phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (tridax procumbens l.) mọc hoang ở thành phố cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY
CÚC MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.)
MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS - TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

TÔ HOÀNG DIỄM
MSSV: 3108481
LỚP: VSVH-K36

Cần Thơ, Tháng 12/ 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY CÚC
MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.)
MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ

Cần Thơ, Tháng 12/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

PGs-Ts. Nguyễn Hữu Hiệp

Tô Hoàng Diễm

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã
nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận
tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được
luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh
vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn
thành luận văn này.
Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ
những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về
mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống.
Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn
thành công.
Cần Thơ, ngày 17 tháng 11 năm 2013

Tô Hoàng Diễm


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

TÓM LƯỢC
Mười bảy dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc
mui (Tridax procumbens) trong môi trường PDA. Phần lớn vi khuẩn đều có khuẩn lạc
dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, dạng hình que, Gram âm và có khả
năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định N và tổng hợp IAA của vi khuẩn
cho thấy, lượng ammonium và IAA này tăng cao nhất vào ngày thứ tư và giảm dần sau
sáu ngày chủng. Dòng R6, T3, L4, L5, L6 có khả năng tổng hợp lượng NH4+ cao nhất
so với các dòng còn lại (0,213 µg/ml - 0,221 µg/ml). Tuy nhiên các dòng vi khuẩn này
tổng hợp lượng ammonium khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở ngày thứ tư sau khi
chủng và lượng IAA cao nhất (16,67 µg/ml) do dòng R5 tổng hợp trong điều kiện
không có tryptophane vào ngày thứ 6 sau khi chủng. Bên cạnh đó, dòng L5 có khả
năng hòa tan lân cao nhất so với các dòng còn lại, đồng thời cũng có khả năng kháng
khuẩn. Hai dòng R2 và T2 có khả năng kháng lại hai vi khuẩn E. coli và Aeromonas
hydrophila gây bệnh.
Kết quả giải trình tự gene 16S-rDNA và so sánh với dữ liệu của ngân hàng gene
NCBI, dòng L5 được nhận diện là KC182058.1 Bacillus subtilis dòng M1, dòng R2 là
KC443084.1 Bacillus subtilis dòng BAB - 244 và dòng T2 là KC465726.1 Bacillus
subtilis dòng 14 với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 99%, 99% và 95%.
Từ khóa: Ammonium, hòa tan lân, IAA, khả năng kháng khuẩn, phân lập, vi
khuẩn nội sinh.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... viii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................3
2.1 Thành phố Cần Thơ ............................................................................................... 3
2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ ...........................................................................3
2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ.................................3
2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens) ............................................................. 5
2.2.1 Phân loại thực vật ............................................................................................... 5
2.2.2 Mô tả cây cúc mui ............................................................................................... 6
2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui .............................................6
2.2.4 Đặc tính sinh học ................................................................................................ 7
2.2.5 Thành phần hoá học ............................................................................................ 7
2.2.6 Dược tính ............................................................................................................9
2.2.7 Công dụng, chỉ định và phối hợp ........................................................................9
2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh .............................................................................10
2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh ............................................................................10
2.3.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .............................................................. 13
2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh ..................20

2.3.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh lên hình thái và chức năng bộ rễ cây ..........23
2.3.5 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ............................................................. 23

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trên thế giới và trong
nước ............................................................................................................................... 30
2.4.1 Trên thế giới ......................................................................................................30
2.4.2 Trong nước ........................................................................................................32
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................34
3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................ 34
3.1.1 Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 34
3.1.2 Địa điểm thực hiện ............................................................................................ 34
3.1.3 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 34
3.1.4 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 34
3.1.5 Hóa chất ............................................................................................................35
3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 35
3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui ..................................................35
3.2.2 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn. ..................................................................37
3.2.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. .........39
3.2.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập. ....41

3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được.
....................................................................................................................................42
3.2.6 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn ............................. 43
3.2.7 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .........................................44
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ...................................................................................48
4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc........................................................................................... 49
4.1.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn .................................................................................52
4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập
dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. .................................................54
4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và
thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) .......................................................... 54
4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá
của cây cúc mui (L1 - L7) .......................................................................................... 56
Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và
nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ............................................58
4.3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân ở các dòng vi khuẩn phân lập được
trên môi trường PDA. .................................................................................................60
4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) ở các dòng vi
khuẩn được nuôi trong môi trường Nfb lỏng không bổ sung Tryptophan ............61

4.4.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân
cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) ..................................................................62
4.4.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây
cúc mui (L1- L7) ........................................................................................................64
4.4.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2
được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ......................................................... 65
4.5 Kết quả khả năng tạo kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn .................................66
4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột (E. coli).............66
4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh cá (Aeromonas hydrophila)....67
4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.......................... 69
4.6.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng R2 ................................................70
4.6.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng T2 ................................................71
4.6.3 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng L5 ................................................73
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................76
5.1 Kết luận ..................................................................................................................76
5.2 Kiến nghị ................................................................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 77
PHỤ LỤC .....................................................................................................................95

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Thành phần môi trường PDA ..........................................................................37
Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb ............................................................................37
Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP lỏng.................................................................42
Bảng 4. Thành phần môi trường LB agar .....................................................................44
Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR ...................................................... 46
Bảng 6. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh ................46
Bảng 7. Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây cúc
mui trên môi trường PDA .............................................................................................. 49
Bảng 8. Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường
PDA ............................................................................................................................... 52
Bảng 9. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA
.......................................................................................................................................53
Bảng 10. Lượng ammonium trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 R8 và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ...................................................56
Bảng 11. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường
NBRIP đặc .....................................................................................................................61
Bảng 12. Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8 và
T1-T4) tổng hợp được theo thời gian(µg/ml) ................................................................ 63
Bảng 13. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn
E.coli .............................................................................................................................. 67
Bảng 14. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila ..................................................................................................68

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ ............................................................. 4
Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) ....................................................................5
Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ .............................................................. 6
Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6) .................................................................8
Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli ...............................................................................29
Hình 6: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila.....................................................................30
Hình 7: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ....................................................... 41
Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA ........................................................ 43
Hình 9: Gel trước khi chụp hình DNA .........................................................................47
Hình 10: Môi trường NFb bán đặc (a) và vòng pellicle xuất hiện sau khi chủng vi
khuẩn (b) ........................................................................................................................ 48
Hình 11: Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA Agar…..
.......................................................................................................................................51
Hình 12: Vi khuẩn Gram âm (dòng T4) và vi khuẩn Gram dương (dòng L5) được
chụp dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100X. ............................................................... 53
Hình 13: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1- L7) tạo ra ............57
Hình 14: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra ....................... 59
Hình 15: Vòng halo do vi khuẩn tạo ra khi chủng vào trong môi trường NBRIP. ......60
Hình 16: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1 - L7) tạo ra được phân lập từ
lá của cây cúc mui .........................................................................................................64
Hình 17: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân
và lá của cây cúc mui .....................................................................................................66
Hình 18: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn T4 với vi khuẩn E. coli theo thời
gian ................................................................................................................................ 67

Hình 19: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn L2 và L3 với vi khuẩn Aeromonas
hydrophila gây bệnh ở cá .............................................................................................. 68
Hình 20: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S rDNA ................................ 70

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vi

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Hình 21: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R2 ........................................71
Hình 22: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng T2.........................................72
Hình 23: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng L5.........................................74

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vii

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
16S-rRNA

16S ribosomal RNA

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

Đ.K

Đường kính

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EDTA

Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid

IAA

Indol -3- acetic acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

PGPR

Plant Growth Promoting Rhizobacteria

VKNS

Vi khuẩn nội sinh

VSV

Vi sinh vật

Chuyên ngành Vi sinh vật học

viii

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Thiên nhiên là một nguồn nguyên liệu của các loại dược phẩm khoảng hàng ngàn
năm nay và một con số ấn tượng của các loại thuốc ngày nay đã được điều chế từ tài
nguyên thiên nhiên. Một số loài thực vật và các giá trị cần thiết của chúng đã được
nghiên cứu và công bố, nhưng cho đến nay nhiều loài trong số chúng vẫn còn chưa
được khám phá. Vì vậy, điều cần thiết để khám phá công dụng của chúng và để tiến
hành nghiên cứu ngành dược liệu học và y học để khám phá ra các loại thuốc chữa

bệnh. Cây cúc mui (Tridax procumbens L.) là một thảo dược quý được tìm thấy ở khắp
Ấn Độ nhưng tiếc là nó là một trong những cây dược liệu bị bỏ quên.
Cây cúc mui là một loại thảo dược thường được sử dụng trong y học dân tộc,
thuộc họ Cúc. Nó có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Mỹ, nhưng nó đã được lan rộng ở
vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và giữa các vùng ôn đới trên toàn thế giới. Cây cúc mui
là một loại cây thân cỏ, mọc lan bò (procumbens) và dược tính của nó rất có giá trị.
Từ thuở xa xưa con người đã biết sử dụng các cây cỏ để làm thuốc phòng chữa
bệnh và bảo vệ sức khỏe. Cùng với sự tồn tại và phát triển của lịch sử loài người,
những kinh nghiệm nghiên cứu, sử dụng dược liệu để làm thuốc phòng chữa bệnh
cũng ngày một phát triển. Trong sự nghiệp chăm sóc sức khỏe hiện nay, cây thuốcdược liệu càng được quan tâm và phát triển mạnh mẽ hơn. Theo số liệu thông kê gần
đây ở nước ta có hơn 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật.
Hàng năm cả nước sử dụng khoảng 50.000 tấn dược liệu ( />cvn2.html, ngày 20/8/2113). Với số lượng lớn như vậy có rất nhiều cây thuốc, vị thuốc
còn xa lạ với người dùng, hoặc nghe nhắc đến nhiều nhưng chưa hiểu đầy đủ về
chúng.
Ngày nay, dân số thế giới đang gia tăng với tốc độ đáng báo động, và một loạt
các vấn đề mới về sức khỏe tăng lên. Ví dụ, số lượng các vi khuẩn kháng thuốc tăng
lên là một nguyên nhân khá được quan tâm. Sự nghiên cứu về thuốc kháng sinh và các
sản phẩm tự nhiên khác từ vi sinh vật là quan trọng trong cuộc chiến toàn cầu chống
lại vấn đề ngày càng tăng của việc kháng kháng sinh. Vì vậy, để đối phó với số lượng
ngày càng tăng của mầm bệnh kháng thuốc, vi khuẩn nội sinh (VKNS) có thể phục vụ
như là một nguồn tiềm năng của thuốc kháng sinh mới.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng VKNS thực vật đã và đang là
những đề tài được nghiên cứu rộng rãi trên khắp thế giới. Tập đoàn vi sinh vật nội sinh
hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng
và đồng hóa tốt. Ngoài ra chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng
khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) nhưng chúng cũng có khả năng kích thích cây chủ sản
xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất
ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Hardoim et al., 2008). Nhiều nghiên cứu
từ các cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất (Wedelia calendulacea,
Less), cây Diếp cá (Houttuynia cordata, Thunb), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus
urinaria, Less)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ
chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl nnonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen,
camphen,… có tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus
aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006;) vì nguyên liệu làm thuốc từ
các cây cỏ rất ít độc, rẻ tiền, dễ kiếm mà hiệu quả cao, sử dụng đơn giản, thân thiện
với môi trường và giúp hạn chế điều kiện kháng thuốc. Vì vậy, đề tài: “Phân lập vi
khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) ở Cần Thơ” nhằm nghiên
cứu các tác động có ích và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội trong cây
dược liệu nói chung và cây cúc mui nói riêng ở thành phố Cần Thơ.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui
(Tridax procumbens) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả
năng kháng khuẩn.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Thành phố Cần Thơ
2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ
Cần Thơ là một thành phố trực thuộc trung ương, nằm bên hữu ngạn của sông
Hậu, thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là một trong 5 thành phố trực thuộc
trung ương của Việt Nam. Ngày 24 tháng 6 năm 2009, thành phố Cần Thơ chính thức
được Thủ tướng Chính phủ ra quyết định công nhận là đô thị loại 1 của Việt Nam
thuộc vùng kinh tế trọng điểm của vùng đồng bằng sông Cửu Long và là vùng kinh tế
trọng điểm thứ tư của Việt Nam (, ngày 23/11/2013).
2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ
 Về vị trí địa lý: Thành phố Cần Thơ nằm ở vùng hạ lưu của Sông Mê Kông và
ở vị trí trung tâm đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, nằm cách thành phố Hồ Chí
Minh 169 km, cách thành phố Cà Mau 178 km, cách thành phố Rạch Giá 128 km, cách
biển khoảng 100 km theo đường sông Hậu.
Cần Thơ có tọa độ địa lý 105o13’38” - 105o50’35” kinh độ Đông và 9o 55’08” 10o19’38” vĩ độ Bắc, trải dài trên 55 km dọc bờ Tây sông Hậu. Phía bắc giáp tỉnh An
Giang, phía đông giáp tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Vĩnh Long, phía tây giáp tỉnh Kiên
Giang, phía nam giáp tỉnh Hậu Giang. Diện tích nội thành là 53 km². Thành phố Cần
Thơ có tổng diện tích tự nhiên là 1.409,0 km², chiếm 3,49% diện tích toàn vùng và dân
số vào khoảng 1.200.300 người, mật độ dân số tính đến 2011 là 852 người/km². Cần
Thơ cũng là thành phố hiện đại và lớn nhất của cả vùng hạ lưu sông Mê Kông
(, ngày 23/11/2013) (Hình 1).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ
(*Nguồn: />o-qhsdd+den+nam+2020, ngày 30/07/2013)

 Về điều kiện tự nhiên: Thành phố Cần Thơ nằm toàn bộ trên đất có nguồn gốc
phù sa sông Mê Kông bồi đắp và được bồi lắng thường xuyên qua nguồn nước có phù
sa của dòng sông Hậu. Địa chất trong thành phố được hình thành chủ yếu qua quá trình
bồi lắng trầm tích biển và phù sa của sông Cửu Long, trên bề mặt ở độ sâu 50 mét có
hai loại trầm tích là Holocen (phù sa mới) và Pleistocene (phù sa cổ).
Địa hình nhìn chung tương đối bằng phẳng, phù hợp cho sản xuất nông, ngư
nghiệp, với độ cao trung bình khoảng 1 - 2 mét dốc từ đất giồng ven sông Hậu, và
sông Cần Thơ thấp dần về phía nội đồng tức là từ phía đông bắc sang phía tây nam.
Bên cạnh đó, thành phố còn có các cồn và cù lao trên sông Hậu như Cồn Ấu, Cồn
Khương, Cồn Sơn, Cù lao Tân Lập. Thành phố Cần Thơ có 3 dạng địa hình chính là
Địa hình ven sông Hậu hình thành dải đất cao là đê tự nhiên và các cù lao ven sông
Hậu.
Ngoài ra do nằm cạnh sông lớn, nên Cần Thơ có mạng lưới sông, kênh, rạch khá
chằng chịt. Vùng tứ giác Long Xuyên, thấp trũng, chịu ảnh hưởng lũ trực tiếp hàng
năm. Đồng bằng châu thổ chịu ảnh hưởng thủy triều cùng lũ cuối vụ.
Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm,
không có mùa lạnh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12

tới tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C, số giờ nắng trung bình cả
năm khoảng 2.249,2 giờ, lượng mưa trung bình năm đạt 1600 cm. Độ ẩm trung bình
Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

năm giao động từ 82% - 87%. Do chịu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có lợi thế
về nền nhiệt độ, chế độ bức xạ nhiệt, chế độ nắng cao và ổn định theo hai mùa trong
năm (, ngày 23/11/2013).
Các lợi thế này rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của sinh vật, có thể tạo
ra một hệ thống nông nghiệp nhiệt đới có năng suất cao, với nhiều chủng loại cây con,
đặc biệt là các cây cỏ hoang dại có tác dụng làm thuốc chẳng hạn như cây cúc mui
(Tridax procumbens).
2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens)
2.2.1 Phân loại thực vật (Amita et al., 2012)
Giới : Thực vật
Ngành phụ: Tracheobionta (Thực vật có mạch)
Phân loại: Magnoliophyta (Thực vật có hoa)
Lớp: Magnoliopsida (Cây song tử diệp)
Lớp phụ: Asteridae
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae (Cúc)
Giống (chi): Tridax

Loài: Tridax procumbens (L.)
Tên khác: Cúc mui, Sài lan, Sài lông, Thu thảo

Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens)
(*Nguồn: ngày 01/08/2013)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

2.2.2 Mô tả cây cúc mui (Amita et al., 2012)
Cây cúc mui là cây thân thảo sống lâu năm.
Thân cao từ 30 - 50 cm, có lông trắng dày, phân nhánh, mọc bò sát mặt đất.
Lá lá đơn, mọc đối, có lông ở cả hai mặt, mép có răng to, nhọn, không đều.
Cụm hoa hình đầu, mọc ở ngọn thân, trên một cán dài 20 - 30cm. Hoa cái hình
môi, màu trắng; hoa lưỡng tính hình ống, màu vàng.
Quả bế còn lông, mào lông do 10 lông to dài và 10 lông ngắn.
Đài hoa được tạo thành bởi các vảy hoặc mào lông ngắn lại.
Hạt rơi xuống phôi và không có phôi nhũ.
Cây ra hoa, kết quả tháng 4 - 6 và tháng 8 - 12.

Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ
(*Nguồn: ngày 01/08/2013)

Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Tridacis Procumbentis.
2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui
Cây gốc ở Trung Mỹ được truyền vào nước ta, nay mọc hoang ở bờ đường, bãi
cỏ, đất hoang, đồi núi. Để làm thuốc, thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi
khô ( ngày 24/11/2013).
Nó không thể vi nhân giống bằng các cách thức như ở thực vật ví dụ như cắt. Sự
nhân giống thông qua các hạt gây ra các biến thể. Các phương pháp đã được phát triển
để bảo tồn sự di chuyển của chúng thông qua phương pháp vi nhân giống (Saini et al.,
2008). Cây cúc mui phân bố rộng rãi là do thân sản xuất nhiều hạt và phát tán
(Chauhan và Germination, 2008). Không giống như các cây lâu năm, cây cúc mui
không có bất kỳ phương tiện phát tán, vì vậy nó được phân tán gần như hoàn toàn
Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

bằng hạt của nó. Các chùm của lông trên quả bế cho phép chúng được phát tán theo
gió.
2.2.4 Đặc tính sinh học
Cây cúc mui là loài thảo dược lâu năm sinh sản bằng hạt và yêu cầu phải được
tiếp xúc đầy đủ cho sự phát triển. Các loại thảo mộc này chịu được hạn hán, nhiệt độ
và độ ẩm, ô nhiễm môi trường, bờ biển, độ dốc và gió (Amita et al., 2012).
2.2.5 Thành phần hoá học

Một số thành phần hóa học đã được nghiên cứu từ cây cúc mui như: alkaloid,
flavonoid, carotenoid, β-sitisterol, n-hexane, acid fumaric, luteolin, quercitin, oxoester,
acid lauric, myristic, palmitic, arachidic, acid linoleic và tannin…(Singh và Ahirwar,
2010). Trước đây, nó đã được báo cáo về sự hiện diện của dexamethasone, luteolin,
glucoluteolin, betasitosterol và quercitin (Reddy et al., 2006; Subramanian et al.,
1968).
Acid linolenic cũng đã được báo cáo trong các phần ở phía trên của cây. Hai
polysaccharide tan trong nước; WSTP - IA và WSTP - IB có chứa chuỗi chính β - (1 6) - D - Galactan cũng đã được tinh chế từ lá của cây (Raju và Davidson, 1994). Sự
xác định một số sterol bằng GC - MS và các thành phần lipid của cây cúc mui cũng đã
được báo cáo. Một flavonoid mới "Procumbenetin" được phân lập từ các bộ phận phía
trên của cây đã được mô tả là 3,6 dimetoxy - 5,7,2',3',4' - pentahydroxyflavone 7 - O β - glucopyranoside (Singh và Ahirwar, 2010).
Thành phần khoáng chất được nghiên cứu từ lá của cây cúc mui có chứa calci,
magie, kali, natri và selen. Nó đã được quan sát thấy rằng có thể phục vụ như một
nguồn cung cấp protein thực vật và bổ sung kali, cũng như là nguồn tiềm năng của tiền
chất vitamin A (caroten) cho người dân (Chen et al., 2008; Jude et al., 2009).
Bốn terpenoid mới cùng với bis-bithiophene đã được báo cáo từ Tridax
procumbens là acetate taraxasteryl, beta-amyrenone, acid lupeol và oleanolic (Ali và
Jahangir,

2002).

Hai

flavon

mới,

8,3'-dihydroxy-3,7,4'-trimethoxy-6-O-β-D-

glucopyranosyl flavone (1) và 6,8,3'-trihydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone (2) được

phân lập từ Tridax procumbens Linn., cùng với bốn hợp chất đã được biết là puerarin
(3), esculetin (4), acid oleanolic (5) và acid betulinic (6) (Hình 4). Các cấu trúc của hai
flavon mới đã được giải thích dựa trên phân tích hóa học và phương pháp quang phổ

Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

(IR, 1D và 2D NMR, ESIMS, HR-ESI-MS). Các hoạt động chống oxy hóa của hai
flavon mới được đánh giá bằng hai phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) hoạt động loại bỏ triệt để gốc tự do và các xét nghiệm làm giảm năng lượng
chống oxy hóa của sắt (FRAP), và các dữ liệu cho thấy các hợp chất (1) và (2) có hoạt
động chống oxy hóa nhất định, với các hoạt động chống oxy hóa của hợp chất (2) là
mạnh hơn so với hợp chất (1). Có thể thấy rằng các phân tử 1 có cấu trúc taraxasteryl
acetate, hình dạng của các mảnh triterpene trong số đó thực tế cũng giống như của
taraxasterol acetate (Runsheg et al., 2010).

Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6)
(*Nguồn: www.ijpbs.net/vol-3/issue-1/bio/P% 20 -% 2061.pdf, ngày 04/08/2013)

Cây cúc mui giàu natri, kali và calci (Jude, 2009). Lá của nó chủ yếu chứa
protein thô 26%, chất xơ thô 17%, và carbohydrate hòa tan 39%, calcium oxide 5%.
Acid oleanolic cũng thu được với số lượng nhiều từ cây cúc mui và nó được cho là

một tác nhân trị đái tháo đường tiềm năng khi thử nghiệm với a-glucosidase (Verma et
al., 1998; Ali và Jahagir, 2002).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

2.2.6 Dược tính
Cây cúc mui đã được biết đến với một số hoạt động điều trị tiềm năng như tác
động bảo vệ gan, khả năng điều hòa miễn dịch, hứa hẹn hoạt động chữa lành vết
thương, chống tiểu đường, hạ huyết áp, giảm sưng tấy do côn trùng cắn, chống viêm
và chống oxi hóa, viêm phế quản, kiết lỵ và tiêu chảy. Cây cúc mui cũng ngăn rụng tóc
và được sử dụng như một loại thuốc bổ tóc (Nazeruddin et al., 2011).
 Hoạt động kháng khuẩn
Toàn bộ cây cúc mui đã được báo cáo cho hoạt động kháng khuẩn của nó trên
nhiều loài vi khuẩn. Dịch chiết cây tươi được sử dụng hai lần một ngày trong 3-4 ngày
để chữa trị các vết đứt và vết thương. Chiết xuất của cả cây cúc mui cho thấy hoạt tính
kháng khuẩn chỉ chống lại Pseudomonas aeruginosa. Bốn chủng vi khuẩn được sử
dụng trong thử nghiệm là cả vi khuẩn gram dương và gram âm Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus và cả hai vi khuẩn gram âm Escherichia coli và Pseudomonas
aeruginosa (Mahato và Chaudhary, 2005). Theo nghiên cứu của Bharathi et al., 2012
đã xác định hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất methanolic và ethyl acetate từ lá của
cây cúc mui có khả năng chống lại Echerichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Salmonella typhi, Bacillus cereus, Staphylococcus eureus. Chiết xuất n-hexane từ hoa
cây cúc mui cho thấy hoạt động chống Bacillus cereus và Klebsiella sp, chiết xuất ethy
acetate ở những phần phía trên của hoa cây cúc mui chỉ chống lại Mycobacterium
smegmatis và Staphylococcus aureus. Chiết xuất n-hexan của tất cả những phần phía
trên của cây cúc mui đã được báo cáo về hoạt động chống Mycobacterium smegmatis,
Escherichia coli, Salmonella nhóm C và Salmonella paratyphi (Taddei và Rosas,
2000).
2.2.7 Công dụng, chỉ định và phối hợp
Thường được dùng trong phạm vi dân gian làm thuốc sát trùng, chữa sưng tấy
thay vị Sài đất. Ở Campuchia, cây dùng làm thuốc giải nhiệt, trị ho và đau thấp khớp.
Ngày dùng 20 - 30g, sắc nước uống ( ngày 24/11/2013).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh
2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh
Endophytes, theo định nghĩa là các vi sinh vật (VSV) (chủ yếu là nấm và vi
khuẩn) sống trong mô của cây còn tươi cả đời hoặc một phần chu kỳ sống của chúng
mà không gây ra các triệu chứng có hại rõ ràng cho các cây chủ (Sturz et al., 2000;
Wellington và Marcela, 2004). Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập
trung vào các hoạt động sinh học của nấm nội sinh và vi khuẩn nội sinh (Strobel,

2003). Bởi vì sống trong một môi trường tương đối ổn định - trong mô thực vật,
endophytes có thể sản xuất được nhiều hoạt tính sinh học hơn các vi khuẩn vùng rễ
hoặc bất kỳ vi khuẩn khác mà được phân lập từ bề mặt cây trồng hoặc từ đất (Dowler
và Weaver, 1974; Andrews, 1992). Là một thành viên của endophytes, VKNS cũng đã
được quan tâm nhiều hơn về hoạt động sinh học đối kháng của chúng bao gồm cả kiểm
soát sinh học của các bệnh thực vật, kích thích tăng trưởng thực vật, và cố định
đạm…(Harris et al., 1994; Chen et al., 1995; Cui et al., 2003; Qiao et al., 2006).
Vi khuẩn nội sinh được tìm thấy hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong
nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác
nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… Hầu hết các dạng nội
sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký
sinh trên hạt. Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng
vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học. Vi khuẩn nội sinh sản xuất hàng loạt các sản
phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để
ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp. Ngoài ra nó còn có tiềm năng
loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độc trên
thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình phosphate và cố định
đạm. Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triển các ứng dụng tiềm năng công
nghệ sinh học của VKNS để phát triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng
thời có khả năng sản xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học.
Những tương tác có lợi giữa thực vật - vi khuẩn thúc đẩy sức khỏe, sự phát triển
của cây trồng, vấn đề này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Gần đây, họ đang
nghiên cứu tiềm năng cho giải pháp nâng cao khả năng phân hủy sinh học của các chất
gây ô nhiễm trong đất. Hầu hết các nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn ở rễ
(Lindow và Brandt, 2003; Kuiper et al., 2004; Berg et al., 2005). Vi khuẩn nội sinh có
Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

thể được xem như là vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà có những dấu hiệu
nhiễm bệnh hay hậu quả tiêu cực đối với cây chủ (Schulz và Boyle, 2005). Vi khuẩn
nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992). Từ
vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề
mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút,
giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotbacter, Bacillus,
Beijerinckia,

Derxia,

Enterobacteriaceae

(Klebsiella,

Enterobacter,

Pantoea),

Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum,
Gluconacetobacter và Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm
nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và
Hittingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các VKNS có thể tập trung tại vị trí
xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng
trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể

VKNS rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây
chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi
trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003).
Một số nhóm VKNS không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại chúng
có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự
sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Hơn nữa, một
số dòng VKNS có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích
thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác động của các nhân tố vô sinh và hữu
sinh (Hallmann et al., 1997).
Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động các chất hữu cơ,
và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi
sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh
dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra. Đặc tính quan trọng của các
dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định
đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng
đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất
dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Harari et al., 1988). Nhờ sự đa dạng của
cây trồng và sự đa dạng của vùng rễ nên các nhà khoa học đã khám phá được nhiều
nhóm VKNS khác nhau từ các loại cây khác nhau.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất
trong các cây còn non (Rovira et al., 1983). Azospirillum brasilense đã thúc đẩy sự
phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum miliaceum
(Harari et al., 1988). Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân,
kali và sắt tăng từ 10 - 64% (Biswas et al., 2000). Chaintreuil et al. (2000) đã phát hiện
những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu
Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với
cây lúa hoang. Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn
xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây.
Hơn 300.000 loại thực vật được biết trên trái đất, mỗi loài có một hay nhiều loài
VKNS (Strobel et al., 2004). Tuy nhiên chỉ có một số ít cây trồng được nghiên cứu
tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và tìm thấy nhiều loài VKNS mới với nhiều
đặc tính tốt (Ryan et al., 2008). Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sinh trưởng và
chuyển hóa các chất trong cây. Vi khuẩn nội sinh có thể sống bám ở bề mặt rễ, hay
chui vào rễ qua lông hút hoặc các vị trí tổn thương của cây. Sau khi xâm nhập vào cây
chủ các VKNS có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây,
vào các khoảng gian bào, vào hệ mạch (Sprent và James, 1995; Reinhold - Hurek,
1988; Zinniel et al., 2002), giúp tăng cường sự dinh dưỡng của cây bằng nhiều cơ chế
trực tiếp hay gián tiếp, bao gồm sự cố định Nitơ trong khí quyển, cung cấp khoáng
chất như phosphate tổng hợp hoocmon thực vật (Hill et al., 1972; Khalil et al., 1989;
Kloepper và Beauchamp, 1992; Kloepper et al., 1992; Hallmann et al., 1997;
Kobayashi và Palmudo, 2000; Hung và Annnapurna, 2004; Lãng Ngọc Dậu et al.,
2007). Vi khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm cho cây trồng.
Thí nghiệm trên mía ở Brazil cho thấy VKNS có thể cung cấp 80 kg/ha/năm (Boddey
et al., 1995). Đây là những vi sinh vật có lợi, có vai trò quan trọng trong sự ổn định
chu trình dinh dưỡng Nitơ, bổ sung nguồn đạm cho đất và dinh dưỡng cây trồng, ổn
định năng suất mùa vụ, phát triển bền vững sinh thái (Persello - Cartieaux et al., 2003).
Nhiều VKNS trong cây lúa mùa, cây cỏ chăn nuôi, cây khóm như Azospirillum
lipoferum, Klebsiella pneumoniae, Burkholderia tropica… cũng có khả năng hòa tan
lân khó tan (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007; Nguyễn Thị Thu Hà et al., 2009; Cao Ngọc

Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009). Vi khuẩn Enterobacter cloacae có khả năng tổng hợp
IAA từ tiền chất L-tryptophan (Koga et al., 1991). Vi khuẩn Azotobacter cũng có khả

Chuyên ngành Vi sinh vật học

12

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

năng tổng hợp IAA từ tiền chất L - tryptophan (Ahmad et al., 2005). Nghiên cứu của
Somers et al. (2005) cho thấy vi khuẩn Azospirillum brasilense có khả năng tổng hợp
IAA từ L - tryptophan.
Một trong những khám phá mới về VKNS là chúng có khả năng tổng hợp ra
những hợp chất chống lại mầm bệnh như vi khuẩn, nấm, tuyến trùng… gây bệnh cho
cây trồng, có thể xem những hợp chất này (phytophathogens) như là một hợp chất
kiểm soát sinh học hay đối kháng (biocontrol agents) (Berg et al., 2005). Ngoài ra,
chúng còn có thể tổng hợp ra những hợp chất tự nhiên phân hủy các hóa chất độc hại
như thuốc bảo vệ thực vật, dung môi hữu cơ…nên còn gọi là các hợp chất phân hủy
thực vật (phytoremediation) (Siciliano et al., 2001) góp phần trong việc xây dựng nền
nông nghiệp bền vững.
2.3.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh tiêu biểu
Ngày nay các nhà khoa học đã phát hiện nhiều nhóm VKNS trong nhiều loại cây
trồng và cả những loài thực vật hoang dại, các nhóm VKNS thường gặp sẽ mô tả dưới
đây:
2.3.2.1 Vi khuẩn Azospirillum

Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn,
và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về
sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau.
Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới, và được gọi là Azospirillum
(Tarrand et al., 1978).
Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có
dạng hình que ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1,7μm chiều rộng và 1,4 3,7μm chiều dài (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Các loài Azospirillum biểu hiện sự
phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây
trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980).
Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống
Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986);
trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm,
hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000;
Richardson, 2003), sản xuất kích thích tố thực vật (Vande Broek et al., 1999), hay

Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học