KHẢO sát ẢNH HƯỞNG của NAA, BA và KINETINE đến sự HÌNH THÀNH mô sẹo và tái SINH NHÂN NHANH GIỐNG HOA cúc đại đóa IN VITRO

Đề tài:

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ
KINETINE ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO
VÀ TÁI SINH NHÂN NHANH GIỐNG HOA
CÚC ĐẠI ĐÓA IN VITRO
GVHD: PGS.TS Phan Thanh Kiếm SVTH: Nguyễn Thị Thu Hiền
KS. Dương Thị Lan Oanh
Lớp: DH07NHA

*


1. Mở đầu
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
4. Kết luận và đề nghị


1. Mở đầu
1.1 Đặt vấn đề
- Cúc Đại Đóa là loại hoa có hình dáng và màu sắc đẹp, hoa
to nên được người tiêu dùng rất ưa chuộng, đóng vai trò
quan trọng trong thị trường hoa cúc.
- Hoa cúc thường được nhân giống bằng cách lưu lại cây mẹ
và tách mầm giá. Phương pháp này không chủ động được
cây giống và dễ làm thoái hóa giống.
- Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, cho hệ số nhân
cao, tương đối đồng đều về mặt di truyền và sạch bệnh.

*


1.1 Đặt vấn đề (tt)
- Trong nuôi cấy mô không có môi trường nào là chuẩn tuyệt
đối cần phù hợp cho sự phát triển của tất cả các tế bào. Vì
vậy sự thay đổi môi trường nuôi cấy là điều cần thiết, tùy
thuộc vào từng giống, loại mô nuôi cấy khác nhau
- Đề tà i: “Khả o sá t ả nh hưở ng củ a nồ ng độ NAA, BA và
kinetine đế n quá trı̀nh ta ̣o mô sẹo và nhân nhanh giố ng
hoa cú c Đa ̣i Đó a in vitro” được thực hiện.

*


1.2 Mục tiêu
- Xá c đinh
̣ nồ ng đô ̣ Hypocloride calcium và thờ i gian

khử trù ng thı́ch hơ ̣p cho khả năng vào mẫu của cây
cú c Đa ̣i Đó a.
- Tìm ra sự phối hợp của BA và NAA thı́ch hơ ̣p cho
quá trı̀nh ta ̣o mô sẹo trong ố ng nghiê ̣m củ a nụ hoa
cú c Đa ̣i Đó a.
- Xá c đinh
̣ nồ ng đô ̣ Kinetine và NAA thích hợp cho khả
năng nhân nhanh chồi và tạo rễ của cây cúc Đại Đóa.
*

1.3 Yêu cầu
- Đưa đươ ̣c mẫu và o trong ố ng nghiê ̣m củ a giố ng cú c Đa ̣i Đoá
- Ta ̣o đươ ̣c mô sẹo, chồi và rễ cho giố ng cú c Đa ̣i Đó a trong
ố ng nghiê ̣m.
- Theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu.

1.4 Giới hạn đề tài
Đề tài chỉ thực hiện trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 6
nên không thể thực hiện các thí nghiệm nhiều lần để có kết
quả chính xác hơn.
*


2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Thời gian - địa điểm
- Thời gian: 03/2011 đến 06/2011.
- Địa điểm: phòng Di truyền và Chọn giống cây trồng,
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam TP.
HCM.

*


2.2 Vật liệu thí nghiệm
- Thu thập chồi thân, chồi ngọn và nụ hoa từ nhữ ng cây khỏ e
và không bi ̣sâu bê ̣nh tại Phan Thiết, Bình Thuận.
- Mẫu cấy trong thí nghiệm nhân nhanh chồi và tạo rễ được
lấy trong chai mô.
- Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường cơ bản

MS (Murashige and Skoog, 1962), pH được điều chỉnh từ
5,7 – 5,8.
*


2.3 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu
❖ Thí nghiệm 1: Xác định nồ ng đô ̣ Hypocloride calcium và
thờ i gian khử trù ng thı́ch hơ ̣p cho khả năng đưa mẫu và o
phòng thí nghiệm củ a cây cú c Đa ̣i Đó a.

❖ Thí nghiệm xử lý mẫu ở các nồng độ Hypocloride calcium:
6%, 8%, 10%, 12% trong thời gian 30 phút và 40 phút.
- Số NT: 8
- Số LLL: 3
- Số mẫu/1 LLL: 15
- Tổng số mẫu thí nghiệm: 360 mẫu
*


Mẫu rửa sạch
dưới vòi nước

Rửa xà
bông

Rửa sạch
dưới vòi
nước

Tủ cấy vô trùng,

rửa lại 4 lần
bằng nước cất vô
trùng

Quy trình khử trùng

Cấy vào môi trường
khoáng MS không bổ
sung chất điều hòa
sinh trưởng

Rửa lại bằng
nước cất vô
trùng 3 lần

Chất khử trùng
*


Các chỉ tiêu – phương pháp theo dõi
- Tỷ lệ nhiễm (%) = (số mẫu nhiễm/tổng số mẫu đưa vào) x 100
- Tỷ lệ chết (%) = (tổng số mẫu chết/tổng số mẫu đưa vào) x 100

- Tỷ lệ mẫu sạch (sống) (%) = (số mẫu thu được/tổng số mẫu
đưa vào) x 100

*


❖ Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng phối hợp giữa BA và NAA đến

khả năng tạo mô sẹo của nụ hoa cúc Đại Đóa in vitro
- Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên
- Yếu tố A: nồng độ của NAA (0 mg/l, 0,2 mg/l, 0,5 mg/l ), ký
hiệu A0, A1, A2
- Yếu tố B: nồng độ của BA (0 mg/l, 1 mg/l, 2mg/l, 3 mg/l)
được ký hiệu từ B0, B1, B2, B3

*


Yếu tố B

Phối hợp hai yếu tố

Yếu tố A

B0

B1

B2

B3

A0B0

A0B1

A0B2

A0B3

A0

(NT1- ĐC)

(NT2)

(NT3)

(NT4)

A1

A1B0
(NT5)

A1B1
(NT6)

A1B2
(NT7)

A1B3
(NT8)

A2

A2B0
(NT9)

A2B1
(NT10)

A2B2
(NT11)

A2B3
(NT12)

Tổng số nghiệm thức: 12
- Số LLL: 3
- Số bình/LLL: 3
- Số mẫu/bình: 3
- Tổng số mẫu trong thí nghiệm: 324

*


Các chỉ tiêu – phương pháp theo dõi
- Tỷ lệ mô sẹo được hình thành (%) = tổng số mẫu mô sẹo
hình thành/tổng số mẫu đem cấy x 100 (giai đoạn 45 NSC)
- Đường kính mô sẹo (cm): đo đường kính dài nhất của mô
sẹo (45NSC)
- Mô tả đặc điểm hình thái mô sẹo hình thành.


❖ Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Kinetine đến quá trình nhân
nhanh chồ i củ a giống cúc Đại Đóa in vitro
❖ Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu

nhiên, đơn yếu tố.
- NT1 (Đ/C): MTN + 0mg/l kinetine
- NT2: MTN + 1 mg/l kinetine
- NT3: MTN + 2 mg/l kinetine
- NT4: MTN + 3 mg/l kinetine
- NT5: MTN + 4 mg/l kinetine

❖ MTN: Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar
*


Thí nghiệm 3 (tt)
- Tổng NT: 5
- LLL: 3
- Số bình/LLL: 1
- Số mẫu/bình: 30
- Tổng số mẫu dùng trong TN: 450
- Mẫu thí nghiệm: đoạn thân mang một mắt ngủ

*


Các chỉ tiêu – phương pháp theo dõi
- Tỷ lệ tạo chồi (%): (đếm toàn bộ số mẫu tạo chồi/tổng số
mẫu cấy) x 100
- Số chồi/ mẫu: đếm toàn bộ số chồi/mẫu
- Chiều cao chồi: đo từ gốc đến đỉnh đọt của chồi cao nhất
- Hệ số nhân = tổng số mẫu thu được sau khi nhân/tổng số
mẫu cấy ban đầu
- Các chỉ tiêu được theo dõi ở 35 NSC

*


❖ Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hı̀nh
thà nh rễ củ a cây cú c Đa ̣i Đó a in vitro
❖ Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên, đơn yếu tố.
- TN1 (Đ/C): MTN + 0 mg/l NAA
- TN2: MTN + 1 mg/l NAA
- TN3: MTN + 1,5 mg/l NAA
- TN4: MTN + 2 mg/l NAA
- TN5: MTN + 2,5 mg/l NAA

❖ MTN: Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar +0,1 g/l
than hoạt tính
*


Thí nghiệm 4 (tt)
- Tổng số NT: 5
- Số LLL: 3
- Số bình/ LLL: 1
- Số mẫu/ bình: 25
- Tổng số mẫu dùng trong TN: 375

*


Chỉ tiêu - phương pháp theo dõi
- Tỷ lệ ra rễ (%) = (tổng số cây ra rễ/tổng số mẫu cấy) x 100

- Số rễ/cây: đếm toàn bộ số rễ/cây
- Chiều dài rễ (cm): đo từ gốc đến chóp rễ dài nhất
- Mô tả đă ̣c điể m hình thái của rễ tạo thành.
- Các chỉ tiêu được theo dõi ở 25 NSC

*


2.4 Phương phá p xử lý số liêụ
Các số liệu thu thập được tính toán trên phần mềm
Excel, việc xử lý số liệu được thực hiện trên phần
mềm SAS 9.13.

*


3. Kết quả và thảo luận

*


❖Thí nghiệm 1: Xác định nồ ng đô ̣ Hypocloride calcium và thờ i gian
khử trù ng thı́ch hơ ̣p cho khả năng đưa mẫu và o phòng thí nghiệm củ a
cây cú c Đa ̣i Đó a.
Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm, sống, chết (%) của mẫu Cúc Đại Đoá 10 NSC
Nồng độ
Hypochlorite
Calcium
(%)

6
8
10
12

Tỷ lệ
mẫu
nhiễm
(%)

100
60
27
20

Thời gian khử trùng (phút)
30
40
Tỷ lệ
Tỷ lệ Tỷ lệ
Tỷ lệ
mẫu
mẫu
mẫu
mẫu
sống
chết nhiễm sống
(%)
(%)
(%)

(%)

24
56
27

16
17
53

87
51
22
16

13
29
38
18

Tỷ lệ
mẫu
chết
(%)

0
20
40
67
*

• Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng phối hợp giữa BA
và NAA đến khả năng tạo mô sẹo của nụ hoa
cúc Đại Đóa in vitro

*


Bảng 3.2: Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến quá trình hình thành mô sẹo
TLhình
hình
TL
NAA (mg/l)
(mg/l) BA
BA (mg/l)
(mg/l) thành
Hình thái
thànhmô
mô sẹo
sẹoĐK
ĐK mô
mô sẹo
sẹo ngày
ngày hình
hình Hình
NAA
thái mô
mô sẹo
sẹo

(%)
(cm)
thành(ngày)
(%)
(cm)
thành(ngày)
0,0f
0,00f
00
00
0,0f
0,00f
--0
1
14,8e
0,57e
20 - 25
nâu đen
0
1
14,8e
0,57e
20 - 25
nâu đen
0
2
25,9de
1,07c
25
vàng nâu

0
2
25,9de
1,07c
25
vàng nâu
0
3
40,7d
0,77de
20 - 30
vàng nâu
0
3
40,7d
0,77de
20
30
vàng
0,2
0
0,0f
0,00f
- nâu
0,2
0
0,0f
0,00f
0,2
1

63,0c
0,80cde
20 - 24
trắng xanh, phát triển chậm
0,2
1
63,0c
0,80cde
20 - 24 trắng xanh, phát triển chậm
0,2
2
100,0a
2,30a
10 - 13
trắng xanh, phát triển nhanh
0,2
23
100,0a
2,30a
10
phátnâu
triển nhanh
0,2
100,0a
1,93a
10 -- 13
13 trắng xanh,
vàng
0,2
30

100,0a
1,93a
10 -- 13
vàng- nâu
0,5
0,0f
0,00f
0,5
01
0,0f
0,00f
- triển hệ rễ
0,5
85,2b
0,93dc
10 -- 13
trắng xanh, phát
0,5
12
85,2b
0,93dc
10
trắng
triển hệ
hệ rễ
rễ
0,5
100.0a
2,07a
10 -- 13

13
trắngxanh,
xanh, phát
phát triển

0,5
0,5

23

100.0a
100,0a

2,07a
1,57b

0,5 CV (%) 3

10,71
100,0a

1,57b

F(NAA*BA)

27,7**

13,88**

10

10 -- 13
13
10 - 13

trắng
pháttriển
triểnhệhệrễrễ
vàngxanh,
nâu, phát
vàng nâu, phát triển hệ rễ

CV (%)
10,71
F(NAA*BA)
27,7**
13,88**
Ghi chú: : kí tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột, **: có sự khác biệt rất
có ý nghĩa trong thống kê ở mức α = 0,01.