Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

LÊ THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG RƠM RẠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đinh
Thị Kim Nhung và các thầy cô, chuyên viên phòng thí nghiệm Vi sinh vật,
tổ Thưc vật – Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành khóa
luận trong thời gian qua.
Em xin cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn nghiên cứu tại phòng
thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè luôn sát cánh,
động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong thời gian làm khóa luận.

Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Sinh viên

Lê Thị Thùy Dung


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đề tài “ Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của
chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy Cellulose trong rơm rạ” là do em
thực hiện. Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống
kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào đã
công bố. Trong đề tài em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả
khác, em xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt
nghiệp của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Sinh viên

Lê Thị Thùy Dung


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài ...................................................... 2
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................ 2

4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................................. 2
5. Điểm mới của đề tài ................................................................................... 3
CHƢỚNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose .................................. 4
1.1.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose ......................................................... 4
1.1.2. Vi sinh vật phân hủy hemicellulose ................................................. 6
1.1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin .............................................................. 6
1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam ............................................... 7
1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên ............................. 8
1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên .......................................... 8
1.3.2. Cellulose ........................................................................................... 8
1.3.3. Hemicellulose ................................................................................. 10
1.3.4. Lignin ............................................................................................. 10
1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose.................................................. 11
1.4. Thành phần chính của rơm rạ ............................................................... 14
1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh ...................................................... 14


1.5.1. Trên thế giới ................................................................................... 14
1.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................... 15
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 16
2.2. Hóa chất, thiết bị ................................................................................... 16
2.2.1. Hóa chất.......................................................................................... 16
2.2.2. Thiết bị ........................................................................................... 16
2.3. Các loại môi trường nuôi cấy ............................................................... 16
2.3.1. Môi trường giữ giống vi khuẩn MPA ............................................ 16
2.3.2. Môi trường giữ giống xạ khuẩn Gauze I ....................................... 17
2.3.4. Môi trường giữ giống nấm mốc Crapeckdox ................................ 17
2.3.5. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng

VSV ................................................................................................ 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 17
2.4.1. Phương pháp vi sinh học ................................................................ 17
2.4.2. Phương pháp hóa sinh .................................................................... 19
2.4.3. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu.................. 23
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài ...................................................................... 23
2.7. Thời gian thực hiện đề tài ..................................................................... 23
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 24
3.1. Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả
năngsinh enzyme phân giảicellulose của các chủng vsv nghiên cứu ... 24
3.1.1. Xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm, rạ nghiên cứu ......................... 24


3.1.2. Kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các
chủng vsv nghiên cứu ..................................................................... 25
3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng
phân hủy cellulose trong rơm rạ ........................................................... 26
3.2.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn................................... 26
3.1.2. Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn ........................................ 28
3.2.3. Đặc điểm hình thái các chủng nấm mốc ........................................ 29
3.3. Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu ......... 30
3.3.1. Đồ thị đường chuẩn ........................................................................ 30
3.3.2. Hoạt độ enzyme của các chủng vsv nghiên cứu ............................ 32
3.4. Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các
chủng vi sinh vật nghiên cứu ................................................................ 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37
1. Kết luận .................................................................................................... 37
2. Kiến nghị.................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 38

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU

: Colony forming unit

CMC

: Cacboxyl methyl cellulose

ĐC

: Đối chứng

G

: Gram

MPA

: Meat peptone agar

MT

: Môi trường

PTN

: Phòng thí nghiệm

STT

: Số thứ tự

TN

: Thí nghiệm

U

:Ủ

V

: Vi khuẩn mẫu làm giàu

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật

XK

: Xạ khuẩn

VSV

: Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rơm rạ ..................................................... 14
Bảng 1.2. Hàm lượng một số chất có trong rơm rạ ......................................... 14
Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose ................................. 17
Bảng 3.1. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV nghiên cứu ......... 25
Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme của tổ hợp vi sinh vật nghiên cứu ....................... 32
Bảng 3.3. Vi sinh vật bổ sung vào mỗi khối ủ thí nghiệm .............................. 34
Bảng 3.4. Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ ........................................ 35
Bảng 3.5. Độ giảm khối lượng của các khối ủ sau 32 ngày............................ 36


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose .......................................................... 9
Hình 3.1. Hoạt tính của một số chủng tuyển chọn .......................................... 26
Hình 3.2. Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trường MPA . 27
Hình 3.3. Hình thái tế bào các chủng vi sinh vật nghiên cứu (x1000) ........... 27
Hình 3.4. Khuẩn lạc xạ khuẩn nghiên cứu dưới kính hiển vi soi nổi ............. 28
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bào tử của các chủng xạ khuẩn (x 1000) ..... 29
Hình 3.6. Khuẩn lạc các chủng nấm mốc trên môi trường thạch đĩa ............. 29
Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC .......................... 31
Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất bột giấy ...................... 31
Hình 3.9. Khối ủ thí nghiệm và đối chứng sau khi phối trộn nguyên liệu ..... 33
và bổ sung giống vi sinh vật ............................................................ 33
Hình 3.10. Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ lớn ........................ 35

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Lúa gạo cung cấp nguồn lương thực chính cho nhu cầu tiêu dùng của
người dân và xuất khẩu. Tuy nhiên ngoài sản phẩm chính là thóc, rơm rạ còn
chiếm đến 50% trọng lượng của cây lúa do vậy sản xuất lúa còn tạo ra lượng
rơm rạ khổng lồ. Những năm gần đây cơ giới hóa khâu làm đất phát triển, số
lượng trâu, bò nuôi giảm mạnh, việc sử dụng rơm làm thức ăn cho trâu, bò cũng
giảm theo, rơm, rạ cũng không còn được sử dụng làm chất đốt. Mặt khác, rơm
rạ sau khi thu hoạch không thể vùi trực tiếp vào trong đất vì tỉ số C/N của chúng
rất cao, trong điều kiện ngập nước sẽ sản sinh ra khí độc gây ra hiện tượng vàng
lá nghẹt rễ, cây trồng sẽ không phát triển được hoặc chết và đất đai ngày càng
suy giảm độ phì nhiêu. Nguồn rơm, rạ dư thừa sau mỗi vụ thu hoạch không tìm
được cách sử dụng hợp lý nên đã được nông dân tự xử lý bằng biện pháp đốt
cháy ngay tại đồng ruộng. Hậu quả là phá vỡ sự cân bằng tự nhiên, ô nhiễm
không khí.
Phân hữu cơ chủ yếu được sử dụng hiện nay là phân chuồng, loại phân
này nếu ủ theo phương pháp truyền thống mất thời gian từ 55 - 60 ngày, quá
trình ủ gây ra mùi hôi thối khó chịu. Nhiều lúc người dân bón phân tươi, chưa
được xử lý các vi sinh vật có hại. Thông qua con đường này đã đưa các các
chủng nấm, vi sinh có hại vào đất, gây nên một số bệnh hại cho cây trồng và
ảnh hưởng đến sức khỏe người sản xuất, tiêu dùng. Theo thống kê của các nhà
khoa học lượng rơm, rạ thu được từ 1ha lúa là 5 đến 7 tấn/năm. Bình quân
lượng rơm rạ thu được từ 1ha lúa có: 51,5 kg N; 25,4 kg P2O5; 137,4 kg K2O và
các nguyên tố vi lượng. Trước thực trạng đó, một giải pháp để xử lý các phụ
phẩm nông nghiệp này là sử dụng những phế phẩm bỏ đi trong nông nghiệp như
rơm rạ để ủ phân hữu cơ. Rơm rạ có thành phần chính là cellulose, bên cạnh đó
còn có lignin và hemicellulose. Trong tự nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có

1


khả năng phân giải cellulose, lignin và hemicellulose nhờ có hệ enzyme ngoại
bào. Do đó tôi chọn đề tài:“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi
sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng
phân hủy cellulose trong rơm rạ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năng
sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu
3.2.Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân
hủy cellulose trong rơm rạ
3.3. Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
3.4. Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng
vi sinh vật nghiên cứu
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài nhằm nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật có
khả năng sinh enzyme cellulase. Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu
về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng
trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Việc nghiên cứu này nhằm mục tiêu tuyển chọn các chủng vi sinh vật có
hoạt tính phân giải cellulose cao để xử lý nhanh rơm rạ, rút ngắn quá trình ủ,
nhằm hạn chế nguồn sâu bệnh, tạo nguồn phân bón hữu cơ từ rơm rạ, bón trở lại
cho ruộng đồng, góp phần nâng cao dinh dưỡng đất, giảm thiểu ô nhiễm môi
trường.

2


5. Điểm mới của đề tài
Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát có hoạt độ enzyme
cellulase của một số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase được
phân lập, tuyển chọn trong đất tại 3 địa điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện
Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc).

3


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose
1.1.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose
Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô
cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn.
a) Nấm sợi
Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thì nấm
sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất. Chúng là những vi
sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh
ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các tàn dư
của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở
nên màu mỡ hơn [9].
Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng
sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hoá
cellulose đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài
loại enzyme. Các loại nấm đáng chú ý nhất là: Alternaria tenuis, Aspergillus

wentii,

Aspergillus

fumigatus,

Trichoderma

reesei,

Fusarium

solani,

Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger... [8].
Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzyme
bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose nhưng hoạt tính
cellulase của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất
cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6 [9].
b) Vi khuẩn
Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi
sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose. Những năm đầu thế kỷ XX
(1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng
4


này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm một
vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế
bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống Cytophaga,
Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận năng lượng khi oxy hoá

các sản phẩm của sự phân giải cellulose thành CO2 và H2O [9].
Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân
huỷ cellulose. Trong điều kiện kị khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc giống
Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải cellulose. Chúng phát triển yếu trên
môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và
xenlobiose, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn
cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O.
Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt. Chúng
có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm. Các vi sinh vật đó thường
là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio fibrisolvens,
Cillobacterium

cellulosolvens,

Bacteroides

amylophillus,

Bacteroides

ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium... [9].
c) Xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân
nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về nhiệt
độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng:
Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300C.
Xạ khuẩn ưa nhiệt : phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 700C.
Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất. Cellulase của xạ
khuẩn là enzyme ngoại bào [7].
Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân

cellulose. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Nhiều
nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết nấm men,
pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng. Xạ khuẩn
thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Bào tử
5


của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi
và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng. Các xạ khuẩn
khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Việc hình thành cuống bào tử
diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng [9].
Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh
Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp cellulose
và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl. Mandels và cộng tác viên
nghiên cứu khả năng tổng hợp enzyme cellulase của hai chủng Streptomyces
antibioticus và Streptomyces sp. với cơ chất là CMC, nhiệt độ tối thích là 370C
và pH tối thích là 5,9 [9].
1.1.2. Vi sinh vật phân hủy hemicellulose
Hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanase vì xylan
là một loại hemicellulose phổ biến trong tự nhiên. Các tác giả cho rằng nhiều vi
sinh vật có khả năng tổng hợp cả cellulase đồng thời tổng hợp cả hemicellulase.
Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus, Bacteriodes,
Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium.
Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp
xylanase. Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus
oryzae,

A.niger,

A.wentti,

Aspergillus

terreus,

T.reesei,

Chaetomium

trilaterates, Penicilium...[11].
1.1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin
Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ rất
chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm. Các vi sinh vật phân giải lignin thường
là các loại nấm mục xốp như: Paocylimyces, Allescheria, Pseussis,
Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites… Ngoài ra còn có các loại nấm trắng như:
Corrolus

versicolor,

Polyrus

anceps,

Phanerochaeter

Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus... [12].

6

chrysosporium,

1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam
Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ.
Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu tấn
rơm. Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt gây
lãng phí và làm ô nhiễm môi trường. Hiện nay, cùng với việc ứng dụng các tiến
bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và tuốt lúa. Sau
khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm được nhiều
công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt. Vì thế, rơm rạ phần
lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa về nhà để làm
thức ăn cho gia súc về mùa đông. Phần rơm rạ ngoài đồng lại được người dân
đốt thành tro. Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và ảnh hưởng trực
tiếp tới sức khoẻ của người dân. Theo các chuyên gia y tế, mù bụi ro đốt rơm rạ
(đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm không khí rất có hại
đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người già và người mắc bệnh
đường hô hấp.
Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng
rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng màu…
Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể mua máy
đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả trong việc
ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ được dễ
dàng. Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác. Máy ép rơm đã
được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Thành phố
Hồ Chí Minh... Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất ethanol được
áp dụng rất ít ở nước ta.
Hiện nay tại nhiều tỉnh thành trong cả nước đã ứng dụng công nghệ vi
sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón. Chẳng hạn, tại tỉnh Quảng Nam, người
dân đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón ở Hội An.
Kết quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ phế phẩm nông nghiệp đã cho thấy cây

phát triển tốt hơn so với mẫu đối chứng về mật độ gieo trồng, bộ lá xanh, mượt,
7


cây cao, chắc khoẻ và đặc biệt là đã hạn chế được nấm bệnh cho cây trồng.
Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học, thuốc bảo
vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi. Do vậy, việc sử dụng rơm, rạ làm
phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội.
1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên
1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên
Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.1012 tấn. Trong đó
cellulose chiếm khoảng 4.1010 tấn. Sản lượng cellulose được tổng hợp hàng năm
trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác.
Dưới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nông nghiệp chăn
nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt từ
nhà bếp, đường phố... Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi của
cellulose có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ môi
trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi hỏi
phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng vùng
[6], [7], [9].
1.3.2. Cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Thông thường,
cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất
của chúng ta. Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp
cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những chất
khác như hemicellulose, lignin, pectin... các chất này liên kết với nhau tạo nên
màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là lignocellulose. Trong đó, cellulose
và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Hai chất này được bao bọc bởi một lượng
lignin. Các thành phần này thường có tỉ lệ khác nhau trong các loại cây khác
nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loại thực vật.

Về mặt cấu tạo hoá học, cellulose là một polime mạch thẳng, có thành
phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranose. Các gốc này nối với nhau nhờ liên
8


kết β-1,4-glucozit. Mức độ polime hoá của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ
vài trăm đến 15000) trung bình là 3000. Các đơn phân glucoza trong cellulose
thì có cấu trúc dạng ghế bành (hình 1.1). Trong công thức phối cảnh, biểu diễn
glucoza số chẵn, quay góc 180o so với glucose số lẻ và các nhóm hydroxyl đều
nằm trên mặt phẳng nằm ngang [9], [11].

H

H

H

CH2OH
O

OH

O
H
HO

HO

H

H
H

O
H

OH

H

H

CH2OH

O

Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose
Dùng phương pháp phân tích của Rơngen, người ta đã chứng minh được
rằng phân tử cellulose có dạng sợi. Các sợi này của cellulose lại gắn với nhau
nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin. Microfibrin có
cấu trúc không đồng nhất và thường có hai vùng β. Vùng kết tinh có cấu trúc
trật tự rất cao vì thế nó rất bền vững với tác động bên ngoài. Vùng vô định hình
có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vững hơn.
Do có cấu trúc như thế, vùng vô định hình của cellulose có thể hấp thụ
nước và trương lên. Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydrogen
ngăn cản sự trương này. Ở vùng kết tinh, enzyme chỉ tác dụng lên bề mặt các
sợi [7].
Cellulose là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững. Nó không
tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và động
vật có dạ dày một túi. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất

9


có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là enzyme thuỷ
phân cellulose [9].
1.3.3. Hemicellulose
Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng.
Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với
cellulose. Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đường. Các gốc đường được nối
với nhau bằng liên kết β-1.4, β-1.5, β-1.6 glucozit. Chúng tạo thành mạch ngắn
và phân nhánh.
Do đó, so với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ
bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng. Đôi khi
hemicellulose còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải
bởi enzyme hemicellulase.
Hemicellulose tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ,
trấu. Trong các loại hemicellulose thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên.
Trong đó nhiều nhất là ở rơm rạ (chiếm hơn 30%), kế đến là cây lá rộng

(20

- 30%). ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 - 17%) [7], [8], [11].
1.3.4. Lignin
Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu
trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic. Tuy nhiên, tỉ lệ ba loại
rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau.
Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và CC. Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến [7].
Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic, 14% cumarylic và 6% cynapylic.
Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế

bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn
các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác dụng khác
từ bên ngoài. Lignin không hoà tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ đậm
đặc kể cả axit. Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, lignin
mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối với tác dụng của các
10


enzyme. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao
đổi chất.
Ba cấu tử cellulose, hemicellulose, lignin tạo nên lignocellulose. Thành
phần lignin, cellulose, hemicellulose trong các loại thực vật có sự khác biệt lớn.
Điều này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật lý và
thành phần hoá học. Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử lý khác
nhau đối với các loại thực vật khác nhau [7], [11].
1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose
Lignocellulose là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime
cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzyme. Các cấu phần
hợp thành nên lignocellulose được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với các
thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ.
Do thành phần cấu tạo của lignocellulose rất đa dạng và phức tạp nên để
có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ enzyme
tương ứng. Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể sinh tổng
hợp một phức hệ enzyme phong phú và đa dạng như vậy. Muốn chuyển hoá
được lignocellulose cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh vật khác nhau.
1.3.5.1. Enzyme và cơ chế thủy phân lignocellulose
a) Enzyme thuỷ phân cellulose: Cellulase
Cellulase ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được một
số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzyme thuỷ phân cellulose tạo
ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Nhiều tác giả cho rằng phức

hệ enzyme cellulase bao gồm ba enzyme chủ yếu sau:
Exo-β(1,4)-glucanasehay xenlobiohydrolase: Enzyme này phân cắt chuỗi
cellulose từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza. Enzyme này không
thuỷ phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan (caboxymetyl cellulose)
nhưng có thể thuỷ phân được cellulose đã bị cắt ngắn mạch. Có lẽ vai trò chính
của enzyme này là giúp cho enzyme endocellulase tác động lên được cellulose
kết tinh.
11


Endoglucanase hay Endocellulase (1,4 β-D-glucano-hydrolaza): Enzyme
này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết ò 1,4-glucozit trong phân tử cellulose một
cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobiose và glucose. Enzyme
này phân giải mạnh mẽ các cellulose vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên
cellulose kết tinh và không phân giải được xenlobiose. Chính nhờ sự phân cắt
trước của endocellulase, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzyme
xenlobio-hydrolase, do đó mà thuỷ phân được cellulose kết tinh.
Enzyme β-1,4-glucozidasehay xenlobiase: Đây là những enzyme rất đặc
hiệu. β-glucozidase làm thuỷ phân xenlobiose và các xenlooligo-sacarit mạch
ngắn thành glucose. Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân cellulose phụ thuộc
chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiase. Tuy nhiên theo một số tác giả
cơ chế thuỷ phân cellulose bởi phức hệ enzyme trên diễn ra theo một trật tự
khác nhau.
b) Cơ chế thuỷ phân cellulose
Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzyme “tiền tố thuỷ phân” hay là
không đặc hiệu. Các enzyme này chỉ có tác dụng làm trương cellulose tự nhiên.
Các cellulose tự nhiên sẽ được chuyển thành các cellulose hoạt động trương nở
có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ được enzyme Cx tiếp tục phân cắt tạo
thành đường tan (xenlobiose) và sau cùng thành glucose [9].
Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzyme

endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt các
liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó exoglucanose sẽ cắt
ra tạo thành những đoạn xenlobiose. Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit mạch
ngắn, xelobiose, glucose. Cuối cùng enzyme xenlobiase thuỷ phân tiếp theo tạo
thành glucose.
Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về
enzyme C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở cellulose kết
tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra cellulose biến tính. Sau đó enzyme
endoglucanase tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobiose. Ông cho rằng sự thuỷ
12


phân cellulose là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanase,
enxoglucanase và xenlobiase.
Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân cellulose
nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân cellulose vẫn chưa hoàn toàn thống
nhất.
1.3.5.2. Enzyme và cơ chế thủy phân hemicellulose
Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống
nhau giữa hai thành phần này. Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzyme
hemicellulase cũng có nhiều điểm tương đồng với cellulase ví dụ như cơ chế tác
động... Tuy nhiên, giữa hemicellulase và cellulase vẫn còn nhiều điểm khác
biệt:Hemicellulose có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém bền
hơn so với cellulose. Hemicellulose là cơ chất dễ đồng hoá hơn cellulose do đó
hemicellulase thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy vi sinh
vật. Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemicellulose thường diễn ra song song
với quá trình phân giải cellulose [7].
1.3.5.3. Enzyme và cơ chế thủy phân lignin
Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin. Một số
tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra

ligninase. Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là
một quá trình trao đổi chất thứ cấp. Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các
nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nếu thêm nitơ
vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzyme tham
gia vào quá trình thuỷ phân lignin. Ligninase không thuỷ phân lignin thành các
tiểu phần hoà tan như phân giải cellulose và hầu hết các polime khác, vì lignin
chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ. Mặt khác ligninase lại
rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với
lignin.

13


1.4. Thành phần chính của rơm rạ
Tại thời điểm thu hoạch, hàm lượng ẩm của rơm rạ thường cao tới 60%,
tuy nhiên trong điều kiện thời tiết khô hanh rơm rạ có thể trở nên khô nhanh đạt
đến trạng thái độ ẩm cân bằng vào khoảng 10 - 12%. Rơm rạ, có hàm lượng tro
cao và lượng protein thấp [13]. Trong rơm rạ chứa lượng lớn các chất hóa học
và cacbon-hydrate thể hiện trong bảng 1.2. và 1.3. [14].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rơm rạ
Các chất hóa học

Rơm rạ (%)

Cellulose

32 – 47

Hemicelluose

19 – 27

Ligin

5 – 24

Protein

-

Tro

12.4

Bảng 1.2. Hàm lượng một số chất có trong rơm rạ
Cacbon-hydrate

Rơm rạ (%)

Glucose

41 – 43.4

Xylose

14.8 – 20.2

Mannose

1.8

Galactose

0.4

Arabinose

2.7 – 4.5

1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh
1.5.1. Trên thế giới
Phân bón vi sinh vật (tên thường gọi: phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm
được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất
dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống
được tuyển chọ với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định, góp phần nâng cao năng
xuất, chất lượng nông sản. Phân hữu cơ vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến
con người, động vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
14


Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và
được đặt tên là Nitragin. Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở Mỹ (
1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914).
Nitragin là một loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizibium do
Beijerink phân lập năm 1888 và được Ferd đặt tên vào năm 1889 dùng để bón
cho các loại cây thích hợp họ Đậu. Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình
nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh
cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích
khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp. , Azotobacter

spp. , các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium, Pasterium, Beijerinkia
indica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hoặc một số chủng vi
sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ photpho, kali ở dạng khó hòa
tan với một số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit,
photpho,… chuyển chúng thành dạng dễ hòa tan, cây trồng có thể hấp thụ được.
1.5.2. Ở Việt Nam
Phân vi sinh vật cố đinh đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân
đã được nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin nền chất mang
than bùn mới được hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập
trung nghiên cứu phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều
chủng vi sinh vật cố định đạm và vi sinh vật phân giải lân. [5]
Nhiều loại phân HCVS đã được nghiên cứu sản xuất và được ộ N ng
nghiệp và hát triển n ng th n công nhận là tiến bộ kỹ thuật. Theo ước tính của
Cục Tr ng trọt, lượng phân HCVS sản xuất trong năm 2008 có trên 100 loại với
khoảng 1,2 triệu tấn, bước đầu tham gia vào sản xuất nông nghiệp theo hướng
hữu cơ. Thị trường cho các sản phẩm dạng này đang dần được mở rộng, trong
đó ứng dụng nhiều nhất là các vùng đất cơ giới nhẹ, các vùng trồng rau tập
trung như Lâm Đồng, vùng ven Hà Nội và những vùng trồng các loại cây có giá
trị kinh tế cao như cà phê, hồ tiêu, thanh long.

15


CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
10 chủng vi sinh vật V6, Uv2.23, Uv2.8, X4, X9, X10, M4, M16, M17,
M21 đã được phân lập và tuyển chọn từ khu vực đất nông nghiệp Mê Linh (Hà
Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) thông qua đề tài “

Phân lập, tuyển chon một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ
thành phân hữu cơ” của Lê Thị Thùy Dung, Đại học Sư phạm Hà nội 2.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.2.1. Hóa chất
Giấy lọc, thuốc thử lugol 1%, côngô đỏ 1%. Các hóa chất: NaNO3,
MgSO4.7H2O, KCl, K2HPO4, FeSO4, NaCl, NH4Cl, (NH4)2 SO4, CaCO3,
saccarose, cao thịt, pepton... các hóa chất thông dụng khác.
2.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), box vô trùng
(Haraeus), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), micropipet Jinson (Pháp)
các loại từ 0.5 μl – 10 ml, máy so màu UV – vis (Nhật), máy đo pH (MP 200R Thuỵ Sĩ), cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ), kính hiển vi quang học Carl Zeiss
(Đức), tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que
trang, lamen, đèn cồn... và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2.3. Các loại môi trƣờng nuôi cấy
2.3.1. Môi trường giữ giống vi khuẩn MPA
Peptôn : 5g;

Thạch agar : 20g;

Cao thịt : 5g;

NaCl

: 5g;

16

Nước : 1000ml.