Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây lùng nghệ an bằng phương pháp vi nhân giống in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
------------------------

PHẠM THỊ HUYỀN

TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU
TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
------------------------

PHẠM THỊ HUYỀN

TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU
TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dấn khoa học
ThS. LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến ThS. La
Việt Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2,
Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và
hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nuôi cấy mô tế bào
thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí
nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề
tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân và bạn bè đã động viên, tạo
mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành
khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Huyền


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Tạo vật liệu khởi đầu và
bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in

vitro”: là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do ThS. La Việt Hồng hướng dẫn
và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác.

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Huyền


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP

6 - benzyl amino purin

CT

Công thức

ĐC

Đối chứng

Kn

Kinetin

H2O2

Hydro peroxide (nước oxy già)

HgCl2

Thủy ngân Clorua

MS

Murashige and Skoog, 1962


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các công thức tạo vật liệu khởi đầu

........................................ 23

Bảng 2.2. Công thức nghiên cứu tạo cụm chồi mẫu cành và đốt thân cây Lùng ..... 25

Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu giống cây Lùng ....................... 27
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân
chồi, số lá, chiều dài mẫu cành cây Lùng ...................................... 32
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân
chồi, số lá, chiều dài mẫu đốt thân cây Lùng................................. 35


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây Lùng (Bambusa sp.)

............................................................ 4

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tạo vật liệu in vitro ở cây Lùng ........................ 22
Hình 3.1. Sơ đồ thể hiện tỷ lệ mẫu sống của cây Lùng ................................. 28
Hình 3.2. Mẫu cành vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) ....30
Hình 3.3. Mẫu cành vô trùng sống phát sinh chồi ......................................... 30
Hình 3.4. Mẫu thân vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết)30
Hình 3.5. Mẫu thân vô trùng( mẫu sống) .................................................. 30
Hình 3.6. Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ cành có chứa mắt ngủ của
cây Lùng ..................................................................................... 31
Hình 3.7. Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân
nhanh
chồi mẫu cành cây Lùng ............................................................... 33
Hình 3.8. Mẫu cành sau 2 tuần nuôi cấy ....................................................... 34
Hình 3.9. Mẫu cành sau 3 tuần nuôi cấy ....................................................... 34
Hình 3.10. Mẫu cành sau 5 tuần nuôi cấy ..................................................... 34
Hình 3.11. Chồi mới tạo ra chết

................................................................ 34

Hình 3.12. Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân
nhanh
chồi mẫu đốt thân cây Lùng ....................................... 35
Hình 3.13. Mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy................................................ 37
Hình 3.14. Mẫu đốt thân sau 3 tuần nuôi cấy................................................ 37
Hình 3.15. Mẫu đốt thân sau 5 tuần nuôi cấy................................................ 37
Hình 3.16. Mẫu đốt thân sau 7 tuần nuôi cấy................................................ 37


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................. 2
2.1. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 2
2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 3
3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
NỘI DUNG ................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................. 4
1.1. Giới thiệu về cây Lùng (Bambusa sp.) ..................................................... 4
1.1.1. Phân loại............................................................................................... 4
1.1.2. Mô tả ................................................................................................... 4
1.1.3. Phân bố................................................................................................. 5
1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro .......................................................... 5
1.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào .......................................................... 5
1.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................. 5
1.2.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro ......................... 6
1.2.4. Các giai đoạn vi nhân giống (nhân giống in vitro) ................................ 8
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật .......... 10
1.3.1. Vật liệu nuôi cấy................................................................................. 10
1.3.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 10


1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy...................................................... 15
1.4. Các nghiên cứu vi nhân giống về họ tre trên thế giới và ở Việt Nam ..... 16
1.4.1. Vi nhân giống họ tre trên thế giới ....................................................... 16
1.4.2. Vi nhân giống họ tre ở Việt Nam ........................................................ 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP................................... 20
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................... 20
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 20
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 20
2.2.2. Trang thiết bị và dung cụ .................................................................... 20
2.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 21
2.4. Điều kiện nuôi cấy................................................................................. 21
2.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 22
2.5.1. Bố trí thí nghiệm................................................................................. 22
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu ................................... 22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 26
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu ................................................................................................ 26
3.2. Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo
cụm chồi và đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng ......................................... 32
3.2.1. Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo
cụm chồi từ cành ................................................................................................. 32
3.2.2 Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo
cụm chồi từ đốt than ................................................................................... 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 39
PHỤ LỤC.................................................................................................... 44


MỞ ĐẦU
2. Lý do chọn đề tài
Cây Lùng (Bambusa sp.) thuộc họ Tre – Bambusoideae là một loại cây
trồng quan trọng được quan tâm trong nhiều lĩnh vực nông nghiệp, lâm nghiệp
và công nghiệp tại Việt Nam và nhiều nước khác. Tại rừng Nghệ An có gần 20
loài tre trúc các loại, trong đó Lùng là loại có giá trị kinh tế đặc biệt nhất với
các tính năng ưu việt như: độ dẻo, màu sáng bóng, thớ mịn, lóng dài (dài nhất

trong các loài tre trúc của Việt Nam). Trong điều kiện đất tốt, mật độ thích
hợp, Lùng có thể cho lóng dài tới 1,5m, cho phép đan những vật dụng có kích
thước lớn, đảm bảo độ thẩm mỹ cao, hoặc sản xuất nhiều mặt hàng thủ công
mỹ nghệ xuất khẩu hiện đang rất được ưa chuộng 42.
Lùng có giới hạn bền khi nén dọc thớ và giới hạn bền khi kéo dọc thớ,
hơn hẳn nhiều loại gỗ. Chính vì vậy dùng Lùng làm cột chống, xà đỡ trong
xây dựng, giao thông vận tải, chèn hầm lò, sản xuất giấy là rất tốt. Mặt khác
với hình dáng đẹp, màu sáng bóng, long dài, độ bền cao Lùng được ưa
chuộng dùng làm nhà ở, cửa hàng,... Những ngôi nhà được làm từ Lùng rất
bền lại có vẻ đẹp trang nhã, thích hợp cho những khách sạn, nhà hàng, hay
những quán ăn,… hơn nữa nếu kết hợp toàn bộ đồ nội thất, mỹ nghệ cũng
được làm từ Lùng như: Bàn, ghế, tủ đựng hàng, đèn chiếu sáng thậm chí là cả
lọ cắm hoa,… sẽ tạo nên một khung cảnh cực kì lãng mạng và sang trọng,
chính vì vậy những đồ nội thất, mỹ nghệ làm từ Lùng đang là mặt hàng xuất
khẩu rất có giá trị. Ngoài ra, trong nông nghiệp, trong sinh hoạt hàng ngày cây
Lùng cũng được sử dụng khá rộng rãi như: làm neo, giá đỡ cho nhiều cây
lương thực, làm chiếu, mành, đũa, xiên thịt, ván sàn, than hoạt tính, mây tre
đan, tăm, chân hương,…

1


Lùng cũng thể hiện nhiều ưu điểm như sinh trưởng phát triển nhanh, dễ
trồng, dễ khai thác. Được sử dụng làm cây trồng phủ xanh rừng ở Việt Nam
và một số nước khác.
Với những lợi ích kinh tế to lớn cây Lùng đang dần dần xóa đói giảm
nghèo cho nhiều hộ nông dân nghèo ở Nghệ An và một số tỉnh khác trong cả
nước, từ những người trồng Lùng, người thu hoạch và thợ thủ công, tuy nhiên
chính những lợi ích kinh tế này hiện người dân với mục đích thu được lợi
nhuận kinh tế cao đã khai thác quá mức, không đúng kĩ thuật, dẫn đến các khu

rừng Lùng đang đứng trước nguy cơ giảm về diện tích cũng như sản lượng và
chất lượng. Chính vì vậy việc đưa Lùng vào trồng trọt và khai thác hợp lí là
một giải pháp lâu dài và cực kì cấp thiết 42, 43.
Nhưng với các kĩ thuật nhân giống hiện nay như: Ươm, chiết, không
đáp ứng được nhu cầu cung cấp giống cho trồng trọt.
Để góp phần đẩy mạnh sử dụng có hiệu quả nguồn nguyên liệu, vật liệu
trong nước và xuất khẩu. Đáp ứng nhu cầu về giống cây Tre nói chung và cụ
thể là cây Lùng nói riêng. Một hướng nghiên cứu mới đã và đang được quan
tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất,
năng suất cao.
Việc tạo ra cây Lùng ổn định và đồng nhất là vấn đề cần thiết để phục
vụ cho nhu cầu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, sử dụng. Vì vậy, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài “Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây
Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro”.
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1. Mục đích nghiên cứu
Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng
phương pháp vi nhân giống in vitro.

2


2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo vật liệu khởi đầu.
- Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm
chồi.
- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, số lá, chiều cao của chồi cây
Lùng in vitro.
3. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Nhằm góp phần bổ sung vào tài liệu nghiên cứu

nhân giống in vitro về cây Lùng.
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong
nuôi cây mô tế bào cây gỗ. Góp phần sản xuất cây giống đồng bộ có hiệu quả
cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả
nghiên cứu khai thác nguyên liệu, vật liệu và măng từ cây Lùng.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây Lùng (Bambusa sp.)
1.1.1. Phân loại
Bộ: Poales (Hòa thảo)
Họ: Bambusoideae
Tông: Bambuseae
Loài: Bambusa sp.
1.1.2. Mô tả
Lùng là loại tre to, không gai, lá nhỏ, mọc cụm – thân ngầm dạng củ,
thưa cây, thân khí sinh có ngọn cong ngắn.
Thân tre cao, ngọn cong, đường kính lớn (40-50 cm), lóng dài (ngắn
nhất là 1m), vách thân dầy. Phiến lá thuôn hình ngọn giáo, hai mép có răng
sắc rất nhỏ, đầu nhọn đuôi hình nêm
hay gần tù. Lá khi non mầu xanh
thẫm, mềm mại; khi già mầu xanh
nhạt có những chấm nhỏ mầu gỉ sắt.
Bẹ mo hình chuông. Tai mo phát
triển và có nhiều lông mầu nâu. Thìa
lìa xẻ răng sâu thành dạng lông. Lá

mo hình mũi giáo, có lông cả 2 mặt,
hơi lật ngửa – cụp về phía ngoài. Mo
sớm rụng, khi cây măng toả đuôi én
thì mo trên thân cũng rụng gần hết.
Măng ở giai đoạn thấp có mầu tím
Hình 1.1. Cây Lùng (Bambusa sp.)

4


nâu, lên cao có mầu tím hồng hay tím đỏ; lên cao hơn nữa có mầu tím da cam
hay đỏ hồng; khi cây măng vượt ra ánh sáng măng có mầu xanh vàng hay
xanh xám nhạt.
Hoa tự cành nhiều chuỳ, các bông chét tập hợp thành cụm thành hình
cầu ở các đốt của trục hoa tự. Bông chét hình trái xoan nhọn.
1.1.3. Phân bố
Lùng là một loài cây bản địa thuộc bộ tre trúc, ở Việt Nam Lùng phân
bố tương đối hẹp ở 5 xã của huyện Quỳ Châu, 3 xã của huyện Quế Phong
(Nghệ An) và một số xã của huyện Thường Xuân (Thanh Hóa), hiện nay đang
được trồng mở rộng thêm ở một số địa phương khác 42.
1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro
1.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy từ nguyên liệu hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường
nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật
được xem là giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói
chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các hoocmon các cơ quan thực vật ban
đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có
thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh
học giống hệt nhau.

1.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, Haberlandt (Đức) là người đầu tiên đề xướng học thuyết về
tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào
đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ
thể hoàn chỉnh. Vì vậy khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể
phát triển thành một cơ thể”. Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ

5


những cơ quan, bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng thời về
mặt di truyền giống với cây mẹ.
1.2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Sự phân hóa là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào
chuyên hóa để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hóa khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi
sinh để thực hiện chức năng phân chia.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết
quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toán năng
của tế bào thực vật.
1.2.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
1.2.3.1. Ưu điểm
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở
ngại mà các phương pháp khác thường gặp, sau đây là những ưu điểm chính:
- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng và
phát triển cao.
- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã
chọn lọc.
- Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao.

- Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội).
- Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen.
- Có khả năng sản xuất quanh năm.
- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh
thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém.
- Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào
sản xuất đại trà.

6


Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp
không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Thí dụ:
Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối
với cây khoai tây bằng phương pháp này. Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải
mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một
giống mới rất khó khăn. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có
thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm.
1.2.3.2. Nhược điểm
Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang
thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá
trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác. Ngoài ra, phương pháp
này còn có những nhược điểm sau:
- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây non có
kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn
sau ống nghiệm.
- Cây có thể có những đặc tính không mong muốn.
- Khả năng tạo đột biến tăng.
- Khả năng tái sinh có thể mất đi do cấy truyền callus, hay huyền phù tế
bào nhiều lần.

- Cây giống có thể nhiễm bệnh đồng loạt.
Tuy nhiên phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng
rộng rãi để phục vụ những mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liêu cho công tác
chọn giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống
các cây trồng khác như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây
dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo.

7


- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm
nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm
thân gỗ.
- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm
sạch virus.
- Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống, nhân giống vô tính và các loài
giao phấn trong ngân hàng gen.
1.2.4. Các giai đoạn vi nhân giống (nhân giống in vitro)
Vi nhân giống (Micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro
(in vitro propagation) là phương pháp ứng dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô để
nhân giống thực vật, bắt đầu từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích
thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc các
loại bình nuôi cấy khác.
Sự thành công của việc nhân giống in vitro đạt được khi trải qua các
giai đoạn sau:
1.2.4.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình
nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu

thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô thực vật, người
ta thường dùng một số chất hoá học như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2. Tùy
thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá
chất thích hợp.
1.2.4.2. Giai đoạn 2: Tái sinh và nhân nhanh chồi
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích
tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này được xem là giai đoạn
then chốt của quá trình.

8


Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, xytokynin,
gibberellin,...). Các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men,
dịch thủy phân casein,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.
Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích
thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát
triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô
tính.
1.2.4.3. Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 2 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 1 - 2 tuần, từ những chồi riêng
lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin vì auxin là hoocmon thực
vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này, các
chất IAA, IBA,  - NAA và 2,4 - D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất.
1.2.4.4. Giai đoạn 4: Đưa cây ra đất
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất
là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả

năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Cây lấy ra từ ống
nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của
côn trùng và nấm mốc.
Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng. Do đó, để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải
đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ 10 - 15 ngày. Lúc này
rễ mới được sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó chuyển cây ra đất với
chế độ chăm sóc bình thường.

9


1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.3.1. Vật liệu nuôi cấy
Cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khả năng
phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong
môi trường dinh dưỡng nhân tạo và môi trường có điều kiện thích hợp. Do
vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng làm
vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn như cây con, mầm non,
các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần,. . .
Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài, có loài dễ tái sinh từ
mô nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá,… có loài rất khó như hoa đồng
tiền, trầm hương,. . . Thông thường các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của
mô cũng như các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết
quả khác nhau. Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ cây in
vitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi cấy có
nguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính. Nhìn chung, tất cả
các bộ phận như thân, lá, rễ, cuống lá,. . . đều có thể sử dụng để nuôi cấy,
nhưng các cơ quan này do có sự chuyển hoá khác nhau nên quá trình giải mã
các thông tin di truyền trong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái sinh cây,. . . là

cũng rất khác nhau.
Kích thước mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giống
nhau và có liên quan mật thiết với tỷ lệ sống, cũng như mức độ ổn định về
mặt di truyền của mô cấy. Do đó, tuỳ từng đối tượng, từng loại mô và mục
đích sử dụng mà người ta nuôi cấy mô có kích thước khác nhau cho phù hợp.
1.3.2. Môi trường nuôi cấy
Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng.
Vì vậy, để cho mô tồn tại và phân hóa thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải
tạo ra được môi trường có đủ các chất dinh dưỡng mà cây cần thiết. Thành

10


phần hoá học của môi trường dinh dưỡng gồm chủ yếu là muối khoáng,
nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng,. . . Cho đến nay, đã có nhiều loại
môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (l962)
26 viết tắt là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1965) [23], môi trường
Gamborg (1968) [15]… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải biến
ra nhiều loại môi trường khác nhau cho phù hợp với mỗi đối tượng nghiên
cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó, môi trường MS được đánh giá là
phù hợp nhất cho đa số loài thực vật 2.
Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo từng loại
thực vật, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng,
phát triển của mẫu cấy cũng như mục đích nuôi cấy. Tuy nhiên môi trường
nuôi cấy mô tế bào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:
- Các nguyên tố đa lượng (muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali, lưu
huỳnh) là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các
cơ quan tử trong cơ thể thực vật.
- Các nguyên tố vi lượng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban,
molipden, bo, iot). Các nguyên tố này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò

quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân
hóa, ngoài ra chúng còn là thành phần của enzym, xúc tác cho các phản ứng
sinh hóa trong cơ thể. Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu bo
gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh nhưng lại xốp,
mọng nước và tái sinh kém, molipđen tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi
đạm trong tế bào thực vật 1.
- Nguồn cabon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả
năng quang hợp nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lượng
cho các quá trình sinh lí, sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào. Đường
sucrose là nguồn cacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ 2 - 3%.

11


Đường có thể bị caramen hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản
ứng với các hợp chất melanoidin, một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức
chế sự phát triển của tế bào 2.
- Các vitamin: mô và các tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp được vitamin
nhưng không đủ nên thường phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy
chủ yếu là: thiamin (B1) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi
cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxi hóa
khử dehydrogenase xúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin
(B6) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm
amin trong các axit amin; myo - insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô,
có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào. Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng
trưởng của mô nuôi cấy, vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò
quan trọng trong sự tổng hợp tế bào 1.
- Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, dịch chiết muối,
dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân cazein,… cũng được
sử dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc

đẩy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy. Nước dừa bổ sung vào môi trường các
loại đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh
trưởng, các vitamin và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt trong tăng
trưởng của mô 5.
- Các chất làm rắn môi trường: agar là một polysaccarit thu được từ
một số tảo thuộc ngành tảo đỏ. Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo
giá thể nâng đỡ cây. Tùy đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử
dụng thay đổi từ 0,8 - 1,0%. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi
trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuếch tán cũng như hấp thụ dinh
dưỡng của mô, tế bào. Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục
màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể ảnh hưởng

12


đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể
có những tác động sinh lí trên mô thực vật. Ngoài agar, một số hợp chất khác
cũng đã được thử nghiệm thành công để làm rắn môi trường như Gerlit (là
một polysaccarit tinh và trong suốt được hình thành trong quá trình lên men
của Pseudomonas 5.
- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: phytohoocmon là thành phần
quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này mà các nhà
nghiên cứu có thể điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro.
Trong nuôi cấy mô tế bào hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng
rộng rãi là auxin và xytokynin:
*Auxin là chất điều khiển sinh trưởng chủ yếu kích thích sinh trưởng tế
bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành
rễ 1. Nhóm auxin bao gồm IAA, IBA,  - NAA, 2,4 - D có hiệu quả sinh lý
ở nồng độ thấp kích thích ra rễ, ở liều lượng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô
sẹo và thường gây nên các đột biến 5. 2,4 - D thường được sử dụng rộng rãi

trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA,  - NAA thường được sử dụng trong
việc phát sinh rễ 2.
*Xytokynin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên
quan chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hóa chồi từ mô cấy.
Các xytokynin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA, zeatin giúp tạo số
lượng chồi nhiều nhưng có kích thước nhỏ 2, có thể gây ra hiện tượng mọng
nước (thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ). Theo Skoog và Miller, tỷ lệ
auxin/xytokynin cao thường có xu thế kích thích quá trình tạo rễ bất định, kéo
dài chồi, ngược lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đẩy mạnh biệt hóa chồi và ức chế sự
phát triển chồi, nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽ được hình thành 5.
Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào người ta còn sử dụng nhóm
phytohoocmon khác là GA (Gibberellic axit). Gibberelin điển hình là GA3 có

13


tác dụng kích thích kéo dài lóng đốt và sự sinh trưởng của cây, phá vỡ trạng
thái ngủ nghỉ của cây,… Nhưng so với auxin và xytokynin thì nhóm GA rất ít
được sử dụng vì có biểu hiện ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực
vật in vitro, đặc biệt là với mô thực vật một lá mầm, GA3 được đưa vào môi
trường trong những trường hợp cần thiết để kéo dài những chồi bất định hoặc
kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật 5.
*pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH của môi
trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững
và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH
môi trường là NAA, gibberellin và các vitamin. Sự hấp thụ các hợp chất sắt
cũng phụ thuộc vào pH. pH môi trường thường ở 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng
4. Giá trị pH đầu tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh
trưởng và tổng hợp của tế bào. Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hóa các
enzym hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa

của tế bào trong mô nuôi cấy 3. Giá trị pH đầu tiên của môi trường nuôi cấy
luôn luôn ở trong khoảng 5,5 - 5,9. Vì hầu hết trong môi trường nuôi cấy đều
không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi
trường và trong quá trình nuôi cấy. Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 4,5 trong vòng 24 - 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trường nuôi. Những
thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ amonium của tế bào. Tuy nhiên, giá trị
pH sẽ tăng lên sau vài ngày và giữ ở mức độ ổn định 5,0 - 5,5 do có liên quan
đến sự hấp thụ nitrate.
*Ảnh hưởng của than hoạt tính
Nồng độ thường dùng là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có các tác dụng
sau:
- Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố
không màu khác.

14


- Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin,
chelate Fe và Zn…).
- Thúc đẩy sự tạo phôi soma.
- Ổn định độ pH.
1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao
đổi chất trong mô nuôi cấy, ảnh hưởng đến sự phát triển của từng tế bào riêng
lẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp sẽ ảnh
hưởng tích cực đến quá trình sinh trưởng của đa số các loại thực vật nuôi cấy.
Nhiệt độ rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay ngừng sinh trưởng hẳn của
mầm nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro. Trong thực
tế, nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định 250C  10C,
điều này là do nhiệt độ thật của các mô nuôi cấy trong bình nuôi cấy có thể
cao hơn 2 - 40C so với nhiệt độ của phòng. Thông thường, người ta điều chỉnh

nhiệt độ phòng nuôi cấy trung bình. Các loại cây sống ở vùng ôn đới thường
quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính vì vậy mà người ta sẽ có lợi
hơn khi có những phòng nuôi cấy có nhiệt độ 200C  10C dành cho cây nhiệt
đới 2.
Ánh sáng: bao gồm cường độ, thời gian và chất lượng ánh sáng. Khi
chuẩn bị cho cây con ra ngoài vườn ươm nếu gia tăng cường độ ánh sáng thì
sẽ “tăng sức “cho cây con. Trong thực tế ở phần lớn các phòng thí nghiệm
thời gian chiếu sáng 16 - 18 giờ/ngày được coi là tốt nhất cho nuôi cấy mô
2. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh
trưởng của mô nuôi cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội
sinh. Các kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy quá
trình phát sinh hình thái của thực vật được điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh
sáng: chất phytochrom và các chất khác.

15


Không khí: Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi
cấy in vitro bao gồm oxy, carbon dioxide và ethylene. Các nhà trồng cây
thương mại không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy
nhiên tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí
được ở một vài mức độ khác nhau, thường có sự thúc đẩy tăng trưởng qua lỗ
không khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và
ctv, 1997).
1.4. Các nghiên cứu vi nhân giống về họ tre trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Vi nhân giống họ tre trên thế giới
Trong khi một loạt các phương pháp có thể sử dụng để nhân giống tre,
hầu hết các phương pháp chủ yếu là hạn chế với các loài cụ thể và điều kiện
địa phương (vi dụ như về nguồn hạt giống). Nói chung thì không thể áp dụng
được phương pháp này.

Ngoài ra để phổ biến giống với quy mô lớn (> 500.000 cây/1 năm) kĩ
thuật cổ điển chủ yếu là không đủ và không hiệu quả.
Hầu hết các kĩ thuật cổ điển nhân giống vô tính chỉ hữu ích cho việc
sản xuất trên quy mô nhỏ hơn (lên đến 100.000 cây/1 măm) mặc dù tối ưu hóa
hoặc các kĩ thuật như nhân giống phổ biến vi mô (Adarsh Kumar, 1991) 6
có thể cho năng suất sản xuất cao hơn nhiều khi phụ thuộc vào sự sẵn có của
cây mẹ. Nhân giống quy mô lớn (từ 10.000 và 500.000 cây mỗi năm) đòi hỏi
kĩ thuật cao và rất nhiều cây mẹ. Cho nên nuôi cấy mô nhân giống quy mô lớn
(> 500.000 cây mỗi năm) là phương pháp duy nhất khả thi. Do vậy, vật liệu
khởi đầu đóng vai trò quan trọng đối với vi nhân giống (Gielis, 1998.
Subramaniam, 1994) 16, 35.
Kể từ 4 thập kỉ qua, nhiều nhà khoa học và các công ty trên thế giới đã
thực hiện nghiên cứu để phát triển công nghệ vi nhân giống hiệu quả cho tre
nhiệt đới và ôn đới.

16