Cell based screening assay for inhibitors of porcine circovirus type2 (PCV2) replication

CELL-BASED SCREENING ASSAY FOR INHIBITORS OF
PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) REPLICATION

CARLA BIANCA LUENA VICTORIO 

 
YONG LOO LIN SCHOOL OF MEDICINE 
NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE 
& 
SWISS TROPICAL AND PUBLIC HEALTH INSTITUTE 
UNIVERSITY OF BASEL 
2010 


CELL-BASED SCREENING ASSAY FOR INHIBITORS OF
PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) REPLICATION

CARLA BIANCA LUENA VICTORIO 
(BSc. Molecular Biology and Biotechnology) 
University of the Philippines Diliman 

 

 
 
 
A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF 
 
JOINT MASTER OF SCIENCE IN INFECTIOUS DISEASES, 
VACCINOLOGY AND DRUG DISCOVERY 
 

 
 
 
 
YONG LOO LIN SCHOOL OF MEDICINE 
NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE 
& 
SWISS TROPICAL AND PUBLIC HEALTH INSTITUTE 
UNIVERSITY OF BASEL 
2010 


 
 

Acknowledgements 
 
This  research  project  wouldn’t  have  been  possible  without  the  support  and  funding  from 
Temasek  Life  Science  Laboratories  (TLL)  and  the  expertise  of  the  researchers  at  the  Animal  Health 
Biotechnology Group headed by Prof. Jimmy Kwang. My special thanks to my supervisor, Prof. Kwang, co‐
supervisor, Prof. Justin Chu, and mentor Mr. Anbu Karuppannan for giving me guidance and direction in 
this research endeavor.  
This Joint Msc program had been a wonderful, albeit stressful, experience and I am grateful for 
this  opportunity  bestowed  to  me  by  Novartis  Institute  of  Tropical  Diseases  (NITD),  Swiss  Tropical  and 
Public  Health  Institute  (STPH),  and  National  University  of  Singapore  (NUS).  My  special  thanks  to  Ms. 
Christine Mensch for all the much‐needed assistance during my stay in Basel, and to Ms. Susie Soh for the 
constant  gentle  reminders  in  Singapore.  I  would  like  to  acknowledge  the  program  lecturers,  most 
especially  Prof.  Reto  Brun,  for  providing  the  inspiration  to  delve into  the field  of  drug discovery.  To the 
JIBES, thank you for making life outside the lab and lecture memorable. To Patricia, who has been my life 
raft these past 2 years; to Casey, Mad, Ed, Sukriti, Hanwern, Neisha, and Ashley, thank you for all the fond 

memories. 
I wish to express my heartfelt thanks to the people of TLL who showed me how to make stress a 
bearable  part  of  daily  life.  To  Shaz,  Peypey,  Lu  ting,  Keiko,  Adi,  Ivan,  and  Ranjay,  thanks  for  all  your 
support;  and  to  Vin, who  has  been  my source of  respite  during  the  crucial moments,  thank  you for the 
companionship and strength. 
To  my  friends  back  home  in  the  Philippines  and  in  Basel,  who  still  give  me  constant  emotional 
support, thank you for all your wonderful efforts.  
Lastly,  I  would  like  to  express  my  whole‐hearted  gratitude  to  my  family  for  being  my  constant 
refuge. Thank you for the selfless love, caring support, and understanding and for allowing me to pursue 
my dreams independently.   

 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 1  
 


 
 

Table of contents 
Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  5 
List of Tables and Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  6 
List of Abbreviations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  8 
 
1.   Introduction 

1.1.   Porcine Circoviruses (PCV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 
 

1.1.1.   PCV Taxonomy, Morphology and Genetics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 

 

1.1.2.   Pathogenesis and Replication Cycle of PCV2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  14 
1.2.   PCV2‐Associated Diseases (PCVAD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 

 

1.2.1.   Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17  

 

1.2.2.   PDNS and other PCVAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  18 

 

1.2.3.   Treatment of PCVAD  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  19 
1.3.   Assay Development and Screening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  20 

 

1.3.1.   Cell‐based and Cell‐free Assays   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  21 

 

1.3.2.   Signal Detection Systems   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  22 

 

1.3.3.   Assay Development for HTS  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  23 
1.4.   Objectives of the Study  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  25 
 

2.   Materials and Methods 
2.1.   Maintenance of cell lines 

 

 

 

 

 

 

 

2.1.1.   Culturing PK15‐C1 Cells   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 

 

2.1.2.   Culturing 3D4/31 Cells   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  27 

 

2.1.3.   Culturing #4 Clone Hybridoma Cells  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

 

2.1.4.   Cryopreservation of Cells  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  28 

 

2.1.5.   Establishment of Cell Growth Curve  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 2  
 


 
 
2.2.  Production of High Titer PCV2 Stock 

 

 

 

 

 

 

 

2.2.1.   Infecting Cells and Harvesting Virus  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29  

 

2.2.2.   Increasing PCV2 Titer   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  30 

 

2.2.3.   Detection of Infection by Western Blot   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 

 

2.2.4.   Detection of Infection by PCR   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  31 
2.2.5.   Virus titration by IFA   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 
2.3.  Cell‐Based Screening Assay Optimization 

 

 

 

 

 

 

2.3.1.   Downscaling IFA to 384‐well Plate Format  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  33 

 

2.3.2.   Cell‐Based ELISA   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  33 
2.4.  Testing Efficacy of Reference Drugs Against PCV2 Replication 
2.4.1.   Establishment of Standard Curve for FI at Various   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  34                               
Seeding Densities 
2.4.2.   Evaluating Drug Cytotoxicity    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 
2.4.3.   Inhibition of PCV2 Replication with Reference Drugs  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 
2.5.  Generation of Graphs and Statistical Analyses    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   35 

 
3.   Results 
3.1.  Preparation of materials needed for the screening  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 
 

3.1.1.   Finding the best cell line for the screening assay  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

 

3.1.2.   Growth dynamics of PK15‐C1 cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  39 

 

3.1.3.   Generation of high titer PCV2 stock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  39 
3.1.4.   Large‐scale production of monoclonal antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40                              
(clone #4) 
3.2.  Scaling down of Assay to 384‐well plates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  42 
3.2.1.   Comparison of infection rates between glucosamine‐treated . . . . . . . . . . . . . . .  42                    
and untreated cells 
3.2.2.   Determining optimum cell seeding density, MOI, and . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  42               
duration of infection 
 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 3  
 


 
 
3.2.3.   Infection at higher MOI to induce 50% infection rates. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 
3.2.4.   Comparison of FITC with Alexa Fluor 546 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 
 
3.3.  Testing efficacy of reference drugs against PCV2 replication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 
3.3.1.   Standardizing the alamar blue cytotoxicity assay. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 
3.3.2.   Determining cell tolerance for CAPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

3.3.3.   Efficacy of CAPE against PCV2 replication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 
3.3.4.  Development of screening assay using cell‐ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 
 
4. Discussion  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   58 
 
5. References  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 
 
6. Appendix  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  79 
6.1.  Effect of glucosamine treatment on infection rates at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  79                
various seeding densities 
 
 
 
 
6.2.  Standard curves for FI and absorbance with alamar blue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  82 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 

 
 

Page | 4  
 


 
 

Summary 
 
PVC2  is  a  small  non‐enveloped  virus  that  causes  a  wide  array  of  porcine  diseases 
categorized  under  the  umbrella  term  PCV‐Associated  Diseases  (PCVAD).  To  date,  the  only 
available antiviral strategy, albeit ineffective against diseased pigs, is prevention via vaccination. 
Thus,  treatment  of  affected  pigs  requires  discovery  of  drugs  that  inhibit  viral  replication.  The 
focus  of  this  MSc  project  was  to  develop  a  suitable  primary  screening  assay  for  inhibitors  of 
PCV2 replication and subsequently perform a proof of concept trial using reference drugs. PK15‐
C1, a cell line previously shown to be highly permissive to PCV2 infection (Zhu et al., 2007), was 
used in the study to grow PCV2 to a high titer (106 TCID50/ml) and exhibited infection rates > 50% 
at 15 MOI in a 96‐well plate format. The assay was subsequently scaled down to 384‐well plates 
for  better  amenability  to  HTS,  and  the  major  part  of  the  study  was  aimed  at  optimizing  this. 
Infection with PCV2 was done both at low (< 10) and high (> 10) MOI but neither succeeded in 
inducing minimum of 50% infection rate. Even with proof of concept trials performed in 96‐well 
plates employing reference drugs CAPE, U0126, and MPA at 15 MOI resulted to infection rates 
lower than 50%. This sudden and unexpected drop in infectivity precluded further testing, so a 
cell‐based  ELISA,  which  does  not  require  minimum  infection  rate,  was  tested  instead.  Assay 
sensitivity was assessed by S/N and S/B ratios. Although S/N ratios were promising, S/B values 
were < 2 and sensitivity was found insufficient for further assay development. This was probably 
due  to  low  infection  rates  (<  5%)  resulting  from  stringent  blocking  and  washing,  which  were 

necessary  to  reduce  background  signals  in  ELISA.  Thus,  significantly  improving  infection  rates 
above  50%  is  necessary  to  optimize  these  cell‐based  screening  assays  for  inhibitors  of  PCV2 
replication. 
 
 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 5  
 


 
 

List of Tables and Figures 
 
Tables 
1. Introduction 
Table 1.1  

Common equations for determining assay performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24                              
and sensitivity 

 
 

Figures 

1. Introduction 
Figure 1.1  

PCV Ultrastructure and Genome Morphology  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 

Figure 1.2 

Genome Organization of Porcine Circoviruses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  14 

Figure 1.3 

Map of Worldwide Occurrence of PWMS  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 

Figure 1.4 

Flow of a Typical Drug Discovery Process  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

 
2. Materials and Methods 
 
3. Results 
Figure 3.1  

Detection of PCV2 from PK15‐C1 and 3D4/31 Cultures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38                              
by PCR and Western Blot 

Figure 3.2 

PCV2 Rep Expression in PK15‐C1 and 3D4/31 Cells  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 

Figure 3.3 

Growth Curve for PK15‐C1  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 

Figure 3.4 

Titration of PCV2 BJW  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 

Figure 3.5 

Titration of Concentrated PCV2 BJW  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   41 

Figure 3.6 

Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  43                              
in 384‐well Plates 48 HPI 

Figure 3.7 

Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43                              
in 384‐well Plates 60 HPI 

Figure 3.8 

72 HPI Rates at Different Cell Seeding Densities and MOI . . . . . . . . . . . . . . . . . .  44 

Figure 3.9 

48 HPI Rates at Different Cell Seeding Densities and MOI  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 

 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 6  
 


 
 
Figure 3.10 

60 HPI Rates at Different Cell Seeding Densities and MOI  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 

Figure 3.11 

Infection with High MOI (10, 20 and 25) PCV2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  48 

Figure 3.12 

Pre‐incubation of Virus (MOI 10, 20 and 25) with  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48                              
Cell Suspension Prior to Seeding 

Figure 3.13 

Comparison of Infection Rates With FITC and . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49                              
Alexa Fluor 546  

Figure 3.14 

Standard Curve for Alamar Blue FI Against Various . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  51                              
Seeding Densities 

Figure 3.15 

Growth Inhibition by CAPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  51 

Figure 3.16 

Inhibition of PCV2 Replication by CAPE  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   52 

Figure 3.17 

S/N Ratio From Various Seeding Densities, MOI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54                              
and Dilutions of Detecting Antibody 

Figure 3.18 

S/B Ratio From Various Seeding Densities, MOI  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  55                              
and Dilutions of Detecting Antibody 

Figure 3.19 

S/N and S/B Values From Three ELISA Trials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 

Figure 3.20 

Infection Rates in Cell ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  57 

 

 
4. Discussion 
 
 
5. References 
 
 
6. Appendix 

Figure 6.1  

Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79                              
in Cells Seeded at 2000 per well 

Figure 6.2 

Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80                              
in Cells Seeded at 3000 per well 

Figure 6.3 

Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81                              
in Cells Seeded at 3500 per well 

Figure 6.4 

Standard Curve for Alamar Blue FI Against Various . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  82                              

Seeding Densities 

Figure 6.5 

Standard Curve for Alamar Blue Absorbance at 570 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  83                              
Against Various Seeding Densities 

 
 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 7  
 


 
 

List of Abbreviations 
 

 
ANOVA  

Analysis of Variance 

ATCC   

American Type Culture Collection 

BBTV   

Banana Bunchy Top VIrus 

BFDV   

Beak and Feather Disease Virus 

BJW 

 

Beijing strain 

Cap 

 

Capsid 

CAPE   

Caffeic Phenethyl Ester 

CFDV   

Coconut Foliar Decay Virus 

CPE 

Cytopathic Effects 

 

DMEM   

Dulbecco’s Minimal Essential Medium 

DNA 

Deoxyribo Nucleic Acid 

 

EDTA   

EthyleneDiamineTetraacetic Acid 

EM 

 

Electron Microscopy 

FBS 

 

Fetal Bovine Serum 

FI 

 

Fluorescence Intensity 

FITC 

 

Fluorescein Isothiocyanate 

GAG 

 

Glycosaminoglycans 

GPCR   

G protein‐Coupled Receptor 

HEPES   

4‐(2‐HydroxyEthyl)‐1‐PiperazineEthaneSulfonic Acid 

HPI 

Hours Post‐Infection 

 

hPirH2   

Human p53‐induced RING‐H2 

HRP 

 

Horseradish Peroxidase 

HTS 

 

High Throughput Screening 

HTRF   

Homogeneous Time‐Resolved Fluorescence 

IHC 

 

Immunohistochemistry 

IFA 

 

Immunofluorescence Assay 

 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 8  
 


 
 
Ig 

 

Immunoglobulin 

ISH 

 

In Situ Hybridization 

kDa 

 

Kilo Daltons 

mAb 

 

Monoclonal Antibody 

MEM   

Minimal Essential Medium 

MEM/5% 

MEM with 5% FBS 

MOI 

 

Multiplicity of Infection 

MPA 

 

Mycophenolic Acid 

MPDH   

Inosine Monophosphate Dehydrogenase 

NPTr 

 

Newborn Pig Trachea 

NSK 

 

Newborn Swine Kidney 

OPD 

 

o‐Phenylenediamine Dihydrochloride 

ORF 

 

Open Reading Frame 

PBS 

 

Phosphate‐Buffered Saline 

PBS‐T   

PBS with 0.1% (v/v) Tween‐20 

PCR 

 

Polymerase Chain Reaction 

PCV 

 

Porcine Circovirus 

PCV1   

Porcine Circovirus Type 1 

PCV2   

Porcine Circovirus Type 2 

PCVAD   

Porcine Circovirus‐Associated Diseases 

PDNS   

Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome 

PFA 

 

Paraformaldehyde 

PK15   

Porcine Kidney‐15 

PK15‐C1 

Porcine Kidney‐15, Clone C1 

PMWS   

Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome 

POC 

Proof of Concept 

 

pPirH2   

Porcine p53‐induced RING‐H2 

PPV 

Porcine Parvovirus 

 

PRDC   

Porcine Respiratory Disease Complex 

PRRSV   

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 9  
 

 
 
RCF 

 

Relative Centrifugal Force 

RCR 

 

Rolling‐Circle Replication 

Rep 

 

Replicase 

RF 

 

Replicative Form 

RPM 

 

Revolutions per minute 

RPMI   

Roswell Park Memorial Institute 

RT 

 

Room Temperature 

S/B 

 

Signal to Background Ratio 

S/N 

 

Signal to Noise Ratio 

SDS 

 

Sodium Dodecyl Sulfate 

SIV 

 

Swine Influenza Virus 

SPA 

 

Scintillation Proximity Assay 

TCID50   

50% Tissue Culture Infective Dose  

uHTS   

Ultra High‐Throughput Screening 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 
 

Page | 10  
 


1.  INTRODUCTION  

 

  
 
 
 
 
 
 

Introduction 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 11  
 

1.  INTRODUCTION  
 

1.1 Porcine Circoviruses (PCV) 
1.1.1 PCV Taxonomy, Morphology and Genetics 
Porcine  circoviruses  (PCV)  are  small  non‐enveloped  viruses  with  a  circular  single‐
stranded DNA genome (1,700 nucleotides). The genome is packaged in an icosahedral capsid of 
17  nm  in  diameter  (Figure  1.1)  and  is  considered  the  smallest  virus  infecting  mammalian  cells 
(Tischer  et  al.,  1982;  Nawagitgul  et  al.,  2000).  PCV  was  serendipitously  identified  as  a  benign 
picornavirus‐like  contaminant  persisting  in  a  porcine  kidney  (PK‐15)  cell  line  without  causing 
visible cytopathic changes (Tischer et al., 1982). Further study later grouped PCV as a member of 
the Family Circoviridae and Genus Circovirus, and identified it as close relative to another animal 
circovirus  such  as  Psittacine  Beak  and  Feather  Disease  Virus  (BFDV)  and  other  similar  viruses 
from the Geminiviridae Family such as Coconut Foliar Decay Virus (CFDV), and from Nanoviridae 
Family such as Banana Bunchy Top Virus (BBTV) (Niagro et al., 1998; Pringle, 1998).  
 
 
 
 
 

  
(A) 

 

 

 
(B) 

 
Figure 1.1 | PCV Ultrastructure and Genome Morphology. EM micrographs of (A) purified PCV 
particles negatively stained with uranyl acetate. Scale bar = 100 nm; and (B) PCV single‐stranded 
 
circular DNA genome (scale bar = 1µm). Source: (Tischer et al., 1982). 
 
PCV  was  recently  divided  into  two  genotypes  (PCV1  and  PCV2)  based  on  the 
identification  of  PCV‐like  entities  in  lesions  derived  from  pigs  affected  with  Post‐Weaning 
Multisystemic  Wasting  Syndrome  (PMWS),  but  displaying  distinct  antigenic  properties  from 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 12  
 


1.  INTRODUCTION  
 
currently  known  PCV1  (Allan  et  al.,  1998;  Ellis  et  al.,  1998).  PCV1  and  PCV2  have  the  same 
ambisense  genomic  organization,  which  is  the  main  strategy  employed  by  PCV2  to  encode  six 
predicted overlapping Open Reading Frames (ORF), and three characterized proteins despite its 
small genome (Meehan et al., 1998). ORF1, which is expressed on the plus (leading) strand of the 
genome, encodes a replicase (Rep) protein essential for virus replication (Mankertz et al., 1998). 
Rep  has  two  splice  variants,  Rep’  and  Rep,  of  which  the  former  has  a  truncated  C‐terminal 
region; Rep’ and Rep both comprise the complex needed for initiation of replication. The other 
two  ORF  are  expressed  from  the  minus  (lagging)  strand:  ORF  2  encodes  the  major  structural 
protein (Cap) of the capsid (Nawagitgul et al., 2000), while ORF3 encodes an apoptosis‐inducing 
protein (Liu et al., 2005; Liu et al., 2007).  

Although  phylogenetic  analysis  of  genomic  sequences  of  PCV1  and  PCV2  found  in 
GenBank designate these viruses to different branches (Mankertz et al., 2004), they have similar 
morphology,  genomic  organization,  and  display  a  high  degree  of  sequence  homology.  PCV2 
ORF1 (Rep) has shown 83% nucleotide identity and 86% predicted protein homology with ORF 1 
of PCV1, while ORF 2 has shown 67% nucleotide identity and 65% predicted protein homology 
between the two genotypes (Allan and Ellis, 2000). ORF 3 differs significantly between PCV 1 and 
PCV  2  due  to  an  internal  stop  codon  in  PCV2  resulting  to  a  truncated  protein;  the  predicted 
amino acid identity between the two ORF3 is only 61.5% (Liu et al., 2005). 
PCV  is  thought  to  undergo  Rolling‐Circle  Replication  (RCR)  because  the  stem‐loop 
structure (Figure 1.2) characterizing the origin of replication is similar to plasmids, viruses, and 
bacteriophages  that  replicate  by  the  same  manner  (Finsterbusch  and  Mankertz,  2009).  The 
origin  of  PCV2  replication  is  located  in  the  intergenic  region  between  the  transcriptional  start 
sites  of  ORF  1  and  ORF  2.  The  loop  has  an  AxTAxTAC  sequence  where  replication  is  initiated, 
while the stem has a 10‐nucleotide palindrome that serves as binding site for the Rep complex. 
Downstream of the stem‐loop is  a  series of four hexanucleotide  repeats (H1, H2,  H3, and H4), 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 13  
 


1.  INTRODUCTION  
 
two of which (H1‐H2) function as Rep‐binding sites. The Rep complex comprised of Rep and Rep’ 
initiates replication by binding to the H1‐H2 hexamers and to the 10‐nucleotide palindrome on 
the right side of the stem. Binding to H1‐H2 leads to effective silencing of the Rep promoter and 
shuts down its transcription, in a negative feedback loop. Binding to the palindrome destabilizes 

the origin of replication on the stem, thus making it a target for Rep‐catalyzed nicking leading to 
a  free  3’‐OH  end  that  function  as  primer  for  the  host‐encoded  DNA  polymerase  II  to  catalyze 
strand elongation. A free plus‐strand genome is generated at the end of this cycle (Faurez et al., 
2009;  Mankertz  et  al.,  2004),  and  it  either  participates  in  another  round  of  replication  or 
packaged  into  the  capsid.  The  exact  mechanism  of  the  lagging  strand  synthesis  is  currently 
unknown, but at the end of the cycle a double‐stranded Replicative Form (RF) DNA is generated 
from which transcription occurs in both strands.  
 
 
 
 
 
 

 

Figure  1.2  |  Genome  Organization  of  Porcine  Circoviruses.  ORF  1  (Rep)  is  encoded  on  the 
positive  (leading)  strand,  while  ORF  2  (Cap)  and  ORF  3  are  encoded  on  the  negative  (lagging) 
strand  of  the  PCV  genome.  ORF3‐encoded  protein  has  a  C‐terminal  truncation  compared  with 
the  PCV1  homolog.  The  stem‐loop  structure  represents  the  origin  of  replication  located  in  the 
 
intergenic region between the 5’ ends of ORF 1 and ORF 2. The arrow indicates the nicking site 
from  where replication  is  initiated. Boxed regions  represent  hexanucleotide  repeats, which  act 
as binding sites for Rep proteins. Source: (Finsterbusch and Mankertz, 2009). 
 
 
 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 14  
 


1.  INTRODUCTION  
 
1.1.2 Pathogenesis and Replication Cycle of PCV2 
PCV2  is  capable  of  infecting  various  cell  types  from  various  species  (Liu  et  al.,  2005; 
Chaiyakul et al., 2010). Based on infection studies in 3D4/31 cells, a porcine‐derived monocytic 
cell  line,  PCV2  utilizes  the  surface  glycosaminoglycans  (GAG)  heparin,  heparan  sulfate  and 
chondroitin  sulfate‐B  on  the  host  cell  for  attachment  (Misinzo  et  al.,  2006).  The  virus  is 
afterwards  internalized  by  clathrin‐mediated  endocytosis  and  passes  through  the  endosome 
pathway, where uncoating requires an acidic environment (Misinzo et al., 2005). In PK15 cells, a 
porcine‐derived  kidney  cell  line,  inhibition  of  endosome  acidification  led  to  increased  PCV2 
disassembly  (Misinzo  et  al.,  2008)  suggesting  that  acidification  is  unnecessary  for  virus 
uncoating.  This  disparity  in  findings  was  speculated  to  be  due  to  distinct  serine  proteases 
catalyzing Cap protein cleavage found in the two cell lines.  
Subsequent to capsid disassembly, the PCV2 genome is converted to a double‐stranded 
RF  intermediate,  which  is  the  template  for  both  replication  and  transcription.  The  ORF1  is 
transcribed to produce Rep protein, and viral genome replication begins. PCV2 replication is cell 
cycle‐dependent and often slow because the virus DNA is “only able to enter the nucleus during 
mitosis when nuclear  material  is being distributed to the daughter cells” (Tischer et al.,  1987). 
However,  treatment  with  glucosamine  enables  the  PCV  DNA  to  “enter  the  nucleus  directly” 
through an  unknown  mechanism, hence  circumventing  the  need for  mitosis  before replication 
initiation (Tischer et al., 1987) and resulting to significantly higher infection rates. 
Once  the  negative‐strand  DNA  has  been  produced,  ORF  2  encoding  the  Cap  protein  is 
expressed. The protein has a mass of 26 kilo Daltons (kDa) and is found to self‐assemble to form 
the  characteristic  icosahedral  structure  of  PCV2  capsid  (Nawagitgul  et  al.,  2000).  The  viral 
genome  is  packaged  into  the  capsid  through  still  unknown  mechanism,  and  the  progeny  virus 

subsequently  form  paracrystalline  arrays  within  inclusion  bodies  under  the  cell  membrane  of 
infected cells, in preparation for release to the environment (Stevenson et al., 1999). At the end 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 15  
 


1.  INTRODUCTION  
 
of the cycle, the virus induces apoptosis of host cells through a pathway believed to be mediated 
by ORF 3 protein (Liu et al., 2006; Liu et al., 2005), which was shown to interact with a porcine 
homolog  of  human  ubiquitin  ligase  E3  hPirH2  (human  p53‐induced  RING‐H2).  ORF3  protein 
binding  destabilizes  pPirH2  (porcine  p53‐induced  RING‐H2)  and  results  to  increased  p53 
expression  and  subsequent  apoptosis  (Liu  et  al.,  2007;  Karuppannan  et  al.,  2010).  Apoptosis 
allows progeny virus to be disseminated into the environment and aids infection of neighboring 
cells, resulting to increased viral load (Karuppannan and Kwang, 2010).  
Although  both  PCV1  and  PCV2  have  been  detected  in  and  isolated  from  both  healthy 
and diseased pigs (Allan and Ellis, 2000; Chae, 2004; Harding, 2004) and despite the documented 
high  homology  between  the  two  virus  genomes,  only  PCV2  had  been  associated  with  porcine 
disease  while  PCV1  remained  benign.  Determinants  hypothesized  to  cause  the  differential 
pathogenic  potential  of  these  two  closely  related  viruses  are  ORF2  and  ORF3  proteins.  ORF2 
exhibits high sequence diversity between PCV1 and PCV2 (Fenaux et al., 2000; Larochelle et al., 
2002)  and  this  translates  to  alterations  in  host  cell  tropism  and  virus‐host  interactions  (Chae, 
2005). ORF3, which had been shown to induce p53 expression and subsequent cell death (Liu et 
al.,  2007;  Karuppannan  et  al.,  2010),  is  differentially  expressed  between  PCV1  and  PCV2,  and 
ORF3‐induced apoptosis was shown to play a key role in PCV2 pathogenesis by facilitating virus 

exit from the host cell and consequently aiding its subsequent spread (Karuppannan and Kwang, 
2010).  
 

1.2 PCV2‐Associated Diseases (PCVAD) 
Since its association with PMWS‐affected pigs, PCV2 has been implicated with a number 
of swine diseases later categorized under the umbrella term “PCV‐Associated Diseases” (PCVAD). 
PCVAD  is  divided  into  “clinical  syndromes  and  diseases  that  have  pre‐or  post‐natal 
manifestations”  (Grau‐Roma  et  al.,  2010)  and  include  Postweaning  Multisystemic  Wasting 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 16  
 


1.  INTRODUCTION  
 
Syndrome (PMWS), Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome (PDNS), Porcine Respiratory 
Disease  Complex  (PRDC),  Reproductive  Failure,  etc.  PCV2  is  a  ubiquitous  virus  and  has  been 
reported  from  all  continents  (Grau‐Roma  et  al.,  2010).  It  is  believed  to  be  horizontally 
transmitted  by  direct  contact  among  pigs  through  the  oronasal  route,  although  it  can  also  be 
shed  in  bodily  secretions  such  feces,  saliva,  urine,  milk,  and  semen  (Larochelle  et  al.,  2000; 
Shibata et al., 2003; Ha et al., 2009), which may contribute to viral transmission. 
  
1.2.1 Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) 
PMWS is a well‐established porcine disease that has existed since 1962 (Jacobsen et al., 
2009) although it was first detected only in 1996 (Ellis et al., 1998). To date, it has been reported 
in  5  continents  (Figure  1.3)  and  primarily  affects  postweaned  piglets  aged  7‐15  weeks.  It  is 

diagnosed by 6 clinical signs which are: wasting, shortness of breath or dyspnea, enlarged lymph 
nodes,  diarrhea,  pallor,  and  jaundice  or  yellowing  of  the  skin  (Harding,  2004;  Chae,  2005). 
Isolation  of  microscopic  lymphoid  lesions  with  PCV2  antigen  detected  either  through  in  situ 
hybridization  (ISH)  or  immunohistochemistry  (IHC)  is  also  necessary  to  diagnose  PMWS  (Chae, 
2004).  Although  PCV2  is  necessary  to  cause  PMWS,  it  is  not  sufficient  and  it  only  causes  the 
disease  in  the  presence  of  either  immunomodulatory  agents  or  other  swine  pathogens.  The 
most  commonly  found  pathogens  in  PCV2  co‐infections  resulting  to  PMWS  include  porcine 
parvovirus (PPV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), swine influenza 
virus  (SIV),  Streptococcus  suis,    and  Mycoplasma  hyopneumoniae.  Noninfectious 
immunomodulators  leading  to  the  disease  include  keyhole  limpet  hemocyanin  in  incomplete 
Freund’s  adjuvant  (Kennedy  et  al.,  2000;  Tomás  et  al.,  2008).  One  hypothesis  put  forward  to 
explain  this  phenomenon  is  that  lymphoid  depletion  caused  by  PCV2  infection  leads  to  an 
immunocompromised  state  in  pigs  resulting  to  enhanced  susceptibility  to  other  swine 
pathogens. This is supported by the observation of successful induction of PMWS in postweaned 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 17  
 


1.  INTRODUCTION  
 
pigs  once  maternal  antibodies  have  waned,  and  following  immunosuppression  caused  by 
immunomodulators. 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
Figure 1.3 | Map of Worldwide Occurrence of PMWS. Countries around the world are mapped 
along  with  the  initial  reports  of  PMWS.  The  disease  has  been  reported  from  North  and  South 
America,  Europe,  and  Asia.  Source:  (Nawagitgul  et  al.,  2000;  Chae,  2004).  PCV2  but  not  the 
 
disease  has  been  reported  from  Australia  and  New  Zealand  (Raye  et  al.,  2005;  Muhling  et  al., 
2006). 
 
 
1.2.2 PDNS and other PCVAD 
PDNS is a fatal but sporadic disease first recognized in 1993 and affects pigs 12‐14 weeks 
of age (Chae, 2005). It has been reported in Asia and North America and is characterized by the 
appearance  of  primary  lesions  in  both  the  skin  and  kidney.  High  mortality  rates  are  observed 
upon onset of anorexia, weight loss and depression. Similar with PMWS, PCV2 is necessary but 
insufficient  to  cause  PDNS  and  the  disease  results  only  through  co‐infection  with  other  swine 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 18  
 


1.  INTRODUCTION  

 
pathogens such as Pasteurella multocida and PRRSV. In contrast with PMWS, PCV2‐filled lesions 
in PDNS‐affected pigs are localized in kidneys and not in lymphoid tissues. 
PRDC is another health problem observed in pigs 16‐22 weeks of age. It is also caused by 
co‐infections of PCV2 with PRRSV, SIV, M. hyopneumoniae, and other swine pathogens. PRDC is 
diagnosed  by  meeting  criteria,  which  includes  presence  of  respiratory  signs  such  as  prolonged 
dyspnea,  pulmonary  microscopic  lesions  with  PCV2  antigens,  and  absence  of  lymphoid  lesions 
characteristic of PMWS (Ellis et al., 2004).   
PCV2 is also associated with high rates of abortion, stillbirths and fetal mummification. 
PCV2 has been isolated from specimens with reproductive failure at different stages of gestation 
(Sanchez  et  al.,  2001),  although  characteristic  lesions  were  absent  in  recovered  fetuses.  Aside 
from  the  diseases  and  syndromes  mentioned,  PCV2  has  been  associated  with  other  infectious 
porcine  diseases  including  necrotizing  lymphadenitis,  congenital  tremors,  and  other  hepatic, 
enteric and renal diseases (Ellis et al., 2004; Chae, 2005). 
 
1.2.3 Treatment of PCVAD 
Agents that inactivate PCV2 could potentially aid in the treatment of PCVAD. PCV2 is a 
non‐enveloped  virus  and  therefore resistant  to  lipid‐dissolving  disinfectants  commonly  used  in 
farms  such  as  alcohol,  chlorhexidine,  and  phenol.  Moreover,  PCV2  is  highly  thermostable  and 
cannot be attenuated successfully with heating and drying (O'Dea et al., 2008). However, PCV2 
can  be  inactivated  by  alkaline  disinfectants,  oxidizing  agents  and  quaternary  ammonium 
compounds (Martin et al., 2008), although the success rate has yet to be studied. 
Several vaccines against PCV2, which express the Cap protein, had been developed and 
are currently available in the market: Suvaxyn® (Fort Dodge Animal Health Inc) is a whole‐virus 
chimeric 

vaccine 

derived 

from 

attenuated 

PCV1 

expressing 

Cap 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

from 

PCV2 

Page | 19  
 


1.  INTRODUCTION  
 
TM

(FortDodgeAnimalHealth, 2009); Ingelvac® CircoFLEX  (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc) is 
a  subunit  vaccine  containing  purified  Cap  protein  expressed  from  Baculovirus 
(BoehringerIngelheimVetmedica,  2010); CircumventTM vaccine (Intervet Inc., Millsboro, Denver, 
USA) is derived from killed baculovirus expressing purified PCV2 Cap antigen (Schering‐Plough, 

2009) . Both CircoFLEXTM and Suvaxyn® are single‐dose vaccines, while CircumventTM is a 2‐dose 
vaccine. All three vaccines are recommended to be given to healthy piglets prior to weaning and 
had  been  tested  in  field  conditions.  Trial  immunizations  resulted  to  reduction  of  viremia  in 
unchallenged  pigs  (Kixmöller  et  al.,  2008;  Segalés  et  al.,  2009)  and  development  of  long‐term 
protective memory upon experimental triple challenge with PCV2‐PPV‐PRRSV (Shen et al., 2010). 
Other  PCV2  vaccines  currently  being  developed  include  DNA  vaccines,  subunit  vaccines, 
recombinant virus vaccines, and chimeric PCV1‐PCV2 vaccines (Blanchard et al., 2003; Kamstrup 
et al., 2004; Song et al., 2007; Wang et al., 2007).  
Although  commercially  available  vaccines  lead  to  significant  reduction  in  PCV2  viremia 
and induce protective immunity against challenge with PCV2, these do not benefit pigs that are 
already affected with PCVAD. Treatment of diseased pigs entails administration of antivirals that 
limit PCV2 replication but unfortunately, no such drug exists to date.  
 

1.3 Assay Development and Screening 
Since  PCV2  causes  a  wide  array  of  swine  diseases  and  vaccination,  which  is  the  only 
antiviral  strategy  currently  available,  confers  only  limited  protection,  there  is  urgent  need  for 
developing drugs that can cure diseased pigs. No such drugs exist to date and they have to be 
discovered.  The  drug  discovery  process  is  usually  divided  into  two  phases:  1)  Research  and  2) 
Development.  The  research  phase  deals  with  the  identification  of  an  array  of  suitable 
compounds  with  desired  effect  against  a  selected  target,  while  the  development  phase  deals 
with (1) optimization of the compound for greater potency and efficacy, and (2) formulation into 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 20  
 

1.  INTRODUCTION  
 
a  marketable  drug  suitable  for  consumption.  The  research  phase  typically  begins  with 
identification and selection of a target, for which an assay to determine target response has to 
be  developed.  The  research  phase  ends  with  the  candidate  selection  process,  where  hits  are 
narrowed down to a few candidates and at which the development phase begins with the proof 
of concept (POC) trials in animal models. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  1.4  |  Flow  of  a  Typical  Drug  Discovery  Process.  Drug  discovery  is  divided  into  two 
phases:  1)  Research  and  2)  Development.  The  research  phase  deals  with  identification  of 
  compounds  against  a  selected  target,  while  the  development  phase  deals  with 
candidate 
optimizing  the  compound  for  human  consumption  and  formulating  as  a  suitable  marketable 
drug. Source: (Novartis, 2010) 
 
 
1.3.1 Cell‐based and Cell‐free Assays 
Generally,  assays  in  drug  discovery  are  classified  as  either  cell‐based  or  target‐based 
techniques.  In  the  former,  whole‐cell  phenotypic  responses  are  measured;  while  in  the  latter, 
binding and kinetics of individual molecules (the target and candidate drug) are measured in cell‐
free  systems.  Cell‐based  assays  are  further  classified  into  three  broad  categories:  (1)  second 
messenger assays, (2) reporter gene assays, and (3) cell proliferation assays. Second messenger 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 

 
 

Page | 21  
 


1.  INTRODUCTION  
 
assays  involve  measurement  of  signal  transduction  resulting  from  activation  of  cell‐surface 
receptors,  such  as  in  the  discovery  of  ion  channel  activators  and  inhibitors  (Gonzales  et  al., 
1999). Reporter gene assays monitor responses at the transcriptional and translational levels of 
cells  transfected  with  reporter  genes  depending  on  the  expression  of  the  reporter  upon 
activation of the target gene (Mankertz et al., 2003). These offer advantages such as availability 
of  multiple  instrumentation  platforms,  relative  low  cost  of  reagents,  and  high  amenability  for 
HTS  (Johnston,  2002).  Lastly,  cell  proliferation  assays  monitor  the  activated  or  stunted  cell 
growth upon activation of the target. 
Cell‐free or biochemical assays, on the other hand, are divided into 1) enzyme assays, 2) 
receptor‐mediated  assays,  and  3)  immunoassays.  Common  drug  targets  include  five  main 
protein families: G protein‐couples receptors (GPCRs), kinases, proteases, nuclear receptors, and 
ion channels (Inglese et al., 2007). Although responses measured in cell‐free assays are generally 
less  complicated  due  to  the  absence  of  whole  biological  systems,  hits  obtained  are  often 
confounded  by  nonspecific  binding  and  background  signals  from  the  compounds  being  tested 
(Feng et al., 2007; Feng et al., 2008).  
 
1.3.2 Signal Detection Systems 
Prior to the 21st century, majority of screening assays employed radiometric methods of 
signal detection, often through Scintillation Proximity Assay (SPA; Amersham Pharmacia Biotech) 
and FlashPlatesTM (NEN Life Science Products, Boston, MA).  The technology is based on either 
SPA  microbeads  or  FlashPlateTM  surfaces  containing  scintillant  and  coated  with  the  target  of 

interest.  Binding  of  a  radiolabeled  molecule  to  the  target  brings  the  radioisotope  in  close 
proximity to the solid support, leading to energy transfer between the emitted beta particle and 
the  scintillant  and  subsequent  release  of  photons.    However,  radiometric  assays  were  slowly 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 22  
 


1.  INTRODUCTION  
 
phased  out  due  to  safety  issues,  limited  reagent  stability,  and  relatively  long  read  times 
(Hertzberg and Pope, 2000).  
Fluorescence is now the most widely used detection system in screening assays due to 
its intrinsic sensitivity, safety, short read times, the development of modified highly fluorescent 
probes such as the Alexa Fluor (Molecular Probes, Invitrogen) and Cy family of dyes (Amersham 
Life Sciences), and the advent of more sophisticated fluorescence microplate readers  (Hertzberg 
and  Pope,  2000).  Sensitivity  in  fluorescence‐based  assays,  however,  is  often  limited  by 
background signal arising from assay reagents, containers, or compounds being tested, and this 
could also lead to high amounts of false‐positive hits. This problem, however, can be overcome 
by  time‐resolved  techniques  such  as  Homogeneous  Time‐Resolved  Fluorescence  (HTRF)  using 
lanthanide cryptates as dyes.  
Another  method  to  circumvent  problems  resulting  from  high  background  signal  is 
through  luminescent  detection  systems  (Inglese  et  al.,  2007).  Luminescence  generates  light 
through  catalytic  reactions  on  a  substrate,  either  through  an  enzyme  (Bioluminescence)  or 
through  decay  of  an  unstable  chemical  intermediate  (Chemiluminescence)  (Schweitzer  and 
Abriola, 2002). It doesn’t depend on an external source of excitation energy, hence significantly 

reducing background signals. 
 
 
1.3.3 Assay development for HTS 
Once  the  format  and  detection  system  have  been  chosen,  the  assay  is  developed  as  a 
bench  top  method  with  low  throughput,  and  later  miniaturized  to  smaller‐volume  formats 
(typically  using  microtiter  plates)  amenable  to  high‐throughput  screening  (HTS).  Factors  to 
consider  when  developing  an  assay  include:  (1)  defined  response  to  be  measured,  (2)  clear 
parameter‐response  dependence,  and  (3)  lag  time  between  stimulation  with  the  compounds 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication 
 
 

Page | 23