phân lập vi khuẩn nội sinh thân cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh đồng nai, bình phước và thành phố hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC







PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH THÂN CÂY BẮP
TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM Ở TỈNH ĐỒNG NAI,
BÌNH PHƯỚC VÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH








CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Gs. Ts. CAO NGỌC ĐIỆP LÝ KIỂN

MSSV: 3103959
LỚP: VI SINH VẬT K36





Cần Thơ, Tháng 11/2013


PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)



GS. Ts Cao Ngọc Điệp Lý Kiển



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình học tập tại trường cho đến khi hoàn thành luận văn này tôi
đã nhận được sự giúp đỡ từ các thầy cô, bạn bè và gia đình rất nhiều. Để có được kết
quả như hôm nay, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Gs.Ts Cao Ngọc Điệp và cố vấn học tập – cô
Nguyễn Thị Pha đã tận tình hướng dẫn, góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến!
- Ban Lãnh Đạo Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học cùng quý thầy
cô đã hướng dẫn và chỉ dạy tôi trong suốt quá trình học tập.
- Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Chị Trần Thị Giang cán bộ phòng thí nghiệm Vi
sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ cho tôi thực hiện
tốt đề tài.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và những người thân
luôn luôn ủng hộ và động viên tôi, tạo điều kiện tốt để tôi học tập và là nguồn động lực
lớn lao giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống.
Một lần nữa, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!


Cân thơ. Ngày 25 tháng 11 năm 2013

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
i

TÓM LƯỢC
Sáu mươi bốn dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường NFb và môi
trường LGI từ thân cây bắp trồng ở đất Huyện Trảng Bom-Tỉnh Đồng Nai, Huyện
Thống Nhất-Tỉnh Đồng Nai, Huyện Long Thành-Tỉnh Đồng Nai, Huyện Chơn
Thành-Tỉnh Bình Phước và Huyện Củ Chi-Thành Phố Hồ Chí Minh.Các dòng vi
khuẩn đều có khả năng phát triển trên môi trường Burk’s không đạm và môi trường
NBRIP sau 72 giờ nuôi trên môi trường đặc, ủ ở 30
0
C. Kiểm tra khả năng tổng hợp
đạm trên môi trường Burk’s lỏng và khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường
NBRIP lỏng, Kiểm tra khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA). kết quả có 64/64
dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm chiếm tỉ lệ 100% và 64/64 dòng vi khuẩn có
khả năng hòa tan lân khó tan chiếm tỉ lệ 100%. kế quả có 64/64 dòng vi khuẩn có khả
năng tổng indole-3-acetic acid (IAA) chiếm tỉ lệ 100%.
Trong 64 dòng vi khuẩn phân lập chọn ra 3 dòng có khả năng cố định đam, hòa
tan lân, và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA ) tốt: ĐTN1b (lượng đạm cố định ở
ngày 4 là 3,50 mgNH
4
+
/l, lượng lân hòa tan ở ngày 10 là 83,96 mgP
2
O
5
/l và lượng
indole-3-acetic acid (IAA)là 16,83 mg/l) , ĐTN11(lượng đạm cố định ở ngày 4 là 3,14
mgNH

4
+
/l, lượng lân hòa tan ở ngày 10 là 87,82 mgP
2
O
5
/l và lượng indole-3-acetic
acid (IAA)là 10,83 mg/l), và HTN1c (lượng đạm cố định ở ngày 4 là 2,73 mgNH
4
+
/l,
lượng lân hòa tan ở ngày 10 là 75,56 mgP
2
O
5
/l và lượng indole-3-acetic acid (IAA)là
13,50 mg/l)
Từ khóa: Cây bắp, cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA), vi
khuẩn nội sinh.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
ii

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT i
LỜI CẢM TẠ i
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG…………………………………………………………………iv

DANH SÁCH HÌNH vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 4
2.1 Sơ lược về cây bắp 4
2.2 Vi khuẩn nội sinh 5
2.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ 6
2.2.2 Vi khuẩn Azospirillum 7
2.2.3 Vi khuẩn Azotobacter 7
2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia 7
2.2.5 Vi khuẩn Enterobacter 8
2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter 8
2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillum 9
2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella 9
2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam 10
2.4 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 11
2.4.1 Khả năng cố định đạm 11
2.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan 12
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 14
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
iii

3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 14
3.1.2.Thời gian thực hiện 14
3.2 Phương tiện nghiên cứu 14
3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 14

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm 15
3.2.3 Hóa chất và môi trường 15
3.3 Phương pháp nghiên cứu 19
3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn nội
sinh …………………………………………………………………….19
3.3.2 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc 20
3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 20
3.3.4 Xác định đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh 21
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25
4.1 Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập 25
4.1.1 Phân lập vi khuẩn 25
4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập 28
4.2 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn từ môi trường NFb và môi trường
LGI sang môi trường Burk’s không đạm và khả năng cố định đạm của các
dòng vi khuẩn 33
4.2.1 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn đã phân lập 33
4.2.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập 35
4.3 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn từ môi trường NFb và môi
trường LGI sang môi trường NBRIP và khả năng hòa tan lân của các dòng vi
khuẩn 39
4.4 khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của các dòng vi khuẩn từ môi
trường NFB và LGI (không có bổ sung tryptophan). 44
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49
5.1 Kết luận 49
5.2 Đề nghị 49
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
iv

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC
Bảng 1: Khả năng cố định đạm (mgNH
4
+
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau
2 ngày nuôi trong môi trường Burk không đạm.
Bảng 2: Khả năng cố định đạm (mgNH
4
+
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau 4
ngày nuôi trong môi trường Burk không đạm.
Bảng 3: Khả năng cố định đạm (mgNH
4
+
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau 6
ngày nuôi trong môi trường Burk không đạm.
Bảng 4: Khả năng cố định đạm (mgNH
4
+
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau 8
ngày nuôi trong môi trường Burk không đạm.
Bảng 5: Khả năng hoa tan lân (mgP
2
O
5
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau 5
ngày nuôi trong môi trường NBRIP
Bảng 6: Khả năng hoa tan lân (mgP
2

O
5
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau 10
ngày nuôi trong môi trường NBRIP
Bảng 7: Khả năng hoa tan lân (mgP
2
O
5
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau 15
ngày nuôi trong môi trường NBRIP
Bảng 8: Khả năng hòa tan lân (mgP
2
O
5
/l) của 64 dòng vi khuẩn được phân lập sau 20
ngày nuôi trong môi trường NBRIP
Bảng 9: Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của 64 dòng vi khuẩn được
phân lập sau 2 ngày nuôi trong môi trường NFb, LGI lỏng.
Bảng 10:Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của 64 dòng vi khuẩn được
phân lập sau 4 ngày nuôi trong môi trường NFb, LGI lỏng.
Bảng 11: Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của 64 dòng vi khuẩn được
phân lập sau 6 ngày nuôi trong môi trường NFb, LGI lỏng.
Bảng 12: Khả năng hoa tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)của 64 dòng vi khuẩn
được phân lập sau 8 ngày nuôi trong môi trường NFb, LGI lỏng.

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
v

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Diện tích và năng suất bắp qua các năm 2
Bảng 2: Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại hạt 5
Bảng 3: Công thức môi trường LGI (Cavalcante và Döbereiner, 1988) 16
Bảng 5: Công thức môi trường Burk’s N-free (Park et al., 2005) 18
Bảng 6: Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal., 1999) 18
Bảng 7: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24
Bảng 9: Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của dòng vi khuẩn đã phân lập 29
Bảng 10: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường Burk's không
đạm………… ………………………………………………………… …32
Bảng 11: Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2, 4, 6 và 8
ngày nuôi trong môi trường Burk's không đam………….…………………35
Bảng 12: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP đặc 38
Bảng 13: Khả năng hòa tan P
2
O
5
(mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 5 ngày và 10
ngày nuôi trong môi trường NBRIP lỏng 41
Bảng 14: Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của các dòng vi khuẩn sau
2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường NFb và LGI
lỏng 43
Bảng 15: Lượng đạm cố định (mg NH
4
+/l), lượng lân hòa tan (mg P

2
O
5
/l) và tổng
hợp indole-3-acetic acid (IAA) cao của các dòng vi khuẩn 47



Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
vi

DANH SÁCH HÌNH

Trang
Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu thân cây bắp 19
Hình 2: Vi khuẩn sau 24 giờ nuôi trên môi trường bán đặc. 27
Hình 3: Đặc điểm của một số khuẩn lạc. 31
Hình 4: Đường chuẩn do đạm 35

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT
VK: Vi khuẩn
DC: Đối chứng
CV: Coefficient of variation
IAA: Indole-3-acetic acid
NBRIP: National Botanical Research Institute’s Phosphate.
SS: Sum of Square
MS: Mean Square

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
1

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Bắp còn gọi là ngô (danh pháp khoa học: Zea mays L.) được xem là một loại
ngũ cốc vàng và là cây lương thực quan trọng đứng thứ hai sau lúa ở nước ta vì
không những nó đáp ứng cho nhu cầu thực phẩm chính của con người từ thuở sơ khai
mà còn là một nguồn dinh dưỡng tiềm năng góp phần ngăn ngừa những triệu chứng
bệnh lý của động mạch Bắp được trồng khắp nơi, từ đồng bằng đến trung du và khá
nhiều ở miền núi, nhở khả năng sử dụng đa dạng và việc áp dụng những kỹ thuật canh
tác tiến bộ kết hợp với các giống cải tiến. Cuộc cách mạng về giống bắp lai đã góp
phần tăng nhanh diện tích, năng suất và sản lượng bắp toàn quốc, đưa nước ta vào
hàng ngũ những nước trồng bắp lai tiên tiến của vùng châu Á. Những năm trở lại đây
sản xuất bắp đang được chú ý do bắp không những là lương thực mà còn sử dụng làm
thức ăn gia súc trong khi cơ cấu nông nghiệp đã chuyển dịch theo hướng giảm dần tỷ
trọng ngành trồng trọt và tăng tỷ trọng ngành chăn nuôi nên nhu cầu về bắp là khá lớn.
Mục tiêu của ngành nông nghiệp trong những năm tới sẽ phấn đấu xây dựng vùng

trồng bắp hàng hoá ở các khu vực: vùng Trung Du Miền Núi phía Bắc, vùng đồng
bằng sông Hồng, Đông Nam Bộ, Tây Nguyên. Phát triển bắp đông trên đất lúa ở
những nơi có điều kiện phù hợp, có đủ nước tưới. Đây là hướng đi tích cực trong
chuyển dịch cơ cấu sản xuất theo hướng thâm canh tăng vụ, góp phần tăng sản lượng
lương thực vững chắc đặc biệt ở khu vực dân cư miền núi.
Hiện nay diện tích trồng bắp cả nước là gần 1,2 triệu ha, năng suất trung bình 43
tạ/ha, sản lượng giao động trong khoảng 4,5 - 5 triệu tấn/năm, trong khi nhu cầu về
bắp của nước ta hiện nay là trên 5 triệu tấn/năm kể cả cho chế biến lương thực và chăn
nuôi, hơn nữa tổng sản lượng bắp sản xuất vẫn chưa đủ cho nhu cầu trong nước, hàng
năm vẫn phải nhập trên nửa triệu tấn. Đây là điều kiện thuận lợi để sản xuất bắp phát
triển mở rộng.
Từ năm 1992, việc du nhập và phát động trồng các giống bắp lai (DK-888,
Pacific-11, Bioseed-9670 ) với năng suất cao (có khả năng đạt 7-8 t/ha, cá biệt có thể
đạt đến 12,3 t/ha tại Tân Châu, An Giang) đã đem lại lợi tức cao, đồng thời kết hợp
các chính sách cho vây vốn của ngân hàng, bao tiêu giá cả sản phẩm của các tỉnh đã
kích thích nông dân gia tăng diện tích trồng bắp khá nhiều.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2

Bảng 1: Diện tích và năng suất bắp qua các năm.
Năm
Diện tích (ha)
Năng suất (t/ha)
1975
267.100
1,04
1980
389.600
1,10

1985
397.300
1,47
1990
431.800
1,55
1991
432.900
1,51
1995
556.800
2,10
1996
615.200
2,50
(Nguồn: Dương Minh. 1999. Giáo trình môn ”hoa màu”. Khoa Nông nghiệp, ĐHCT)
Các tỉnh trồng bắp nhiều nhất của nước ta (1996) là: Đồng Nai (64.500 ha) và các
tỉnh vùng Trung du (Hà Giang 38.000 ha, Cao bằng 33.000 ha ,Lào Cai 20.100 ha,
nhưng năng suất thường dưới 2,0 t/ha). Tại đồng bằng sông Cưu Long, An Giang là
tỉnh trồng bắp nhiều nhất (8.600 ha, năm 1996), diên tích nay đang gia tăng trong các
năm gần đây nhờ ứng dung nhanh các giống lai có năng suất cao vào sản xuất giúp
tăng hiệu quả kinh tế của nông dân. An Giang dẫn đầu về năng suất bắp tại Niệt Nam
(6,53 t/ha năm 1996).
Điều kiện tự nhiên của Việt Nam hoàn toàn thích hợp cho sản xuất bắp, đặc biệt
là các vùng miền núi trong điều kiện canh tác lúa bị hạn chế.
Trong tương lai, khi đã sản xuất đủ cho nhu cầu nội địa, chắc chắn bắp sẽ là mặt
hàng xuất khẩu của nước ta giống như lúa gạo, vì nhu cầu lương thực và chế biến của
thế giới cũng ngày một tăng, nhiều nước trên thế giới sử dụng bắp là lương thực chính,
trong khi các giống bắp được trồng ở Việt Nam đều có chất lượng tốt.
Bắp có nhiều công dụng. Tất cả các bộ phận của cây bắp từ hạt, đến thân, lá đều

có thể sử dụng được để làm lương thực, thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc,
làm nguyên liệu cho công nghiệp (rượu bắp, sản xuất ethanol để chế biến xăng sinh
học…), một số bộ phận của bắp có chứa một số chất có vai trò như một loại thuốc
chữa bệnh.…
Bắp có giá trị dinh dưỡng cao, sinh trưởng mạnh, thích nghi với nhiều loại đất là
nhờ sự có mặt của các vi khuẩn nội sinh (endophytic bacteria) trong cây. Vi khuẩn nội
sinh là các vi khuẩn từ vùng rễ xâm nhập vào rễ để sống bên trong mô thực vật mà
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3

không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với cây chủ; trái lại chúng còn xúc tiến sự
sinh trưởng của cây chủ. Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sự tăng trưởng của cây
bằng cách tổng hợp kích thích tố auxin (IAA) (Barbieri et al., 1986), tăng hàm lượng
các chất khoáng, tăng khả năng kháng nhiều nguồn bệnh khác nhau của cây (Fashey
et al., 1991; Bandara et al., 2006), giúp cố định đạm sinh học, giảm tính mẫn cảm với
mầm bệnh và sự thay đổi của thời tiết gây tổn hại cho cây. Sự phát triển của vi khuẩn
nội sinh có ích này ở những trung tâm nghiên cứu trên thế giới đã mở ra một viễn cảnh
tốt đẹp của sự vận dụng những vi khuẩn nội sinh vào việc tăng cường các sản phẩm
nông nghiệp nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học cung cấp cho
cây trồng giúp cho việc xây dựng nền nông nghiệp bền vững xanh và sạch.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Phân lập được những dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó
tan và khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) từ thân cây bắp trồng ở các tỉnh Đồng
Nai, Binh Phước và Thành Phố Hồ Chí Minh.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
4

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây bắp
Bắp hay còn gọi là Ngô (danh pháp khoa học: Zea mays L.) là một loại cây
lương thực được thuần canh tại khu vực Trung Mỹ và sau đó lan tỏa ra khắp châu Mỹ.
Bắp được gieo trồng ở phần còn lại của thế giới sau khi có tiếp xúc của người châu Âu
với châu Mỹ vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16. Ở Việt Nam cây bắp có nguồn gốc từ
Trung Quốc. Theo Lê Quý Đôn trong “Vân Đài loại ngữ “ hồi đầu đời Khang Hi
(1662-1762), Trần Thế Vinh, người huyện Tiên Phong (Sơn Tây, phủ Quảng Oai) sang
sứ nhà Thanh lấy được giống bắp đem về nước. Khắp cả Sơn Tây đã dùng bắp thay
cho lúa gạo. Từ đó bắp được phổ biến và phát triển ra khắp đất nước. Nhà nông có
câu: “Được mùa chớ phụ ngô khoai”, điều đó đủ để thấy rằng, mặc dù trong những
năm tháng đã có đủ lúa gạo nhưng bắp vẫn giữ vai trò quan trọng đối với người nông
dân.
Có nhiều loại bắp, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất và
công dụng như bắp nếp (hạt màu trắng, dẻo hạt), chủ yếu để ăn, bắp tẻ (hạt màu trắng
hoặc vàng), cứng nhưng sản lượng cao nên dùng làm thức ăn cho gia súc. Hai loại là
bắp đường (hạt màu vàng không đều), vị ngọt và bắp rau (bắp nhỏ, ít tinh bột) dùng để
ăn. Bắp là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (chỉ riêng tại Hoa
Kỳ thì sản lượng đã là khoảng 270 triệu tấn mỗi năm). Các giống bắp lai ghép được
các nông dân ưa chuộng hơn so với các giống bắp thông thường do có năng suất cao vì
có ưu thế giống lai. Trong khi một vài giống bắp có thể cao tới 7m tại một số nơi, thì
các giống bắp thương phẩm đã được tạo ra với chiều cao chỉ khoảng 2,5m. Bắp ngọt
(Zea mays var. rugosa hay Zea mays var. saccharata) thông thường thấp hơn so với
các giống bắp khác. Các giống bắp nếp, bắp răng ngựa ở nước ta thì có hàm lượng tinh
bột cao, lượng đường ít. Trong khi các giống bắp ở Mỹ và châu Âu thường được lai
tạo để có lượng tinh bột rất ít, độ ngọt cao (họ vẫn gọi là sweetcorn).




Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
5

Bảng 2: Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại hạt. Đơn vị: Phần trăm (%)
Hàmlượng
Loại hạt
Tinh bột
Protein
Lipit
Xenluloza
Tro
Nước
Bắp
69,2
10,6
4,3
2,0
1,4
12,5
Lúa
62,4
7,9
2,2
9,9
5,7
11,9
Lúa mì
63,8
16,8
2,0

2,0
1,8
13,6
Cao lương
71,7
12,7
3,2
1,5
1,6
9,9
Kê
59,0
11,3
3,8
8,9
3,6
13,0
(Nguồn: ngày 02/07/2013)
Protein: Bắp có trung bình 10,6% protein, protein chính của bắp là zein, một loại
prolamin gần như không có lysin và tryptophan. Nếu ǎn phối hợp bắp với đậu đỗ và
các thức ǎn động vật thì giá trị protein bắp sẽ tǎng lên nhiều.
Lipit: Lipit trong hạt bắp toàn phần từ 4-5%, phần lớn tập trung ở mầm. Trong
chất béo của bắp có 50% là acid linoleic, 31% là acid oleic, 13% là acid panmitic và
3% là Stearic.
Gluxit: Gluxit trong bắp khoảng 69% chủ yếu là tinh bột. Ở hạt bắp non có thêm
một số đường đơn và đường kép.
Chất khoáng: Bắp nghèo canxi, giàu photpho.
Vitamin: Vitamin của bắp tập trung ở lớp ngoài hạt bắp và ở mầm. Bắp cũng có
nhiều vitamin B1. Vitamin PP hơi thấp cộng với thiếu tryptophan một acid min có thể
tạo vitamin PP. Vì vậy nếu ǎn bắp đơn thuần và kéo dài sẽ mắc bệnh Pellagre. Riêng

bắp vàng có chứa nhiều caroten (tiền vitamin A).
2.2 Vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn mà vòng đời của nó chiếm phần lớn trong cây trồng
(Quispel, 1992) hoặc một phần chu kì sống của chúng trong mô thực vật, chúng không
làm tổn thương mô thực vật mà còn giúp ích cho cây trồng (Kobayashi và Palumbo,
2000; Bandara 2006). Trong nông nghiệp vi khuẩn nội sinh có tác dụng như là một
công cụ giúp cải tiến mùa màng (Muthukumarasamy et al., 2002).
Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào thân theo các cách sau: xâm nhập vào thân từ
những điểm lộ rõ, bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
6

roots) (Reinhold Hurek và Hurek, 1998), xâm nhập vào rễ thông qua những vết nứt
của quá trình thành lập rễ bên, xâm nhập qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay
biểu bì rễ để sống nội sinh trong cây như: Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia,
Derxia, Klebsiella, Enterobacter, Pantonae, Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus,
Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter và Paenibacillus
(Elmerich, 2007). Tuy nhiên vi khuẩn nội sinh này cũng có khả năng xâm nhập qua
các vị trí bị tổn thương của lá hay các mô thông qua khí khẩu (Roos và Hattingh,
1983). Bằng những con đường đó vi khuẩn có thể tiến vào lục lạp của rễ.
Khi quá trình xâm nhập vào rễ của những vi khuẩn nội sinh này thành công,
chúng tập trung tại vị trí xâm nhập hay phân tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên
trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay hệ mạch (Zinniel et al., 2002) và thúc đẩy
quá trình sinh hóa trong cây. Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ
thuộc vào chủ yếu ở loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, mặc khác chúng phụ
thuộc vào điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển của cây (Pillay và Nowak,
1997). Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ mà
chúng còn có thể thúc đẩy sự sinh trưởng cho cây trồng bằng cách sản xuất ra chất
kích thích sự sinh trưởng (auxin, gibberellin) của thực vật và sự cố định đạm từ không

khí (Sturz et al., 2000).
2.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ
Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực và đất, là nơi lắng đọng các chất hữu cơ, và
là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh
vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh
dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ và các chất do rễ tiết ra (El-Shatnawi và Makhadmeh,
2001). Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự
phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại,
vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động
của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira
et al., 1983; Harari et al., 1988).
Vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả
cây bắp và cố định đạm sinh học cho cây bắp sử dụng.

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
7

2.2.2 Vi khuẩn Azospirillum
Nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn được phân lập bởi Beijerinck vào năm
1923, và được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô
tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác
nhau. Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới, và được gọi là
Azospirillum (Tarrand et al., 1978).
Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng chuyển động và có
dạng hình que ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1,7µm chiều rộng và 1,4-
3,7µm chiều dài (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Các loài Azospirillum biểu hiện sự
phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây
trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980). Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã
phát hiện nhiều loài của giống Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa

fusca) (Reinhold et al., 1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô
rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng
khác (Seshadri et al., 2000; Richardson, 2003), sản xuất kích thích tố thực vật (Vande
Broek et al., 1999), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan
et al., 2003).
2.2.3 Vi khuẩn Azotobacter
Năm 1966, loài Azotobacter paspali được Döbereiner phân lập từ các cây cỏ
đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra
vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là
loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên khi Brown (1976) theo
dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspalum notatum cũng được
cộng sinh với sự có mặt của A. paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspalum notatum
chủ yếu là bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm.
2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia sống ở vùng rễ của nhiều loại cây khác nhau; các vi
khuẩn thuộc giống Burkholderia được phân lập từ vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như
bắp, mía, cà phê, lúa, cỏ Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có
khả năng cố định đạm như khi các vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây lúa
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
8

sẽ cố định đến 19% tổng lượng đạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa, cũng như năng
suất cây lúa có chủng loài Burkholderia vietnamiensis tương đương với năng suất của
cây lúa không chủng loài Burkholderia vietnamiensis nhưng có bón phân đạm 25 –
30 kg/ha.
Vi khuẩn Burkholderia thuộc nhóm vi khuẩn gram âm có hình dạng xoắn, đường
kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu, có khả năng cố
định đạm. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng
trong môi trường ít khí oxy thì sẽ phát triển tốt nhất. Trong môi trường nuôi cấy,

Burkholderia tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2
– 4mm, tròn, phẳng hoặc lài.
2.2.5 Vi khuẩn Enterobacter
Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm

– Proteobacteria, hầu hết là vi khuẩn
gram âm có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này
sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi
khuẩn kích thích sự sinh trưởng của thực vật.
( ngày 05/07/2013).
Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng
rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan
để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic
acid.
2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter
Ban đầu vi khuẩn Gluconacetobacter được nhận biết là vi khuẩn hấp thụ acid để
tạo ra sắc tố nâu cam và biểu hiện các đặc tính chung giống với đặc tính của
Acetobacter spp. Đầu tiên được đặt tên là Saccharobacter nitrocaptans, sau đó là
Acetobacter nitrocaptans, tiếp theo là Acetobacter diazotrophicus (Döbereiner, 1992),
và hiện nay được phân loại là Gluconacetobacter diazotrophicus do nó có thể sống tốt
trong nồng độ đường cao và cố định đạm mạnh. Vào năm 1988, Lavalcante và
Döbereiner đã phân lập được Gluconacetobacter diazotrophicus từ rễ, thân và lá mía
trồng ở Brazil, chúng hiện diện trong các khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và
được xem là vi khuẩn nội sinh bắt buộc.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
9

Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Đây là vi khuẩn gram
âm sinh trưởng tốt nhất ở môi trường hiếu khí, ở nhiệt độ 25 – 30

0
C và pH từ 5,5 – 6,0.
Có nhiều loài khác nhau, bằng cặp mồi AC – DI chuyên biệt, người ta đã phát hiện
loài Gluconacetobacter diazotrophicus hiện diện rất nhiều trong mía và các loài cây
hòa bản khác nhau (Nguồn: Rosenblueth và Matínez – Romero (2006), trang 828) như
bắp, lúa hoang, cỏ voi, cà rốt, khóm, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với đặc tính
ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng hợp auxin và gibberellins, hòa tan kẽm và
lân khó tan (Muthukumarasamy et al ., 2002; Madhaiyan et al., 2004).
2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillum
Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm

– Proteobacteria, là vi khuẩn cố định
đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ lúa có
giá trị kinh tế.
Các loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã
được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, cỏ, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986;
Olivares et al., 1996); vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cây cỏ chăn nuôi và các cây
trồng ở vùng nhiệt đới như khóm và chuối (Cruz et al., 2001).
Gần đây, các nhà nghiên cứu đã phát hiện được loài Herbaspirillum frisingense
mới được phân lập từ các cây cho sợi (Kirchhof et al., 2001)
Herbaspirillum hầu hết các loài của chúng thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh bắt
buộc trong mô thực vật. Trong rễ chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et
al., 1986). Ngoài ra chúng còn phát tán đến cả những vùng thân và lá (Barraquio et al.,
1997).
2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm

– Proteobacteria, là vi khuẩn gram âm, có
dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2
loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca.

Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào
cây trồng và sống nội sinh trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể
cố định đạm trong điều kiện kỵ khí ( ngày
05/07/2013).
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
10

Theo ZX Lu (2000), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập từ rễ
lúa là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng của thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm
từ nitơ trong không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole
– 3 – pyruvic acid của chúng (
ngày 04/07/2013).
2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam
Hiện nay, người ta đã tìm được nhiều giống vi khuẩn nội sinh như: Azoarcus,
Enterobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter,
Brudyrhizobium, Azospirillum, Gluconacetobacter, Cellulomonas, Klebsiella,
Corynebacterium, Burkholderia, Herbaspirillum ở các cây lương thực, cây hoa màu,
cây họ đậu và cây cỏ chăn nuôi
Năm 1958, các nhà khoa học đã tìm thấy Beijerinckia spp. ở vùng rễ cây mía.
Sau đó Berg et al. (1980) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của Azospirillum cộng sinh
ở cây mía đã làm tăng cường hoạt tính của enzim nitrogenase từ đó làm tăng tỉ lệ tổng
hợp đạm của cây.
Năm 1988, Cavalcante và Döbereine đã phân lập được vi khuẩn cố đinh đạm
trong rễ và thân cây mía trồng ở Brazil và đặt tên là Acetobacter diazotrophicus. Gần
đây, các nhà nghiên cứu đã phát hiện loài vi khuẩn này có một số đặc tính: tổng hợp
hormone tăng trưởng, tổng hợp auxin và gibberellin, làm giảm pH môi trường để hòa
tan lân (Muthukumarasamy et al., 2002). Hiện nay người ta đã nghiên cứu và tìm thấy
vi khuẩn này còn hiện diện ở cây cà phê, gari, khóm, lúa (Loganathan và Nair, 2003).
Ớ Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở vùng rễ của các loài ngũ cốc và

cỏ chăn nuôi các vi khuẩn Enterobacter và Bacillus (Lindberg và Granhall, 1984).
Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các vi khuẩn nội sinh
Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbeltagy et al.,2001).
Người ta cũng đã tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và
giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19%
tổng số đạm cần thiết cho cây (Verma et al.,2001).
Ở Mỹ, mất hơn 6 năm nghiên cứu ở 4 loài cây nông nghiệp (bắp, lúa miến, đậu
tương và lúa mì) và 27 loài cỏ tự nhiên khác nhau người ta đã xác định được 15 giống
vi khuẩn nội sinh: Agrobacterium, Bacillus, Bradirhizobium, Erwinia, Cellulomonas,
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
11

Clavibacter, Corynebacterium, Enterobacterium, Escherichia, Klebsiella,
Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Rothia và Xanthomonas (Zinniel et
al.,2002), trong đó số vi khuẩn gram dương xấp xỉ bằng số vi khuẩn gram âm.
Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau, người ta đã xác định
được vi khuẩn nội sinh Gluconacetobacter diazotrophicus cũng có khả năng cố định
đạm nhờ vào gen Nif (Muthukumarasamy et al., 2005).
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa
tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã tiến hành khá nhiều
trong những năm gần đây . Tại Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học –
Đại học Cần Thơ, Cao Ngọc Điệp et al. (2007) đã phân lập và nhận diện các dòng
Azospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa trồng; Cao Ngọc Điệp (2005) cũng
đã nghiên cứu ảnh hưởng của các vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn
Pseudomonas sp. trên cây đậu nành đã làm gia tăng số trái và giảm số trái lép trên cây.
Gần đây, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2008) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn
Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh ở rễ, thân và lá của các giống mía trồng ở
huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, tỉnh Sóc Trăng. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có
một nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh ở thân cây bắp.

2.4 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là nhóm vi khuẩn tiền nhân được liên kết với thực vật, chúng
hình thành sự liên hợp với cây chủ của chúng bằng cách hình thành tập đoàn của các
mô bên trong. Đối với nông nghiệp, phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh
vật chủ mà ngược lại chúng còn được xem là công cụ để cải tiến năng suất cây trồng
nhờ vào các đặc tính sinh học của chúng (Muthukumarasamy et al., 2002)
2.4.1 Khả năng cố định đạm
Đạm là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của sinh vật bởi vì nó thường là chất
dinh dưỡng đầu tiên hạn chế sự sinh trưởng của sinh vật trong các hệ sinh thái. Trong
nông nghiệp năng suất của cây trồng được cung cấp chủ yếu bằng cách dùng các phân
đạm vô cơ, mà phân này thì đắc đỏ và có hại cho môi trường (Muthukumarasamy et
al., 2005). Từ các viễn cảnh về sinh thái và kinh tế, sự cố định đạm sinh học do sự liên
kết giữa vi khuẩn với cây trồng là điều mong đợi thiết yếu, nhất là đối với các cây có
giá trị kinh tế quan trọng.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
12

Sự cố định đạm sinh học chỉ giới hạn ở sinh vật sơ hạch, chủ yếu là ở vi khuẩn và
Archaea. Nhóm vi sinh vật này có thể sống tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình cố
định đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu là nguồn carbohydrate do cây
chủ cung cấp, do đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càng
cao. Trong quá trình cố đạm sinh học, khâu then chốt của toàn bộ chu trình nitơ là sự
khử liên kết của N
2
thành NH
3
nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của phức
hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase.
Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase biến đổi N

2
thành NH
3

theo công thức sau:

Ammonia (NH
3
) được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để
đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng. Việc đánh
giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn được phân lập cũng là một khâu quan
trọng để phân loại chúng.
Trong nhiều trường hợp, sự phát triển của vi khuẩn ở các môi trường nuôi cấy
đặc, bán đặc hay môi trường lỏng không đạm thì không đủ bằng chứng cho hoạt tính
cố định đạm của vi khuẩn. Các điều kiện sinh lý tương thích với hoạt tính nitrogenase
và sự phát hiện về hoạt tính này bằng các thử nghiệm khử acetylene cũng có thể không
đem lại kết quả như mong muốn hay thuyết phục (Postage, 1981).
Theo Klucas (1991) để sự cố định đạm nội sinh có hiệu quả thì cần phải cung cấp
đầy đủ các chất cần thiết từ cây chủ và các điều kiện môi trường thích hợp cho sự cố
định đạm liên kết. Do đó, sự chứng minh phân tử về sự có mặt của các gen Nif trong
bộ gen của vi khuẩn được giả định là cố định đạm thường được xem là vật chỉ thị đáng
tin cậy để phân loại vi khuẩn (Elmerich, 2007).
2.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan
Lân (P) là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho sự
sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Illmer và Schinner, 1992). Nhìn chung, lân sẵn
có trong đất cần cho sự sinh trưởng thực vật thấp, hàm lượng lân trung bình trong đất
khoảng 0,05% (w/w) nhưng chỉ có 0,1% hàm lượng lân tổng số là có giá trị cho cây
(Zou et al., 1992).
N
2

+ 8H
+
+ 8e
-
+ 16ATP + 16H
2
O
2NH
3
+ H
2
+ 16ADP +16Pi
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
13

Việc thiếu lân ở đất là một trong những nhân tố quan trọng nhất ở đất hạn chế sự
sinh trưởng của thực vật, vì vậy để đạt năng suất thực vật tối đa người ta thường dùng
các dạng phân lân dễ tan để bón cho cây . Tuy nhiên, các dạng có thể hòa tan của
phân lân khi bón vào đất lại dễ dàng bị kết tủa thành các dạng không hòa tan được
như là: CaHPO
4,
Ca
3
(PO
4
)
2
, FePO
4

và AlPO
4
nên cây khó hấp thụ (Omar, 1998) và
dẫn đến việc bón phân lân vượt quá mức đối với cây trồng. Việc bón phân lân vượt
quá giới hạn cho phép là một trong những nguyên nhân gây ra ô nhiễm môi trường,
làm đất bị hoang hóa hay xói mòn; đồng thời cũng gây ra các vấn đề về kinh tế.
Theo nghiên cứu của Đặng Thị Huỳnh Mai (2001) có nhiều vi sinh vật được
phân lập từ các loại đất ở đồng bằng sông Cửu Long có khả năng hòa tan lân như là
các nhóm vi khuẩn và nấm. Trong đó nhóm vi khuẩn nhiều hơn nấm nhưng nấm có độ
hữu hiệu cao hơn.
Các vi sinh vật hòa tan phosphate làm cho phosphate khó tan có thể thành dạng
hòa tan bằng quá trình acid hóa và làm giảm pH do các acid hữu cơ do vi khuẩn tiết ra
tạo ra nhiều ion H
+
(Lin et al.,2006). Các acid hữu cơ được sản xuất từ vi khuẩn và
nấm trong quá trình hòa tan lân khó tan chủ yếu là: citric, lactic, gluconic, oxalic,
tartaric, acetic và 2-ketogluconic acid (Sperber, 1985; Duff, 1963).
Theo nghiên cứu của Moghimi và Tate (1978) thì ngoài cơ chế acid hóa, các vi
khuẩn còn có thể hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion.
Trong đó phức cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp hòa tan lân khó
tan khi có cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
14

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Vi sinh vật
môi trường thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần

Thơ.
3.1.2.Thời gian thực hiện
Từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ, thiết bị
Sử dụng những thiết bị, phương tiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ.
a) Thiết bị, dụng cụ để phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn
- Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, ống Falcon
- Bình Erlenmeyer 50ml,100 ml
- Que cấy, đèn cồn, lame và lammen
- Kính hiển vi Olympus BH – 2 (Nhật)
- Cân điện tử Sartorius (Đức )
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi – international (Đức)
- Tủ cấy vi sinh vật ( Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật Inccucell 111 (Đức)
- Tủ sấy EHRET (Đức)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức), máy Vortex
- pH kế Orion 420A (Hoa Kì)
- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)
- Bộ micropipette Gibson P10, P20, P50, P200, P1000
b) Thiết bị và dụng cụ khác dùng để phân lập và nhận diện vi khuẩn
- Tủ lạnh Electrolux Confor Plus (Thụy Điển)
- Tủ lạnh Akira (Việt Nam)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
15

- Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus 7,1 megapixel
- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm
Thân cây bắp được lấy ở các địa điểm mỗi địa điểm lấy ba cây: Xã Trung Hòa-
Huyện Trảng Bom-Tỉnh Đồng Nai, Xã Lộ 25-Huyện Thống Nhất-Tỉnh Đồng Nai, Xã
Bào Hàm 2-Huyện Thống Nhất-Tỉnh Đồng Nai, Thị trấn Lòng thành-Huyện Long
Thành-Tỉnh Đồng Nai, Xã Suối Trầu-Huyện Long Thành-Tỉnh Đồng Nai, Xã Bình
Sơn-Huyện Long Thành-Tỉnh Đồng Nai, Xã Cẩm Đường-Huyện Long Thành-Tỉnh
Đồng Nai, Xã Cẩm Mỹ-Huyện Long Thành-Tinh Đồng Nai. Xã Nha Bích-Huyện
Chơn Thành-Tỉnh Bình Phước, Xã Minh Thành-Huyện Chơn Thành-Tỉnh Bình Phước,
Xã Minh Hưng-Huyện Chơn Thành-Tỉnh Bình Phước. Xã Tân Thông Hội-Huyện Củ
Chi-Thành Phố Hồ Chí Minh, Xã Tân Phú Trung-Huyện Củ Chi-Thành Phố Hồ Chí
Minh và được bảo quản trong ngăn mát ở 4
0
C.
3.2.3 Hóa chất và môi trường
a) Hóa chất dùng để khử trùng mẫu
- Nước cất vô trùng
- Ethanol (cồn) 96%
- Hydrogen peroxide (H
2
O
2
) 10%