Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống phi điệp tím (dendrobium anosmun) phân bố tại vĩnh phúc bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
THÂN THỊ THÚY
“BƯỚC ĐẦU NGHIÊN cứu QUY TRÌNH NHÂN
NHANH GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM
(DENDROBIUM ANOSMUN) PHÂN BỐ TẠI VĨNH
PHÚC BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TỂ
BÀO”
KHÓA LUẬN TỔT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
HÀ NỘI - 2015
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn tói Th.s Phan Thị Thu Hiền và TS.
Nguyễn Như Toản - Giảng viên khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thày cô giáo Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho em học tập và nghiên cứu.
Qua đây em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã
động viên, giúp đỡ em trong thòi gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Ngày 5 tháng 4 năm 2015 Sinh viên thực tập
Thân Thị Thúy
Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên
cứu trong khóa luận “Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Phi điệp
tím (Dendrobium anosmum) phân bố tại Vĩnh Phúc bằng công nghệ nuôi cấy mô tế
bào ” là trung thực và chưa từng có ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả
LỜI CẢM ƠN
Thân Thị Thúy
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
4

2.4.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo yật liệu sạch bệnh bằng nuôi cấy
V
CÁC CHỮ VIẾT TẤT TRONG LUẬN VĂN
AS: Điều kiện ánh sáng
BAP: 6-Benzyl Aĩĩũno Purin
Cs: Cộng sự
CT: Công thức
ĐC: Đối chứng
IBA: 3 - Indol Butyric Acid
MS: Murashige và Skoog
NN: Nhân nhanh
TR: Tạo rễ
THT: Than hoạt tính
6
DANH MỤC CÁC BẢNG *
Bảng Tên bảng Trang
Bảng 3.1
Kêt quả nghiên cứu khử trùng của Ca(OCl
2
)2 đên tỷ lệ
sống của hạt lan Phi điệp tím (sau 10 ngày nuôi cấy).
21
Bảng 3.2
Anh hưởng của các chât điêu hòa sinh trưởng lên khả
năng nhân nhanh của lan Phi điệp tím.
22
Bảng 3.3
Anh hưởng của cường độ chiêu sáng tới sinh trưởng của
chồi
23

Bảng 3.4
Anh hưởng của nông độ IBA lên khả năng tạo rê của
cây lan Phi điệp tím.
24
Bảng 3.5
Anh hưởng của nông độ than hoạt tính đên hình thái rê
của lan Phi điệp tím (sau 30 ngày nuôi cấy)
25
Bảng 3.6 Kêt quả huân luyện và ra cây lan Phi điệp tím. 26
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1 Cây Phi điệp tím {Dendrobỉum anosmum) 6
2 Quy trình khử trùng quả và gieo hạt lan Phi điệp tím. 18
3
Hạt lan Phi điệp tím sau khi khử trùng và cấy vào môi
trường
20
4
Sinh trưởng của chôi Phi điệp tím ở các điêu kiện ánh
sáng khác nhau
23
5
Rễ lan Phi điệp tím trong các môi trường có nồng độ
chất kích thích khác nhau
25
6
Các giai đoạn phát triển của lan Phi điệp tím trong thí
nghiệm
28
MỞ ĐẦU

1. Lí do chon đề tài
•
Cây hoa Lan (Orchidaceae) là một giống cây cảnh được nhiều người ưa
chuộng, ngoài các giá tri làm cảnh và trang trí, hoa lan còn được sử dụng với
nhiều mục đích khác nhau như: dùng làm thực phẩm (giống Orchis), rau xanh
(giống Anoetochilus), ttà uống (loài Jumellea fragrans), hương liệu (Vannila
plannifolia) và đặc biệt lan còn được dùng làm dược liệu, có tác dụng chữa bệnh
như một số loài thuộc chi Orchis, Platanthera, Gymnadenda, Dactylorhiza và
đặc biệt là chi Hoàng thảo ịDendrobỉum nobile, Caulỉs Dendrobium,
Dendrobium loddgesii, Dendrobium chrysanthum, Dendrobium fimbriatum,
Dendrobỉum nobile Lỉndl) [3], [7], [9].
Hoàng Thảo là một trong những chi lớn nhất của của họ Lan
ịOrchỉdaceae). Theo A. Takhajan (1966), trên thế giới chi Hoàng thảo
(Dendrobium) có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo
thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia.
Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và
trên một số đảo ven biển [17]. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến
nay nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa. Để bảo tồn và phát triển các loài
lan quý hiếm, không còn cách nào khác là phải tiến hành nhân giống và nuôi
trồng chúng ở quy mô lớn [2].
Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) có hình thái đẹp, hương thơm đậm
mùi trầm, là một trong số các loại Hoàng Thảo được ưu chuộng hàng đầu. Giống
Phi điệp tím phân bố ngày càng hẹp do sự khai thác bừa bãi của con người, vì
vậy cần nhân nhanh lưu trữ nguồn gen, phục vụ thị hiếu người tiêu dùng.
Hiện nay, một số loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên đã
được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [22], ừên môi trường Vi MS sau
đó đến môi trường KC và vw [25], hoặc nhân nhanh in vitro với nguồn nguyên
liệu ban đầu là hạt gieo trên môi trường MS +15% đường saccarose + 2,0 mg/1
IBA [16]. Theo Lê Văn Hoàng [8], phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp
1

0
duy nhất có thể nhân giống lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá
thành hợp lý. Tuy nhiên, cho đến nay ở nước ta, nghiên cứu nhân giống và nuôi
trồng chi Hoàng thảo chủ yếu với các giống lan lai nhập nội nhằm sản xuất hoa
cắt cành hay trồng chậu làm cây cảnh. Việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy
mô loài Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) chưa được đề cập đến một cách
đầy đủ.
Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài “Bước đầu
nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Phi điệp tím (Dendrobỉum
anosmum)phân bố tại Vĩnh Phúc bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nhân nhanh thành công giống lan Phi điệp tím ịDendrobỉum anosmum)
bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro, góp phần bảo tồn nguồn gen, cung
cấp cây giống có chất lượng cao cho thị trường.
3. Ý nghĩa
Ỷ nghĩa khoa học
Đe tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về quy trình nhân nhanh giống
lan Phi điệp tím phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.
Ỷ nghĩa thực tiễn
Việc nhân nhanh bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro tạo ra những cây
sạch bệnh, chất lượng tốt, góp phần đáp ứng nhu càu của con người.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về chi Hoàng Thảo (Dendrobium) và cây lan Phi điệp
tím (Dendrobium anosmum)
1.1.1. Sơ lược về chi Hoàng Thảo
Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799,
Dendrobium được hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan Hoàng
Thảo. Lan Hoàng Thảo có nhiều màu sắc và hình thái khác nhau [1], [15]. Lan
Hoàng Thảo là chi lan phong phú nhất trong họ lan, có 1400 loài nguyên thủy
1

1
được phân chia thành 40 nhóm, phân bố ở các vùng nhiệt đới châu Á, tập trung
nhiều nhất ở Đông Nam Á và châu Á. Dendrobium không có kiểu hoa chung, mà
rất đa dạng. Chúng phân bố ở cả ba vùng khí hậu như: nóng, lạnh và trung gian
[4], [5], [13].
Các loài lan Hoàng Thảo có mặt ở tất cả các vùng sinh thái trong cả nước,
phân bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển
nước ta. Các đại diện của chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh ttên thân hoặc
các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm,
thường mọc ở độ cao 500 - 1500 m so với mực nước biển nhưng có khi gặp
chúng mọc ở độ cao 200 m hoặc tới 2000 m.
Rễ của chúng có lớp mô xốp màu ttắng ngà với nhiều công dụng: hút nước
và các muối khoáng bám trên bề mặt rễ, hấp thụ cả hơi nước trong không khí ẩm,
bám chặt vào các yật mà chúng tiếp xúc và làm một phần chức năng quang hợp
cho cây [15].
Phần của cây lan nhìn thấy được chỉ có lá, hoa và cuống, chúng được mọc
lên từ một đoạn phình to, giống như củ hành nên người ta thường gọi là giả hành.
Giả hành là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nước để nuôi cây [15].
Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung, mọc đơn độc hoặc
xếp dày đặc ở gốc hay xếp đều đặn trên thân, trên củ giả,
Cụm hoa chùm thường nhiều hoa, cụm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều
loài có cụm hoa đẹp có giá ttị làm cảnh [9]. Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên.
Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ. Hoa đa số các loài có hương thơm.
1.1.2. Sơ lược về loài Phỉ điệp tím
1.1.2.1. Vị trí phân loại
Theo phân loại học thực vật, cây Phi điệp tím thuộc:
Giói: Thực vật (Plantae)
Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheobionta)
Liên ngành: Thực vật có hạt (Spermatophyta)
Ngành: Hạt kín (Mangoliophyta)

1
2
Lớp: Một lá mầm (Monocotyledoneae)
Bộ: Măng tây (Asparagales)
Họ: Phong lan ịOrchìdaceac)
Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae)
Chi: Hoàng thảo (Dendrobium)
Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum).
1.1.2.2. Đặc điểm cây Phi điệp tím Xuất xứ từ nhiều nơi, mỗi nơi có một đặc
điểm thân lá hoa riêng nhưng đều có chung 1 kết cấu, thân cứng, lá mọc so
le, dày, có loại thân dài tói 1,2 m, có loại thân dài tối đa 0,5 m. Lá mọc đối
cách dài 8-12 cm, rộng từ 4 - 7 cm.
Hoa to tới 10 cm mọc từ 1 - 3 chiếc ở các đốt đã rụng lá, nở vào mùa
Xuân. Hoa có hai màu sắc chính: tím hồng và trắng, tuy nhiên có khá nhiều biến
dạng hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím; lưõi mở hình tim, phủ lông
mịn như nhung, có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mắt tím đậm, hương thơm
đậm mùi trầm, lâu tàn (3 - 4 tuần lễ). Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh
khỏe có thể ra tói 50 - 70 hoa.
Sau khi hoa tàn, những đốt gàn ừên ngọn hay gần gốc thường nảy sinh cây
con (keiki), vài tháng sau khi các cây con mọc rễ dài chừng 3-4 cm có thể tách
trồng riêng. Năm đàu cây này còn nhỏ và ngắn tàm 30 -40 cm, không ra hoa, ra
hoa vào năm sau. Dưới gốc khi đó có 3 - 4 mầm non, những mầm này mọc mạnh
và lớn hơn nhiều, có thể đạt tới 1 - 1,2 m nếu trồng đứng cách.
Ngoài ra có thể trồng cây này theo phương pháp truyền thống: cắt thân cây giả
thành từng đoạn 15 - 20 cm đặt lên khay có rong rêu hoặc mùn cưa ẩm ướt, vài
tháng sau cây con mọc từ các đốt.
1
3
Hình 1: Cây Phi điệp tím (Dendrobium anosmum)
A: Ngồng hoa Phi điệp tím; B: Quả lan Phi điệp tím.

1.2. Tình hình sản xuất hoa lan
1.2.1. Trong nước
Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp ttồng nhiều
loại hoa lan khác nhau. Hoa lan ttồng ttên giá thể nên có thể trồng ở những vùng
đất bạc màu, nhiễm mặn, đất chua,
Các giá thể trồng lan là mùn cưa, xơ dừa, rất dễ kiếm, và có tỉ suất lọi
nhuận khá cao. Nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao, hơn hẳn trồng cây
lương thực, rau màu. Theo số liệu thống kê của vụ kế hoạch thuộc Bộ Nông
nghiệp và Phát triển Nông thôn nếu trồng lan cắt cành Dendrobìum và Mokara
thì có thể thu lợi nhuận 500 triệu đến 1 tỷ/ha/năm (2006).
Vào dịp tết chậu lan có thể có giá 50-60 triệu đồng. Với lợi nhuận không
nhỏ từ nghề trồng lan, ngày nay nó đã trở thành một ngành công nghiệp của
nhiều nước và có xu hướng phát triển mạnh ừong tương lai trên thế giới và ở cả
Việt Nam.
1.2.2. Ngoài nước
Ở một số nước trên thế giới ngành trồng hoa cây cảnh nói chung và hoa
lan nói riêng là một ngành sản xuất công nghiệp đem lại hiệu quả kinh tế cao.
1
4
Hoa lan thực sự trở thành sản phẩm nông nghiệp có giá trị kinh tế cao, nó thúc
đẩy ngành sản xuất kinh doanh phát triển mạnh mẽ như ở các nước Thái Lan,
Singapore, Malaysia, Indonesia trong đó Thái Lan có kim ngạch xuất khẩu hoa
lan cắt cành năm 1987 là 21 triệu USD, năm 1990 là 26 triệu USD, năm 1991 là
30 triệu USD, Singapore thu lợi nhuận từ hoa cắt cành mỗi năm là 10 triệu USD.
1.3. Phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Nuôi cấy mô - tế bào là phương pháp sử dụng các điều kiện nhân tạo để
duy trì sự sống của tế bào trong ống nghiệm. Mục đích chung của nuôi cấy mô tế
bào là sử dụng các điều kiện như nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng,
để điều khiển quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo
mục tiêu, yêu cầu đặt ra.

1.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mò - tế bào thực vật
1.3.1.1. Nhân giong in vitro
Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại
nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, ừên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống
(Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành.
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành.
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus).
+ Nuôi cấy tế bào đơn.
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật sau khi đã
tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần.
Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí
nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm {ỉn vitro) để
1
5
phân biệt với các quá trình nuôi cấy ừong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm.
Khác với các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng ừong một thời gian ngắn
có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà
các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương
pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh
năm [11].
Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều
phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng
năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất

như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp [11].
1.3.1.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tể bào
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân
giống vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân
hoá và phản phân hoá.
> Tỉnh toàn năng của tế bào:
Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra giả thiết về tính toàn năng của tế bào thực
vật. Các mô đã phân hóa tách tò cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp
thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng phát triển thành tế bào mô
sẹo (callus). Đó là loại tế bào không phân hóa, phân chia liên tục và có khả năng
phân hóa thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh. Như vậy, mỗi tế bào bất kì lấy từ
cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn
chỉnh.
Nhưng phải đến năm 1922 tính toàn năng của tế bào mới được chứng
minh bằng thực nghiệm nhờ thí nghiệm nuôi cấy thành công đỉnh sinh trưởng
tách từ đầu rễ một cây hòa thảo của Kotte và Robbins. Sau đó 43 năm (1965)
Vasl và Haberlandt đã nuôi từng tế bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được
cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Kết quả này đã chứng minh toàn diện
tính toàn năng của tế bào.
1
6
> Tỉnh phân hoá và phản phân hoá của tế bào:
Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các
tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chức năng khác nhau.
Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các
chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết, ) nhưng chúng đều
có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình
thành các mô riêng biệt [8].
Tính phản phân hoá của tế bào là các tế bào khi đã được phân hoá thảnh
các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định

chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào.
Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân, thì giai
đoạn tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng
phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá,
thân. Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên
hoá được thể hiện theo sơ đồ sau:
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh « zz^ Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào
về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen,
tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được
hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương
trĩnh đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm ừong một cơ thể
hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và
trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên
chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là
cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào [12].
1.3.2. Ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy
1.3.2.1. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường
1
7
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy chiếm một vị trí quan trọng trong lịch
sử phát triển của nuôi cấy mô - tế bào. Đã có rất nhiều loại môi trường được
nghiên cứu phù họp cho việc nuôi cấy từng loài, từng bộ phận và tùy theo mục
đích nuôi cấy. Cho đến nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng đã được
xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm
các thành phần chính sau:
> Thành phần khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường nuôi cấy mô - tế bào thực
vật chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng, nhóm đa lượng và vi lượng

- Nhóm đa lượng: gồm các nguyên tố như nitơ, lưu huỳnh, photpho, magie,
canxi. Chúng đặc biệt càn thiết đối với quá trình sinh trưởng và trao đổi
chất của tế bào.
- Nhóm vi lượng: gồm các nguyên tố như sắt, mangan, bo, là nhóm
nguyên tố được sử dụng với nồng độ rất nhỏ nhưng lại không thể thiếu đối
với sự phát triển của mô - tế bào.
> Nguồn cacbon.
Phần lớn mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống theo phương thức dị
dưỡng vì vậy việc vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt
buộc. Nguồn cacbon thông dụng hiện nay là saccarose, nồng độ thích hợp là 2 -
3% song còn tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi. Ngoài ra còn có thể
sử dụng một số nguồn cacbon khác như glucose, maltose, fructose,
Các loại rượu như glycerin cũng được tế bào sử dụng. Manitol hoặc sobitol
còn có thể được sử dụng trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với
chức năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu.
> Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
- Auxin
Có 4 loại auxin thường được sử dụng là Indole acetic acid (IAA), Naphthyl
acetic acid (NAA), 2,4 - Dichlorphenoxy acetic acid (2,4 - D), Indole butyric
1
8
acid (IBA). Chúng chủ yếu có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào
nhưng cũng làm phân bào.
- Cytokinin
Là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenine. Cytokinin liên quan
chặt chẽ đến phân bào, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan, làm giảm hiện tượng
ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy. Các loại cytokinin
thường dùng trong môi trường nuôi cấy là kinetin, 6 - Benzyl amino purin
(BAP). Ngoài ra còn có zeacin nhung ít được sử dụng vì giá thành quá đắt.
> Chất độn - thạch (Agar)

Agar là thành phần quyết định ừạng thái vật lí của môi trường. Hàm lượng
agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1% theo khối lượng. Tuy nhiên còn
tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy mà sử dụng cho phù hợp.
> Nước
Nước là thành phàn quan ừọng ừong môi trường nuôi cấy. Nước pha môi
trường nuôi cấy thường là loại nước cất hai lần.
> Độ pH của môi trường
Độ pH của môi trường nuôi dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình
thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Độ pH môi trường
thường được điều chính từ 5,5 - 6,0 trước khi khử trùng. Nếu độ pH cao hơn 6,0
sẽ làm môi trường bị cứng, nếu thấp hơn 5,0 agar khó đông [19], [20].
1.3.2.2. Ảnh hưởng của các yểu tố vật lỉ
> Nhiệt độ
Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển của các loài là không
giống nhau. Tuy nhiên trong thực tế phòng thí nghiệm, nhiệt độ được duy trì từ
25 - 28°c [20].
> Ánh sáng
Có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy bao
gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng. Cường độ ánh sáng
thường được dùng trong nuôi cấy nhiều loại mô là từ 1000 - 2500 lux. Với
1
9
cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng lại thúc đẩy
quá trình tạo rễ. Sự thu nhận ánh sáng của chồi ỉn vitro phụ thuộc vào bước sóng
ánh sáng và chất lượng bình nuôi cấy [20].
1.4. Các thành tựu nuôi cấy mô ở cây Phong Lan
Phong lan là một ừong những loại cây trồng đạt thành công nhất trong
nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô ở mức độ công nghiệp. Trên
thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhân nhanh các giống lan nhằm
bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất. Điển hình như Kusumoto, Furukawa

[23], Kauth [22], Tawaro Supavadee et al. [25]. sử dụng kỹ thuật nuôi cấy nhân
giống đã tạo ra sự phát triển vượt bậc trong phát triển nghề trồng phong lan ở
quy mô lớn. Cho tới nay, hàu hết các loài phong lan đều được nhân nhanh bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào và đã thu được rất nhiều thành tựu. Từ năm
1960 trở lại đây kĩ thuật nuôi cấy mô đã đạt được những thành tựu như:
1960, Cooking tách được tế bào trần và từ đó trở đi nuôi cấy tế bào tách
rời đã có những bước phát triển đáng khích lệ.
1964, Guha và MaheíÀvari tạo được cây cà độc dược có bộ nhiễm sắc thể
đơn bội từ nuôi cấy bao phấn.
1967, Nitsch, 1968 Nakata và Tanaka tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy
bao phấn thuốc lá, mở ra triển vọng ứng dụng đơn bội vào công tác giống và
nghiên cứu di truyền.
1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá
1977, Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây.
1985, cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.
1994, giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virut biến nạp đưa vào
sản xuất đại trà ở Nauy.
Phong lan Việt Nam (Orchidaceae) có số lượng chi, loài ừong họ phong
lan ngày càng lớn và ừở thành một họ cây có giá trị tài nguyên và kinh tế bậc
nhất trong các họ cây rừng của hệ thảm thực vật nước ta. Trong những năm gần
đây, hầu như năm nào cũng xuất hiện các tên mới định danh cho phong lan Việt
2
0
Nam trên các tạp chí trong nước và quốc tế và trên website
www.hoalanvietnam.org, đó là những loài thuộc các nhóm : Hồ Điệp
(Phaleonopsis), lan Kiếm (Cymbidium), lan Vũ Nữ (Oncỉdỉum) và Hoàng Thảo
(.Dendrobium).
Việt Nam trong thời gian gần đây, đã có rất nhiều đề tài nhân
giống cây Phong lan, đặc biệt là các cây lan có giá trị về
đặc tính dược liệu, hay các loài có giá trị kinh tế cao như

đề tài của tác giả Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh [10],
Nguyễn Thị Mỹ Duyên [6]. Nhiều tác giả khác nhân nhanh in vitro
với nguồn nguyên liệu ban đầu là hạt gieo trên môi trường MS
+ 15% đường saccarose + 2,0 mg/1 BA [16].
Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Vật liệu thực vật
- Qủa của giống lan Phi điệp tím 7 tháng tuổi thu từ khu vực rừng đặc dụng
Tam Đảo, Vĩnh Phúc.
2.2. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng Thí nghiệm Di truyền học Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Khóa luận được tiến hành từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 5 năm 2015.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo vật liệu sạch bệnh bằng nuôi cấy
chồi hoặc quả lan.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân
nhanh, ra rễ của lan Phi điệp tím.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của cây: ánh
sáng, than hoạt tính,
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, động thái sinh trưởng, ra
lá của cây con lan Phi điệp tím.
2.4. Phương pháp tiến hành
2
1
2.4.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo vật liệu sạch bệnh bằng
nuôi cấy chồi hoặc quả lan
Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả khử trùng của dung dịch Ca(OCl
2
)2 đổi

với quả lan.
Bố trí 3 công thức, thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần
nhắc, mỗi lần nhắc 150 mẫu/công thức. Nền môi trường cấy mẫu MS + 20 g/1
saccarose + 7 g/1 agar.
Cách tiến hành: Khử trùng bằng cách rửa qua dưới vòi nước chảy —> rửa
trong nước xà phòng loãng —» dùng bông lau sạch bề ngoài —> rửa cho sạch xà
13
phòng —> lắc trong cồn 70° trong 1 phút (trong tủ cấy) —» rửa lại bằng nước
cất tiệt trùng (trong tủ cấy) —» lắc trong dung dịch Ca(OCỈ2)2 trong 10 phút —>
rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần —> cắt vỏ quả tách lấy hạt rồi đưa vào
nuôi cấy trên môi trường đã chuẩn bị sẵn: MS + 20 g/1 saccarose + 7 g/1 agar.
Bố trí thí nghiệm: bố trí 3 công thức:
CT1: Ca(OCl
2
)
2
20% CT2: Ca(OCl
2
)
2
50% CT3: Ca(OCl
2
)
2
100%
Sau khi cấy vào môi trường, theo dõi và xác định số mẫu sống, số mẫu
chết và mẫu nhiễm sau 10 ngày nuôi cấy.
2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng nhân
nhanh, tạo cây hoàn chỉnh in vitro đối với loài lan Phi điệp tím
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kỉnetin lên khả năng

nhân nhanh của chồi.
Sau khi vào mẫu thành công, chuyển mẫu sang các môi trường nhân
nhanh với nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau. Chất kích thích sinh
trưởng chúng tôi dùng là kinetin kết hợp với BAP (đều thuộc nhóm xytokinin
nhân tạo) để cho kết quả tốt nhất, ừong đó nồng độ BAP không đổi, kinetin thay
đổi. Bố trí 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức 150 chồi, 3 lần lặp lại.
NN1: 1 mg/1 BAP + 0,5 mg/1 kinetin NN3: 1 mg/1 BAP +1,5 mg/1 kinetin
NN2: 1 mg/1 BAP + 1 mg/1 kinetin NN4: 1 mg/1 BAP + 2 mg/1 kinetin
Sau 40 ngày nuôi cấy, ghi nhận số chồi mới tạo thành và tính hệ số nhân
nhanh của chồi ở các công thức thí nghiệm.
2
2
Các công thức thí nghiệm đều bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa và
30 g/1 saccarose.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiểu sáng lên sự sinh
trưởng của chồi.
Ánh sáng trong nuôi cấy mô thực vật là ánh sáng nhân tạo, cường độ ánh
sáng 1000 ~ 5000 lux, 16h chiếu sáng. Để chồi loài lan in vitro phát triển hoàn
chỉnh thì cần điều chỉnh cường độ ánh sáng thích hợp.
Trong 4 công thức với những dải cường độ ánh sáng khác nhau được bố trí
như sau:
AS1: NN2 ở điều kiện 800 luxAS3: NN2 ở điều kiện 1800 lux
AS2: NN2 ở điều kiện 1300 lux AS4:NN2 ở điều kiện 2300 lux.
NN2 là công thức tốt nhất ở thí nghiệm trước, được sử dụng tiếp cho thí
nghiệm sau, các công thức thí nghiệm đều bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước
dừa và 30 g/1 saccarose.
Theo dõi ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự sinh trưởng của chồi
dựa vào các chỉ tiêu:
- Chiều cao cây (cm): lấy trung bình chiều cao các chồi.
- Số lá (chiếc): trung bình của tổng số lá trên các chồi.

- Số rễ (chiếc): trung bình của tổng số rễ trên chồi.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo
rễ của cây lan Phi điệp tím.
IBA là một chất thuộc nhóm auxin nhân tạo, có ảnh hưởng đến khả năng
tạo rễ của chồi. Để tìm ra nồng độ IBA thích hợp nhất cho sự ra rễ của cây
chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm với 4 công thức:
TRI: 0,6 mg/1 IBA TR3: 1,2 mg/1 IBA
TR2: 0,9 mg/1 IBA TR4: 1,5 mg/1 IBA
Các công thức thí nghiệm đều bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa và
30 g/1 saccarose.
Theo dõi ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ của cây sau 20
ngày cấy qua các chỉ tiêu:
2
3
- Số lượng rễ trung bình ttên cây (chiếc).
- Chiều dài rễ trung bình trên cây (cm).
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến sự
ra rễ của chồi lan Phỉ điệp tím.
Nồng độ than có ảnh hưởng đến sự ra rễ của cây, tùy thuộc vào đặc điểm
của từng giống. Đe tìm ra nồng độ than hoạt tính tốt nhất, bố trí 5 công thức thí
nghiệm sau:
CTl : 0 g/1 than hạt tính CT4: 1,5 g/1 than hoạt tính
CT2: 0,5 g/1 than hoạt tính CT5: 2 g/1 than hoạt tính
CT3: 1 g/1 than hoạt tính
Nen môi trường là TR2, môi trường có nồng độ chất kích thích ra rễ tốt
nhất, các công thức thí nghiệm đều bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa và
30 g/1 saccarose.
Theo dõi sau 30 ngày nôi cấy theo các chỉ tiêu:
- Tỉ lệ tạo rễ (%).
- Số rễ trung bình của cây (chiếc).

- Chiều dài rễ trung bình (cm).
- Hình thái rễ.
2.4.3. Giai đoạn ra cây
Sau 4 tuần bình cây ra rễ đem ra khu huấn luyện, khoảng 10-15 ngày ra
ngôi đưa cây ra vườn ươm. Giá thể trồng lan rất quan trọng, liên quan đến suốt
quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Có nhiều loại giá thể khác nhau, để
đạt kết quả ra cây nuôi cấy mô tốt nhất chúng tôi tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng
của giá thể đến chất lượng cây con ngoài vườn ươm khảo sát số cây con sống sót
trên từng giá thể sau 4 tuần.
Các giá thể chúng tôi dùng nghiên cứu là: dớn, than, dừa miếng,
Theo dõi qua các chỉ tiêu:
- Chiều cao cây (cm)
- Số lá trang bình (chiếc)
- Độ dài lá (cm).
2
4
2.4.4. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng ứng dụng Data analysis, Microsoft Excel 2007.
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu
3.1. Ảnh hvởng của phvorag pháp khử trùng lên khả năng nảy mầm
của mẫu
Vào mẫu là một khâu quan trọng giúp chúng ta có được nguồn mẫu
sạch, là nguyên liệu cho mọi quá trình khác ttong quá trình nhân nhanh in
vỉtro. Với điều kiện thực tế cho phép, chứng tôi nghiên cứu phương pháp
khử trùng quả lan. Quá trình khử trùng quả lan được tóm tắt qua hình 2:
2
5
r ^
Hình 2: Quy trình khử trùng quả và gieo hạt lan Phỉ điệp tím.