho các loài
khác như ngô, lúa mạch, lúa mỳ, chuối, mía và cây cỏ.
1.3.3. Chủng Agrobacterium và plasmid
Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A. tumefaciens cho thấy hiện tại
chỉ có 3 chủng vi khuẩn được sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm đó là LBA4404
; C58 và EHA 101; các chủng cải biên: EHA105 từ EHA101, AGLO & AGL1 từ
EHA101 (Cheng & cs., 2004). Dạng Ti- plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò
trong quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật.
1.3.4. Các điều kiện xử lý mẫu mô đích, lây nhiễm và đồng nuôi cấy
- Tiền xử ỉỷ mẫu mô biến nạp
Hệ thống chuyển gen có hiệu quả đã được xây dựng đối YỚi phôi non tiền nuôi cấy
được xử lý co nguyên sinh (Lucca & cs., 2001). Thổi khô phôi non lúa mỳ tiền nuôi cấy
sau khi lây nhiễm với Agrobacterium đã làm tăng rõ rệt hiệu quả chuyển gen (Cheng &
cs., 2003).
- Xử lý chống thối hoại mô biến nạp

Các thao tác in vitro đối với mẫu mô thực vật sau khi lây nhiễm YỚi
Agrobacterium là rất cần thiết để kích thích khả năng chuyển T-DNA vào tế bào thực vật
và để phục hồi tế bào sau khi biến nạp.
- Xử lý áp suất thẩm thấu
Xử lý này có hiệu quả trong chuyển gen thông qua Agrobacterium ở một số loài cây
một lá mầm. Nghiên cứu của Uze và cộng sự (1997) cho thấy xử lý phôi lúa non tiền nuôi
cấy trên môi trường áp suất thẩm thấu 10% sucrose đã cải thiện khả năng chuyển T-DNA.
1
Tuy nhiên, ảnh hưởng của môi trường xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển T-
DNA và chuyển gen bền vững không rõ rệt trong các nghiên cứu chuyển gen ở ngô
(Frame & cs., 2002). Điều này cho thấy tác động của xử lý áp suất thẩm thấu đến chuyển
gen thông qua Agrobacterium phụ thuộc nhiều vào loài.
- Thổi khô mẫu
Một yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen ở các loài cây một lá mầm
đó là thổi khô mẫu trước hoặc sau khi lây nhiễm. Thổi khô huyền phù tế bào mía với thời
gian từ 10-15 phút đã kích thích khả năng chuyển T- DNA và tần số chuyển gen bền vững.
- Nhiệt độ đồng nuôi cấy mô thực vật với vỉ khuẩn Agrobacterium
Nhiệt độ thích họp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải được đánh giá với mỗi
dạng mẫu mô đích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp. Nghiên cứu của Kondo &
cộng sự (2000) cho thấy biểu hiện gus tạm thời trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt
được cao nhất ở 22°c, trong khi đó tần số chuyển gen cao hơn đã nhận được ở phôi ngô
non sau khi biến nạp đồng nuôi cấy ở 20°c (Frame & cs„ 2002).
- Thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Thành phần môi trường cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả
chuyển gen. Trong chuyển gen vào phôi ngô non, Ishida và cộng sự (1996) đã sử dụng
môi trường LS, Zhao và cộng sự (2001) sử dụng môi trường N6 có bổ sung nitrat bạc.
Môi trường YỚi hàm lượng khoáng giảm đã kích thích khả năng chuyển T-DNA trong
biến nạp gen vào mô sẹo phôi hoá ở lúa mỳ (Khanna & Daggard, 2003), phôi non ở ngô
(Armstrong & Rout, 2001).
Việc bổ sung acetosyringone (AS) - chất kích thích sự hoạt động của các gen vỉr, đã

có trong hàu hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm. Trong môi trường không có
AS, mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus rất thấp, không tái sinh được các cây lúa và
cây hành chuyển gen.
- Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium
Các chất kháng sinh như: cefotaxim, carbenicillin, timentin thường được sử dụng để
loại bỏ vi khuẩn sau khi nuôi cộng sinh trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua A.
tumefaciens. Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban đầu ở
ngô và lúa.Mặc dù Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban
1
đầu ở ngô và lúa, nhưng các nghiên cứu sau này cho thấy ở nồng độ 250mg/l ảnh hưởng
không tốt đến khả năng tạo mô sẹo dòng ngô Hill (Ishida & cs., 1996).
- Mật độ vi khuẩn Agrobacterium
Mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế bào thực vật, giảm khả
năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững.
Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các
mẫu mô khó, tằn số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn,
rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng
nuôi cấy.
1.4.Nghiên cứu chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở cây ngô
Cây ngô chuyển gen (Zea mays) đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp sử dụng
súng bắn gen vào năm 1990 (Gordon-Kamm & cs., 1990). Ke từ sau đó công nghệ chuyển
gen vào cây ngô đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu chất nguyên sinh của
phôi và nghiên cứu về các vấn đề sinh học cơ bản thông qua nghiên cứu về cây ngô
chuyển gen. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh phương pháp chuyển gen thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là lựa chọn tốt hơn về sự phân phối của gen vào cây
ngô so với việc sử dụng phương pháp súng bắn gen. Hệ thống phân phối gene này giúp
cho tỉ lệ ổn định của gen cao hơn, số bản sao của gen trong cây mang gen thấp hơn
phương pháp súng bắn gen (Ishida & cs., 1996; Zhao & cs., 1998) và có ưu điểm là có thể
chuyển phân mảnh DNA có kích thước lớn tới các tế bào nhận (Hamilton & cs., 1996),
hiệu quả chuyển gen cao hơn (Ishida & cs., 1996; Zhao & cs., 1998). Phương pháp

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterỉum. cho hiệu quả cao đã được chứng minh tại
nhiều phòng thí nghiệm. Tần số chuyển gen có thể đạt từ 5-30% khi đồng nuôi cấy
Agrobacterium mang vector nhị thể ’’super-binary” với phôi chưa trưởng thành của dòng
ngô A188 (Ishida & cs., 1996) đã sử dụng phospho-mannose-isomerase giống như chỉ thị
chọn lọc đã thu được các cây ngô chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi
khuẩn Agrobacterium. Zhao & es., (2001) đã tối ưu hóa các điều kiện chuyển gen vào
callus của giống ngô Hi-II tăng hiệu suất chuyển gen trung bình xấp xỉ 40%. Frame & cs.
(2002) sử dụng vi khuẩn Agrobacterium mang vector nhị thể chuyển gen vào dòng ngô
AI88 thu được hiệu suất chuyển gen đạt 5,5%.
1
1.5.Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới và ở Việt Nam
1.5.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới
Chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens đã được biết
đến như là một cơ chế đưa DNA mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao. Tuy nhiên,
hàu hết các cây một lá mầm đều không phải là vật chủ của A.tumefaciens, do vậy
những nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô ban đàu được xây dựng và phát triển hệ thống
tái sinh từ việc chuyển gen vào các tế bào đặc biệt.
Vào năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên được thu nhận nhờ
lây nhiễm phôi non với A.tumefaciens (Chan & cs., 1993). Tiếp đó, cây ngô chuyển gen
cũng được tạo ra bằng phương pháp này. Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chậm
trễ trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây ngũ cốc thông qua A.tumefaciens là do
thiếu phản ứng gây tổn thương hoặc phản ứng gây tổn thương kém ở mô tế bào của cây
ngũ cốc. Phản ứng này là một trong những yếu tố cần thiết đối với sự lây nhiễm thành
công A.tumefaciens vào tế bào thực vật.
Một tiến bộ mới trong cải tiến quy trình biến nạp gen ở ngô là sử dụng chủng
A.tumefaciens LBA4404 và hệ thống siêu vector hai nguồn đã tạo bước đột phá trong
chuyển gen thông qua A.tumefaciens (Ishia & cs., 1996), cải thiện tần số chuyển gen lên
đến 5 - 30%. Các nghiên cứu chuyển gen vào tế bào ngô thông qua A.tumefaciens cho
thấy quá trình chuyển gen thường bị tắc nghẽn ở sự kết hợp của T-DNA trong hệ gen của
thực vật. Sự kết hợp của DNA ngoại lai trong hệ gen thực vật có thể xảy ra thông qua sự

tái tổ hợp bất thường. Sử dụng các siêu vector hai nguồn, gen hpt/bar được chuyển vào
phôi non dòng ngô AI88 và các dòng lai với AI88 (Ishida & cs., 1996).
Năm 2002, trong nghiên cứu của mình, Frame và cộng sự đã tiến hành chuyển gen
vào phôi non mới tách của dòng ngô lai HỈII, sử dụng vector hai nguồn và bổ sung cystein
trong môi trường nuôi cộng sinh thu được hiệu quả chuyển gen tương đối cao lên đến gàn
5,5%.
Gần đây nhất, Hensel và cộng sự (2009) đã sử dụng hệ thống vector hai nguồn
pGH218 để chuyển thành công gen chỉ thị chọn lọc pat và gen gus vào phôi non của dòng
ngô lai HiII với tần số lên đến 24%. Mặc dù vậy, các công trình chuyển gen thành công ở
1
ngô vẫn bị giới hạn bởi việc sử dụng dòng ngô AI 88 hoặc dòng lai trong đó dòng AI88 là
bố hoặc mẹ làm vật liệu.
Trong hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thành công ở ngô nhờ vi khuẩn
A.tumefaciens, phôi non mới tách được xem là dạng vật liện ban đầu có khả năng chuyển
nạp tốt nhất. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu gàn đây cho thấy các dạng mẫu mô khác của
cây ngô như cờ non, bao phấn, cây con in vitro và tế bào gốc là cũng có khả năng tái sinh
và sử dụng làm vật liệu cho biến nạp gen (Cheng & cs., 2004).
1.5.2. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô tại Việt Nam
Tại Việt Nam cùng với phương pháp chọn tạo giống truyền thống ngày càng hiệu
quả hơn thì việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo các giống cây trồng có khả
năng chống chịu với điều kiện bất thuận sinh học và phi sinh học đã được nghiên cứu. Bắt
đầu từ các nghiên cứu nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy noãn ngô để tạo dòng ngô thuần, Lê
Huy Hàm và cộng sự (2003), Nguyễn Thị Khánh Vân và cộng sự (2005) đã thực hiện và
chuyển giao ứng dụng thành công tại Viện Nghiên cứu Ngô.
Sử dụng chỉ thị phân tà để đánh giá đa dạng di truyền, tính khoảng cách di truyền và
tìm ra sự tương quan di truyền để dự đoán ưu thế lai sớm cho chọn tạo giống ngô đã được
một số tác giả nghiên cứu (Ngô Hữu Tình, 2009).
Xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen vào cây ngô đã được bắt đầu nghiên cứu
một cách bài bản ở Việt Nam từ năm 2002 (Phạm Thị Lý Thu & cs., 2003, 2005, 2006,
2007). Tiếp đó, nhóm nghiên cứu đã biến nạp thành công gen kháng sâu crylAc vào các

dòng ngô mô hình (HR8 và HR9) và các dòng ngô chọn lọc, bước đầu thu nhận được các
dòng ngô có khả năng kháng sâu đục thân (Nguyễn Văn Đồng & cs., 2009, 2010). Ngoài
đặc tính kháng sâu bệnh, các đặc tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường như
hạn, lạnh cũng đã được bắt đàu đưa vào nghiên cứu trên các đối tượng cây trồng như
ngô, lúa, đậu tương
Nguyễn Văn Đồng và cộng sự đã chuyển thành công vector mang gen chịu hạn
CaMV35S:: ZmNF-YB và SARK::IPT. Kết quả đã thu được 6 dòng ngô được xác định có
khả năng kháng hạn (Nguyễn Vãn Đồng & cs., 2013).
Tháng 3/2015, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ra quyết định số 69/QĐ-
CL-CLT cho phép ba giống ngô của công ty Syngenta Việt Nam được phép thương mại
2
đưa vào sản xuất đại trà (các giống ngô được phát triển từ giống NK66 là NK66Bt mang
gen CrylA(b) kháng sâu đục thân, NK66GT mang gen GA21 kháng thuốc trừ cỏ gốc
glyphosate và NK66BƯGT kháng sâu đục thân và kháng thuốc trừ cỏ).
1.6. Cơ sở khoa học nghiên cứu về chọn tạo cây ngô biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ
Trong sản xuất nông nghiệp, kiểm soát cỏ dại là một vấn đề quan ừọng, nếu không
kiểm soát cỏ dại có thể làm giảm sản lượng cây trồng từ 20-60%. Ngày nay, hàng loạt các
biện pháp phòng trừ cỏ dại đã được áp dụng như: sử dụng các thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc
không chọn lọc, phun 1 lần hoặc phun liên tục trước và sau khi trồng. Đặc biệt ở những
vùng có hiện tượng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ được sử dụng như một giải pháp duy nhất
để loại trừ cỏ dại.
Trong giai đoạn từ 1991-2012, đặc tính kháng cỏ là tính trạng nổi bật. Giống ngô
kháng thuốc diệt cỏ glyphosate đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996 bởi công ty
Monsanto và được gọi là “Roundup Ready Com”. Năm 2011 ngô biến đổi gen kháng
thuốc trừ cỏ đã được trồng ở 14 quốc gia. Đen năm 2012, 26 giống ngô kháng thuốc trừ cỏ
đã được ủy quyền nhập khẩu vào liên minh Châu Âu.
2
Vào năm 1997, cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ gluíbsinate và gen tăng hàm
lượng axit oleic lần đầu tiên được thương mại hóa. Trong số diện tích đậu tương chuyển
gen thì 75% được trồng ở Bắc Mỹ. Riêng ở Mỹ, diện tích đậu tương kháng thuốc diệt cỏ

chiếm 85% diện tích trồng cây đậu tương. Còn ở châu Á, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ
chiếm 6% tổng sản phẩm cây trồng biến đổi gen. Trong năm 2007, đậu tương chuyển gen
là cây trồng chủ đạo, chiếm diện tích 58,6 triệu ha (chiếm 51% diện tích đất trồng cây
chuyển gen), tiếp theo là diện tích trồng ngô (35,2 triệu ha, chiếm 31%), bông (15 triệu ha,
chiếm 13%) và cải canola (5,5 triệu ha, chiếm 5% diệntích đất trồng cây chuyển gen trên
toàn cầu) (James, 2007).
Đậu tương kháng thuốc trừ cỏ tiếp tục là cây trồng công nghệ sinh học ưu thế được
trồng thương mại ở 11 nước trong năm 2012 (USA, Argentina, Brazil, Paraguay, Canada,
Uruguay, Bolivia, Nam Phi, Chile và Costa Rica). Cây trồng ưu thế thứ 5 là ngô kháng cỏ
chiếm 7,8 triệu ha tương đương với 5% diện tích cây trồng công nghệ sinh học toàn cầu
và được trồng tại 9 nước: USA, Paraguay, Brazil, Canada, Argentina, Nam Phi,
Philippines, Honduras và Chile.
1.6.1. Thuốc trừ cỏ Glyphosate
Glyphosate (N-(phosphonomethyl) glycine) là chất diệt cỏ phổ rộng, không chọn
lọc (Amrhein et al., 1980, 1983), được sử dụng để diệt các loài cỏ dại, cây có lá rộng và
các cây lấy gỗ. Nó được phun hoặc cho hấp thụ qua lá, hoặc tiêm vào thân và di chuyển
tới phần mô đang phát triển. Glyphosate là sản phẩm thương mại đầu tiên có tên là
Roundup do Công ty Monsanto sản xuất vào năm 1970. Theo số liệu thống kê ở Mỹ hằng
năm sử dụng glyphosate khoảng từ 2500 - 4000 tấn ở mức độ gia đình và 40000 - 50000
tấn cho sản xuất nông nghiệp.
Glyphosate là một chất ức chế cạnh tranh với phosphoenolpyruvate (PEP) trong quá
trình tổng hợp 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP). Dưới sự xúc tác đặc biệt của
enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS), glyphosate ngăn cản
phản ứng của PEP và 3-phosphate-shikimate (S3P) để tạo thảnh 5-enolpyruvul 3-
phosphate-shikimate (Haslam, 1974).
-
2
PEP oxonium ion Glyphosate
Hình 1.1. Phản ứng tống hợp EPSP từ S3P và PEP dưới sự xúc tác của
enzyme EPSPS

coo-
coo-
Shi ki mate-
3-phosphate
(S3P)
Ph os p ho
enol
pyruvate
(PEP)
coo-
5-enolpyruvyl-3-shi
ki mate phOSphate
(EPSP)
■COO-
2
Glyphosate ức chế hoạt động của EPSPS thông qua cơ chế cạnh tranh vị trí hoạt
động của PEP. Sự ức chế các tổng hợp acid shikimic, tiền chất để tổng hợp các loại amino
acids thơm như trypsine, tryptophane và phenylalanine, sẽ gây chết đối với các loài thực
vật và vi khuẩn. Con đường sinh tổng hợp shikimate chỉ có mặt trong thực vật, vi khuẩn
và nấm; không có trong động vật, bởi vậy EPSPS là mục tiêu tác dụng của chất diệt cỏ và
các chất kháng khuẩn (Priestman & cs., 2005). Sử dụng glyphosate không ảnh hưởng tới
con người và môi trường, không gây độc hại đối với thảnh phần của đất và thường không
phát sinh các loại cỏ kháng thuốc.
Ở đa số các loài cây trồng và cỏ dại đều không có khả năng kháng với glyphosate.
Tính tự kháng với glyphosate chỉ tìm thấy khi nuôi cấy mô của một số loài thực vật. Tuy
nhiên, ở các trường hợp này không có giá trị sử dụng do tính kháng glyphosate hoặc là
không ổn định về mặt di truyền hoặc là không có tính di truyền.
EPSPS là enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp các acid amino thơm ở
thực vật và vi khuẩn. EPSPS đã được quan tâm rất nhiều khi các nhà khoa học phát hiện
nó bị ức chế bởi glyphosate vào những năm 1980 (Steinrucken and Amrhein, 1980;

Amrhein & cs., 1983). Trong tự nhiên có 2 dạng EPSPS với độ tương đồng về acid amino
khoảng 50%, bao gồm: dạng EPSPS I tồn tại ở thực vật và vi khuẩn, dạng này đã được đa
số công trình tập trung nghiên cứu cấu trúc và vị trí xúc tác của EPSPS. Dạng EPSPS II
chỉ có ở một số vi khuẩn, ví dụ A.tumefaciens sp. strain CP4 và Staphylococcus aureus.
Một số nghiên cứu cho thấy cấu trúc EPSPS I thay đổi sẽ làm giảm ái lực của
glyphosate. Điều này đã được chứng minh trong nghiên cứu cấu trúc và động học của
enzyme ở chủng đột biến E. coli G96A (Eschenburg & cs., 2002). Những nghiên cứu về
đột biến EPSPS kháng glyphosate không chỉ làm sáng tỏ cơ chế ức chế của glyphosate,
mà còn trở thành công cụ để tạo cây trồng kháng glyphosate.
Năm 1983, các nhà khoa học đã phát hiện gen mã hóa cho EPSPS từ chủng
A. tumefaciens CP4 có tính kháng glyphosate mức độ cao (Padgette & cs., 1996). Sử dụng
các kỹ thuật công nghệ sinh học trên cơ sở di truyền học, các cây trồng đã được chuyển
gen này. Các cây chuyển gen đều có chứa cả 2 dạng EPSPS: EPSPS từ chính bản thân cây
trồng sẽ chịu sự ức chế bởi glyphosate; EPSPS từ vi khuẩn CP4 biến nạp sẽ có tính kháng
lại glyphosate. Vì glyphosate không bám kết với EPSPS vi khuẩn nên EPSPS vi khuẩn
2
trong cây biến nạp tiếp tục sinh tổng hợp các aromatic amino acids, trong khi đó dạng
enzyme EPSPS của thực vật sẽ bị bất hoạt bởi sự ức chế của glyphosate. EPSPS từ A.
tumefaciens sp. strain CP4 đã tỏ ra và ứng dụng thảnh công trong các cây trồng chống
chịu glyphosate (Padgette & cs., 1996).
1.6.2. Thuốc trừ cỏ glufosinate
Glufosinate là thuốc diệt cỏ không chọn lọc, kiểm soát cỏ dại theo phương thức ức
chế enzyme sinh tổng hợp glutamine. Quá trình tổng hợp glutamine là sự kết hợp giữa
glutamate và ammonia để hình thành nên glutamine, ức chế hoạt động của enzyme này là
nguyên nhân làm tăng dàn hàm lượng ammonia trong các tế bào thực vật cũng như làm
cạn kiệt nguồn amino acid và ức chế quang hợp ở cây.
L-phosphinothricin ( L-PPT) (Bayer & cs., 1972) là thảnh phần thuốc diệt cỏ
bialaphos, là một dạng tri-peptide tự nhiên được tạo thành bởi ít nhất hai loài
Streptomyces hygroscopicus giống như sản phẩm ngoại bào. Glufosinate là tên của quá
trình tổng hợp hóa học của hỗn hợp hai chất triệt quang D, L phosphinothricin. Sau khi

tách chiết thuốc diệt cỏ bialaphos từ loài Streptomyces hygroscopicus, các nhà khoa học
đã tách chiết được hai gen ịpat và bar).
B. napus L. line HCN92 chứa gen pat, là loài thực vật chuyển gen đầu tiên kháng lại L-PPT
nhận được sự tán thảnh của chính phủ (CFIA, 1995b). Ke từ sau đó có nhiều loài thực vật
chuyển gen kháng lại L-PPT bao gồm ngô, rau diếp và củ cải đường cũng đã được thương
mại hóa.
1.7.Các gen sử dụng trong tạo cây trồng chống chịu thuốc trừ cỏ
Các loại thuốc trừ cỏ phổ rộng được sử dụng phổ biến hiện nay là glyphosate (ức chế
EPSPS synthase), glufosinate ammonium (ức chế glutamine synthetase), nhóm
imidazolinone và nhóm sulfonyurea (ức chế acetolactate synthase -ALS). Bên cạnh đó
bromoxynil (ức chế quang hợp do đình chỉ sự vận chuyển điện tử trong hệ thống quang
hóa II) là thuốc trừ cỏ chọn lọc cũng được sử dụng rộng rãi nhằm điều khiển cỏ dại hai lá
mầm. Việc phát triển cây trồng kháng cỏ dại dựa vào 3 cơ chế sau:
- Tạo ra các enzyme không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ: tạo ra những thay đổi trong
enzyme là mục tiêu của thuốc trừ cỏ nhằm mục đích ngăn cản sự tác động của thuốc trừ
cỏ vào enzyme đó.
2