Nhân nhanh giống mía c95 186 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro luận văn tốt nghiệp đại học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
KHOA SINH HỌC

ĐẶNG MINH HẰNG

NHÂN NHANH GIỐNG MÍA C95-186 BẰNG CƠNG NGHỆ
NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

VINH 2011


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đề tài này tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cơ giáo
Th.s Phạm Thị Như Quỳnh, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào đã hướng dẫn tận
tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu
và hồn thành đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp q báu của các
thầy cơ giáo trong bộ mơn sinh lí – sinh hố, sự tạo điều kiện ủng hộ của cán
bộ phịng thí nghiệm Ni cấy mơ – tế bào thực vật.
Cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi nhất trong quá trình thực hiện đề tài.
Lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học sẽ không tránh khỏi những
thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cơ và bạn bè để đề tài
nghiên cứu của tơi được hồn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

Vinh, tháng 5 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Đặng Minh Hằng

1


MỤC LỤC
Đặt vấn đề............................................................................................................3
Chương I. Tổng quan tài liệu............................................................................5
1.1. Công nghệ NCM-TB thực vật in vitro..........................................................5
1.1.1. Cơ sở khoa học của công nghệ NCM-TB thực vật in vitro.............5
1.1.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật..........................................6
1.1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro..........................................................13
1.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam.........................................................14
1.2.1. Trên thế giới...................................................................................14
1.2.2. Ở Việt Nam....................................................................................14
1.3. Tìm hiểu chung về cây mía.........................................................................17
1.3.1. Đặc điểm thực vật của cây mía......................................................17
1.3.2. Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía...................................................18
Chương II. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu.....................20
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu..............................................20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................20
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu.....................................................................20
2.1.3. Thời gian nghiên cứu....................................................................20
2.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................21
2.3.1. Bố trí thí nghiệm...........................................................................21
2.3.2. Điều kiện thí nghiệm......................................................................21
2.3.3. Vật liệu khởi đầu............................................................................21
2.3.4. Giai đoạn vào mẫu.........................................................................21

2.3.5. Giai đoạn nhân nhanh.....................................................................22
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................22

2


Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận...............................................23
3.1. Kết quả nghiên cứu giai đoạn vào mẫu.......................................................23
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lí hố chất khử trùng
HgCl2 0,1% đến tỉ lệ thành công của đỉnh sinh trưởng.......................................23
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lí hố chất khử trùng là
H2O2 10% đến tỉ lệ thành công của đỉnh sinh trưởng.........................................25
3.1.3. So sánh 2 thí nghiệm.....................................................................27
3.2. Kết quả nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh..................................................28
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến hệ số nhân nhanh và sự sinh
trưởng phát triển của chồi mía in vitro giống mía C95-186....................................28
3.2.2. So sánh kết quả nghiên cứu với một nghiên cứu khác...................32
3.3. Một số lưu ý trong quá trình nhân giống mía bằng kỹ thuật ni cấy mơ
in vitro (giai đoạn vào mẫu và nhân nhanh).......................................................36
3.3.1. Giai đoạn vào mẫu.........................................................................36
3.3.2. Giai đoạn nhân nhanh.....................................................................36
Kết luận và đề nghị...........................................................................................37
A. Kết luận..............................................................................................37
B. Đề nghị................................................................................................37
Tài liệu tham khảo............................................................................................38

3


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHỐ LUẬN

NCM – TB

:

Ni cấy mô – tế bào

BAP

:

6- benzylamino purin

IAA

:

Indolylacetic

α-NAA

:

Naphthylacetic axit

KI

:

Kinetin

MS

:

(Môi trường) Marashige & Skoog 1962

ppm

:

part per millimon (phần triệu)

mM

:

millimol

mg

:

milligam

in vitro

:

(điều kiện) nuôi cấy nhân tạo

CT

:

Công thức

Chất ĐTST

:

Chất điều tiết sinh trưởng

4


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây mía (Saccharum officinarum L) thuộc ngành thực vật có hạt
(Spermatophyta), lớp một lá mầm (Monocotyledneae), họ hồ thảo
(Gramineae), chi Saccharum, là cây cơng nghiệp có nhiều giá trị, chủ yếu để
cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến đường. Đường là loại
thực phẩm cần thiết cho đời sống, cung cấp năng lượng lớn cho con người.
Đường cịn là ngun liệu cho nhiều ngành cơng nghiệp thực phẩm như: sản
xuất bánh kẹo, đồ hộp, giải khát... và trong các ngành y dược, hoá học.
Ở nước ta cây mía là nguồn nguyên liệu duy nhất để chế biến đường và
nó được coi là một trong những cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây trồng
của vùng đồi, vùng trung du và miền núi
Trong những năm gần đây ngành sản xuất mía đường gặp nhiều khó
khăn trong việc tìm nguồn giống mía có năng suất và chất lượng cao, nhiều
giống đã bị thoái hoá, năng suất chất lượng thấp, mức độ dịch hại nhiều, đặc

biệt xảy ra trên các giống chủ yếu nhân giống bằng hom lưu gốc nhiều năm.
Trong khi đó, các nhà máy chế biến đường vẫn thiếu một nguồn cung cấp
nguyên liệu mía ổn định và đảm bảo về mặt giá cả và chất lượng.
Từ thực tế này, vấn đề đặt ra là cần có một hệ thống hoàn chỉnh và liên
tục để nhân giống, lưu trữ, phục tráng giống và nhân nhanh giống mới, đảm
bảo hiệu quả, an toàn, đáp ứng yêu cầu sản xuất.
Nuôi cấy mô tế bào in vitro là một công nghệ hiện đại cho phép sản
xuất những cây giống sạch bệnh với quy mô lớn, cung cấp cây giống với số
lượng lớn cho sản xuất trong thời gian ngắn nhất, cây con giống hệt bố mẹ về
các đặc tính di truyền, hệ số nhân cao, độ đồng đều lớn, thể hiện tính ưu việt
so với các phương pháp nhân giống truyền thống khác.
Xuất phát từ những vấn đề trên, để tìm hiểu và nghiên cứu sâu hơn về
kỹ thuật ni cấy mô tế bào in vitro, đặc biệt là nghiên cứu việc nhân nhanh
giống mía bằng cơng nghệ in vitro góp phần cung cấp dữ liệu hồn thiện cơng
nghệ nhân nhanh giống mía C95-186 để có được nguồn giống tốt, đảm bảo cả
về số lượng và chất lượng cho người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Nhân nhanh giống mía C95-168 bằng cơng nghệ ni cấy mơ tế bào
thực vật in vitro”.
5


CHƯƠNG I: TỞNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơng nghệ NCM-TB thực vật in vitro
1.1.1. Cơ sở khoa học của công nghệ NCM-TB thực vật in vitro
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung và kĩ thuật nhân giống
vơ tính in vitro nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính tồn năng, sự
phân hố và phản phân hố của tế bào [8].
1.1.1.1. Tính tồn năng của tế bào
Theo Haberland (1902) mỡi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật
đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hồn chỉnh

[8].
Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỡi một tế bào đã chun hố
đều chứa một lượng thơng tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng
thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất
định một tế bào bất kì đều có thể phát triển thành một cơ thể hồn chỉnh. Đặc
tính đó của tế bào gọi là tính tồn năng của tế bào [8].
Quá trình phát sinh hình thái trong NCM-TB thực chất là kết quả của
sự phân hoá và phản phân hoá [13].
1.1.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác
nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào. Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn
từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử).
Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh
chưa mang chức năng riêng biệt. Sau đó, các tế bào phơi sinh này tiếp tục
được biến đổi thành các tế bào chun hố đặc hiệu cho các mơ, cơ quan khác
nhau. Đó là sự phân hố.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hố thành các tế bào có chức năng
chun biệt, chúng khơng hồn tồn mất khả năng biến đổi của mình. Trong
điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia
mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là q trình phản phân hố tế bào[8], [12].
Phân hố tế bào
Tế bào phơi sinh

Tế bào chun hoá [8].
Phản phân hoá
6


1.1.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Là nhân tố quan trọng quyết định sự thành công của q trình ni cấy.

Hầu hết các mơi trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng để nuôi cấy mô và
tế bào thực vật đều bao gồm các thành phần sau:
+ Các nguyên tố muối khoáng
- Nguyên tố đa lượng
- Nguyên tố vi lượng
+ Nguồn cacbon hữu cơ
+Vitamin
+ Chất điều tiết sinh trưởng
+ Nhóm chất tự nhiên.
+ Chất làm đơng mơi trường (Agar) và một số các chất khác.
a, Các loại muối khoáng
a1 . Các nguyên tố đa lượng
Các nguyên tố đa lượng bao gồm: Fe, N, P, K, S, Mg, Ca... Chúng có
chức năng chính là tham gia vào thành phần cấu trúc của tế bào. Nồng độ của
các nguyên tố trong môi trường trên 30 ppm (tức 30 mg/l).
- Nitơ (N): Tồn tại ở 2 dạng NO3- và NH4+, chúng được sử dụng riêng rẽ
hoặc phối hợp với nhau tuỳ từng loại cây và giai đoạn phát triển.
- Lưu huỳnh (S): Nguyên tố này được cây hấp thu tốt nhất dưới dạng SO42-.
- Photpho (P): Photpho thường được đưa vào môi trường nuôi cấy ở
dạng muối phosphat và hai loại hợp chất hay dùng nhất là NaH 2PO4, KH2PO4,
ngoài ra khi photpho ở dạng H2PO4- cịn có tác dụng như một hệ đệm, làm ổn
định pH của môi trường trong q trình ni cấy.
- Magiê (Mg): Được cung cấp cho cây đưới dạng MgSO 4.7H2O, nồng
độ 0,5-3 mM.
- Canxi (Ca): Được cung cấp cho cây dưới dạng Ca(NO 3)2.4H2O, CaCl2
.6H2O, CaCl2.2H2O nồng độ 1- 3,5 mM.
- Sắt (Fe): Thiếu Fe, tế bào mất đi khả năng phân chia và Fe được sử
dụng tốt nhất dưới dạng phức chất: [FeCl 2.FeCl3.6H2O], FeSO4.7H2O,
Fe2(SO4)3...
a2. Các nguyên tố vi lượng

7


Các nguyên tố vi lượng bao gồm: Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co... đó là những
nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm [2].
- Mangan (Mn): Thường được cây sử dụng dưới dạng MnSO 4.4H2O.
Thiếu Mn làm cho quá trình phân bào bị ức chế.
- Bo (B): Thường được cây sử dụng dưới dạng H 3BO3. Nếu thiếu B
trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin. Mơ ni cấy có biểu hiện
thành mơ sẹo hố mạnh, nhưng thường là loại mơ xốp, mọng nước, kém tái
sinh.
- Molypden (Mo): Mo có tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm
trong tế bào thực vật.
- Đồng (Cu): Được cây hấp thu dưới dạng CuSO 4, với nồng độ rất bé
0,04 – 0,08 mM [2].
b. Nguồn Cacbon (C)
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng, cũng có thể sống bán dị dưỡng nhờ vào khả năng quang hợp
trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, nhưng rất yếu không đủ nguồn cacbon hữu
cơ cho sự sinh trưởng phát triển của cây. Vì vậy trong mơi trường ni cấy
cần được bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và thường dùng saccarosa với liều
lượng thích hợp là 2 – 3%. Trong một số trường hợp đặc biệt như nuôi cấy
bao phấn lúa, ni cấy tế bào trần,... có thể dùng glucoza, mantoza, galactoza
[2], [6].
c. Các vitamin
Vitamin là các hợp chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc của enzim và các
cofacto của nhiều phản ứng sinh hoá. Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực
vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưng
thường khơng đủ về lượng do đó cần phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào,
nhất là các vitamin thuộc nhóm B (Vitamin B 1, vitamin B2, vitamin B6, myo

inositol, biotin, pantothenic axit)
Các vitamin thường được pha trong hỡn hợp dung dich mẹ có nồng độ
cao gấp 500 hoặc 1000 lần dung dịch làm việc [2], [11].
Một số vitamin thường dùng trong môi trường nuôi cấy [11]

8


Tên vitamin
Myo-Inositol

Nồng độ sử dụng (mg/l)
100

Axit nicotinic (niaxin)

0,5-1

Pyridoxine HCl (vitamin B6)

0,05-0,5

Thiamine HCl (B1)

10-50

Pandothenat canxi

1-5

Riboflavin (B2)

1-5

Biotin

0,1-1

Axit folic

0,1-1

d. Các chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều tiết sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi
trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, có vai trị quyết định q trình phát
triển hình thái của cây.
Một số chất điều tiết sinh trưởng thường dùng [11]
Tên chất sinh trưởng

Nồng độ sử dụng (mg/l)

2,4D [dichlorrophennoxy]

0,2-5

α-NAA [naphtylaxetic axit]

0,1-5

β-IAA [indol axetic axit]

0,1-5

IBA [indol butyric axit]

0,1-2

Kinetin [6 finfuryl amino purine]

0,1-2

BA [6-BAP][6benzy 1 amino purine]

0,1-2

2-IP[N6γ-γDimetylally1amino purine]

0,1-2

GA3 [Gibberelic axit]

0,1-2

Các chất đó thuộc các nhóm sau:
+ Auxin

9


Là một loại hoocmon thực vật (phytohormon), tăng cường các q trình

tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ. Có 4 loại auxin thường
được sử dụng trong NCM-TB là:
- Indolylacetic (IAA)
- Naphthylacetic axit(α-NAA)
- 2,4- Dichlorphenoxyaxetic axit (2,4-D)
- Indolbutyric axit (IBA)
Hàm lượng của các chất này từ 0,1 - 2,0 ppm. Tuỳ theo loại, hàm lượng
sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích
sinh trưởng của mơ, hoạt hố sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia
mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mơ sẹo [2].
+ Xytokinin
Các hợp chất xytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và
sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961).
Các loại xytokinin thường được dùng trong nuôi cấy bao gồm:
- Kinetin (6- furfurylamio purine)
- Zeatin (6-[4 hydroxy-3-metyl-but-2- enylamino] purine)
- BAP (6- benzylamino purin)
- 2-ip (Isopentenyl adenine)
Trong nhóm này, Kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả.
+ Axit Gibberellic
GA3 được phát hiện vào những năm 1930. Loại gibberellic acid thông
dụng nhất trong nuôi cấy mơ thực vật là GA3.
GA3 là axit đóng vai trị quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý của
thực vật như: sinh lí ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lí phát triển của hoa, làm
tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật. Nhưng trong NCM-TB thực vật tác
dụng của GA3 chưa thật sự rõ ràng [2], [6].
+ Axit abscisic (ABA)
ABA thuộc nhóm chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ
của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng.
ABA thuộc nhóm chất ức chế sinh trưởng. ABA có tác dụng tăng khả

năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Vì
10


vậy nó được đưa vào mơi trường ni cấy và mang lại hiệu quả nhất định [ 2],
[6].
e. Các hỗn hợp chất tự nhiên
Một số hợp chất được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng như:
+ Nước dừa: Là hợp chất thường được sử dụng nhiều hơn cả. Chất có
hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-inositol (minositol) và một số axit amin khác. Lượng nước dừa dùng trong môi trường
nuôi cấy thường khá lớn chiếm 10 - 20% thể tích mơi trường [2], [11].
Từ năm 1941 nước dừa được sử dụng để nuôi phôi của Datura và 1949
ni mơ của Daucus. Kết quả phân tích thành phần của nước dừa từ non đến
già của Tulecke và CTV (1961) cho thấy trong nước dừa có:
-Amino axit tự do: Đạt nồng độ từ 190,5 ppm đến 685 ppm trong
nước dừa tuỳ theo tuổi của quá trình từ non đến già. Khi hấp ở nhiệt độ cao
chỉ còn khoảng 70 ppm.
- Amino axit dạng liên kết có trong protêin và peptit
- Axit hữu cơ
- Đường
- AND và ARN
- Myo Inosidol
- Các hợp chất có hoạt tính auxin
- Các xytokinin dạng glucoside [2].
+ Dịch chiết nấm men: Với dịch chiết nấm men, White (1934) lần đầu
tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn. Thành
phần hố học của dịch chiết nấm men ít được chú ý phân tích, chủ yếu chứa:
đường, axit nuclêic, amino axit, vitamin, auxin, khoáng. Tác dụng của dịch
chiết nấm men rất tốt với rễ [2].
+ Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha): Thành phần hố học chưa được

phân tích kĩ, chủ yếu chứa một số đường, vitamin và một số chất có hoạt tính
điều khiển sinh trưởng [2].
+ Dịch chiết một số loại rau, quả tươi (khoai tây, chuối, cà rốt...): Với
thành phần có đường, axit nuclêic, vitamin, axit amin, khoáng…[2].

11


+ Dịch thuỷ phân casein: Được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật vi sinh
vật, ở NCM-TB thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung axit amin.
+ Hỗn hợp axit amin nhân tạo: Kết quả sử dụng các hỡn hợp này cịn
rất khác nhau. Có thể u cầu axit amin của các loại tế bào rất khác nhau.
Trong môi trường lỏng để nuôi mô sẹo lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ
mô sẹo prolin là một thành phần quan trọng [2].
f. Chất làm đông môi trường (Agar) và các thành phần khác
+ Chất độn - thạch (Agar)
Agar là một trong những chất để làm đông môi trường phổ biến nhất (tạo
gel), được sử dụng làm chất đệm cho môi trường dinh dưỡng rắn lại. Ở 80 0C,
thạch ngậm nước chuyển thành dạng sol và ở 400C trở về trạng thái gel. Khả
năng ngậm nước của thạch là 6 – 12 g/l nước [2].
Agar là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu tảo hồng- Rodophyta). Tuy
ở trạng thái gel nhưng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng. Vì
vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây trong nuôi cấy mô [8].
+ Nước pha môi trường
Nước pha môi trường nuôi cấy phải là nước hồn tồn sạch ion. Thơng
thường người ta sử dụng nước cất hai lần [2].
+ Than hoạt tính
Được dùng để hấp thu các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm
trao đổi thứ cấp... Làm thay đổi môi trường ánh sáng, do mơi trường trở nên
sẫm khi có than hạt tính, có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ

[2].
+ Độ pH của môi trường
Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các
môi trường nuôi cấy pH 5,0 – 6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu.
Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm
khả năng đông đặc của Agar.
Đối với nuôi cấy mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 6,0, sau 4 tuần nuôi cấy đạt được 6,0 - 6,5
g. Môi trường nuôi cấy

12


Môi trường được sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật rất phong
phú, nhưng sử dụng phổ biến hơn cả là môi trường MS (Murashige - Skoog,
1962).
Thành phần môi trường MS gồm:
Thành phần

Đa lượng

Vi lượng

Vitamin

Các chất hữu cơ
Chất ĐTST

Hoá chất

Nồng độ (mg/l)

NH4NO3

1.650

KNO3

1.900

CaCl2.2H2O

440

KH2PO4
Na2EDTA.2H2O

370
37,26

FeSO4.7H2O

27,8

MnSO4

16,9

ZnSO4.7H2O

8,6

H3PO3

6,2

KI

0,83

Na2MoO4.2H2O

0.25

CuSO4.5H2O

0,025

CaCl2.6H2O
Glyxine

0,025
2

Myo-inositol

100

Nicotinic acid

0,5

Pyridocine

0,5

Thiamine
Saccarose

0,1
30

Agar
Cytokinin

6-8
0,1-10

Auxin

0,1-5

1.1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro
Về cơ bản quy trình nhân giống được chia thành 4 giai đoạn [13].
a. Giai đoạn 1: Giai đoạn vào mẫu
Đây là giai đoạn khó khăn nhất có ý nghĩa quyết định tới tồn bộ quy
trình nhân giống. Giai đoạn này phải đảm bảo được các yêu cầu sau:
13


- Tỷ lệ chết thấp.

- Tỷ lệ sống cao.
- Mô cấy sinh trưởng và phát triển tốt.
Một số hoá chất thường dùng HgCl2, CaOCl2, NaOCl, H2O2... Tuỳ thuộc vào
từng mô thực vật mà lựa chọn nồng độ, thời gian xử lý và hố chất thích hợp [13].
b. Giai đoạn 2: Giai đoạn nhân nhanh
Giai đoạn nhân nhanh được xem là giai đoạn then chốt của cả quá trình
nhân giống in vitro vì mục đích của giai đoạn này là nhằm tạo ra hệ số nhân
chồi in vitro cao nhất. Để tăng hệ số nhân chồi, phải đưa thêm vào môi trường
dinh dưỡng các chất điều tiết sinh trưởng: Auxin, Xytokinin, Gibberelin,…
các hợp chất tự nhiên kết hợp với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Giai
đoạn này kéo dài trong khoảng 4 – 8 tuần [13].
c. Giai đoạn 3: Giai đoạn ra rễ tạo cây hồn chỉnh
Mơi trường ni cấy thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin vì đây là
nhóm hormon thực vật có vai trị sinh lý là tạo rễ bất định cho mơ ni cấy,
trong đó IAA, IBA, α-NAA, 2,4 D được sử dụng nhiều nhất. Giai đoạn này
thường kéo dài 2 – 8 tuần [13].
d. Giai đoạn 4: Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro, nó quyết
định khả năng ứng dụng của q trình này vào thực tiễn sản xuất. Thời gian
tối thiểu cho sự thích nghi đó là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây cần được
chăm sóc, bảo vệ cẩn thận trước những bất lợi như mất nước, nhiễm nấm, vi
khuẩn,… Giai đoạn này cần có giá thể chăm sóc phù hợp.
Phải giữ ẩm cho cây, khi đưa ra ngoài vườn ươm cần phải che chắn để
giữ ẩm và tránh ánh sáng quá mạnh. Giai đoạn này cần đảm bảo độ ẩm đất từ
76 – 80% và độ ẩm không khí đạt 82 – 85% [13].
1.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng cơng nghệ ni cấy mơ tế
bào thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Năm 1952 lần đầu tiên tại Pháp, Morel và Martin đã tạo ra được cây
hoa cúc sạch bệnh virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ năm 1958 – 1960,

14


một bộ sưu tập các cây được làm sạch bệnh đã được xây dựng nhờ kĩ thuật
nhân giống in vitro. Từ đây người ta bắt đầu nhận thức được lợi ích của
phương pháp này trong nhân nhanh và kinh tế các giống, mà phương pháp tự
nhiên không đáp ứng được. Từ năm 1963, kĩ thuật nhân giống in vitro đã phát
triển rất nhanh trên thế giới, đặc biệt ở các nước phát triển [15].
Phương pháp nuôi cấy in vitro đã được áp dụng ở nhiều quốc gia như
Ấn Độ, Cu Ba, Trung Quốc, Đài Loan... Tại Cu Ba hệ thống sản xuất và cung
cấp mía giống được hình thành nhằm mục tiêu hình thành dịch vụ giống và
hom giống có độ thuần và chất lượng cao, sạch sâu bệnh để bảo quản tốt tính
di truyền và tăng cường thời gian khai thác giống thương phẩm. Trong đó
phương pháp ni cấy mơ đóng vai trị then chốt trong việc nhân nhanh giống
cơ bản đạt tiêu chuẩn [4].
Tại Trung Quốc nhân giống mía bằng phương pháp này đã được triển
khai ở một số vùng trồng mía. Chỉ trong vịng 4 năm, giống Quế Đường 11 đã
phủ kín hơn 32.000 ha, trong khi đó bằng phương pháp nhân truyền thống
phải mất hơn 10 năm mới có được diện tích tương tự [4].
Heinz, 1977 ở Hawaii và sau đó các nhà khoa học Đài Loan, Pháp,
Cuba, Argenetina, đã thành công trong việc tái sinh mía từ callus, từ ni cấy
túi phấn đã tạo được cây đơn bội có năng suất cao hơn trong điều kiện tự
nhiên so với cây bố mẹ, hoặc phương pháp chọn dòng soma cho phép phân
lập được các dòng kháng bệnh [7].
Phương pháp nhân giống và nhân dịng vơ tính đặc biệt có ý nghĩa đối
với các cây trồng nhiệt đới vì chúng có độ dị hợp tử cao. Hầu hết đều có thể
đưa vào nhân giống vơ tính in vitro với mục tiêu thương mại hố trên quy mơ
lớn (theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987) [7].
1.2.2. Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các ngành khoa học nói chung và cơng nghệ NCM-TB nói
riêng đang tiến triển chậm hơn so với thế giới rất nhiều. Việc ứng dụng những
thành tựu của phương pháp nhân giống in vitro còn là một lĩnh vực khá mới
mẻ, nhưng giàu tiềm năng phát triển. Tuy nhiên, trong những năm gần đây
chúng ta cũng đã đạt được những thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân
15


nhanh các loại cây như: cà phê, cỏ ngọt, chuối (Trung tâm CNSH), dứa (Viện
nghiên cứu dầu và cây có dầu, Viện khoa học Việt Nam), mía đường (Trung
tâm CNSH, Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, Trung tâm sinh học và cây
thực nghiệm)… và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao [3].
Phương pháp nuôi cấy in vitro trên cây mía đã được thử nghiệm ở
nhiều nơi như Viện Sinh Học Nhiệt Đới Việt Nam, Viện Khoa học Nông
Nghiệp Việt Nam, Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt Nam,… Tại Viện khoa
học và cơng nghệ Việt Nam đã thí nghiệm và nhân giống vơ tính nhiều giống
cây trồng như: mía, ngơ, dứa, lúa, thuốc lá… có khả năng chống chịu để phục
vụ cho việc trồng trọt ở địa bàn miền Bắc [7].
Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng nhiều hơn trong việc nhân
giống và chọn tạo giống cây trồng nơng nghiệp. Đối với mía, phương pháp
này có thể dùng bổ trợ cho phương pháp lai hữu tính để giữ một số đặc tính di
truyền tốt của bố mẹ mà chúng khơng có khả năng kết hợp trong tổ hợp lai
[5].
Tuy việc nghiên cứu sử dụng phương pháp ni cấy mơ đối với cây
mía đã được tiến hành từ những năm 1970 nhưng cho đến nay thì ni cấy mơ
cây mía vẫn cịn là một vấn đề mới mà các nhà chọn tạo giống đang rất quan
tâm nghiên cứu [5].
Chi Thị Tứ, Mai Văn Quắc, Hồ Hữu Nhị (1994) đã nghiên cứu sử dụng
kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào để nhân nhanh một số giống mía ở Việt Nam như:
CP5243, VN 72234, Việt đường và giống ROC 10. Kết quả nghiên cứu thu

được là: ở giai đoạn vào mẫu, lá non của cây mía được sử dụng làm vật liệu
tạo cụm chồi, xử lí thích hợp nhất với hoá chất HgCl 2 0,1% trong 5 phút; Ở
giai đoạn nhân nhanh tạo cụm chồi kết quả thu được là: đối với 2 giống mía
CP5243 và VN 72234 thì nồng độ BA thích hợp nhất cho sự phát sinh cụm
chồi là 0,1 mg/l môi trường. Đối với hai giống mía ROC 10 và Việt đường thì
nồng độ BA thích hợp nhất cho sự phát sinh cụm chồi là 0,3 mg/l môi trường
[10].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Uyển và cộng sự tại Trung Tâm
Công Nghệ Sinh Học đã cho thấy đối với ni cấy mơ cây mía thì bộ phận

16


mơ ni cấy thích hợp nhất cho việc tạo callus và tái sinh cây hồn chỉnh là
các lá non cịn đang bọc trong bẹ và đòng hoa non của cây [11].
Năm 2003, Thân Thị Thu Hạnh và Lưu Thị Duyên đã nghiên cứu kĩ
thuật nhân nhanh giống mía VN84-422 và VN85-1427 bằng phương pháp in
vitro, sử dụng nguyên liệu nuôi cấy là mắt mầm. Kết quả nghiên cứu thu được
là: ở giai đoạn nhân nhanh chồi đối với 2 giống mía VN84-422 và VN851427 thì nồng độ 0,5 mg/l kinetin + 1,5 – 2 mg/l BAP thích hợp nhất và hệ số
nhân nhanh đạt 2,8 lần sau 3 – 4 tuần. Ở giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
nồng độ 2 – 4 mg/l α-NAA là thích hợp nhất [4].
Nguyễn Thị Nhẫn (2005) nghiên cứu kĩ thuật nhân nhanh các giống
mía Quế Đường 15 và F134 bằng phương pháp in vitro. Kết quả nghiên cứu
thu được: Ở giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu in vitro đối với mô cấy là đỉnh
sinh trưởng và các mắt ngủ trên thân cây việc khử trùng bằng Hypocloric
canxi 5% trong 15 phút là phù hợp; Ở giai đoạn nhân nhanh in vitro môi
trường phù hợp là: MS + 0,5 ppm α-NAA + 1 ppm BA. Ở giai đoạn ra rễ tạo
cây hoàn chỉnh mơi trường thích hợp là: MS + 0,5 ppm α-NAA (hoặc 7,5%
Saccaroza) [8].
Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện KHKTNN, Viện Rau Quả Trung

Ương, Trung Tâm nghiên cứu ứng dụng KH và CN Hải Phịng, Sở KHCN Nam
Định, cơng ty giống cây trồng Trung Ương I, Viện Sinh học Đà Lạt,… mỗi năm
sản xuất hàng triệu cây giống in vitro, củ giống in vitro của các loại cây hoa, cây
khoai tây, cây mía,… Tại Đà Lạt từ nhiều năm nay, rất nhiều phịng ni cấy mơ
của tư nhân ra đời, hoạt động rất có hiệu quả và mỡi năm đã cung cấp một số
lượng lớn cây giống in vitro cho vùng sản xuất tại Đà Lạt và các vùng phụ cận
[8].
1.3. Tìm hiểu chung về cây mía
1.3.1. Đặc điểm thực vật của cây mía
a- Rễ:
Rễ mía thuộc loại rễ chùm, gồm 2 loại rễ cây và rễ hom hay còn gọi là
rễ sơ cấp và rễ thứ cấp.

17


+ Rễ sơ cấp: Được mọc từ các đốt của hom giống, đường kính bé, phân
nhánh nhiều, có vai trị hút nước và dinh dưỡng cho cây ở thời kì đầu.
+ Rễ thứ cấp: Mọc từ gốc của mầm mới sinh ra của hom giống. Thường
cây con có từ 3 – 5 lá thật thì rễ thứ cấp xuất hiện. Rễ thứ cấp được chia thành
3 nhóm nhỏ là rễ mặt, rễ giữ và rễ ăn sâu.
So với những cây hồ thảo khác cây mía có bộ rễ phát triển rất mạnh,
một khóm có từ 500 – 2.000 rễ, tổng chiều dài có thể tới 100 – 500 m [1].
b- Thân:
- Gồm nhiều lóng và đốt hợp thành. Màu sắc thân và sự sắp xếp các
lóng trên thân là các chỉ tiêu để phân biệt giống.
- Số lượng thân hữu hiệu và khối lượng thân là 2 yếu tố quyết định năng
suất.
- Thân là đối tượng thu hoạch dùng làm nguyên liệu chế biến đường,
thường được làm giống cho vụ sau [1].

c- Lóng mía:
Nằm giữa 2 đốt mía, dài 10 – 18 cm. Màu sắc, hình dạng, kích thước là
các chỉ tiêu để phân biệt giống [1].
d- Đốt mía:
Cịn được gọi là “mấu” hay “mắt” là bộ phận nối liền giữa các lóng với
nhau trên thân. Gồm 4 bộ phận hợp thành: đai sinh trưởng, rễ, mầm và sẹo lá.
Trên biểu bì của lóng, đốt, thân có chứa nhiều chlorofin và xantofin. Hai chất
này hợp thành màu sắc cây mía.
Ví dụ: Xantofin nhiều cây mía có màu đỏ, chlorofin nhiều cây có màu
xanh, cả 2 chất này đều nhiều thì vỏ có màu tím, ít thì vỏ có màu vàng [1].
e- Mầm mía:
Nằm trên đai rễ, thường mỡi đốt chỉ có 1 mầm, cá biệt có 2 hoặc nhiều
mầm. Là phôi cây ở thế hệ sau, từ đây sẽ mọc ra cây mía mới sau trồng [9].
f- Lá mía:

18


Mọc thành 2 hàng so le, đối nhau hoặc theo đường vịng trên thân mía
tuỳ giống, mỡi đốt có 1 lá. Lá mía gồm phiến lá, bẹ lá và cổ lá. Cổ lá là nơi
tiếp giáp giữa bẹ lá và phiến lá [9].
g- Hoa và quả:
Hoa mía được bao bọc bởi chiếc lá cuối cùng của bộ lá. Hoa mía lưỡng
tính có 3 nhị đực, 2 nhị cái và 2 bầu noãn. Khi nở các bao phấn của nhị đực
tung phấn, nhờ gió mà nhị cái tiếp nhận được hạt phấn.
Mía ra hoa trong điều kiện ngày dài từ 12 - 12,5 giờ, ánh sáng đầy đủ,
nhiệt độ tối thiểu là 280C.
Sau khi thụ phấn quả phát triển sau 25 – 30 ngày thì chín, khi chín hạt
chuyển từ màu vàng sang màu hạt dẻ [9].
1.3.2. Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía

Cây mía có khả năng thích ứng rộng, tận dụng tốt năng lượng ánh sáng
mặt trời. Cây mía có các yêu cầu cơ bản sau đây để cho năng suất, chất lượng
cao:
a- Nhiệt độ:
- Thời kỳ mía nảy mầm cần nhiệt độ trên 15 0C, nhiệt độ tối thích của
thời kì này là 26 – 300C.
- Thời kỳ mía đẻ nhánh: Đến 210C mía mới bắt đầu đẻ nhánh, từ 25 0C
trở lên mía bắt đầu đẻ nhánh nhanh và nhiều.
- Thời kỳ phát triển lóng cần nhiệt độ từ 25 – 34 0C. Đây là thời kì mía
cần nhiệt độ cao nhất và cũng là thời kì quan trọng nhất quyết định đến năng
suất cuối cùng.
- Thời kỳ tích luỹ đường cần nhiệt độ thấp và biên độ chênh lệch về
nhiệt độ khá lớn giữa ngày và đêm, nhiệt độ thích hợp từ 14 – 250C [9].
b- Ẩm độ đất:
- Thời kỳ mía nẩy mầm cần ẩm độ đất khoảng 65%.
- Thời kì đẻ nhánh cần ẩm độ từ 55 – 70%.
- Thời kỳ mía phát triển lóng vươn cao cần ẩm độ đất 60 - 80%.
- Thời kỳ mía chín cần ẩm độ đất từ 50 – 60% [9].
19